Summary
AlPcS2aを介した発色団支援レーザー不活性化(CALI)は、生細胞の細胞内小胞(IV)の時空間的損傷を研究するための強力なツールです。
Abstract
細胞内小胞(IV)は、小胞の細胞質へのエンドサイトーシスによって形成されます。IV形成は、IV膜の透過処理やエンドソームやリソソームの形成を通じて、さまざまなシグナル経路の活性化に関与しています。発色団支援レーザー不活性化(CALI)と呼ばれる方法は、IVの形成とIV制御の制御における材料の研究に適用されます。CALIは、膜透過処理によって誘導されるシグナル伝達経路を研究するためのイメージングベースの光力学方法論です。この方法は、選択された細胞小器官の時空間操作を細胞内で透過処理することを可能にする。CALI法は、エンドソームやリソソームの透過処理を通じて特定の分子を観察・モニタリングするために応用されています。IVの膜破裂は、ガレクチン-3などの糖鎖結合タンパク質を選択的に動員することが知られています。ここでは、AlPcS2a によるIV破裂の誘導と、障害のあるリソソームを標識するためのマーカーとしてのガレクチン-3の使用について説明しており、さまざまな状況下でのIV膜破裂の下流効果とその下流効果の研究に役立ちます。
Introduction
細胞内小胞(IV)の一種であるエンドソームは、エンドサイトーシスによって形成され、その後リソソームに成熟します。さまざまな細胞内シグナル経路がIVの形成に関与しています。さらに、異なる内因性および外因性刺激がIVを損傷する可能性があります(たとえば、病原体は感染中に境界膜から逃げ出し、細胞質1に入る可能性があります)。これは通常、エンドサイトーシス小胞2の破裂を伴う。したがって、IVを標的にして損傷を与えるための技術は、関連する研究3で使用できます。
光線力学療法(PDT)は、腫瘍や病原体を殺すことによって病気と戦うための光依存療法です4。PDTでは、標的細胞は、光増感剤と呼ばれる非毒性発色団で標識され、光照射によって局所的に活性化され得る5,6。光増感剤は光からエネルギーを吸収して励起一重項状態に変化し、長寿命の励起三重項状態になります。三重項状態の光増感剤は、電子またはエネルギー移動を受け、酸素の存在下で活性酸素種(ROS)を形成することができ、照明領域7内の標識細胞を空間的に破壊することができる。結果は光の力によって異なります8.光増感剤の濃度と光照射の強度を制御することにより、発色団支援光不活性化(CALI)9と呼ばれる、細胞溶解なしで標的生体分子を選択的に不活性化することができます。さまざまな細胞内標的を選択的に標識できる光増感剤の大幅な開発により、CALIは、ヌクレオチドやタンパク質などの低分子生体分子、およびミトコンドリアやエンドリソソームなどの細胞小器官の生体分子の光を介した不活性化を制御するための貴重なツールになりました3,10,11,12,13。
CALIと比較して、細菌毒素14,15やリソソーム損傷に対するLeu-Leu-OMe16治療などの膜を損なうために化学的または物理的方法も使用されます。ただし、これらの方法では、細胞内のIVの大量の障害が表示されます。堅牢な光増感剤(すなわち、Al(III)フタロシアニンクロリドジスルホン酸(AlPcS2a))がCALIで使用されます。AlPcS2aは、エンドサイトーシスを介してリソソームを標的とし、制御領域17においてエンドソームまたはリソソームを破裂させるために使用される。AlPcS2aは、細胞膜不透過性のフタロシアニンベースの発色団であり、原形質膜上の脂質に結合し、エンドサイトーシスを介してインターナライズされ、最終的にはエンドサイトーシス経路18を介してリソソーム内に蓄積する。近赤外スペクトル領域内の光を吸収し、励起されたAlPcS2a18によって生成される主要なROSである一重項酸素を生成します。一重項酸素の崩壊は、細胞内の小さな領域(約10-20 nm)内での拡散と反応の距離を急速に制限します19。AlPcS2aインキュベーションと光照明の持続時間を調整することにより、細胞内領域内のIVの損傷の時空間制御が可能になります。したがって、CALIは、IV損傷の結果、およびIVの形成と調節を調べるための強力なツールになります。
この研究では、光増感剤としてAlPcS2aを使用するCALIの特定のプロトコルに対処します。このプロトコルは、エンドソームやリソソームを含むさまざまなタイプのIVに適用でき、膜破裂後のフォローアップ応答を調べるために使用できます。リソソーム破裂後に明らかにされた蛍光色素結合ガレクチン-316,20を発現するHeLa細胞を使用して、このプロトコルを実証します。
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Protocol
1. AlPcS2a ストック調製
- 10 mgのAlPcS2a を400 μLの0.1 M NaOHに溶解します。溶解性を向上させるには、溶液を50°Cで加熱し、渦巻きます。
- 溶液を4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と混合します。次に、溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、不溶性沈殿物を除去します。
- UV-Vis分光光度計で溶液の濃度を測定します。672 nmにおけるAlPcS2aの吸光係数は4 x 104 cm-1 M-1である。AlPcS2a溶液をPBSで希釈して、1 mM溶液を作ります。1 mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。
2. トランスフェクション
注:Gal3-GFPは、リソソーム破裂の生細胞イメージングの指標として適用されます。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEMでHeLa細胞培養を維持します。細胞をPBSで洗浄した後、細胞をトリプシン処理し、次いで10%FBSを添加したDMEMに細胞を再懸濁する。
注:この方法は、HeLaおよびA549細胞株を含む、ほとんどの添付細胞株に適用できます。原則として、浮遊細胞をテストしないにもかかわらず、それらを使用してCALIアッセイを実行することができました。 - 300 ngのGal3-GFPプラスミドを25 μLの還元血清培地で希釈し、0.6 μLのP3000試薬を加えます。穏やかに混ぜる。0.45 μLのリポフェクタミン3000試薬を25 μLの還元血清培地で希釈します。穏やかに混ぜる。
- 室温で5分間インキュベートします。希釈したDNAと希釈したリポフェクタミン3000を混合し、室温で10分間インキュベートします。
- DNA-リポフェクタミン混合物、3 x 105 懸濁HeLa細胞、および200 μLのDMEM + 10%FBSを混合し、35 mmガラスボタン皿の中央ガラス領域に細胞を播種します。
3. AlPcS2a染色
- 細胞付着を可能にするために、 5%CO2を供給したインキュベーター内で細胞を37°Cで少なくとも4時間インキュベートする。
- 10%FBSを添加したDMEMでAlPcS 2aを希釈して、1 μMのAlPcS2a溶液を作成します。AlPcS2a含有培地を37°Cの水浴中で予め温める。培養液をAlPcS2a含有培地と交換します。
- 細胞を5%CO2 を供給したインキュベーター内で37°Cで一晩(16-18時間)インキュベートする。
- 翌日、細胞をPBSで2回洗浄し、細胞外AlPcS2aを除去した。培地を新しい培地と交換し、37°Cで4時間インキュベートして、エンドサイトーシス経路に沿った残留色素がリソソームに蓄積できるようにします。
注:エンドソームを染色するには、10%FBSを含むDMEM中の1 μM AlPcS2a 中で細胞を37°Cで15分間インキュベートします。 次に、細胞をPBSで2回洗浄し、イメージングする前に予熱した培地でインキュベートします。
図 1.AlPcS2aによる選択的IV損傷を表す模式図である。 図は、選択的IV損傷の概略図を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.AlPcS2aによるリソソーム染色。 HeLa細胞で1 μM AlPcS2a で一晩標識したリソソームを50 nM緑色蛍光色素で陽性染色します。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. サンプルイメージングと光照明
注:培養皿中の単一細胞またはすべてのAlPcS2a標識細胞の細胞内領域内のIV損傷を行うことができます。培養皿全体のバルク照明は、生化学的研究を含むこの損傷の定量的研究を可能にする。
- 以下に説明するように、単一細胞内のリソソームを損傷することによって単一細胞を操作します。
- 培養皿を共焦点顕微鏡のステージに置きます。GFPとAlPcS2aを励起するには、それぞれ488nmと561nmのレーザーを使用します。
- 損傷するように選択されたAlPcS2a標識小胞上の5 x 5 μm2の関心領域(ROI)を丸で囲みます。
- パルスは、0.21mWの633nmレーザーでROIを70回繰り返し照射します。リソソーム膜透過処理の指標としてGal3プンクタの形成を監視する。
- 下記のように培養皿中のすべての標識細胞を損傷する。
- 文化皿をプラットフォームに置きます。660nmのコリメートLED光で皿を照らします(近赤外光はAlPcS2aの励起スペクトルの理想的なベースです)。
- 培養皿を顕微鏡に置き、ステップ4.1.3で述べたように膜透過処理の指標を監視します。
- 次の指標を使用してIVの損傷を評価します。
- エンドソームまたはリソソームの内容物は最も高度にグリコシル化されており、IV破裂時に細胞質ゾルに曝露されます。ガレクチン-1、ガレクチン-3、ガレクチン-8、およびガレクチン-9を含む細胞質糖鎖結合ガレクチンを使用して、これらを迅速に標識します16,20。
- 創傷の大きさは、21に記載されるような膜不透過性色素の放出によって決定することができる。
- エンドソームとリソソームの違いは、それらの管腔pH値です。リソソーム破裂は管腔pHを乱すが、これはFITC−デキストラン3などのpH感受性色素を用いて測定することができる。
図 3.AlPcS2aを介したCALIは、照明領域内のリソソームへのTagRFP-ガレクチン-3(Gal3)の局所動員を誘導します。 TagRFP-ガレクチン-3発現HeLa細胞のリソソームを1 μM AlPcS2aで一晩染色した後、黄色の四角の中に近赤外光(633 nm)で集束照明を行いました。黄色の四角形内のAlPcS2a シグナルは光退色され、TagRFP-ガレクチン-3プンクタの形成を伴う。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
エンドソームおよびリソソームを含むIVのAlPcS2a誘発損傷を表す模式図が示されている(図1)。
市販のマーカーを使用して、AlPcS2a 染色条件を決定することができる。例えば、AlPcS2a 点状点および緑色蛍光色素22 共局在(図2)。
蛍光色素標識ガレクチン-3は、IV損傷をモニタリングするための指標として適用できます(図3)。さらに、Gal3 punctaの位置は、リソソーム修復およびリソファジー3,23を含む下流シグナル伝達経路をアッセイするために追跡することもできます。細胞質ゾルから損傷したIVへのGal3の急速な蓄積は、Gal3の強度を有意に増加させ、画像のコントラストが細胞質質Gal3を示すように調整された場合、Gal3点の強度を飽和させるであろう。実際、画像は細胞質Gal3のわずかな減少も示しました。
要約すると、これらの結果は、AlPcS2aベースのCALIがROI内の局所的なリソソーム破裂を制御し、残りのリソソームを無傷のままにすることができることを示しています。
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Discussion
AlPcS2aは原形質膜に結合し、次いでエンドサイトーシスによって内在化され、最終的にリソソームに蓄積する。AlPcS2aは、したがって、インキュベーション期間を調整することによって細胞内区画に局在化することができる。この方法論の限界は、ERやゴルジ装置など、IVの膜源が他にもたくさんあるため、エンドサイトーシスを介してAlPcS2aによって標識できるのはIVの亜集団のみであることです。さらに、初期または後期エンドソームへのAlPcS2aの選択的標識は困難ですが、蛍光マーカーを使用して、細胞内イメージング中に初期形成エンドソームと後期形成エンドソームを区別することができます。CALI誘発IV損傷は、種々の色素3、24を用いて誘発され得る。
損傷の強さは、光のパワーと照明時間によって制御できます。損傷の強度が高いと、細胞の収縮または壊死を引き起こす可能性があります。ここでは、IV損傷のいくつかの指標が示されており、実験条件を決定するために使用できます。さらに、これらの指標は、損傷したIVのマーカーとしても機能し、時間の経過に伴う細胞内分布に関する情報を提供する可能性があります。
臨床的には、AlPcS2a は、光化学的インターナリゼーション(PCI)25を通じて、部位および時間特異的な方法で治療薬の送達を改善するように設計されています。しかしながら、細胞のアポトーシスまたは分化などの避けられない副作用も、PCI治療26を伴い得る。そのような効果はリソソーム損傷の誘導の結果であり得るので、提供されたアッセイは前臨床使用のための潜在的なツールを提示する。
この研究では、AlPcS2aを介したCALIプロトコルは、損傷サイズ(エンドソームまたはリソソームの局所および一部)の選択的制御を記述します。科学者は細胞内の挙動を監視できますが、残りのIVは無傷のままであり、コントロールとして扱うことができます。この方法論はいくつかの研究に適用されています。例えば、損傷したリソソームは、ユビキチンおよび微小管関連タンパク質軽鎖3(LC3)で順次標識され、オートファジークリアランス3を受ける。さらに、損傷したエンドソーム上のガレクチン−3およびガレクチン−8標識は、細胞表面グリカン27によって制御される。AlPcS2aはPCIのためにインビボで使用されてきたので、AlPcS2a媒介CALIもインビボで使用することができる。このプロトコルは、AlPcS2aを介したCALIを使用して細胞生物学を研究するための堅牢なツールを提供します。これらの研究は、AlPcS2aを介したCALIが細胞生物学研究のための堅牢なツールであることを裏付けています。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、研究支援を提供してくれた中央研究院炎症コア施設、IBMSに感謝したいと思います。コア施設は、中央研究院コア施設および革新的機器プロジェクト(AS-CFII-111-213)によって資金提供されています。著者らは、画像取得を支援してくれた中央研究院(AS)の生物医科学研究所(IBMS)の共通機器コア施設に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
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