Summary
تعتمد الطرق الكيميائية المناعية المعمول بها لقياس أجهزة إرسال الببتيد في الجسم الحي على غسيل الكلى المجهري أو سحب السوائل السائبة للحصول على العينة لتحليلها في وضع عدم الاتصال. ومع ذلك ، فإن هذه تعاني من قيود مكانية زمنية. يصف هذا البروتوكول تصنيع وتطبيق جهاز استشعار حيوي مناعي سعوي يتغلب على قيود التقنيات الحالية.
Abstract
إن القدرة على قياس المؤشرات الحيوية في الجسم الحي ذات الصلة بتقييم تطور المرض ذات أهمية كبيرة للأوساط العلمية والطبية. ويمكن أن يستغرق الحصول على استبانة النتائج التي يتم الحصول عليها من الطرق الحالية لقياس بعض المؤشرات الحيوية عدة أيام أو أسابيع، حيث يمكن أن تكون محدودة في الدقة مكانيا وزمنيا (على سبيل المثال، الغسيل المجهري لحجرة السوائل للسائل الخلالي الذي يتم تحليله بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم [ELISA]، أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء [HPLC]، أو قياس الطيف الكتلي)؛ وبالتالي ، فإن توجيههم للتشخيص والعلاج في الوقت المناسب يتعطل. في هذه الدراسة ، تم الإبلاغ عن تقنية فريدة للكشف عن أجهزة إرسال الببتيد وقياسها في الجسم الحي من خلال استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (مسبار CI). يتم وصف بروتوكول التصنيع والتوصيف في المختبر لهذه المجسات. يتم توفير قياسات لإطلاق neuropeptide Y (NPY) المستحضر للتحفيز الودي في الجسم الحي . يرتبط إصدار NPY بالإصدار الودي للنورادرينالين كمرجع. توضح البيانات نهجا للقياس السريع والموضعي للببتيدات العصبية في الجسم الحي. وتشمل التطبيقات المستقبلية التقييم في الوقت الحقيقي أثناء العملية الجراحية لتطور المرض والنشر القائم على القسطرة طفيفة التوغل لهذه المجسات.
Introduction
تستخدم العديد من الطرق الكيميائية للكشف عن المؤشرات الحيوية وقياسها بشكل روتيني في كل من كيمياء البروتين والتشخيص السريري ، خاصة في تشخيص السرطان وتقييم تطور أمراض القلب والأوعية الدموية. حاليا، تعتمد طرق مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وقياس الطيف الكتلي على جمع العينات من حجرة الأوعية الدموية1،2،3 عن طريق سحب السوائل السائبة أو المقصورة الخلالية عن طريق غسيل الكلى المجهري. يستخدم غسيل الكلى المجهري أنبوب غشاء شبه نافذ بطول معروف يتم وضعه في منطقة ذات أهمية. يتم تمرير سائل التجميع عبر الأنبوب على مدى عدة دقائق4 لجمع العينة للتحليل5 ، مما يحد من الدقة الزمنية. وبهذه الطريقة، لا توفر العينات المجمعة سوى قيمة متوسطة مع مرور الوقت للبيئة الدقيقة المحلية وتكون محدودة بمعدل التروية وجمع حجم كاف من العينات. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه الأساليب تجميع البيانات التجريبية ومتوسط الإشارات؛ لذلك ، قد يفشلون في حساب التباين بين الموضوعات. الأهم من ذلك ، أن الوقت بين جمع العينات والتحليل اللاحق دون اتصال بالإنترنت يمنع التدخل السريري الفوري والعلاجات.
في هذا البروتوكول ، يتم تحديد استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (CI probe) للكشف الكهربائي الذي يتم حله في الوقت المناسب عن ببتيدات نشطة بيولوجيا محددة. Neuropeptide Y (NPY) ، الذي تم إطلاقه من الخلايا العصبية الودية ما بعد العقدية التي تعصب الأوعية الدموية ، والشغاف ، والخلايا العضلية القلبية ، والعقد داخل القلب ، هو ناقل الببتيد العصبي الرئيسي في نظام القلب والأوعية الدموية6،7،8،9. تم تصميم الطريقة المعروضة هنا لقياس NPY ، ويتم توضيح الجدوى التجريبية في نموذج قلب الخنزير. ومع ذلك ، ينطبق هذا النهج على أي ببتيد نشط بيولوجيا يتوفر له جسم مضاد انتقائي10. تعتمد هذه الطريقة على التقاطع السعوي بين مسبار سلك بلاتيني والسائل الموصل عند الطرف الوظيفي11,12. في هذا التطبيق ، تم التوسط في التفاعل من خلال جسم مضاد ضد neuropeptide المستهدف (NPY) ، والذي كان مرتبطا بطرف القطب الكهربائي ، وربط بيئة السائل الموصل. تم تحقيق هذا الأداء من خلال الترسيب الكهربائي لمادة البوليدوبامين التفاعلية على طرف مسبار الأسلاك البلاتينية10,13.
عندما يتم وضع المسبار الوظيفي للأجسام المضادة في منطقة ذات أهمية في الجسم الحي ، يؤدي إطلاق NPY الداخلي المستحضر إلى الارتباط بالأجسام المضادة المحاصرة على طرف المسبار ، ويتم إزاحة السائل الموصل على سطح القطب الكهربائي بواسطة بروتين NPY. يؤدي التغيير المحلي في البيئة الكهربائية إلى إزاحة سائل عالي الحركة وعازل كهربائي عالي مع جزيء غير متحرك ومشحون بشكل ثابت. هذا يغير واجهة القطب والسائل ، وبالتالي ، سعته ، والتي تقاس كتغيير في تيار الشحنة استجابة لجهد أمر وظيفة الخطوة. يتم استخدام جهد "إعادة ضبط" سلبي مباشرة بعد كل دورة قياس فردية لصد NPY المرتبط من الجسم المضاد من خلال التفاعل الكهروستاتيكي ، وبالتالي تطهير مواقع ربط الأجسام المضادة لجولات القياس اللاحقة10. هذا يسمح بشكل فعال لقياس NPY بطريقة يتم حلها في الوقت المناسب. تتغلب تقنية CI الفريدة من نوعها على قيود الطرق الكيميائية المناعية القائمة على غسيل الكلى المجهري الموضحة أعلاه لقياس مستويات المؤشرات الحيوية الديناميكية من تجربة واحدة دون تجميع البيانات أو الإشارة في المتوسط على مدى العديد من التجارب9 ، مما يوفر البيانات في الوقت الفعلي تقريبا. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تكييف هذه الطريقة مع أي مؤشر حيوي ذي أهمية يوجد له جسم مضاد مناسب على نطاق زمني محدد ومحدد الموقع يوفر تقدما تقنيا كبيرا في القياس الكيميائي المناعي لتقييم تطور المرض وتوجيه التدخلات العلاجية.
وكان البرنامج الحاسوبي للحصول على البيانات وتحليلها مكتوبا خصيصا في IGOR Pro (بيئة برمجية تفاعلية بالكامل). أصدر نظام محول تناظري إلى رقمي (A / D) جهدا قياديا تحت سيطرة الكمبيوتر وحصل على بيانات من مكبر صوت مخصص. يمتلك مكبر الصوت بعض الميزات الفريدة. وشملت هذه مقاومة التغذية المرتدة (قابلة للتبديل) لكل قناة من قنوات الاستحواذ الأربع ، مما يسمح باختيار 1 MOhm أو 10 دوائر مشبك الجهد التغذية المرتدة MOhm لدمج تباين القطب الكهربائي. كما تم بناء وحدة مرحلة ذات رأس واحد ودائرة أرضية / مرجعية متبادلة لجميع قنوات الاستحواذ الأربع لوضع الجهاز بالقرب من الصدر في وحدة مادية واحدة. تم استخدام إعداد مقاوم التغذية المرتدة 1 MOhm لجمع جميع البيانات المبلغ عنها.
تم تلغراف إعدادات المرشح والكسب من مكبر الصوت وتسجيلها داخل ملف البيانات. تمت تصفية البيانات عند 1 كيلو هرتز عبر مرشح بيسل تناظري ثنائي القطب رقمي عند 10 كيلو هرتز. الفرق في الجهد بين المسبار والحل الموصل المحيط يخلق طبقة سعوية هيلمهولتز عند طرف المسبار. يؤدي ربط الليغاند بالجسم المضاد عند طرف المسبار إلى تغيير الشحنة المحلية ، وبالتالي تغيير في سعة هيلمهولتز. يؤدي هذا التغيير في المكون السعوي للدائرة إلى تحول في حجم الشحنة المحقونة المطلوبة لجلب المسبار إلى الجهد المحتمل في بروتوكول الجهد ذي الوظيفة التدريجية. وبالتالي ، فإن ربط رباط معين بالمسبار الوظيفي يؤدي إلى تغيير في قياس سعة القطب الكهربائي كتغيير في ذروة التيار السعوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أبحاث الحيوانات بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية التي حددها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (الطبعة 8th ، 2011). تم استخدام خنازير يوركشاير الذكور البالغة التي يبلغ وزنها حوالي 75 كجم في دراسات الجسم الحي 10.
1. تصنيع المسبار المناعي السعوي ووظائفه
- قم بقطع طول 25 سم من الأسلاك البلاتينية المطلية بالبيرفلوروألكوكسي (PFA) (انظر جدول المواد) وتجريد ما يقرب من 5 مم من طلاء PFA من أحد طرفيه باستخدام مشرط ، مع الحرص على عدم قطع السلك البلاتيني.
- أدخل الطرف المجرد من السلك البلاتيني في دبوس موصل ذكر مطلي بالذهب مقاس 1 مم وقم بتجعيد أسنان دبوس الموصل حول الطرف المجرد من السلك البلاتيني باستخدام كماشة إبرة الأنف (انظر جدول المواد).
- قم بلحام السلك البلاتيني بدبوس الموصل المطلي بالذهب. احرص على عدم استخدام كمية زائدة من اللحام.
- تحضير محلول الدوبامين عن طريق إذابة 50 ملغ من الدوبامين HCl في 50 مل من 10 mM المالحة العازلة بالفوسفات (PBS ، الرقم الهيدروجيني 6.0) عن طريق التحريك.
- بمجرد إذابة الدوبامين تماما ، ضع طرف السلك البلاتيني في الوعاء الذي يحتوي على PBS المكمل بالدوبامين الطازج. قم بتوصيل دبوس موصل ذهبي بقناة من المنصة الرئيسية (انظر جدول المواد).
- قم بتوصيل قطب القرص AgCl (القطب الأرضي، انظر جدول المواد) بالقناة الأرضية في المنصة. ضع قرص AgCl في الوعاء الذي يحتوي على PBS وأسلاك البلاتين المكملة بالدوبامين ؛ كن حريصا فقط على غمر قطب القرص وليس أي طول للسلك أو اللحام. قم بتوصيل تحويلة سلكية بالقنوات المرجعية للمنصة الرئيسية قبل المتابعة.
- افتح برنامج الحصول على البيانات التفاعلي (انظر جدول المواد). قم بإعداد بروتوكول جهد أمر الترسيب الكهربائي لسن المنشار باستخدام المعلمات التالية: جهد البدء = −0.6 V ؛ نهاية المحتملة = +0.65 فولت ؛ معدل المسح الضوئي = 0.04 V∙s-1 ؛ مدة الترسب = 420 ثانية. ابدأ بروتوكول ترسيب البوليدوبامين ، مما يضمن توصيل جميع الأسلاك بشكل صحيح.
- بعد الانتهاء من ترسيب البوليدوبامين ، قم بإزالة حبيبة AgCl الأرضية وطرف السلك البلاتيني من السفينة ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف قطب سلك البلاتين. ضع طرف السلك في أنبوب دقيق يحتوي على PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 2-5 دقائق أثناء تحضير محلول الأجسام المضادة ؛ تأكد من أن طرف السلك لا يلامس جانبي أو أسفل الأنبوب الصغير.
ملاحظة: يمكن إجراء محلول الأجسام المضادة أثناء ترسيب البوليدوبامين. ومع ذلك ، لا ينبغي تخطي نقل سلك البلاتين من الوعاء المحتوي على الدوبامين إلى الأنبوب الدقيق ل PBS بعد ترسب البولي دوبامين. - تحضير محلول الأجسام المضادة. الجمع بين الجسم المضاد للاهتمام مع PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) بنسبة 1:20 في وعاء بحجم مناسب (على سبيل المثال ، أنبوب صغير).
ملاحظة: تم اقتباس الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل NPY (انظر جدول المواد) المستخدم هنا عند 1 ملغم / مل. مثال على إعداد الأجسام المضادة هنا سيكون 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة إلى 76 ميكرولتر من PBS. - انقع الطرف المودع بالبوليدوبامين من القطب البلاتيني في محلول الأجسام المضادة لمدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مما يضمن مرة أخرى تعليق طرف السلك البلاتيني في المحلول وعدم الاستلقاء على السطح الداخلي للأنبوب الدقيق.
ملاحظة: فضل التنفيذ الأخير لهذه التقنية استخدام قطب الأسلاك البلاتينية مباشرة بعد هذه الخطوة بدلا من التخزين الرطب أو الجاف للاستخدام لاحقا. - بعد النقع في محلول الأجسام المضادة ، اشطف لفترة وجيزة طرف المسبار المناعي السعوي (CI probe) الذي تم تشغيله حديثا في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). المسبار جاهز الآن للاستخدام.
2. الإعداد التجريبي للكشف عن الببتيد في المختبر وقياسه
- ضع الطرف الوظيفي لمسبار CI في غرفة التدفق ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف القطب بأي شكل من الأشكال ، لأن القيام بذلك قد يؤدي إلى تلف الطرف الحسي للمسبار.
ملاحظة: تم إنشاء غرفة التدفق عن طريق صب مطاط صناعي من السيليكون (انظر جدول المواد) في طبق استزراع 35 مم مع حشو مساحة بيضاوية ممدودة في وسط الطبق. بعد التصلب ، تتم إزالة الشكل البيضاوي من المطاط الصناعي. ثم يتم دمج الغرفة مع محلول ملحي مخزن مؤقتا (TBS) ويسمح بمعدل تدفق يبلغ 3 مل / دقيقة. تأكد من أن التدفق الداخلي والخارجي يحافظ على مستوى السائل في الغرفة بحيث لا يلاحظ أي عمل مد وجزر لل superfusate. يجب أن يظل التدفق في مكانه طالما أن مسبار CI قيد الاستخدام. - قبل الاختبار التجريبي الأول ، قم بإجراء تشغيل قياسي TBS لتهيئة مسبار CI. قم بإعداد بروتوكول جهد الأوامر التالي: جهد الخطوة الإيجابية = +100 mV ؛ جهد الخطوة السالبة = −5 mV ؛ مدة الخطوة = 20 مللي ثانية ؛ مدة الاستحواذ = 600 ثانية.
ملاحظة: من المهم السماح بتوازن المسبار خلال المرحلة الأولية من إمكانات قيادة ركوب الدراجات قبل الحصول على البيانات. - قم بإنشاء حل للببتيد ذي الأهمية باستخدام نفس TBS للحفاظ على تكوين superfusate. قم بإعداد نظام متعدد حيث يمكن تبديل الفوسات الفائقة بين TBS و TBS المكمل بالببتيد دون إدخال فقاعات في نظام الأنابيب أو غرفة التدفق.
ملاحظة: تم استخدام ببتيد الخنزير الاصطناعي NPY (انظر جدول المواد) في هذه الدراسة. - قم بإعداد بروتوكول الحصول على بيانات استشعار الببتيد باستخدام معلمات TBS القياسية (انظر الخطوة 2.2).
ملاحظة: في هذا التنفيذ، كانت مدة كل اختبار تجريبي 360 ثانية (120 ثانية TBS، 120 ثانية TBS المكمل بالببتيد، 120 ثانية TBS).
3. تكييف مسبار CI للاستخدام في الجسم الحي
- قبل ترسب البوليدوبامين (الخطوة 1.7) ، قم بربط الطرف المكشوف لقطب السلك البلاتيني من خلال إبرة تحت الجلد 22 جم ، تاركا حوالي 2 مم وراء طرف الإبرة. باستخدام الملقط ، ثني بلطف طرف قطب السلك البلاتيني ، مما يخلق "بارب" يتدلى من نهاية الإبرة تحت الجلد.
- اسحب الإبرة بلطف من الطرف الشائك ، تاركا ما يكفي من الأسلاك لوضعها في الوعاء دون أن تلامس الإبرة السائل. تابع الخطوات من 1.4.إلى 1.11.
ملاحظة: اعتمادا على الإعداد في الجسم الحي ، قد يكون من الضروري قطع طول سلك البلاتين لفترة أطول من 25 سم.
- اسحب الإبرة بلطف من الطرف الشائك ، تاركا ما يكفي من الأسلاك لوضعها في الوعاء دون أن تلامس الإبرة السائل. تابع الخطوات من 1.4.إلى 1.11.
- قبل توصيل مسبار CI بالمنصة، تأكد من أن الإعداد الكهربائي بأكمله مثبت بشكل صحيح. قد يؤدي الفشل في القيام بذلك إلى حدوث تداخل كهربائي غير مرغوب فيه أثناء التسجيلات التجريبية.
- تخدير الحيوانات بعد نشر تقرير سابق10.
- إجراء عملية جراحية لفضح المنطقة محل الاهتمام.
ملاحظة: تم إجراء بضع القص المتوسط في هذه الدراسة لفضح القلب. يرجى الاطلاع على Kluge et al.10 للحصول على تفاصيل حول جراحة الحيوانات. - قم بإزالة الطرف الوظيفي بلطف من شطف PBS (الخطوة 1.11) ، وقم بإعادة توجيه إبرة hydodermic إلى مسبار C.I. الشائك وازرعه بلطف في المنطقة ذات الأهمية قبل توصيل دبوس الموصل الذهبي في المنصة. بمجرد زرعها ، اسحب الإبرة تحت الجلد ، تاركا القطب الكهربائي في مكانه.
ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تم وضع المسبار في الجدار الجانبي الأوسط لعضلة القلب البطينية اليسرى10. - بعد التأكد من الإعداد الكهربائي المناسب، تابع بروتوكولات الاختبار القياسية والتجريبية (الخطوة 2.2. والخطوة 2.4).
- عند الانتهاء من التجارب ، القتل الرحيم للحيوان باتباع التقنيات المعتمدة مؤسسيا.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم قتل الحيوانات الرحيم تحت التخدير العميق عن طريق تحريض الرجفان البطيني10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصنيع القطب الكهربائي وتوصيف
تم تصنيع مسبار مناعي سعوي مرن (تحقيقات CI) ، وتظهر صورة تمثيلية في الشكل 1A. تم تعيين جهد القطب الكهربائي بواسطة دائرة مشبك الجهد التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر (الشكل 1B) ، وتم غمر القطب الكهربائي في محلول متعدد الدوبامين مصنوع في PBS. تم ترسيب البوليدوبامين كهربائيا على طرف القطب الكهربائي الموصل13 للتشغيل. قاد جهد القيادة جهد المسبار ، وتم قياس حقن تيار اللقط. ويبين الشكل 1C تيار التثبيت المقاس خلال دورة واحدة من ترسب البوليدوبامين. مباشرة بعد ترسب البوليدوبامين ، تم نقع طرف القطب الكهربائي المطلي في محلول الأجسام المضادة ذي الأهمية (الشكل 2A). تم استخدام جميع الأقطاب الكهربائية مباشرة بعد هذه الخطوات.
في المختبر قياس NPY
تم وضع المسبار الوظيفي للأجسام المضادة في غرفة تدفق ومدفوع بدائرة مشبك الجهد مع مثال على جهد القيادة ، ويظهر التيار المسجل (الشكل 2B ، C). تم إجراء التسجيلات في المختبر بمحلول ملحي مخزن مؤقتا من Tris (TBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4). يتكون الشكل الموجي للدالة التدريجية من جهد خطوة موجب (الجزء الأزرق العلوي، الشكل 2B) وجهد "إعادة ضبط" سالب (الجزء الأحمر السفلي، الشكل 2B). يقيس نطاق إمكانات القيادة هذه بشكل فعال الربط ويثير التنافر اللاحق للببتيدات دون إضعاف حساسية المسبار10. بعد التصنيع ، تم اختبار كل مسبار للتكييف الأولي بموجب بروتوكول القيادة المحتملة. وتجدر الإشارة إلى أن المجسات التي أعادت ملف تعريف التكييف الأولي الأكثر استقرارا وقابلية للتكرار، والذي يعرف بأنه اضمحلال أولي أصغر يليه خط أساس مستقر (الشكل 2D)، أعطى القياسات الأكثر قابلية للتكرار في المختبر وفي الجسم الحي. وبالتالي ، فإن قياس الاستقرار الأولي لمجسات CI يمثل نقطة مهمة لمراقبة الجودة لتحديد مدى ملاءمة المسبار.
تقييم حساسية القطب الكهربائي واستقراره في المختبر
تم وضع المجسات المناعية السعوية في غرفة التدفق ودمجها مع TBS المكملة بتركيزات معروفة من neuropeptide Y (NPY ، 5-150 pM). تم رسم التيارات السعوية ، التي تم قياسها على أنها سعة الذروة لإزالة الاستقطاب +100 mV ، مع مرور الوقت. أدى تدفق NPY إلى غرفة التدفق إلى زيادة التيارات السعوية فوق خط الأساس (60 pM NPY ، الشكل 2E). ويبين الشكل 3 ألف عرضا توضيحيا للاستجابة الحالية المعتمدة على الجرعة ل 5 pM و 75 pM NPY، ويرد منحنى قياسي يقاس تحت جميع التركيزات المختبرة في الشكل 3B. كانت نقاط البيانات الواردة في الشكل 3B مناسبة لتناسب أسي واحد لأغراض المعايرة.
في الجسم الحي تقييم ملامح الافراج عن neuropeptide مع التحقيق CI
تم تطبيق هذه المنهجية على إعداد قلب الخنزير لتقييم مدى ملاءمته للتطبيق البيولوجي ، كما هو موضح في المنشورات السابقة10. باختصار ، تم ربط قطب CI من خلال إبرة تحت الجلد 22 G وانحنى قليلا لإنشاء شائك (الشكل 4A). تم إدخال الإبرة والقطب الشائك في عضلة القلب البطينية اليسرى لقلب الخنزير النابض. ثم تم سحب إبرة التوجيه تحت الجلد من القطب الكهربائي ، وتركها في مكانها في عضلة القلب. تم قياس NPY الخلالي قبل واستجابة ل 60 ثانية من تحفيز العقدة النجمية الثنائية (انظر Kluge et al.10 للحصول على وصف كامل لخطوات المحاكاة). تم وضع قطب تحكم سلبي ثان بدون وظائف الأجسام المضادة بجوار مسبار NPY. تم تركيب تيارات المشبك المناعية السعوية التي تم الحصول عليها ضد منحنى المعايرة في المختبر لتوفير تغييرات تم حلها مؤقتا ومثيرة في تركيزات NPY في البيئة الدقيقة القلبية. لوحظ ارتفاع NPY أثناء تحفيز العقدة النجمية الثنائية وتم رسمه بالاشتراك مع تيارات C.I ذات التحكم السلبي (الشكل 4B ، المخطط العلوي). في موازاة ذلك ، تم قياس مستويات النورادرينالين الخلالي (NE) أيضا عن طريق المسح السريع للفولتامتر الدوري (FSCV) ، وهي تقنية استخدمت سابقا لتقييم إطلاق الكاتيكولامين من الخلايا المعزولة 14،15 ، والأنسجة المعزولة 16،17،18 ، وفي إعداد قلب الخنزير 19. النورادرينالين هو ناقل عصبي ودي يتم إطلاقه تحت التحفيز النجمي (الشكل 4B ، المؤامرة السفلية) ويظهر إطلاقا متزامنا مع NPY ، بما يتفق مع استجابة متعاطفة مستحضرة. وتبين هذه البيانات أنه يمكن استخدام نهج CI بالتزامن مع طرق الكشف عن المؤشرات الحيوية الأخرى لتقييم البيئات الدقيقة الخلالية ذات الدقة الزمنية العالية. باختصار ، يتم زرع قطب استشعار في عضلة القلب المجاورة لمسبار CI. يتم تشغيل جهد القطب الكهربائي من خلال إمكانات الأكسدة / الاختزال لجهاز الإرسال بواسطة دائرة مشبك الجهد. لذلك ، عندما يصبح جهد القطب الكهربائي موجبا لجهد الأكسدة ل NE ، يتم أكسدة NE بعد ذلك إلى مشتق كينون. يتم توليد الإلكترونات بواسطة تفاعل الأكسدة ، الذي يقاس كتيار تعويضي في القطب الكهربائي المثبت بالجهد ، وبالتالي توفير مؤشر لإطلاق NE المحلي. يؤدي تحويل جهد القطب الكهربائي مرة أخرى إلى استقطاب سالب إلى تقليل منتج الكينون لتجديد الكاتيكولامين20.
الشكل 1: تصنيع مسبار CI السلك البلاتيني (A) تم استخدام سلك بلاتيني مطلي ب PFA (بطول 25 سم وقطر 127 ميكرومتر) لإنشاء كل مسبار CI. تم تجريد حوالي 5 مم من طلاء PFA من أحد طرفي السلك ، والذي تم لحامه بعد ذلك إلى دبوس موصل مطلي بالذهب (شريط المقياس = 3 سم). (ب) يظهر تصوير لدائرة مشبك الجهد المستخدمة لتطبيق جهد القيادة. (C، يسار) تم غمر الطرف الحسي للقطب الكهربائي في أنبوب يحتوي على PBS مكمل بالدوبامين 5 mM. (C، يمين) تم ترسيب البوليدوبامين كهربائيا على الطرف الحسي. تم إجراء الترسيب الكهربائي باستخدام شكل موجي لأسنان المنشار مع المعلمات التالية: -0.6 V إلى +0.65 V بمعدل مسح 0.04 V∙s-1. يتم عرض إمكانات الأوامر (أعلى) والتيار الناتج (أسفل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: القياس المختبري ل NPY باستخدام مسبار CI. (أ) تم غمر سلك يعمل بتقنية البولي دوبامين في PBS مكملا بجسم مضاد مضاد ل NPY لمدة 2 ساعة. سمح هذا للجسم المضاد بالارتباط تساهميا بسطح البوليدوبامين عند طرف المسبار. (ب) يظهر جهد أمر الجهد. تعمل الخطوة الإيجابية في إمكانات القيادة على قياس تيار الحقن المطلوب لتثبيت جهد المسبار (الأزرق) وتسمح بقياس التيار السعوي. تقوم خطوة جهد الأمر السلبي (جهد إعادة الضبط) بإزالة الببتيد المرتبط من الجسم المضاد عن طريق التنافر الكهروستاتيكي (الأحمر). (ج) يوفر الشكل الموجي لأمر وظيفة الخطوة (التتبع العلوي ؛ +100 mV قياس المرحلة إلى -5 mV مرحلة إعادة التعيين ، كل من 20 مللي ثانية المدة) الكشف عن الوقت ، والكشف التكراري وتحديد كمي للببتيد. يتم عرض إمكانات القيادة والتسجيل الحالي الناتج تحت الانصهار الفائق للمسبار مع TBS (التتبع السفلي). (د) يظهر توازن مسبار CI على مدى فترة 6 دقائق (انظر الخطوة 2.2). (ه) يظهر ذروة التيار السعوي الذي يقاس بواسطة مسبار C.I. الوظيفي NPY. تم دمج مسبار CI أولا مع محلول ملحي مخزن مؤقتا من Tris ، ثم محلول ملحي مخزن مؤقتا من Tris مع 60 pM NPY ، ثم تبعه غسل ملحي مخزن مؤقتا بدون NPY. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المعايرة المخبرية لمسبار CI. (أ) تم قياس تيارات المسبار المناعي السعوي باستخدام مسبار وظيفي للأجسام المضادة NPY تم دمجه مع محلول ملحي مخزن مؤقتا من قبل Tris. تم تبديل superfusate ليحتوي على 5 pM (أحمر) و 75 pM (أسود) NPY. تمثل هذه التسجيلات إشارة تعتمد على التركيز حساسة ل NPY البيكومول المنخفض. (ب) تم اختبار المجسات المناعية السعوية التي تعمل بالجسم المضاد NPY لحساسية الاستجابة للجرعة. تم إجراء التسجيلات تحت الانصهار الفائق مع TBS. ثم تستكمل TBS مع NPY (في pM): 1 و 5 و 15 و 25 و 60 و 75 و 150 ، ثم في غسل TBS خال من NPY. تم قياس قيم التيار السعوي الذروة (C.I. Current) عند حالة ثابتة في كل تركيز NPY ورسمت مقابل تركيز NPY. تم تركيب بيانات الاستجابة للجرعة لتوفير منحنى قياسي لمعايرة البيانات التجريبية (مقتبس من Kluge et al.10). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الإطلاق التفاضلي ل NPY و NE الناجم عن التحفيز النجمي الثنائي. (أ) يظهر مسبار CI ذو نهاية شائكة للاستخدام في الجسم الحي (شريط المقياس = 3 مم). يتم ربط المسبار من خلال إبرة تحت الجلد 22 G ويتم تحضيره كما هو مذكور في الخطوة 1. والخطوة 2. قبل إدخال المستشعر ، يتم ثني طرف المسبار لإنشاء شوكة ، ويتم سحب الإبرة عند إدخالها في عضلة القلب ، وبالتالي ترك مسبار شائك مثبتا في جدار عضلة القلب في البطين الأيسر. (ب) تم إدخال مسبار يعمل بجسم مضاد مضاد ل NPY في عضلة القلب البطينية اليسرى. تم إدخال مسبار مماثل بدون وظيفة الأجسام المضادة (ø mAb) بجوار مباشرة وكان بمثابة عنصر تحكم سلبي. تم تحديد تيارات CI استجابة للتحفيز النجمي الثنائي عند 10 هرتز (BSG ، عرض نبضة 4 مللي ثانية ، عتبة 2x). تمت معايرة التيارات الناتجة مقابل المنحنى القياسي (الشكل 3B) ورسمت (المخطط العلوي). تم قياس إطلاق النورادرينالين في نفس الموقع الخلالي باستخدام قياس الفولتاميمتر الدوري السريع المسح الضوئي (المخطط السفلي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول تصنيع واختبار مسبار مناعي سعوي (مسبار CI) قادر على اكتشاف وقياس المؤشرات الحيوية ذات الأهمية في كل من المختبر والجسم الحي . يتم تحقيق الكشف عن طريق محاصرة العلامة الحيوية عند طرف القطب الكهربائي. يغير حدث الاصطياد التقاطع السعوي بين مسبار مناعي سعوي من الأسلاك البلاتينية وبيئة السائل الموصل المحيطة به ، ويتم قياسه على أنه تغير في التيار المسؤول استجابة لتحول محتمل في المسبار. كما تم تقديم بروتوكول اقتناء كهربائي فريد من نوعه يسمح "بإعادة ضبط" المسبار المناعي بين دورات الكشف عن طريق صد العلامة الحيوية المحاصرة كهروستاتيكيا من طرف المسبار. ويسمح هذا التخليص بالمؤشرات الحيوية بدورات لاحقة من القياس، مما يوفر مقياسا10 تم حله زمنيا. في هذا التنفيذ ، تضمن تصنيع المسبار الترسيب الكهربائي لطبقة تفاعلية متعددة الدوبامين على طرف قطب سلك بلاتيني رفيع يرتبط به الجسم المضاد ، المرفوع ضد علامة حيوية ذات أهمية ، تساهميا. يختلف الدوبامين والبولي دوبامين في أن البوليدوبامين يحتوي على مجموعة وظيفية من الكينون. تعمل الكينونات كهدف للهجوم النووي من قبل الأمينات الأولية لتشكيل رابطة تساهمية21. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي التعامل مع السلك المادي بعناية ، لأن أي تآكل للطرف الوظيفي قد يجعل مسبار CI غير قابل للاستخدام.
بالإضافة إلى ذلك ، يعد ضمان استقرار مسبار CI قبل القياس أمرا ضروريا. قد يكون من الضروري تشغيل العديد من معايير التحكم في محلول ملحي مخزن مؤقتا من Tris قبل الاختبار التجريبي ؛ عند القيام بذلك ، يبحث المجرب عن منحنى عابر مستقر في التيار الناتج (على سبيل المثال ، الشكل 2D). يمكن أن تقلل ممارسة التصنيع المتسقة من هذه الإشارة العابرة ولكنها لا تقضي عليها.
يعد استخدام الأجسام المضادة المناسبة عند التحقيق في المؤشرات الحيوية ذات الأهمية عاملا مهما آخر عند استخدام هذه التقنية. وفي هذا التنفيذ، تكون الأجسام المضادة التي توصف بأنها قابلة للتطبيق في تقنيات الكشف عن البروتينات غير المشوهة هي الأنسب (مثل IHC، ELISA، التهجين في الموقع ) بدلا من تلك الخاصة بتطبيقات البروتين المشوهة (اللطخة الغربية).
يعتمد استخدام الأساليب الكيميائية المناعية في التشخيص السريري وتقييم تطور أمراض القلب ، على الرغم من أنهراسخ 1 ، في المقام الأول على العينات المستمدة من خزعة الأنسجة أو أخذ عينات من حجرة الأوعية الدموية ، وثانيا ، على جمع السوائل الخلالية القائمة على غسيل الكلى المجهري. قد تتطلب العينات إعدادا خاصا ومناولة وتكنولوجيا لتوفير نتائج دقيقة ، والتي ، في أحسن الأحوال ، توفر مقياسا للعلامة الحيوية ذات الأهمية عند الدقة الزمنية على مستوى الدقيقة 4,5. وتوفر منهجية المسبار المناعي السعوي الموصوفة العديد من المزايا مقارنة بهذه النهج: 1) يمكن تكييف تصنيع المسبار وتطبيقه الموصوفين للكشف عن العديد من المؤشرات الحيوية الفريدة ذات الأهمية؛ و (ب) يمكن تكييف عملية تصنيع المسبار وتطبيقه الموصوفة للكشف عن العديد من المؤشرات الحيوية الفريدة ذات الأهمية؛ و (2) يمكن تكييف عملية تصنيع المسبار وتطبيقه الموصوفة للكشف عن العديد من المؤشرات الحيوية الفريدة ذات الأهمية؛ و (2) يمكن تكييف تصنيع المسبار وتطبيقه للكشف عن العديد من المؤشرات الحيوية الفريدة ذات الأهمية؛ 2) يمكن نشر أقطاب الأسلاك البلاتينية المرنة في الأوعية الدموية أو في الأعضاء أو في مقصورات السوائل الأخرى ؛ 3) توفر الإشارة المشتقة ملامح إطلاق ديناميكية تم حلها عبر الزمن للمؤشرات الحيوية ذات الأهمية في مواضيع فردية ؛ 4) يحافظ مسبار CI على الاستقرار بمرور الوقت ؛ 5) يمكن الحفاظ على حالة تسجيل مستقرة حتى في المناطق التي تعاني من درجة عالية من الإجهاد الميكانيكي أو الحركة بسبب مرونة المستشعر نفسه ؛ و 6) يسمح تنقل النظام بقراءات ديناميكية للمؤشرات الحيوية ذات الأهمية بدقة غير مسبوقة في المختبر ، في الجسم الحي ، على مقاعد البدلاء ، وفي النهاية بجانب السرير.
تتغلب التقنية الموضحة أعلاه على القيود المكانية الزمانية المتأصلة في الكشف عن المؤشرات الحيوية التقليدية القائمة على غسيل الكلى المجهري وقياسها. يمكن لهذه المنهجية تقييم ملفات تعريف الإطلاق الديناميكي على أساس شبه فوري في مواضيع فردية دون الحاجة إلى بيانات مجمعة أو إشارة في المتوسط على مدى عدة تجارب. ويعد استخدام هذا النهج بمثابة تقدم تكنولوجي كبير في الكشف عن المؤشرات الحيوية ذات الصلة وقياسها لتوجيه عملية صنع القرار السريري والتدخل العلاجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح، سواء كانت مالية أو غير مالية.
Acknowledgments
نشكر الدكتور أولو أجيجولا (مركز عدم انتظام ضربات القلب بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس) على دعم الخبراء للتجارب في الجسم الحي . تم دعم هذا العمل من قبل NIH U01 EB025138 (JLA ، CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
References
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S.
- Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction. European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).
- Farrell, D. M., et al. Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).
- Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation. JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).
- Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone. Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y. JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).
- Rigel, D. F. Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT. American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).
- Kluge, N., et al. Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G.
- Prodromidis, M. I.
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318 (5849), 426-430 (2007).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells. Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).
- Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).
- Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices. The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).
- Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).
- Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C). The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).
- Chan, S. A., et al. Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).
- Chow, R. H., von Rüden, L. Single-Channel Recording, Second Edition. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).
- Ren, Y., et al. Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating. BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).
