Summary
Le présent protocole décrit les concepts et l’application technique de la technique du myographe tensométrique utilisant un système myographique à chambres multiples dans l’évaluation expérimentale ex vivo de la fonction endothéliale aortique de la souris.
Abstract
La myographie tensométrique à chambre de petit volume est une technique couramment utilisée pour évaluer la contractilité vasculaire des petits et grands vaisseaux sanguins chez les animaux de laboratoire et les petites artères isolées des tissus humains. La technique permet aux chercheurs de maintenir les vaisseaux sanguins isolés dans un environnement étroitement contrôlé et standardisé (quasi physiologique), avec la possibilité de s’adapter à divers facteurs environnementaux, tout en défiant les vaisseaux isolés avec différents agents pharmacologiques qui peuvent induire une vasoconstriction ou une vasodilatation. La chambre myographique fournit également une plate-forme pour mesurer la réactivité vasculaire en réponse à diverses hormones, inhibiteurs et agonistes qui peuvent avoir un impact sur la fonction des muscles lisses et des couches endothéliales séparément ou simultanément. La paroi des vaisseaux sanguins est une structure complexe composée de trois couches différentes: l’intima (couche endothéliale), les médias (muscles lisses et fibres d’élastine) et l’adventice (collagène et autres tissus conjonctifs). Pour bien comprendre les propriétés fonctionnelles de chaque couche, il est essentiel d’avoir accès à une plateforme et à un système expérimentaux qui permettraient une approche combinatoire pour étudier les trois couches simultanément. Une telle approche exige l’accès à une condition semi-physiologique qui imiterait l’environnement in vivo dans un contexte ex vivo . La myographie tensométrique à chambre de petits volumes a fourni un environnement idéal pour évaluer l’impact des indices environnementaux, des variables expérimentales ou des agonistes et antagonistes pharmacologiques sur les propriétés vasculaires. Pendant de nombreuses années, les scientifiques ont utilisé la technique du myographe tensométrique pour mesurer la fonction endothéliale et la contractilité des muscles lisses en réponse à différents agents. Dans ce rapport, un système myographique tensométrique à chambre de petit volume est utilisé pour mesurer la fonction endothéliale dans l’aorte isolée de la souris. Ce rapport se concentre sur la façon dont la myographie tensométrique à chambre de petit volume peut être utilisée pour évaluer l’intégrité fonctionnelle de l’endothélium dans de petits segments d’une grande artère telle que l’aorte thoracique.
Introduction
Au cours des dernières décennies, le système de myographie à petite chambre a été utilisé pour mesurer la réactivité de différentes couches de parois de vaisseaux sanguins en réponse à divers agents pharmacologiques et neurotransmetteurs dans un cadre ex vivo en temps réel. La réactivité vasculaire est une composante majeure d’un vaisseau sanguin fonctionnel sain et est essentielle à la régulation du flux sanguin et de la perfusion dans le système vasculaire périphérique et cérébral1. Dans la paroi des vaisseaux sanguins, l’interaction entre les couches endothéliales et musculaires lisses est un déterminant majeur du tonus vasculaire, qui est également constamment affecté par les changements structurels dans la couche de tissu conjonctif entourant la paroi des vaisseaux sanguins (adventice).
La couche endothéliale contrôle la vasomotion en libérant quelques facteurs vasodilatateurs, y compris l’oxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et le facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF), ou en produisant des agents vasoconstricteurs tels que l’endothéline-1 (ET-1) et le thromboxane (TXA2)2,3,4. Parmi ces facteurs, le NO a fait l’objet d’études approfondies et ses rôles régulateurs importants dans d’autres fonctions cellulaires critiques telles que l’inflammation, la migration, la survie et la prolifération ont été largement cités dans la littérature scientifique 2,5.
Dans le domaine de la biologie vasculaire, la myographie en chambre a fourni aux physiologistes et pharmacologues vasculaires un outil précieux et fiable pour mesurer la fonction endothéliale dans un système semi-physiologique étroitement contrôlé1. Actuellement, il existe deux systèmes myographiques différents à la disposition des scientifiques: la myographie tensométrique (isométrique) par fil (ou broches) et la myographie par pression. Dans un système de myographie filaire, le vaisseau sanguin est étiré entre deux fils ou broches, ce qui permet la mesure isométrique du développement de la force ou de la tension dans la paroi du vaisseau sanguin, tandis que la myographie par pression est une plate-forme préférable pour les mesures de la réactivité vasculaire dans les petites artères de résistance, où les changements de pression artérielle sont considérés comme le principal stimulus pour les changements de tonus vasculaire et de vasomotion. Il est généralement admis que, pour les petites artères de résistance telles que les artères mésentériques et cérébrales, la myographie par pression crée une condition plus proche des conditions physiologiques du corps humain. Le myographe à petite chambre peut être utilisé pour les vaisseaux de très petits diamètres (200-500 μm) à des vaisseaux beaucoup plus grands tels que l’aorte.
Alors que le myographe filaire est un système puissant pour enregistrer la tension des vaisseaux sanguins dans des conditions isométriques, le myographe à pression est un système plus approprié pour mesurer les changements de diamètre des vaisseaux en réponse aux changements des conditions isobares. Les changements de diamètre dans le vaisseau en réponse aux changements de pression ou de débit sont beaucoup plus importants dans une petite artère musculaire (artériole) par rapport aux grandes artères élastiques telles que l’aorte. Pour ces raisons, le myographe de pression est considéré comme un meilleur outil pour les petits vaisseaux sanguins avec une vasoréactivité substantielle1. L’une des autres forces pratiques de la myographie tensométrique à chambres multi-chambres à petits volumes est que l’on peut discerner la contribution de différents mécanismes à la réactivité vasculaire en étudiant plusieurs (jusqu’à quatre) segments de la même artère et du même animal pour réduire la variabilité et produire des données robustes et concluantes. Il est également relativement facile à configurer et à entretenir techniquement. Les vaisseaux de presque toutes les tailles peuvent être étudiés avec un myographe filaire. C’est une solution plus rentable pour évaluer la fonction vasculaire et une bonne alternative à la myographie par pression dans les expériences où la longueur du vaisseau disséqué est trop courte pour le protocole myographique de pression.
Ce rapport fournit un protocole détaillé pour l’évaluation de la fonction endothéliale dans l’anneau aortique thoracique isolé de souris à l’aide de broches de montage dans la technique de myographie tensométrique à chambre de petit volume utilisant le système myographique à plusieurs chambres DMT-620 (DMT-USA). Ce protocole utilise une souris C57BL6 mâle âgée de 6 mois avec un poids moyen compris entre 25 et 35 g. Heureusement, ce protocole peut être appliqué à divers types et poids d’animaux, compte tenu de la vaste gamme de types de navires et de diamètres pour lesquels ce protocole peut être utilisé.
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Protocol
Toutes les interventions chirurgicales et les soins aux animaux ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation et de soins des animaux (IACUC) de l’Université Midwestern (IACUC # AZ-3006, AZ-2936).
1. Préparation du tampon
REMARQUE: Bien que le tampon de solution saline physiologique HEPES (HEPES-PSS) soit stable à 4 ° C pendant 7 jours, il est recommandé que tous les tampons soient fraîchement fabriqués le jour de chaque expérience. Tous les autres réactifs et agonistes doivent être préparés fraîchement pour chaque expérience. Le tampon HEPES-PSS utilisé dans ce protocole est un tampon bien établi pour les études vasculaires ex vivo qui s’est avéré cytoprotecteur pendant plus de 12 heures tout en préservant les réponses vasodilatatrices du vaisseau - l’objectif principal de ce protocole expérimental 6,7.
- Préparer la solution HEPES-PSS (pH 7,4) comme suit : Mélanger 10 mmol/L de HEPES, 6 mmol/L de glucose, 1,5 mmol/L de CaCl 2, 130 mmol/L de NaCl, 4 mmol/L de KCl, 4 mmol/L de NaHCO3, 1,2 mmol/L de MgSO4, 1,2 mmol/L KH2 PO4 et 0,03 mmol/L d’EDTA.
- Préparez le tampon HEPES-PSS high K+ . Ceci est identique à la solution HEPES-PSS, sauf qu’il contient 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L glucose, 1 mmol / L MgCl2, 80 mmol / L KCl et ne contient pas de MgSO4 et EDTA.
2. Préparation de l’unité myographique
- Allumez et réglez le bain-marie à 37 °C. Assurez-vous d’un niveau d’eau approprié.
- Placez deux béchers étiquetés de manière appropriée dans le bain-marie, l’un avec 600 ml de solution HEPES-PSS et l’autre avec 150 ml de solution à haute teneur en K+ .
- Aérer un bécher de 300 mL de solution HEPES-PSS avec du gaz carbogène (5% CO 2 et 95% O2) pendant au moins 10 min.
- Ajouter 30 mL de la solution HEPES-PSS aérée dans un tube à centrifuger de 50 mL, étiqueter adéquatement (cage thoracique, numéro d’identification de la souris) et la placer sur de la glace. Conserver le reste de la solution HEPES-PSS aérée sur de la glace pour l’utiliser pendant le processus de dissection aortique.
- Allumez l’unité myographique à quatre chambres; ajouter 6 mL de solution HEPES-PSS dans chaque chambre myographique et régler la chaleur à 37 °C. Laisser aérer la solution dans chaque chambre (avec un mélange de carbogène) pendant 30 min et vérifier que les chambres ont atteint les 37 °C désirées (utilisez cette période d’attente pour disséquer l’aorte de la souris).
- Allumez le matériel d’acquisition de données myographiques et l’ordinateur.
3. Isolation de l’aorte de la souris
- Anesthésier la souris expérimentale avec une inhalation d’isoflurane à 5% et euthanasier par luxation cervicale (une souris mâle C57BL/6J âgée de 6 mois est utilisée pour cette démonstration).
- Posez la souris sur une planche chirurgicale en décubitus dorsal et fixez les appendices à la planche à l’aide de ruban chirurgical.
- Vaporisez la région abdominale avec de l’alcool à 70% afin que la fourrure soit complètement mouillée et que les poils lâches / secs ne pénètrent pas dans l’incision. Essuyez délicatement l’excès de solution.
- Utilisez des pinces pour localiser et isoler la peau abdominale juste inférieure au processus xiphoïde du sternum.
- Créez une tension en soulevant la peau vers le haut. Faites une coupe émoussée à l’aide de ciseaux et retirez la peau superficielle, exposant la cavité thoracique.
- Soulevez le processus xiphoïde et faites des incisions latérales juste inférieures au processus le long des marges sous-costales.
- Étendez les incisions latérales crâniennes pour enlever la partie antérieure de la cage thoracique.
- Retirez la cage thoracique en faisant une coupure émoussée à travers la colonne vertébrale, sous le diaphragme et dans le cou.
REMARQUE : Les chercheurs peuvent également retirer l’aorte directement de l’animal, mais il faut prendre soin de protéger le vaisseau et d’éliminer le sang coagulé de l’aorte. Ce protocole utilise l’exemple du retrait de la cage thoracique et du nettoyage et de la dissection soigneux de l’aorte. Avec de la pratique, cette méthode peut être effectuée rapidement et efficacement et est bénéfique pour préserver le tissu supplémentaire pour d’autres études telles que l’immunohistochimie, l’histologie et le transfert Western. - Transférer la cage thoracique dans une boîte de Petri transparente recouverte d’élastomère de silicone remplie d’un tampon HEPES-PSS aéré glacé et l’épingler des deux côtés.
REMARQUE: Utilisez un kit d’élastomère de silicone (Tableau des matériaux). Mélanger la base et l’agent de durcissement (10:1 en poids), puis verser dans une boîte de Petri en verre, et laisser durcir pendant 24 h à 25 °C. - Placer la boîte de Petri sous un microscope à zoom stéréo, couper et retirer doucement le cœur et l’aorte attachée de la cage thoracique, puis transférer dans une boîte propre et transparente recouverte d’élastomère de silicone (Figure 1).
- Ensuite, retirez doucement la graisse et le tissu conjonctif et tout sang coagulé de l’aorte. À l’aide de petits ciseaux tranchants, disséquez et isolez toute l’aorte en partant de la zone de l’arc jusqu’à la partie inférieure de l’aorte descendante. Rappelez-vous que l’arc aortique ne convient pas aux expériences de myographie mais peut être utilisé pour des études histologiques.
- Utiliser une solution HEPES-PSS aérée à froid tout au long de la dissection. Changez la solution toutes les 10 minutes ou lorsque la visibilité est compromise, selon la première éventualité. Il est recommandé que chaque anneau aortique soit monté sur la chambre myographique dans les 20 minutes suivant la dissection (max 60 min).
4. Montage des segments aortiques sur les chambres myographiques
- Couper l’aorte disséquée en quatre segments de 2 mm chacun à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux tranchants. Utilisez la mini-règle dans le plat comme référence.
- Placez la chambre myographique sous le microscope à zoom stéréo pour visualiser facilement les broches et réglez les micromètres de telle sorte que les broches se touchent presque (Figure 2).
- Assurez-vous que les deux broches de maintien des tissus sont correctement alignées.
- Faites attention et évitez de pincer l’aorte lors du montage des segments pour éviter d’endommager l’endothélium.
- Dans les chambres contenant déjà 5 mL de tampon HEPES-PSS chauffé et aéré, faites glisser délicatement chacun des segments aortiques de 2 mm sur les deux broches de montage à l’aide d’une pince. Soyez très doux tout en faisant glisser les segments aortiques sur les broches. La couche endothéliale est très fragile et se détache très facilement du côté luminal.
- Écartez lentement les broches en faisant pivoter le micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre afin que le segment aortique ne glisse pas des broches lorsque vous replacez la chambre dans le myographe (Figure 3).
- Utilisez le graticule oculaire préalablement calibré du microscope à dissection pour mesurer la longueur réelle et précise de l’anneau aortique monté en positionnant le début de la règle à une extrémité du segment (marqué comme extrémité tissulaire α1) et en notant la mesure à l’autre extrémité du segment aortique dans les divisions oculaires (marquées comme extrémité tissulaire α2)8. Ces valeurs seront utilisées lors des étapes de normalisation de la section 5.
- Remettez chaque chambre myographique dans l’unité et commencez à aérer les chambres à 37 °C pendant 30 min.
REMARQUE: Les quatre segments de l’aorte peuvent être utilisés comme répliques pour le même traitement, ou chaque segment de l’aorte peut être utilisé simultanément pour différentes expériences.
5. Normalisation
NOTA : Une procédure de normalisation est nécessaire pour s’assurer que les conditions expérimentales sont correctement normalisées et que les données recueillies sont fiables et reproductibles. La « CI1/IC100 », ou « facteur de normalisation », est définie comme le rapport de la circonférence interne de l’artère à laquelle il est possible d’enregistrer la réponse maximale à un vasoconstricteur (p. ex. 60 mM KCl) divisée par la circonférence interne à laquelle une pression de paroi transmurale de 100 mm Hg (c.-à-d. IC100) est enregistrée. Par conséquent, en multipliant la CI100 par ce rapport, nous pouvons déterminer la circonférence interne de l’artère à laquelle une réponse optimale (c.-à-d. IC1) peut être établie.
- Réglez le micromètre de telle sorte que les broches se touchent presque.
- Réglez les forces à zéro pour toutes les chambres myographiques et laissez-les s’équilibrer pendant encore 1-2 minutes.
- Notez la première lecture de diamètre à partir du micromètre. C’est la position où l’écart entre deux broches est considéré comme nul (nécessaire pour l’étape 5.7.).
- Ouvrez les paramètres de normalisation du logiciel d’acquisition de données dans le menu déroulant DMT ; Un nouvel écran s’ouvrira avec les paramètres et valeurs par défaut suivants :
Calibrage de l’oculaire (mm/div) : 0,36
Pression cible (kPa): 13.3
IC1/IC100 : 0,9
Durée(s) moyenne(s) en ligne : 2
Délai(s) : 60
Lire le son à la fin du délai (case à cocher)
Sons (avec menu déroulant ou fonction Parcourir) - En fonction du nombre de segments, choisissez le nombre correct de canaux disponibles à l’écran et démarrez l’enregistrement du graphique.
- Utilisez le menu déroulant pour sélectionner le canal qui vous intéresse; L’écran de normalisation apparaîtra.
- Entrez les valeurs constantes dans les fenêtres comme suit : Points d’extrémité tissulaires α1; Extrémités tissulaires α2; Diamètre de la broche : 40 μm ; Valeur de lecture micrométrique de l’échelle micrométrique analogique.
- Pour enregistrer le premier point (la valeur initiale de X ou X0), cliquez sur le bouton Ajouter un point . Après un délai de 60 s, les valeurs de la force et de la pression effective (ERTP) correspondant à ce micromètre seront affichées et la case de lecture du micromètre deviendra active et disponible.
- Commencez à étirer le récipient en tournant le micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Utilisez la boîte de lecture micrométrique pour entrer la valeur et cliquez sur le bouton Ajouter un point (il y aura à nouveau un délai de 60 s).
- Continuez à étirer le récipient et continuez à ajouter des valeurs micrométriques jusqu’à ce que la valeur de Micromètre X1 soit visible, qui est le réglage micrométrique calculé utilisé pour étirer le récipient à son IC1.
- Réglez le micromètre sur la valeur X1.
REMARQUE: La tension normalisée (optimale) pour une souris C57BL6 âgée de 6 mois est de 6 mN. - Après la normalisation, laissez le tissu reposer et équilibrer pendant 30 minutes. Il n’est pas nécessaire de changer la solution HEPES-PSS dans les chambres à ce stade.
REMARQUE : Chaque chambre peut contenir 8 mL de solution. Ce protocole est écrit avec l’utilisation de 5 mL, ce qui permet une immersion complète du vaisseau et des broches de montage. - Utilisez le temps de repos et d’équilibrage pour préparer ce qui suit.
- Préparer le matériel de travail des dilutions en série d’acétylcholine dans l’eau distillée (eau d’osmose inverse) des concentrations les plus faibles aux concentrations les plus élevées comme suit : 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 500 μM, 500 μM et 1 mM. Gardez tous les tubes sur la glace pendant toute la durée de l’expérience.
- Préparer une solution de travail de 100 mM d’ester méthylique de N-nitro-L-arginine (L-NAME) dans de l’eau bidistillée et conserver la solution sur la glace pendant toute la durée de l’expérience.
- Préparer la dose sous-maximale de phényléphrine (10 μM) déterminée dans une série distincte d’expériences.
REMARQUE: La période d’équilibration est nécessaire pour que le segment des vaisseaux sanguins s’adapte au nouvel environnement dans la chambre myographique, réinitialise les gradients ioniques et atteigne un niveau stable de tension passive avant d’être soumis à différents défis pharmacologiques et mécaniques.
6. Mesure de la vasorelaxation dépendante de l’endothélium dans les anneaux aortiques
- À la fin de la période d’équilibration de 30 minutes, égoutter les chambres et ajouter 5 mL de solution HEPES-PSS fraîche, chaude et aérée dans chaque chambre. Vidangez une chambre à la fois pour minimiser l’exposition des tissus à l’air. La vidange des chambres est effectuée à l’aide d’une pompe à vide réglée à 60 cmHg et les valves myographiques réglées à un délai de 6 s pour assurer l’élimination des 5 mL de solution.
- Si nécessaire, réajuster les mesures de force pour lire la tension optimale de 6 mN. Il est très important de réajuster la force à une tension optimale pendant chaque période d’incubation, ainsi qu’avant chaque nouvelle série d’expériences. Laissez reposer le tissu pendant encore 15-20 min.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition de données, modifiez les numéros de suivi de 50:1 à 500:1, puis appuyez sur Démarrer. À ce stade, la force enregistrée pour chaque chambre peut être vue dans le logiciel.
- Immédiatement avant le début d’une nouvelle expérience, assurez-vous d’ajouter l’étiquette appropriée sur le logiciel d’acquisition de données.
- Vidangez les chambres une fois de plus avant d’ajouter 5 ml de solution à haute teneur en K+ dans chaque chambre. Ceci est approprié pour tester la viabilité du tissu aortique et l’intégrité de la réponse contractile du muscle lisse à la dépolarisation de la membrane avant d’utiliser le tissu pour tout autre protocole expérimental. Cela aide à déterminer si le segment de vaisseau sanguin est utilisable pour d’autres expérimentations.
- Vidangez à nouveau les chambres dès que la réponse contractile à la solution à K+ élevé atteint un plateau pour la génération de force (Figure 4).
REMARQUE: Ne laissez pas la solution élevée de K+ dans les chambres pendant plus de 3 minutes, car cela endommagerait le tissu. - Laver le mouchoir avec la solution HEPES-PSS 3x. Ajouter 5 mL de solution à haute teneur en K+ dans chaque chambre. Vidangez les chambres dès que la réponse contractile à la solution de K+ élevé atteint un plateau pour la génération de force et lavez le tissu 3x avec HEPES-PSS avant de laisser le tissu reposer pendant encore 15 minutes.
REMARQUE: Dans certains laboratoires, les segments sanguins sont soumis à une solution élevée de K + trois fois consécutives pour assurer la variabilité du vaisseau sanguin avant de commencer les expériences myographiques. Dans ce protocole, les segments aortiques nouvellement isolés sont soumis deux fois à une solution élevée de K+ avant d’utiliser le tissu pour d’autres expériences. Il est important de maintenir cette cohérence dans toutes les expériences. - Utiliser la moyenne des deux pics enregistrés de développement de force (force de contraction) en réponse à une solution élevée de K+ pour normaliser les valeurs enregistrées en réponse à d’autres agents vasoconstricteurs et vasodilatateurs utilisés dans l’expérience.
- Reposer le tissu pendant 15-20 min.
- Pré-contracter les segments aortiques avec l’agent vasoconstricteur phényléphrine (PE) à une dose inférieure à la dose maximale déjà établie (concentration finale de 10 μM dans la chambre).
REMARQUE : La dose sous-maximale de phényléphrine (10 μM) a été déterminée dans une série distincte d’expériences, où les segments aortiques ont été soumis à des concentrations croissantes de solution de phényléphrine à des concentrations finales de 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM et 50 μM. En conséquence, il a été déterminé qu’une concentration finale de 10 μM de phényléphrine pourrait générer la force de contraction inférieure au maximum (90% de la force maximale) dans les segments aortiques de 2 mm, c’est-à-dire juste avant que la force de contraction n’atteigne un plateau. La raison de l’utilisation de la concentration inférieure maximale de phényléphrine est d’éviter les problèmes liés à la saturation du tissu aortique ou à la désensibilisation à l’agoniste vasoconstricteur. - Laisser la courbe de contraction induite par le PE atteindre un plateau pour le développement de la tension (force) (Figure 5).
- À un plateau de développement de tension à la phényléphrine, effectuer la courbe dose-réponse de l’acétylcholine en ajoutant 5 μL de doses croissantes de solutions mères d’acétylcholine à intervalles de 3 minutes afin d’établir les concentrations finales d’acétylcholine dans la chambre myographique comme suit: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM et 1 μM (Figure 6).
NOTE: Après avoir ajouté chaque dose d’acétylcholine, attendez au moins 3 minutes (pour que la tension atteigne un plateau) avant d’ajouter la dose suivante. - À chaque étape, pipeter la solution mère d’acétylcholine dans la chambre très lentement et loin des anneaux aortiques pour éviter toute perturbation tissulaire.
- Après avoir terminé l’expérience dose-réponse, égoutter les chambres et laver les segments aortiques avec une solution HEPES-PSS chaude et aérée 3x pour éliminer tout résidu restant du médicament.
- Laissez reposer le tissu pendant 30 minutes avant de commencer les prochaines étapes de l’expérience. La viabilité de l’aorte est vérifiée avant chaque étape expérimentale à l’aide de la solution HEPES-PSS high K+ . Si toutes les étapes de préparation et d’expérimentation sont suivies correctement, la viabilité du tissu aortique restera la même pendant toute la durée de l’expérience (4-6 h).
7. Effets des inhibiteurs généraux de la production de NO sur la vasorelaxation médiée par l’endothélium
- Utilisez le même tissu aortique pour cette partie de l’expérience après avoir soigneusement lavé et laissé reposer les segments pendant au moins 30 minutes.
NOTE: Utilisez le temps de repos de 30 minutes pour préparer une solution de travail de 100 mM d’ester méthylique de N-nitro-L-arginine (L-NAME) dans de l’eau bidistillée et gardez la solution sur glace pendant toute la durée de l’expérience. - Après avoir laissé reposer les segments aortiques pendant 30 min, égoutter les chambres et ajouter une solution fraîche et chaude de K+ (60 mM KCl) à chaque chambre.
REMARQUE: Il est important que, pour chaque partie de l’expérience, le tissu aortique soit mis au défi avec une solution élevée de K+ au moins une fois. Le pic de contraction enregistré sera utilisé pour normaliser les données recueillies au cours de cette partie de l’expérience. - Vidangez à nouveau les chambres dès que la réponse de contraction à une solution élevée de K+ atteint un plateau et lavez le tissu avec la solution HEPES-PSS 3x.
- Afin d’évaluer la contribution de la production de NO à la vasorelaxation induite par l’acétylcholine observée (voir rubrique 6), à ce stade, préincuber les segments aortiques avec un inhibiteur général de la production de NO (L-NAME) en ajoutant 10 μL de la solution mère de travail préparée à 100 mM de L-NAME dans chaque chambre myographique (contenant une solution tampon de 5 mL) afin d’atteindre une concentration finale de 200 μM dans chaque chambre myographique.
NOTE: L-NAME est un inhibiteur non sélectif et puissant de toutes les isoformes de NOS (une enzyme responsable de la production de NO) et, par conséquent, il est considéré comme un outil efficace pour bloquer la production de NO dans la paroi des vaisseaux sanguins9. - Laisser les segments aortiques reposer pendant le temps de pré-incubation avec L-NAME (30 min).
- Ne vous lavez pas à ce stade.
- Sans retirer le L-NAME, ajouter la dose inférieure maximale de phényléphrine (concentration finale de 10 μM) dans la chambre pour induire la contraction aortique.
REMARQUE: En raison de l’action inhibitrice de L-NAME sur la production endogène de NO, le pic nouvellement enregistré pour la contraction aortique induite par la phényléphrine sera beaucoup plus élevé que le pic initial qui a été enregistré avant l’incubation du tissu avec L-NAME. Ceci est attendu en raison de l’effet de L-NAME sur la production basale de NO dans la paroi aortique, ce qui conduit à une génération de force plus élevée (en raison de la génération de force contractile plus élevée par le muscle lisse). - Attendez que la courbe de contraction induite par la phényléphrine atteigne un plateau pour le développement de la tension (force contractile).
- À ce stade, ajouter de l’acétylcholine à la chambre myographique pour atteindre une concentration finale de 500 nM (c’est la concentration inférieure maximale d’acétylcholine qui a été établie lors des expériences décrites à la section 5. du protocole).
- Attendez quelques minutes pour enregistrer tout changement possible dans le développement de la force jusqu’à ce que le plateau formé soit stable (figure 7).
REMARQUE: En raison de l’action inhibitrice de L-NAME sur la capacité de la couche endothéliale à produire du NO en réponse à l’acétylcholine, on ne s’attend pas à voir de changements dans la génération de force enregistrée en réponse à la phényléphrine, car le NOS endothélial aortique (eNOS) n’est pas en mesure de générer du NO en réponse à l’application d’acétylcholine. - Vidangez les chambres et lavez les tissus avec une solution HEPES-PSS chaude et aérée 3x.
8. Contribution de la couche endothéliale à la vasorelaxation aortique
- Afin de souligner le rôle de la couche endothéliale dans la vasorelaxation aortique, testez la vasorelaxation induite par l’acétylcholine dans les segments aortiques dénudés par l’endothélium, dans lesquels les couches endothéliales sont enlevées.
- Placez la chambre myographique sous le microscope et passez doucement un petit fil (le même fil que celui utilisé pour la myographie métallique peut être utilisé ici) à travers la lumière de l’aorte. Déplacez doucement le fil à travers la lumière (mouvement circulaire doux) pendant une courte période de temps. Cela suffit pour enlever l’endothélium ou intima.
- Coupez l’aorte en anneaux aortiques de 2 mm et montez ces anneaux sur la chambre myographique comme décrit précédemment.
- Réglez la tension optimale à 6 mN et laissez reposer le tissu pendant 30 min dans un tampon HEPES-PSS aéré et chaud
- À la fin de la période d’équilibration de 30 minutes, vider les chambres et ajouter 5 mL de solution HEPES-PSS fraîche, chaude et aérée dans chaque chambre.
- Zéro la force pour toutes les chambres myographiques en tournant le micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
- Faites tourner lentement le micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour augmenter la distance entre les broches jusqu’à ce que la force enregistrée atteigne la tension optimale souhaitée pour l’aorte de la souris (6 mN pour l’aorte de souris C57BL/6J). Reposer le tissu pendant encore 15-20 minutes à la tension optimale (6 mN).
- Vidangez les chambres 1x de plus avant d’ajouter 5 mL de solution à haute teneur en K+ dans chaque chambre.
- Vidangez à nouveau les chambres dès que la réponse de contraction à une solution élevée de K+ atteint un plateau et lavez le tissu avec la solution HEPES-PSS 3x. Reposer le tissu pendant 15-20 min
- Pré-contracter les segments aortiques avec l’agent vasoconstricteur phényléphrine (concentration finale de 10 μM dans la chambre).
NOTE: En raison de l’élimination de l’endothélium, la production basale de NO dans la paroi aortique est considérablement diminuée; Par conséquent, le pic de contraction induite par la phényléphrine (le pic de génération de force) devrait être plus élevé dans le tissu aortique dépourvu de couche endothéliale. - Lorsque la force induite par la phényléphrine atteint un plateau, ajouter la concentration inférieure maximale d’acétylcholine à la chambre myographique pour obtenir une concentration finale de 500 nM.
REMARQUE: Si l’élimination de la couche endothéliale est effectuée correctement, il n’y aura aucun changement dans la force induite par la phényléphrine enregistrée, car la production de NO induite par l’acétylcholine par l’endothélium aura été diminuée en raison de l’élimination de la couche endothéliale. La trace enregistrée sera très similaire à celle observée en présence de L-NAME (section 7.). - Attendez 3 minutes pour vous assurer que le plateau enregistré pour le développement de la force induite par la phényléphrine ne change pas avant de terminer l’expérience (Figure 8).
REMARQUE: Si l’application d’acétylcholine provoque une baisse de la contraction induite par la phényléphrine pendant le plateau, cela indique que la couche endothéliale n’a pas été complètement éliminée.
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Representative Results
Le protocole de myographie tensométrique à petite chambre expliqué ici est la méthode standard pour mesurer la réactivité vasculaire dans les petites et grandes artères et permet des mesures simultanées de la réactivité vasculaire dans jusqu’à quatre segments de vaisseaux sanguins du même petit animal de laboratoire expérimental. Dans ce rapport, nous utilisons spécifiquement le système pour mesurer la fonction endothéliale dans l’aorte isolée de la souris (Figure 1). Dans ce protocole, des segments aortiques isolés sont montés sur une petite chambre d’orgue (Figure 2) entre deux petites broches en acier inoxydable (Figure 3). La chambre myographique peut contenir jusqu’à 8 mL de solution tampon et fournir un environnement semi-physiologique pour les vaisseaux isolés pendant la durée des expériences. Il est très important qu’avant chaque expérience, la viabilité de chaque segment isolé soit testée et vérifiée. Le protocole standard pour établir l’intégrité et la viabilité de chaque segment de vaisseau isolé consiste à défier le tissu avec une concentration élevée de chlorure de potassium pour induire une dépolarisation de la membrane musculaire lisse. Dans le scénario où le récipient isolé est sain et réactif, nous serions en mesure d’enregistrer la génération de force contractile sur l’écran (Figure 4). Le pic de la force enregistrée est ensuite utilisé pour normaliser la génération de force pour le même segment en réponse aux agonistes utilisés pendant le protocole (p. ex., phényléphrine). Afin de mesurer la vasorelaxation médiée par l’endothélium, il est nécessaire de pré-contracter le tissu aortique avec la concentration inférieure à maximale (10 μM) de phényléphrine, ce qui provoque une contraction à médiation musculaire lisse et une génération de force (Figure 5). Lorsque la contraction induite par la phényléphrine atteint un plateau (Figure 6), des doses croissantes d’acétylcholine sont appliquées en plusieurs étapes pour atteindre la vasorelaxation maximale dans le segment isolé (Figure 6). Le niveau de relaxation des vaisseaux est une mesure indirecte de la production d’oxyde nitrique médiée par l’endothélium. Pour confirmer en outre que la vasorelaxation induite par l’acétylcholine dans les anneaux aortiques est due à la production d’oxyde nitrique, les segments aortiques sont prétraités avec un inhibiteur général de la production d’oxyde nitrique (200 μM de L-NAME) pendant 30 minutes avant l’application de phényléphrine. Comme le montre la figure 7, L-NAME est capable de bloquer complètement la vasorelaxation induite par l’acétylcholine dans l’aorte précontractée, soulignant le fait que l’acétylcholine induit une vasorelaxation aortique en augmentant la production d’oxyde nitrique. D’autre part, l’élimination de la couche endothéliale des segments aortiques bloque également la vasorelaxation induite par l’acétylcholine, soulignant le rôle que joue l’endothélium dans la relaxation des vaisseaux sanguins (Figure 8).
Figure 1 : Vue anatomique globale du cœur, de la racine aortique et de l’aorte descendante isolée d’une souris témoin âgée de 6 mois. Après avoir retiré la cage thoracique de la souris, le cœur et l’aorte sont isolés de la cage thoracique et transférés dans une boîte de Petri propre recouverte d’élastomère de silicone. Avant d’isoler l’aorte, il est important d’enlever toute la graisse et le tissu conjonctif et tout caillot sanguin de la lumière de l’aorte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Image représentative d’une chambre de l’unité myographique montrant les broches de montage de 200 μm. Comme indiqué, les deux broches à l’intérieur de la chambre myographique se touchent à peine. Avant d’utiliser la chambre, il est essentiel de s’assurer que les broches sont correctement alignées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Ancréage des segments aortiques sur la chambre myographique. Un segment aortique de souris de 2 mm isolé d’une souris C57BL/6 âgée de 6 mois est maintenu par deux broches à l’intérieur d’une chambre myographique. Ceci est réalisé en faisant glisser doucement l’aorte sur les deux broches de montage à l’aide de pinces. La boîte pointillée rouge montre l’image agrandie du segment aortique de 2 mm qui est monté entre deux broches à l’intérieur de la chambre myographique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Contraction aortique due à la dépolarisation de la membrane musculaire lisse. Image représentative montrant la trace de la contraction aortique de la souris (génération de force) en réponse à une concentration élevée de K+ (60 mM KCl) qui induirait une dépolarisation et une contraction de la membrane musculaire lisse dans la couche médiale de l’aorte. L’application d’une solution à haute teneur en K+ est immédiatement suivie de trois lavages consécutifs à l’aide d’une solution HEPES-PSS chaude et aérée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ill. 5 : Contraction aortique en réponse à l’agent vasoconstricteur phényléphrine. Trace myographique représentative montrant la génération de force (contraction) par l’anneau aortique en réponse à la concentration inférieure maximale de phényléphrine (10 μM). Comme on le voit, le pic de contraction induite par la phényléphrine finit par atteindre un plateau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Effets dose-réponse de l’acétylcholine sur l’anneau aortique précontracté. Trace myographique représentative montrant l’effet vasodilatateur dose-réponse (50 pM-1 μM) du neurotransmetteur vasodilatateur acétylcholine sur un anneau aortique pré-contracté de 2 mm. Le cycle aortique est pré-contracté avec 10 μM de phényléphrine avant l’application de l’acétylcholine. La première dose d’acétylcholine est ajoutée lorsque la tension induite par la phényléphrine atteint un plateau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Effets d’un inhibiteur général de la production de NO (L-NAME) sur la vasorelaxation médiée par l’endothélium dans l’aorte de souris. Trace myographique représentative montrant que la préincubation de segments aortiques avec un inhibiteur général de la production de NO (L-NAME, concentration finale de 200 μM) bloque la vasodilatation induite par l’acétylcholine dans un anneau aortique précontracté. Cela est dû à l’inhibition de la production de NO par l’endothélium due à l’action inhibitrice de L-NAME sur eNOS. L’acétylcholine a été ajoutée au segment aortique précontracté à la concentration inférieure à 500 nM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Effets de l’élimination mécanique de l’endothélium sur la vasorelaxation médiée par l’endothélium dans l’aorte de souris. Trace myographique représentative montrant que l’élimination de l’endothélium des segments aortiques à l’aide de la dénudation au fil bloque la vasodilatation induite par l’acétylcholine dans un anneau aortique précontracté. Cela est dû à l’inhibition de la vasorelaxation médiée par l’endothélium. L’acétylcholine a été ajoutée au segment aortique précontracté à la concentration inférieure à 500 nM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le domaine de la biologie vasculaire s’appuie fortement sur des outils qui aident les chercheurs à évaluer l’intégrité fonctionnelle et structurelle de la paroi des vaisseaux sanguins. Il exige également une attention particulière sur les interactions directes et indirectes entre les trois couches des vaisseaux sanguins: l’intima, les médias et l’adventice. Parmi ces trois couches, l’intima est formé d’une monocouche de cellules endothéliales et a une fonction très importante dans la régulation de la santé vasculaire et de l’hémostase.
Il est bien établi que tout dommage à la couche endothéliale peut affecter négativement sa capacité à libérer du NO et d’autres facteurs vasodilatateurs, entraînant une dérégulation de la fonction vasculaire, observée dans divers troubles vasculaires tels que l’athérosclérose, l’anévrisme et la vascularite10,11,12. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents qui contrôlent la fonction endothéliale normale et d’évaluer la fonction vasodilatatrice et l’intégrité de l’endothélium dans la paroi vasculaire, il est impératif d’utiliser un système expérimental standard qui imite les conditions physiologiques in vivo.
Pour les grosses artères, telles que l’aorte, la myographie tensométrique (isométrique) à petite chambre est largement reconnue comme un outil fiable qui crée les meilleures conditions quasi physiologiques disponibles pour le vaisseau sanguin dans un environnement ex vivo . Le système permet également de maintenir la viabilité des tissus pendant une période considérablement longue (jusqu’à 6-8 h) en laboratoire, ce qui fait de la technique un outil précieux et polyvalent. Un autre avantage est que la chambre myographique permet de conserver les anneaux des vaisseaux sanguins et de les réutiliser pour différentes expériences consécutives, ce qui en fait une approche rentable tout en réduisant le besoin d’un grand nombre de souris expérimentales. Jusqu’à quatre segments de vaisseaux sanguins peuvent être testés simultanément à l’aide d’un système myographique à quatre chambres, ce qui augmente la cohérence tout en réduisant les variations entre les expériences.
Divers outils pharmacologiques et mécaniques peuvent être utilisés pour étudier la fonction de la couche endothéliale dans les vaisseaux sanguins. Le principal marqueur d’un endothélium fonctionnel est la production normale de NO, qui est connu comme l’agent vasodilatateur le plus important produit et libéré par la couche endothéliale. Le dysfonctionnement endothélial est principalement associé à une baisse significative de la production de NO et il a été démontré qu’il est impliqué dans la progression de différents troubles vasculaires tels que l’hypertension, la thrombose et l’athérosclérose.
Dans le lit vasculaire, la production de NO est principalement contrôlée par des changements dans le flux sanguin et la pression, ou par d’autres événements intracellulaires qui peuvent entraîner des modifications de la concentration de calcium cytoplasmique ou l’activation des voies de signalisation en réponse aux hormones et aux facteurs de croissance13,14. Les changements dans la production de NO sont considérés comme l’un des marqueurs précoces et fiables de la dysfonction endothéliale, et ils sont généralement détectables tôt au cours de la progression des troubles cardiovasculaires. Quel que soit le modèle de la maladie, les biologistes vasculaires s’intéressent beaucoup aux outils et aux tests qui permettent de mesurer la fonction endothéliale. Il est particulièrement important que l’on puisse différencier la contribution des différentes couches du vaisseau sanguin en utilisant une plate-forme qui imite les conditions physiologiques.
Dans un myographe à petite chambre, les chercheurs peuvent utiliser des outils pharmacologiques et mécaniques pour mesurer la fonction endothéliale dans un environnement étroitement contrôlé. À l’intérieur de la chambre myographique, un environnement artificiel est créé qui peut soutenir le fonctionnement normal du vaisseau sanguin. Dans un tel environnement artificiel, étant donné que les segments de vaisseaux sanguins isolés ne sont pas soutenus par le tissu conjonctif environnant et d’autres organes, il est important de déterminer la tension passive optimale à laquelle les segments isolés peuvent générer la contraction maximale possible en réponse aux vasopresseurs. À la tension optimale, on peut mesurer la réponse contractile maximale normale aux agents vasoconstricteurs tels que la phényléphrine ou la noradrénaline pour tester l’intégrité structurelle et fonctionnelle de la couche musculaire lisse de la paroi des vaisseaux sanguins. En laboratoire, il a été déterminé que la tension passive de 6 mN est une tension propre pour les segments aortiques de souris de 2 mm15. Cependant, la tension passive optimale doit être déterminée pour différents types d’artères chez différentes espèces16.
De plus, avant d’effectuer des expériences avec des vaisseaux sanguins isolés, il est impératif de tester la viabilité des anneaux isolés pour s’assurer qu’ils répondent aux critères d’inclusion et d’exclusion des tissus viables et utilisables. Ceci est généralement réalisé en soumettant les anneaux isolés à une solution de K+ à forte concentration (60 mM KCl). Il en résulte une dépolarisation de la membrane musculaire lisse due à l’ouverture des canaux calciques voltage-dépendants (VGCC), conduisant à la contraction des muscles lisses et à la vasoconstriction aortique. Cette méthode est utilisée pour valider la viabilité des segments aortiques avant d’utiliser ces segments pour d’autres expériences.
D’autre part, des agents vasodilatateurs tels que l’acétylcholine peuvent être utilisés pour tester les propriétés fonctionnelles de la couche endothéliale. Si la couche d’endothélium est intacte et fonctionnelle, une concentration inférieure à maximale d’acétylcholine peut induire une relaxation dans un segment de vaisseau sanguin pré-contracté17. L’ampleur de la relaxation induite par l’acétylcholine est une indication du niveau de libération de NO par la couche endothéliale. Tout dommage à la couche endothéliale (mécanique ou fonctionnel) aura un impact sur la production de NO et la réponse vasodilatatrice du vaisseau. Dans ce protocole, les données fournies montrent que l’acétylcholine peut induire une relaxation dans l’aorte de souris précontractée de manière dose-dépendante, avec une relaxation inférieure au maximum obtenue à la concentration finale de 500 nM (Figure 6).
Dans certaines expériences, les chercheurs s’intéressent à la mesure de la réponse directe du muscle lisse au vasodilatateur NO. Étant donné que ces expériences se concentrent uniquement sur la fonction musculaire lisse, il existe un protocole en place qui permettrait aux chercheurs de contourner la contribution de l’endothélium en enlevant (dénudant) la couche d’endothélium du segment des vaisseaux sanguins. L’endothélium peut être retiré par diverses méthodes, y compris l’air, le roulement entre les doigts ou l’enlèvement par fil. Dans de tels contextes expérimentaux, le vaisseau sanguin dénudé (sans couche endothéliale) est soumis à des donneurs de NO tels que la nitroglycérine et le nitroprussiate de sodium. Cela permet de déterminer si la voie de signalisation cyclique GMP-protéine kinase G du muscle lisse qui répond au NO est intacte et fonctionnelle 7,18. Ce manuscrit explique comment l’ablation de la couche endothéliale dans le segment aortique isolé bloque complètement les effets vasodilatateurs de l’acétylcholine, soulignant l’importance de la libération de NO dans la relaxation et la vasodilatation des vaisseaux sanguins (Figure 8).
Bien que les techniques de myographe au fil et tensométrique aient une grande utilité dans les expériences de biologie vasculaire, il convient de noter les limites potentielles. Plus précisément, le système tensométrique a des limites de taille des tissus (c.-à-d. un système vasculaire plus petit). De plus, la nature ex vivo de cette technique ne permet pas de manipuler la pression et le débit intraluminaux pour un mimétisme plus précis de la fonction vasculaire in vivo et des paramètres hémodynamiques. Les installations de myographe de pression tiendraient en fait compte de ces variables et simuleraient la dynamique vasculaire en temps réel tout en permettant l’utilisation d’artères de résistance plus petites. En outre, les expériences de myographe à fil ne peuvent pas reproduire complètement les conditions physiologiques ou modéliser avec précision les interactions entre le sang circulant, les parois des vaisseaux et les tissus environnants, qui jouent également un rôle important dans la régulation de la fonction vasculaire dans le corps.
Quel que soit le protocole expérimental utilisé dans les expériences de myographie ou le vasoconstricteur / vasodilatateur sélectionné dans l’expérience, le système de myographie à petite chambre fournit une plate-forme semi-physiologique fiable, reproductible et stable pour mesurer la réactivité des vaisseaux sanguins et l’intégrité fonctionnelle. Bien que ce rapport se concentre uniquement sur la mesure de base de la fonction endothéliale, le système de myographie peut être utilisé pour évaluer de nombreuses autres propriétés fonctionnelles du vaisseau sanguin, telles que la relation stress/déformation, la résistance de la paroi vasculaire, le point de rupture et la contraction passive et active, pour n’en nommer que quelques-unes. Cela souligne la valeur du système myographique en tant qu’outil fiable dans le domaine de la biologie vasculaire.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health (R15HL145646) et le Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
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