Summary
Post-transkriptionelle modifikationer af RNA repræsenterer et understuderet lag af translationsregulering, der for nylig er blevet forbundet med centralnervesystemets plasticitet. Her beskrives prøveforberedelse og væskekromatografi-tandem massespektrometri tilgang til samtidig karakterisering af talrige RNA-modifikationer i enkelte neuroner.
Abstract
Post-transkriptionelle modifikationer (PTM'er) af RNA repræsenterer en understuderet mekanisme involveret i reguleringen af translation i centralnervesystemet (CNS). Nylige beviser har knyttet specifikke neuronale RNA-modifikationer til lærings- og hukommelsesparadigmer. Desværre er konventionelle metoder til påvisning af disse epitranscriptomiske egenskaber kun i stand til at karakterisere meget rigelige RNA-modifikationer i bulkvæv, hvilket udelukker vurderingen af unikke PTM-profiler, der kan eksistere for individuelle neuroner inden for de aktiverede adfærdskredsløb. I denne protokol beskrives en tilgang - enkelt-neuron RNA-modifikationsanalyse ved massespektrometri (SNRMA-MS) - for samtidig at detektere og kvantificere adskillige modificerede ribonukleosider i enkelte neuroner. Fremgangsmåden valideres ved hjælp af individuelle neuroner i den marine bløddyr, Aplysia californica, begyndende med kirurgisk isolering og enzymatisk behandling af større CNS-ganglier for at udsætte neuroncellelegemer efterfulgt af manuel enkelt-neuronisolering ved hjælp af skarpe nåle og en mikropipette. Dernæst udføres mekanisk og termisk behandling af prøven i et lille volumen buffer for at frigøre RNA fra en individuel celle til efterfølgende RNA-fordøjelse. Modificerede nukleosider identificeres og kvantificeres derefter ved hjælp af en optimeret væskekromatografi-massespektrometrimetode. SNRMA-MS anvendes til at etablere RNA-modifikationsmønstre for enkelte, identificerede neuroner fra A. californica , der har kendte morfologier og funktioner. Eksempler på kvalitativ og kvantitativ SNRMA-MS præsenteres, der fremhæver den heterogene fordeling af RNA-modifikationer på tværs af individuelle neuroner i neuronale netværk.
Introduction
Modifikationer i de kanoniske nukleosider af RNA er i stigende grad blevet anerkendt for deres utallige roller i reguleringen af proteintransformation. Over 150 unikke RNA-modifikationer er blevet rapporteret til dato, der spænder i kompleksitet fra methylering, heteroatom tilsætning til konjugation med cellulære metabolitter 1,2. Dette udvidede RNA-alfabet, også kendt som epitranscriptomet, genereres af enzymatiske forfattere og er ansvarlig for at ændre stabiliteten3, foldning4 og oversættelseseffektivitet 5,6 af cellulære RNA'er. Udvalgte RNA-modifikationer kan også vendes via enzymatiske viskelædere 7,8, mens andre er tilføjet til RNA'er substoichiometrisk 9,10, hvilket giver et komplekst landskab af modificerede og umodificerede RNA-sekvenser i biologiske systemer.
Betydningen af RNA-modifikationer i biologisk funktion er indikeret ved den ulige fordeling af modifikationer på tværs af forskellige organer og væv, herunder underregioner i centralnervesystemet (CNS)11. Denne kemiske heterogenitet har været forbundet med CNS-udvikling12, stressrespons13 og aktivitetsafhængig plasticitet14. CNS-underregionerne omfatter yderligere heterogene populationer af celler, hvor individuelle celler udviser forskellige kemiske profiler 15,16,17,18. Selv enkeltceller af samme type kan vise unikke transkriptomer, delvis på grund af vævsmikromiljøer19 og stokastisk genekspression20. Mens karakterisering af enkeltcelletransskriptomet er noget rutinemæssigt, er der imidlertid ingen analoge metoder til etablering af enkeltcelleepitranscriptomer til flere RNA-modifikationer. Nye tilgange, der er i stand til at profilere fordelingen af RNA-modifikationer i individuelle celler, er nødvendige for omfattende analyse af den cellulære heterogenitet og regulatoriske indflydelse af post-transkriptionelle modifikationer (PTM'er) i CNS og andre biologiske systemer.
Samtidig måling af talrige RNA-modifikationer i bulkceller / væv udføres let ved hjælp af væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) teknikker. Til LC-MS/MS-analyse af modificerede ribonukleosider ekstraheres RNA fra celler (typisk 103-10 6 celler), renses ved udfældning og resuspension og fordøjes efterfølgende til nukleosider. Prøveblandingen bestående af kanoniske og modificerede nukleosider injiceres derefter i LC-MS-systemet til analytseparation og påvisning, hvilket fører til bestemmelse af det fulde komplement af RNA-modifikationer i en organisme 21,22,23. LC-MS/MS blev for nylig brugt til at bestemme 26 RNA-modifikationer i CNS i den neurobiologiske model, Aplysia californica (A. californica). Overfloden af nogle af disse epitranscriptomiske mærker udviste tids- og regionsafhængig dynamik, der korrelerede med adfærdsændringer hos dyret24. Det var imidlertid kun muligt at påvise RNA-modifikationer i bulkprøver indeholdende >103 celler på grund af metodens begrænsede følsomhed. Disse større prøver skjulte sandsynligvis unikke og funktionelt vigtige RNA-modifikationsprofiler af individuelle celler med populationsgennemsnit. Selv om omhyggelig kontrol af prøveforberedelsesbetingelserne har forbedret detektionsgrænserne for RNA-modifikationer i små volumenprøver 25,26,27,28, er der fortsat behov for analysemetoder, der kan detektere og kvantificere flere modificerede ribonukleosider i enkeltceller.
Denne protokol introducerer enkelt-neuron RNA-modifikationsanalyse ved massespektrometri (SNRMA-MS), som tillader påvisning af over et dusin RNA-modifikationer i enkelte neuroner fra CNS af A. californica29. Fremgangsmåden består af kirurgisk isolering af enkelte, identificerede celler fra større CNS-ganglier efterfulgt af en optimeret prøveforberedelsesarbejdsgang, der involverer mekanisk cellelyse, RNA-denaturering og enzymatisk hydrolyse i en MS-kompatibel buffer. Identifikation og kvantificering af post-transkriptionelt modificerede nukleosider opnås derefter ved hjælp af LC-MS / MS. SNRMA-MS opfylder et uopfyldt behov inden for RNA-modifikationsanalyse ved at lette erhvervelsen af post-transkriptionelle RNA-modifikationsprofiler for enkelte neuroner og har potentiale til fremtidig anvendelse på andre celletyper.
Protocol
1. Forberedelse af materialer og opløsninger
- Tilbered kunstigt havvand (ASW) med 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 22 mM MgCl2, 26 mM MgSO4 og 10 mM HEPES i vand opnået fra et strengt rensningssystem. PH justeres til 7,8 ved hjælp af 1 M NaOH eller HCl. Forbered typisk 1 liter ASW og opbevar ved 14 °C indtil brug.
- Der fremstilles en ASW-antibiotikaopløsning med 10.000 U/ml penicillin G, 10 μg/μL streptomycin og 10 μg/μL gentamicin og opbevares ved -20 °C. Umiddelbart før eksperimentet optøes og fortyndes den frosne antibiotika stamopløsning 1:100 i 20-40 ml ASW. Den endelige koncentration af antibiotika i den arbejdende ASW-opløsning er 100 U / ml penicillin G, 100 μg / ml streptomycin og 100 μg / ml gentamicin.
- Der fremstilles en RNA-fordøjelsesbuffer ved at kombinere 1 μL 10 μg/μL bovint serumalbumin, 0,5 μL 0,5 μg/μL pentostatin, 0,495 μL 2 U/μL alkalisk phosphatase, 1 μL 0,1 U phosphodiesterase I (i 10 mM MgCl2) og 0,38 μL endonuklease fra Serratia marcescens (25 U) pr. prøve. Hvis du analyserer flere prøver, skal du forberede en masterblanding i et separat rør indeholdende volumenet af hvert reagens ganget med antallet af prøver, der skal analyseres, plus en mere for at tage højde for tilfældigt reagenstab fra pipetteoverførselstrin.
- Forbered flere skarpe nåle (enten glas eller metal) til manuel isolering af neuroner. Lav metalnåle i huset ved elektrokemisk ætsning af wolframtråd som i30 eller køb dem. Forbered glasnåle fra tykke eller standard vægborosilikatglaskapillærer (1 mm ydre diameter) ved hjælp af en mikropipette-trækker. For den nuværende metode skal nålespidsdiameteren holdes mellem 1-5 μm med en halslængde på 100-150 μm.
BEMÆRK: Fabrikation af både metal- og glasnåle kan optimeres til at producere værktøjer, der passer til forskerens individuelle behov og den specifikke biologiske model, der undersøges.
2. Isolering af enkelt neuron
- Der afkøles en 0,33 M MgCl2 opløsning til 14 °C. Brug en 50 ml sprøjte til at bedøve A. californica (150-250 g) ved at injicere MgCl2-opløsningen i dyrets kropshulrum. De bedste resultater opnås med 1: 3 forhold mellem opløsningsvolumen (ml) og dyrekropsmasse (g). Vent ca. 3 minutter på, at dyret bliver afslappet, og sørg for, at det ikke viser kropssammentrækninger som reaktion på taktil stimulering.
- Placer dyrets ventrale side (fodside) op i en dissekeringsbakke. Disseker dyret ved hjælp af kirurgisk saks med en stump spids placeret mod dyret, og lav forsigtigt et langsgående snit gennem foden.
- Fastgør de rostrale, kaudale og laterale sider af dyrekroppen for at udsætte de indre organer og CNS-ganglier, der er placeret i kropshulen. Isoler store CNS-ganglier fra dyret ved kirurgisk at afskære nerver og nogle forbindelser, der stammer fra ganglierne.
- Ganglierne nedsænkes i en opløsning af proteasetype XIV fra Streptomyces griseus (10 mg / ml i ASW-antibiotikaopløsning) og inkuberes ved 34 ° C i 30 minutter eller 1 time (til cerebral ganglion).
BEMÆRK: Inkubationsvarigheden afhænger af sæsonen, dyrets størrelse og tilstand samt målrettede neuroner. Isolering af nogle neuroner kræver længere inkubation end andre og bør bestemmes eksperimentelt. - Skyl ganglierne 6x med ASW-antibiotikaopløsning og overfør alle ganglier til i en silikonepolymerbelagt skål fyldt med ASW-antibiotikaopløsning ved hjælp af et polypropylenoverførselsrør, der er skåret til en åbning på ~ 5 mm. Behandl pipetten med 1 mg/ml bovint serumalbumin i ASW for at minimere klæbning af ganglierne til pipetten (valgfrit). Hold ganglier nedsænket i ASW til enhver tid.
BEMÆRK: Enzymatisk behandling reducerer den mekaniske stabilitet af neuroner og omgivende bindevæv, og som følge heraf kan neuronale membraner blive beskadiget på grund af udsættelse for luft under ganglieroverførsel. - Fastgør ganglierne, og brug mikrosaks og fine tang til at fjerne ganglionskeder. Med tilstrækkelig stærk enzymatisk behandling skal du bruge glas- eller metalnåle til desheathing.
- Visuelt identificere A. californica neuroner af interesse. I dette arbejde blev følgende celler undersøgt: R2 i abdominal ganglion, LPl1 i pleural ganglion, metacerebralceller (MCC'er) i cerebral ganglion og B2 celler i buccal ganglion. Tag optiske billeder af alle neurale og ganglioniske præparater ved hjælp af et kalibreret mikroskop ved 20x total forstørrelse for at bestemme størrelser og volumener af hver celletype.
- Brug en trukket glaskapillær eller skarpe wolframnåle til forsigtigt at isolere den identificerede celle fra bulkganglion.
- Der udtages en lille mængde (1 μL) ASW i en mikropipette af plast, hvorefter den isolerede celle overføres til et PCR-prøverør indeholdende 4 μL 0,365 M ammoniumacetat (pH 9,2). Til blindprøvemålinger opsamles 5 μL aliquoter af ASW-antibiotikaopløsningen fra skålen indeholdende ganglion og blandes med fordøjelsesbuffer (beskrevet nedenfor).
3. Cellelyse og RNA fordøjelse til SNRMA-MS
- Lyse de isolerede neuroner ved gentagen aspiration og dispensere med en mikropipette (~ 100 μm indre diameter) i 0,365 M ammoniumacetat. Nogle mindre celler kan ikke straks briste; for at lyse dem skal du lægge tryk over cellens diameter med en trukket glaskapillær.
- Brug en termisk cyklist til at opvarme prøverne med følgende temperaturprogram: 95 °C i 3 min, 10 °C i 3 min, hold ved 10 °C. Prøverøret fjernes fra den termiske cyklist.
- Der tilsættes 3,375 μL RNA-fordøjelsesbuffer for hver prøve, og opløsningen blandes ved hjælp af en mikropipette ved at trække opløsningen ud og dispensere flere gange. Brug en miniature bordcentrifuge ved 2700 x g i 30 s til at spinde eventuelle flydende dråber ned, der klamrer sig til PCR-rørets vægge.
- Prøverne inkuberes i varmecyklisten ved 37 °C i 3 timer efterfulgt af et hold ved 10 °C (opvarmet låg indstillet til ON). Umiddelbart efter at prøven er afkølet til 10 °C, overføres 7 μL af opløsningen til et hætteglas med autosampler udstyret med en 250 μL indsats, idet der sørges for, at der dannes bobler i autosamplerrøret.
4. Væskekromatografi-tandem massespektrometri
BEMÆRK: Analyser enkeltneuronfordøjelser og autentiske modificerede nukleosidstandarder ved hjælp af et LC-MS / MS-system udstyret med en elektrosprayioniseringskilde og seks-port diverterventil.
- For at forberede LC-systemet til adskillelse af kanoniske og modificerede nukleosider skal der kalibreres en C18-søjle (150 mm x 2,1 mm, 2,2 μm partikelstørrelse, 120 Å porediameter) med 99 % mobil fase A (5 mM ammoniumacetat, pH 5,6) og 1 % mobil fase B (60/40 mobilfase A/acetonitril (ACN)) ved en strømningshastighed på 0,2 ml/min i 12 minutter ved 36 °C. Brug OPLØSNINGSMIDLER af LC-MS-kvalitet til fremstilling af mobile faser.
- Mens LC-ligevægten kalibreres, kalibreres massespektrometeret ved at indføre en 1 mM opløsning af natriumacetat i 50/50 ACN/vand til massespektrometeret via sprøjtepumpe med en strømningshastighed på 5 μL/min. Efter kalibrering tilsluttes LC-strømmen til massespektrometeret igen.
- Programmer følgende lineære gradientparametre: 1% B i 0-5 minutter, 5% B ved 9 minutter, 7% B ved 11 minutter, 10% B ved 13 minutter, 15% B ved 32 minutter, 40% B ved 38 minutter, 50% B ved 43 minutter, 100% B ved 50 minutter, 100% B ved 60 minutter, 1% B ved 61 minutter, og en 12 minutters re-ækvilibrering ved 1% B før næste injektion.
- Ms-instrumentet betjenes i positiv tilstand med følgende parametre: kapillærspænding indstillet til 4.500 V, tørretemperatur 275 °C, N2 tørregas 5 L/min og forstøvningsgas 1 bar. Indstil omledningsventilen til affald i de første 2 minutters analyse og til kilde i resten af kørslen.
- Saml massespektre over et m/z-interval på 110-600. Vælg ioner til kollisionsinduceret dissociation ved 35-40 eV over en cyklustid på 3 s ved hjælp af en foretrukken masseliste konstrueret ved hjælp af databasen2 og et isolationsvindue på ± 0,5. Brug aktiv udelukkelse til at udelukke ioner fra fragmentering efter tre spektre.
- Indstil dynamisk MS/MS-spektreopsamling for ioner med intensiteter over og under 50.000 tællinger ved henholdsvis 4 Hz og 1 Hz og en minimumstærskel for ionvalg ved 1.990 tællinger.
- For kvantitativ SNRMA-MS konstrueres kalibreringskurver ved hjælp af ekstraherede ionkromatogram (EIC) spidsområder opnået for modificerede nukleosidstandarder ved mindst fem koncentrationer for at muliggøre interpolation af ukendte endogene analytkoncentrationer.
BEMÆRK: Neuroner opnået fra dyr med kropsmasser på 150-250 g kræver typisk kalibreringskurver for modificerede nukleosider, der spænder fra 0,02 pmol til 2 pmol, men disse værdier kan variere afhængigt af instrumentets følsomhed.
5. Analyse af data
- EIC'er genereres for modificerede nukleosider (m/z ud fra databaseværdier2). Identiteten af formodede modificerede nukleosider verificeres ved at sammenligne deres MS2-spektre og LC-retentionsegenskaber med databaseværdier2. Se tabel 1 for en liste over typiske RNA-modifikationer påvist i enkelte neuroner fra A. californica.
- Integrer toppe, der svarer til modificerede og kanoniske nukleosider, manuelt, og registrer disse værdier i et regneark. Normaliser toparealet for hvert modificeret nukleosid med summen af topområderne for kanonisk cytidin, uridin og guanosin påvist i prøven.
BEMÆRK: Adenosin er ikke inkluderet i normaliseringen på grund af dets rolle i CNS som en dynamisk neuromodulator31. - Konstruer en datamatrix bestående af hver enkeltneuronprøve og de tilsvarende normaliserede topområder for modificerede nukleosider, der udviste signal-støj-forhold >10. Udfør hovedkomponentanalyse (PCA), og vis de to første hovedkomponenter i scoreplottet. Lineære kalibreringskurver konstrueres ud fra EIC-spidsområderne opnået ved seriefortynding af nukleosidstandarder, og koncentrationerne af detekterede analysander beregnes.
Representative Results
SNRMA-MS involverer manuel isolering af identificerede neuroner i små prøvevolumener til lysis, fordøjelse og LC-MS / MS-analyse (figur 1A). Denne arbejdsgang detekterede rutinemæssigt over et dusin RNA-modifikationer i enkelte neuroner fra CNS af A. californica (figur 1B), der repræsenterer en dækning på næsten halvdelen af det kendte epitranscriptom af dette dyr24 i en enkelt celle. For eksempel resulterede udsættelse af LPl1-neuronen (~ 500 μm diameter) til SNRMA-MS i påvisning af 15 ± 1 RNA-modifikationer (n = 3). Modificerede nukleosider blev positivt identificeret på grundlag af tre attributter: LC-retentionsegenskaber, nøjagtig masse og MS2-fragmenteringsprofiler sammenlignet med værdier angivet i databasen2. Tabel 1 viser en liste over alle RNA-modifikationer påvist i LPl1-neuronen. Det firedobbelt time-of-flight massespektrometer med høj opløsning, der blev anvendt til disse eksperimenter, muliggjorde en massenøjagtighed på 4 ppm samt påvisning af den karakteristiske MS2-fragmention ved m/z 164 for det modificerede nukleosid N6,6-dimethyladenosin (m66A, figur 1B). Kombineret med LC-separationsdata, som stemmer overens med fund deponeret i databasen (m66A elutes efter N6-methyladenosin (m6A)), viste SNRMA-MS-tilgangen korrekt tildeling af modificerede nukleosididentiteter.
SNRMA-MS-platformen kan udnyttes til at etablere RNA-modifikationsprofiler af enkeltneuroner og undersøge deres forhold til bulkvæv. R2 neuroner er store (~ 500 μm i diameter) kolinerge celler, der ligger i abdominal ganglion. SNRMA-MS blev brugt til at analysere RNA-modifikationer i R2-neuroner såvel som den omgivende bulk abdominal ganglion (figur 2A). Normaliserede topområder for RNA-modifikationer i hver neuron / ganglionprøve (n = 7) blev brugt som input til PCA, hvilket afslørede, at R2-neuroner udviser forskellige RNA-modifikationsprofiler sammenlignet med ganglierne, hvor de bor (figur 2B). Dette fremgår af datapunkter for R2-neuroner og abdominale ganglier, der besætter forskellige regioner i PCA-scoreplottet. Yderligere understøttelse af unikke modificerede nukleosidmønstre blev opnået fra en separat kohorte af dyr (n = 7), hvor parvise sammenligninger blev udført for 13 RNA-modifikationer, der almindeligvis blev påvist i både enkeltneuroner og bulkvæv (figur 2C). To modificerede nukleosider, pseudouridin (Ψ) og 2'-O-methylguanosin (Gm), havde signifikant højere forekomst i abdominale ganglier sammenlignet med R2 neuroner. Når man så en delmængde af RNA-modifikationerne med R2 neuron-ganglionpar indikeret, udviste alle abdominale ganglier højere niveauer af Ψ og Gm, og alle undtagen en af R2-neuronerne havde højere forekomster af 2'-O-methyladenosin (Am) end deres tilsvarende ganglion (figur 2D). Samlet set afslører SNRMA-MS-resultaterne for første gang, at RNA-modifikationsprofiler af enkeltceller kan afvige fra bulkceller i samme væv.
Brug af SNRMA-MS til at undersøge modeldyret A. californica giver en unik mulighed for at karakterisere RNA-modifikationsprofiler i identificerede, funktionelt forskellige neuroner. RNA-modifikationer blev evalueret af SNRMA-MS i fire identificerede celler: R2 og LPl1 (homologe, kolinerge celler involveret i defensiv slimfrigivelse)32, MCC'er (serotonerge modulerende neuroner involveret i fodring)33 og B2-celler (peptidergiske neuroner involveret i tarmmotilitet)34. PCA af seks RNA-modifikationer i disse identificerede neuroner, enten isoleret umiddelbart efter enzymatisk behandling eller dyrket i et ganglionpræparat i 48 timer, demonstrerede stabiliteten og dynamikken i enkeltcelleepitranscriptomer. RNA-modifikationer i funktionelt forskellige celler dannede unikke klynger i scoreplottet, mens homologe R2 / LPl1-neuroner co-grupperede (figur 3A). Belastningsdiagrammet viser, at forskellene primært skyldtes forekomsten af positionelle isomerer af methyladenosin, herunder 2'-O-methyladenosin (Am) og N1-methyladenosin (m1A) (figur 3B). I samme analyse blev der udført en sammenligning af frisk isolerede celler og celler dyrket in situ (dvs. i deres respektive ganglier) i 48 timer. Som vist i PCA-scoreplottet forblev funktionelt forskellige celler kendetegnet ved deres RNA-modifikationsprofiler.
Kvantitativ SNRMA-MS kan bruges til at bestemme absolutte mængder af udvalgte RNA-modifikationer, for hvilke autentiske standarder er tilgængelige. Eksterne kalibreringskurver blev genereret for m1A, Ψ, 2'-O-methylcytidin (Cm), Am og m6A, og mængden af hvert modificeret nukleosid i MCC- og R2/LPl1-celleparrene blev bestemt ved interpolation (figur 4A-E). De intracellulære mængder af m1A og Ψ i to par symmetriske MCC'er syntes at være ens, mens større forskelle i mængderne af disse modifikationer blev observeret i tre par R2 / LPl1-celler. For at tage højde for forskelle på grund af den fysiske størrelse af de undersøgte celler blev RNA-modifikationsmængder normaliseret af cellevolumener beregnet ud fra optisk måling af cellediametre for at give intracellulære koncentrationer af modificerede nukleosider. Signifikante forskelle i intracellulære koncentrationer af Cm og Am blev observeret mellem MCC'er og R2 / LPl1 neuroner. Samlet set muliggør SNRMA-MS både kvalitativ og kvantitativ profilering af RNA-modifikationer i enkelte neuroner.
Figur 1: SNRMA-MS workflow og påvisning af flere RNA-modifikationer i enkelte neuroner af LC-MS / MS. (A) Fotografier af desheathed bukkale ganglion og enkelt neuronisolering i et prøverør. Skalabjælke = 200 μm, pile angiver identificeret B1-celle. Der vises også et diagram over prøveforberedelsesproceduren til LC-MS/MS-analyse. (B) Overlejrede EIC'er til RNA-modifikationer i et enkelt LPl1-neuron, med indsat, der viser MS1- og MS2-spektre for N6, N6-dimethyladenosin (m66A). Se tabel 1 for m/z-værdier , der anvendes til at generere EIC'er for modificerede nukleosider. Dette tal er ændret fra29. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: SNRMA-MS skelner mellem RNA-modifikationsprofiler af enkeltneuroner og bulkvæv. (A) Skematisk af A. californica CNS og arbejdsgang til analyse af R2-neuroner og den omgivende abdominale ganglion. Fotografiet viser abdominal ganglion og R2 neuron (injiceret med Fast Green farvestof for synlighed). (B) Relative topområder fra 13 RNA-modifikationer blev brugt til at generere PCA-score (top) og indlæsning (bund) plots. (C) Parvis sammenligning af RNA-modifikationer i abdominal ganglion og R2 neuron. Fejlbjælker repræsenterer ±1 standardafvigelse (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10−4, parret t-test med Bonferroni−Holm korrektion. (D) Sammenligning af udvalgte RNA-modifikationer fra panel C, hvor R2-abdominal ganglionpar for hvert dyr er vist med droplines. Dette tal er ændret fra29. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Profilering af RNA-modifikationer i identificerede, funktionelt forskellige neuroner fra A. californica CNS. (A) PCA-scoreplot for MCC'er og B2-, R2- og LPl1-celler, der enten var frisk isolerede eller isolerede efter in situ-kultur i 48 timer (betegnet med cMCC, cB2, cR2, cLPl1) og (B) indlæsningsplotter for seks RNA-modifikationer, der almindeligvis detekteres i disse celler. Dette tal er ændret fra29. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvantitativ SNRMA-MS i A. californica neuroner. Kvantitativ SNRMA-MS giver absolutte mængder og intracellulære koncentrationer for flere modificerede nukleosider i enkelte, identificerede A. californica neuroner. Fotografier af (A) venstre og højre MCC'er (henholdsvis LMCC og RMCC) i cerebral ganglion og (B) R2 i abdominal ganglion og LPl1 i pleural ganglion. Celler er cirklet for at forbedre synligheden. Lineære kalibreringsdiagrammer for (C) m1A og (D) Ψ (trekanter), der anvendes til interpolation af modificerede nukleosidmængder i enkeltceller (farvede prikker). Cellepar fra hvert dyr er mærket 1-3. (E) Intracellulære koncentrationer af fem modificerede nukleosider i MCC- og R2/LPl1-cellepar. Tykke linjer forbinder cellepar. *p < 0,05, **p < 0,005, parret t-test med Bonferroni−Holm-korrektion, n = 2 dyr (fire celler i alt) for MCC'er og n = 3 dyr (seks celler i alt) for R2/LPl1. Dette tal er ændret fra29. Klik her for at se en større version af denne figur.
| RNA modifikation | Forkortelse | Elution ordre (C18) | m/z for EIC | m/z for MS2 |
| dihydrouridin | D | 1 | 247.09 | 115 |
| pseudouridin | Y | 2 | 245.08 | 209/179/155 |
| 3-methylcytidin | m3C | 3 | 258.11 | 126 |
| N1-methyladenosin | m1A | 4 | 282.12 | 150 |
| 5-methylcytidin | m5C | 5 | 258.11 | 126 |
| N7-methylguanosin | m7G | 6 | 298.12 | 166 |
| 2'-O-methylcytidin | Centimeter | 7 | 258.11 | 112 |
| inosin | I6A | 8 | 269.09 | 137 |
| 2'-O-methylguanosin | Gm | 9 | 298.12 | 152 |
| N2-methylguanosin | m2G | 10 | 298.12 | 166 |
| N2,N2,N7-trimethylguanosin | M227G | 11 | 326.15 | 194 |
| N2,N2,-dimethylguanosin | m22G | 12 | 312.13 | 180 |
| 2'-O-methyladenosin | Am | 13 | 282.12 | 136 |
| N6-methyladenosin | m6A | 14 | 282.12 | 150 |
| N6,N6-dimethyladenosin | M66A | 15 | 296.14 | 164 |
| N6-isopentenyladenosin | i6A | 16 | 336.17 | 204/136/148 |
Tabel 1: RNA-modifikationer påvist i enkelte neuroner fra A. californica. Attributter til karakterisering af modificerede nukleosider er angivet, herunder LC-retentionsrækkefølge, m/z til generering af EIC'er og tilsvarende CID-fragmenter.
Discussion
SNRMA-MS udnytter en optimeret prøveforberedelsesmetode, hvilket resulterer i en lille, MS-kompatibel prøvevolumen, der kan leveres til LC-MS-platformen. Den indledende enzymatiske forbehandling af CNS-ganglier dikterer både den lethed, hvormed de kan desheathes og holdbarheden af enkelte neuroner under isolering. Den cerebrale ganglion kræver ofte udvidet enzymatisk behandling på grund af sin relativt tykke kappe sammenlignet med bukkale, pleurale og abdominale ganglier. Individuelle forskere, der udfører de enkelte neuronisoleringer, kan have forskellige præferencer for, hvor holdbar skeden skal være, når man bruger mikrosakser og fine tang. Det er dog vigtigt, at ganglierne ikke overfordøjes, da dette kan føre til tab af deres strukturelle integritet, tab af positionel information, der er afgørende for at identificere målceller og / eller cellelyse. Efter isolering fra ganglion er det vigtigt at sikre, at et minimalt volumen isolationsmedium aspireres, når neuronen overføres til prøverøret. ASW-mediet indeholder en høj koncentration af salte, der kan forstyrre fordøjelsesenzymer under RNA-hydrolyse og vil også fortynde prøven.
Under det mekaniske lysistrin er det almindeligt, at store neuroner (>250 μm diameter) brister ved gentagne gange at passere gennem en mikropipette. Mindre neuroner kan kræve yderligere opmærksomhed for at sikre cellelyse, hvilket typisk indebærer at trykke et glaskapillær på cellen. I dette tilfælde er det muligt, at et delvist volumen af prøvebufferen trækkes ind i kapillæren på grund af kapillærkræfter. Dette volumen kan leveres tilbage i prøverøret ved at anvende tryk på enden af glaskapillæren for at sikre, at ingen prøve går tabt.
De bedste resultater opnås ved at inkludere et opvarmningstrin inden tilsætning af enzymer til RNA-fordøjelse. Dette skyldes sandsynligvis, at opvarmning ved 95 ° C denaturerer RNA-sekundære strukturer, der kan hæmme aktiviteten af RNases35 og mindske mængden af nukleosider frigivet fra RNA-biopolymerer. Kontroleksperimenter ved hjælp af prøver spidset med stabil isotopmærket methionin blev tidligere udført for at undersøge, om varmeinducerede RNA-modifikationsartefakter var årsagen til de øgede topområder, der blev observeret for RNA-modifikationer i forhold til en SNRMA-MS-protokoluden varme 29. Ingen sådan mærkning blev observeret, hvilket indikerer, at de forbedrede signaler for RNA-modifikationer ved anvendelse af den optimerede SNRMA-MS-metode skyldtes overlegen fordøjelse af RNA.
Konventionelle metoder til isolering af total RNA fra celler involverer væske-væskeekstraktion (LLE) med phenol-chloroform og efterfølgende RNA-udfældning, vask og resuspension. Disse tilgange har vist sig nyttige til reverse transkriptionspolymerasekædereaktionseksperimenter, hvor ekspressionen af udvalgte gener let kan overvåges i identificerede A. californica neuroner36,37. LLE-metoder kan imidlertid ikke genvinde tilstrækkeligt RNA til påvisning af modificerede ribonukleosider ved LC-MS, mens SNRMA-MS-metoden beskrevet heri muliggør påvisning af adskillige RNA-modifikationer29. For at vurdere modifikationsprofiler af specifikke RNA-typer (f.eks. rRNA, tRNA, mRNA) i bulkvæv / celleprøver er anionbytning fastfaseekstraktion24, hybridiseringssondebaseret berigelse38 og kromatografisk fraktionering39-tilgange blevet anvendt, men lignende metoder er endnu ikke tilgængelige til enkeltcelle RNA-oprensning. Udviklingen af RNA-fraktioneringsmetoder, der er i stand til at isolere specifikke RNA-typer fra enkeltceller, ville give yderligere indsigt i funktionen af RNA-modifikationer.
SNRMA-MS afslørede tidligere ukarakteriseret heterogenitet i RNA-modifikationslandskabet af enkeltneuroner i A. californica , og det er tænkeligt, at der findes lignende forskellige PTM-profiler på tværs af pattedyrceller. Fordi pattedyrceller er relativt små sammenlignet med de store A. californica neuroner analyseret i denne protokol, er der behov for forbedringer i håndteringen af små prøvevolumener for at lette lavere detektionsgrænser. Selvom SNRMA-MS i øjeblikket er begrænset til mængder på ~ 5 μL, forventes det, at der kan opnås betydelige forbedringer ved at inkorporere mikrofluidiske væskehåndteringsanordninger i arbejdsgangen. Desuden vil implementeringen af automatiserede eller halvautomatiske celleisolationer øge prøvegennemstrømningen og muliggøre enkeltcelle-RNA-modifikationsanalyse af større cellepopulationer. Ved grænseflade med nanoflow LC-separationer27 vil karakteriseringen af epitranscriptomiske mærker i endnu mindre celler være opnåelig.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institute on Drug Abuse under award nr. P30DA018310 og National Human Genome Research Institute under award nr. Rm1HG010023. K.D.C. anerkender støtte fra et Beckman Institute Postdoctoral Fellowship. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringsorganernes officielle synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
| Benchtop equipment | |||
| Glass capillary puller | Sutter | P-97 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | ||
| Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
| Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
| HPLC column and consumables | |||
| Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
| Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
| LC and MS Instrumentation and Software | |||
| DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
| Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment | |
| Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | Equipped with ESI source | |
| RStudio | RStudio | ||
| Microdissection tools | |||
| Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
| Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
| Reagents/Materials | |||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
| Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
| Benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| Nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
| Pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
| Phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
| Protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |
References
- Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 195-201 (2011).
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46, 303-307 (2017).
- Kimura, S., Waldor, M. K. The RNA degradosome promotes tRNA quality control through clearance of hypomodified tRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (4), 1394-1403 (2019).
- Helm, M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. Nucleic Acids Research. 34 (2), 721-733 (2006).
- Rezgui, V. A. N., et al. tRNA tKUUU, tQUUG, and tEUUC wobble position modifications fine-tune protein translation by promoting ribosome A-site binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12289-12294 (2013).
- Shanmugam, R., et al. Cytosine methylation of tRNA-Asp by DNMT2 has a role in translation of proteins containing poly-Asp sequences. Cell Discovery. 1 (1), 1-10 (2015).
- Jia, G., et al. N 6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology. 7 (12), 885-887 (2011).
- Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N 1 -methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
- Krogh, N., et al. Profiling of 2′-O-Me in human rRNA reveals a subset of fractionally modified positions and provides evidence for ribosome heterogeneity. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7884-7895 (2016).
- Babaian, A., et al. Loss of m1acp3Ψ Ribosomal RNA Modification Is a Major Feature of Cancer. Cell Reports. 31 (5), 107611 (2020).
- Chang, M., et al. Region-specific RNA m6A methylation represents a new layer of control in the gene regulatory network in the mouse brain. Open Biology. 7 (9), 170166 (2017).
- Wang, C. -X., et al. METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development. PLOS Biology. 16 (6), 2004880 (2018).
- Engel, M., et al. The role of m6A/m-RNA methylation in stress response regulation. Neuron. 99 (2), 389-403 (2018).
- Widagdo, J., et al. Experience-dependent accumulation of N6-Methyladenosine in the prefrontal cortex is associated with memory processes in mice. Journal of Neuroscience. 36 (25), 6771-6777 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), 20-29 (2011).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nature Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 451-464 (2005).
- Chan, C. T. Y., et al. A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress. PLOS Genetics. 6 (12), 1001247 (2010).
- Sun, C., Jora, M., Solivio, B., Limbach, P. A., Addepalli, B. The effects of ultraviolet radiation on nucleoside modifications in RNA. ACS Chemical Biology. 13 (3), 567-572 (2018).
- Heiss, M., Hagelskamp, F., Marchand, V., Motorin, Y., Kellner, S. Cell culture NAIL-MS allows insight into human tRNA and rRNA modification dynamics in vivo. Nature Communications. 12 (1), 389 (2021).
- Clark, K. D., Lee, C., Gillette, R., Sweedler, J. V. Characterization of neuronal RNA modifications during non-associative learning in aplysia reveals key roles for tRNAs in behavioral sensitization. ACS Central Science. 7 (7), 1183-1190 (2021).
- Basanta-Sanchez, M., Temple, S., Ansari, S. A., D'Amico, A., Agris, P. F. Attomole quantification and global profile of RNA modifications: Epitranscriptome of human neural stem cells. Nucleic Acids Research. 44 (3), 26 (2016).
- Huang, W., et al. Determination of DNA and RNA methylation in circulating tumor cells by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (2), 1378-1384 (2016).
- Sarin, L. P., et al. Nano LC-MS using capillary columns enables accurate quantification of modified ribonucleosides at low femtomol levels. RNA. 24 (10), 1403-1417 (2018).
- Clark, K. D., Philip, M. C., Tan, Y., Sweedler, J. V. Biphasic liquid microjunction extraction for profiling neuronal RNA modifications by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (18), 12647-12655 (2020).
- Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry: Characterizing RNA modification patterns and dynamics with single-cell resolution. Analytical Chemistry. 93 (43), 14537-14544 (2021).
- Guise, O. L., Ahner, J. W., Jung, M. -C., Goughnour, P. C., Yates, J. T. Reproducible electrochemical etching of tungsten probe tips. Nano Letters. 2 (3), 191-193 (2002).
- Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., Xu, M. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science. 369 (6508), (2020).
- Rayport, S. G., Ambron, R. T., Babiarz, J. Identified cholinergic neurons R2 and LPl1 control mucus release in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 49 (4), 864-876 (1983).
- Rosen, S. C., Weiss, K. R., Goldstein, R. S., Kupfermann, I. The role of a modulatory neuron in feeding and satiation in Aplysia: effects of lesioning of the serotonergic metacerebral cells. Journal of Neuroscience. 9 (5), 1562-1578 (1989).
- Lloyd, P. E., Kupfermann, I., Weiss, K. R. Central peptidergic neurons regulate gut motility in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 59 (5), 1613-1626 (1988).
- Crain, P. F. Preparation and enzymatic hydrolysis of DNA and RNA for mass spectrometry. Methods in Enzymology. 193, 782-790 (1990).
- Kadakkuzha, B. M., et al. Age-associated bidirectional modulation of gene expression in single identified R15 neuron of Aplysia. BMC Genomics. 14 (1), 880 (2013).
- Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51075 (2014).
- Tardu, M., Jones, J. D., Kennedy, R. T., Lin, Q., Koutmou, K. S. Identification and quantification of modified nucleosides in saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1403-1409 (2019).
- Heiss, M., Reichle, V. F., Kellner, S. Observing the fate of tRNA and its modifications by nucleic acid isotope labeling mass spectrometry: NAIL-MS. RNA Biology. 14 (9), 1260-1268 (2017).
