Summary
已建立的免疫化学方法 在体内 测量肽递质,依靠微透析或体液抽取来获得样品进行离线分析。但是,这些都受到时空限制。本方案描述了克服现有技术局限性的电容式免疫探针生物传感器的制造和应用。
Abstract
在 体内 测量与疾病进展评估相关的生物标志物的能力是科学界和医学界非常感兴趣的。从当前测量某些生物标志物的方法获得的结果的分辨率可能需要几天或几周才能获得,因为它们在空间和时间上的分辨率都受到限制(例如,通过酶联免疫吸附测定[ELISA],高效液相色谱[HPLC]或质谱分析的间质液的流体室微透析);因此,他们对及时诊断和治疗的指导被打乱了。在本研究中,报道了通过使用电容式免疫探针生物传感器(CI探针) 在体内 检测和测量肽递质的独特技术。描述了这些探针的制造方案和 体外 表征。提供交感神经刺激诱导的神经肽Y(NPY) 在体内 释放的测量。NPY释放与去甲肾上腺素的交感神经释放相关,以供参考。数据证明了一种 在体内快速和局部测量神经肽的方法。未来的应用包括术中实时评估疾病进展和基于微创导管的这些探针部署。
Introduction
用于检测和定量生物标志物的几种化学方法通常用于蛋白质化学和临床诊断,特别是在癌症诊断和心血管疾病进展评估中。目前,诸如高效液相色谱(HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和质谱等方法依赖于通过本体流体抽取从血管区1,2,3 或通过微透析从血管区室收集样品。微透析采用已知长度的半透膜管,放置在感兴趣的区域。收集液通过管注水4 分钟以收集样品进行分析5,从而限制了时间分辨率。以这种方式,收集的样品仅提供局部微环境随时间变化的平均值,并且受到灌注速率和收集足够样品体积的限制。此外,这些方法需要汇集实验数据和信号平均;因此,他们可能无法解释受试者之间的可变性。重要的是,样本收集和随后的离线分析之间的时间排除了即时临床干预和治疗。
在本方案中,概述了使用电容式免疫探针生物传感器(CI探针)对特定生物活性肽进行时间分辨电检测。神经肽Y(NPY)从神经节后交感神经元释放,支配脉管系统,心内膜,心肌细胞和心内神经节,是心血管系统中主要的神经调节肽递质6,7,8,9。本文提出的方法旨在测量NPY,并在猪心模型中证明了实验可行性。然而,这种方法适用于任何生物活性肽,其选择性抗体是可用的10。该方法依赖于铂丝探头与功能化尖端11,12处的导电流体之间的电容结。在该应用中,相互作用通过针对靶神经肽(NPY)的抗体介导,该抗体与电极尖端结合,与导电流体环境连接。这种功能化是通过反应性聚多巴胺电沉积到铂丝探针10,13的尖端来实现的。
当抗体功能化探针放置在体内感兴趣的区域 时,诱发的内源性NPY释放导致与探针尖端上的捕获抗体结合,并且电极表面的导电液被NPY蛋白置换。电气环境中的局部变化导致具有高迁移率,高介电流体的位移,具有不动的带静电的分子。这改变了电极 - 流体界面,从而改变了其电容,其被测量为响应阶跃函数命令电位的电荷电流的变化。在每个单独的测量周期之后立即采用负的“复位”电位,通过静电相互作用排斥抗体中结合的NPY,从而清除抗体结合位点以进行后续的测量10。这有效地允许以时间分辨的方式测量NPY。独特的CI技术克服了上述基于微透析的免疫化学方法的局限性,从单个实验中测量动态生物标志物水平,而无需在多个实验上进行数据池或信号平均9,提供近乎实时的数据。此外,将这种方法适应任何感兴趣的生物标志物的能力,在时间分辨和局部尺度上存在适当的抗体,为评估疾病进展和指导治疗干预提供了免疫化学测量的重大技术进步。
用于数据采集和分析的软件是用IGOR Pro(一个完全交互式的软件环境)定制的。模数转换器(A/D)系统在计算机控制下发出命令电压,并从定制放大器获取数据。该放大器具有某些独特的功能。这些器件包括一个反馈电阻(可切换),用于四个采集通道中的每一个,允许选择1 MOhm或10 MOhm反馈电压钳位电路来集成电极的可变性。还构建了一个具有单个磁头和所有四个采集通道的相互接地/参考电路的载物台单元,以将设备放置在单个物理模块中靠近胸部的位置。使用1 MOhm反馈电阻设置来收集所有报告的数据。
滤波器和增益设置由放大器电报,并记录在数据文件中。数据通过10 kHz数字化的2极点模拟贝塞尔滤波器以1 kHz进行滤波。探头和周围导电溶液之间的电位差在探头尖端形成亥姆霍兹电容层。配体与探针尖端的抗体结合导致局部电荷改变,从而导致亥姆霍兹电容的变化。电路容性分量的这种变化导致将探头带到阶跃函数电压协议中的电位所需的注入电荷大小发生变化。因此,特定配体与功能化探头的结合导致电极电容测量的变化,作为峰值电容电流的变化。
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Protocol
所有动物实验均获得加州大学洛杉矶分校动物研究委员会的批准,并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南(第8版,2011年)制定的指南进行。约75公斤的成年雄性约克郡猪用于 体内 研究10。
1. 电容式免疫探针制造和功能化
- 使用手术刀从一端切割25厘米长的全氟烷氧(PFA)涂层铂丝(见 材料表),并从一端剥离约5毫米的PFA涂层,小心不要切入铂丝。
- 将铂线的剥离端插入镀金的 1 mm 公连接器引脚,并使用针尖钳将连接器引脚齿压接到剥离的铂线末端周围(请参见 材料表)。
- 将铂线焊接到镀金连接器引脚上。注意不要使用过量的焊料。
- 通过将50mg多巴胺盐酸盐溶解在50mL的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 6.0)中通过搅拌来制备多巴胺溶液。
- 一旦多巴胺完全溶解,将铂丝的尖端放在含有新鲜制作的多巴胺补充PBS的容器中。将金色连接器引脚插入头台的通道(请参见 材料表)。
- 将 AgCl 圆盘电极(接地电极,参见 材料表)连接到头台的接地通道。将AgCl盘置于含有多巴胺补充PBS和铂丝的容器中;小心只浸没圆盘电极,不要浸没任何长度的导线或焊料。在继续之前,将导线分流器连接到头台的参考通道。
- 打开交互式数据采集软件(见 材料表)。使用以下参数准备锯齿电沉积命令电位协议:起始电位= −0.6 V;端电位 = +0.65 V;扫描速率 = 0.04 V∙s-1;沉积持续时间 = 420 s.开始聚多巴胺沉积方案,确保所有电线正确连接。
- 完成聚多巴胺沉积后,从容器中取出AgCl研磨颗粒和铂丝的尖端,注意不要干扰铂丝电极的尖端。将导线的尖端放入含有PBS(pH 7.4)的微管中2-5分钟,作为制备抗体溶液;确保电线尖端不接触微管的侧面或底部。
注意:抗体溶液可以在聚多巴胺沉积期间制成;然而,不应跳过在聚多巴胺沉积后将铂丝从含多巴胺的容器转移到PBS的微管中。 - 准备抗体溶液。将感兴趣的抗体与PBS(pH 7.4)在适当大小的容器(例如,微管)中以1:20的比例组合。
注:此处使用的抗NPY单克隆抗体(见 材料表)以1mg / mL等分;此处的示例抗体制备是4μL抗体对76μLPBS的抗体。 - 在室温下将铂电极的聚多巴胺沉积尖端浸泡在抗体溶液中至少2小时,再次确保铂丝尖端悬浮在溶液中并且不停留在微管的内表面上。
注意:该技术的最新实施倾向于在此步骤后立即使用铂丝电极,而不是湿式或干式储存以备后用。 - 浸泡在抗体溶液中后,在PBS(pH 7.4)中短暂冲洗新功能化的电容式免疫探针(CI探针)尖端。探头现已准备就绪,可供使用。
2. 用于体外 检测和肽测量的实验装置
- 将CI探针的功能尖端放入流动室中,注意不要以任何方式干扰电极的尖端,因为这样做可能会损坏探头的感觉尖端。
注意:通过将有机硅弹性体(参见 材料表)倒入35毫米培养皿中并在培养皿中心使用细长的卵形空间填充剂来创建流动室。硬化后,从弹性体中去除卵形。然后用Tris缓冲盐水(TBS)补充腔室,并允许流速为3 mL / min。确保流入和流出保持腔室中的液位,以便不观察到过强熔酸盐的潮汐作用。只要CI探头在使用中,流量就必须保持在原位。 - 在第一次实验测试之前,执行TBS标准运行以调节CI探针。设置以下命令电压协议:正阶跃电位= +100 mV;负阶跃电位 = −5 mV;步长 = 20 ms;采集持续时间 = 600 s。
注意:在数据采集之前,在循环命令电位的初始阶段允许探头平衡非常重要。 - 使用相同的TBS创建目标肽的溶液以维持超级富酸盐的组成。建立一个歧管系统,其中超级富集液可以在TBS和肽补充剂TBS之间切换,而不会将气泡引入管道系统或流动室。
注:本研究使用合成猪NPY肽(见 材料表)。 - 使用TBS标准参数设置肽传感数据采集方案(见步骤2.2)。
注意:在此实施中,每个实验测试的持续时间为360 s(120 s TBS,120 s肽补充TBS,120 s TBS)。
3. CI探针的适配,适合 体内 使用
- 在聚多巴胺沉积(步骤1.7.)之前,将铂丝电极的暴露尖端穿过22G皮下注射针,在针尖外留下约2mm。使用镊子,轻轻地向后弯曲铂丝电极的尖端,形成悬挂在皮下注射针末端的“倒钩”。
- 轻轻地将针头从带刺的尖端中取出,留下足够的铁丝以放置在容器中,而不会使针接触流体。继续执行步骤 1.4.-1.11。
注意:根据 体内 设置,可能需要切割长度超过25厘米的铂丝。
- 轻轻地将针头从带刺的尖端中取出,留下足够的铁丝以放置在容器中,而不会使针接触流体。继续执行步骤 1.4.-1.11。
- 在将CI探头连接到头台之前,请确保整个电气设置正确接地。如果不这样做,可能会在实验记录期间引入不必要的电气干扰。
- 在先前发表的报告10之后麻醉动物。
- 进行手术以暴露感兴趣的区域。
注意:在本研究中进行了中位胸骨切开术以暴露心脏。有关动物手术的详细信息,请参阅Kluge等人10 。 - 轻轻地从PBS冲洗器中取出功能化的尖端(步骤1.11),将吸湿性针头向前插入倒钩的CI探头,然后将其轻轻地植入感兴趣的区域,然后将金色连接器引脚插入头台。植入后,取出皮下注射针头,将电极留在原位。
注意:对于本研究,将探针放置在左心室心肌10的中侧壁中。 - 确保正确的电气设置后,继续进行标准和实验测试协议(步骤2.2和步骤2.4)。
- 实验完成后,按照机构批准的技术对动物实施安乐死。
注意:在本研究中, 通过 诱导心室颤动在深度麻醉下对动物实施安乐死10。
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Representative Results
电极制造和表征
制备了柔性电容式免疫探针(CI探针),并描绘了具有代表性的图像 如图1A所示。电极电位由计算机控制的电压钳位电路设置(图1B),并将电极浸入PBS中制成的聚多巴胺溶液中。将聚多巴胺电沉积到导电电极尖端13 上进行功能化。命令电位驱动探头电压,并测量注入的箝位电流。在单周期聚多巴胺沉积期间测得的钳位电流如图 1C所示。在聚多巴胺沉积后,立即将包被的电极尖端浸泡在感兴趣的抗体溶液中(图2A)。所有电极都按照这些步骤立即使用。
NPY 的体外 测量
将抗体功能化的探针置于流动室中,并由具有示例命令电位的电压钳位电路驱动,并显示记录的电流(图2B,C)。在Tris缓冲盐水中进行 体外 记录(TBS,pH 7.4)。步进函数波形包括正阶跃电位(蓝色上部, 图2B)和负“复位”电位(红色下部, 图2B)。该命令电位的范围有效地测量结合并唤起肽的后续排斥,而不会降低探针灵敏度10。制造完成后,根据命令电位协议对每个探针进行初始条件测试。需要注意的是,返回最稳定和可重复的初始调节曲线的探针,定义为较小的初始衰变,然后是稳定的基线(图2D), 在体外 和 体内提供了最可重复的测量。因此,测量CI探头的初始稳定性是确定探头适用性的重要质量控制点。
体外电极灵敏度和稳定性评估
将电容式免疫探针置于流动室中,并补充TBS,补充已知浓度的神经肽Y(NPY,5-150 pM)。将电容电流(测量为+100 mV去极化的峰值幅度)与时间的关系图。NPY流入流动室的流量增加了超过基线的电容电流(60 pM NPY, 图2E)。 图3A显示了5 pM和75 pM NPY的剂量依赖性电流反应的证明,并在 图3B中提供了在所有测试浓度下测量的标准曲线。 图3B 中的数据点拟合到单个指数拟合以进行校准。
使用CI探针对神经肽释放曲线进行体内评估
该方法应用于猪心脏制剂以评估其对生物学应用的适用性,如先前的出版物10所述。简而言之,将CI电极穿过22 G皮下注射针头并稍微向后弯曲以形成倒钩(图4A)。将针头和倒刺电极插入跳动的猪心脏的左心室心肌中。然后将皮下注射导针从电极中取出,将其留在心肌中。在双侧星状神经节刺激60 s之前和响应于间质NPY(参见Kluge等人10,了解模拟步骤的完整描述)。将第二个没有抗体功能化的负对照电极放置在NPY探针附近。将获得的电容免疫探针钳位电流与体外校准曲线拟合,以提供心脏微环境中NPY浓度的时间分辨,诱发的变化。在刺激双侧星状神经节期间观察到NPY升高,并与阴性对照C.I电流共绘制(图4B,上图)。同时,还通过快速扫描循环伏安法(FSCV)测量间质去甲肾上腺素水平(NE),该技术以前用于评估从分离细胞14,15,分离组织16,17,18和猪心脏准备19中释放儿茶酚胺的技术。去甲肾上腺素是一种在星状刺激下共同释放的交感神经递质(图4B,下图),并显示与NPY同步释放,与诱发的交感神经反应一致。这些数据表明,CI方法可以与其他生物标志物检测方法同时使用,以评估具有高时间保真度的间质微环境。简而言之,将传感器电极植入CI探针附近的心肌中。电极电位通过电压钳位电路驱动变送器的氧化/还原电位。因此,当电极电位对NE的氧化电位变为正时,NE随后被氧化成醌衍生物。电子由氧化反应产生,测量为电压钳位电极中的补偿电流,从而提供局部NE释放的指数。将电极电位切换回负极化会减少醌产物以再生儿茶酚胺20。
图1:铂丝CI探针的制造。 (A)使用PFA涂层的铂丝(长25厘米,直径127μm)来制造每个CI探针。从电线的一端剥离约5毫米的PFA涂层,然后将其焊接到公镀金连接器引脚(比例尺= 3厘米)上。(B) 图中描绘了用于施加指令电位的电压钳位电路。(C,左)将电极的感觉尖端浸入含有补充5mM多巴胺的PBS的管中。(C,右)将聚多巴胺电沉积到感觉尖端。电沉积是通过使用具有以下参数的锯齿波形进行的:−0.6 V至+0.65 V,扫描速率为0.04 V∙s-1。显示命令电位(顶部)和产生的电流(底部)。 请点击此处查看此图的大图。
图2:使用CI探针对NPY进行 体外 测量。 (A)将聚多巴胺功能化丝浸入补充有抗NPY抗体的PBS中2 h。这使得抗体能够共价结合到探针尖端的多巴胺表面。(B) 显示电压命令电位。命令电位中的正阶跃用于测量钳位探头电压(蓝色)所需的注入电流,并允许测量容性电流。负指令电位(复位电位)步骤通过静电斥力(红色)从抗体中清除结合的肽。(C) 步进函数命令波形(顶迹线;+100 mV 测量相位至 −5 mV 复位相位,每个复位相位 20 ms)提供肽的时间分辨、迭代检测和定量。图中显示了使用 TBS 对探头进行超融合时的命令电位和产生的电流记录(底部跟踪)。(D)显示了CI探针在6分钟内的平衡(参见步骤2.2)。(E) 所示为NPY功能化C.I.探头测得的峰值容性电流。首先用Tris缓冲盐水补充CI探针,然后用补充60 pM NPY的Tris缓冲盐水,然后用无NPY的Tris缓冲盐水洗涤。 请点击此处查看此图的大图。
图3:CI探针的 体外 校准。 (A)用NPY抗体功能化探针超注Tris缓冲盐水测量电容性免疫探头电流。超级富集液被切换为含有5 pM(红色)和75 pM(黑色)NPY。这些记录代表了对低吡科莫NPY敏感的浓度依赖性信号。(B)对NPY抗体功能化的电容性免疫探针进行剂量反应敏感性检测。录音是在TBS超融合下进行的;然后TBS补充NPY(在pM中):1,5,15,25,60,75和150,然后在无NPY的TBS洗涤中。在每个NPY浓度的稳定状态下测量峰值容性电流值(C.I.电流),并与NPY浓度一起绘制。拟合剂量反应数据以提供校准实验数据的标准曲线(改编自Kluge等人10)。 请点击此处查看此图的大图。
图4:通过双侧星状刺激引起的NPY和NE的差异释放。 (A)显示了带有倒刺末端的CI探针 ,用于体内 使用(比例尺= 3 mm)。将探针穿过22G皮下注射针头,并按照步骤1中提到的方法制备。和步骤 2。在插入传感器之前,将探针尖端弯曲以形成倒钩,并且在插入心肌时将针头抽出,从而使倒钩探针锚定在左心室的心肌壁中。(B)将具有抗NPY抗体功能化的探针插入左心室心肌。将没有抗体功能化的相同探针(ø mAb)插入紧邻并用作阴性对照。CI电流响应于10 Hz(BSG,4 ms脉冲宽度,2x阈值)的双侧星状刺激而测定。根据标准曲线(图3B)校准所得电流并绘制(上图)。使用快速扫描循环伏安法测量同一间质位置的去甲肾上腺素释放(下图)。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本方案描述了能够在 体外 和体内环境中检测和测量感兴趣的生物标志物的电容式免疫探针(CI探针)的制造和 测试 。通过将生物标志物捕获在电极尖端来实现检测。捕获事件改变了铂丝电容式免疫探针与周围导电流体环境之间的电容结,测量为响应探头中电位移位的电荷电流变化。还提出了一种独特的电采集方案,该方案允许通过静电排斥探针尖端上捕获的生物标志物,在检测周期之间“重置”免疫探针。该生物标志物清除允许随后的测量循环,从而提供时间分辨测量10。在该实现中,探针制造包括在薄铂丝电极的尖端电沉积聚多巴胺反应层,该抗体与感兴趣的生物标志物共同结合。多巴胺和聚多巴胺的不同之处在于聚多巴胺含有醌官能团。醌作为伯胺亲核攻击的目标,形成共价键21。该协议中最关键的步骤是小心处理物理导线,因为功能化尖端的任何磨损都可能使CI探头无法使用。
此外,在测量前确保CI探头的稳定性也至关重要。在实验测试之前,可能需要在Tris缓冲盐水中运行几种对照标准品;在此过程中,实验人员正在寻找所得电流中的稳定瞬态曲线(例如, 图2D)。一致的制造实践可以最大限度地减少这种瞬态信号,但不能消除它。
在研究感兴趣的生物标志物时使用适当的抗体是采用该技术时的另一个重要因素。在该实现中,被表征为适用于检测非变性蛋白质的技术的抗体最适合(例如,IHC,ELISA, 原位 杂交),而不是那些用于变性蛋白质应用(蛋白质印迹)的抗体。
免疫化学方法在心脏病进展的临床诊断和评估中的应用虽然已经确立了1,但主要依赖于组织活检或血管室取样,其次是基于微透析的间质液收集。样品可能需要特殊的制备、处理和技术才能提供准确的结果,这充其量只能以分钟级时间分辨率4,5提供目标生物标志物的测量值。所描述的电容式免疫探针方法与这些方法相比具有几个优点:1)所描述的探针制造和应用可以适应于检测许多具有重要意义的独特生物标志物;2)柔性铂丝电极可部署在脉管系统、器官或其他流体室中;3)衍生的信号提供单个受试者感兴趣的生物标志物的时间分辨动态释放曲线;4)CI探头长期保持稳定性;5)由于传感器本身的灵活性,即使在机械应力或运动程度较高的区域,也可以保持稳定的记录条件;6)系统的移动性允许在 体外, 体内,工作台上以及最终在床边以前所未有的分辨率动态读数感兴趣的生物标志物。
上述技术克服了传统基于微透析的生物标志物检测和测量所固有的时空局限性。这种方法可以在近乎瞬时的基础上评估单个受试者的动态释放曲线,而无需在多个实验中汇总数据或信号平均。这种方法的使用是检测和测量相关生物标志物的重大技术进步,用于指导临床决策和治疗干预。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突,财务或其他方面。
Acknowledgments
我们感谢 Olu Ajijola 博士(加州大学洛杉矶分校心律失常中心)对 体内 实验的专家支持。这项工作得到了NIH U01 EB025138(JLA,CS)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
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