Summary
我们提出了一种人心室心肌组织 离体 培养的方案。它允许对收缩力和动力学进行详细分析,以及应用前负荷和后负荷来更密切地模拟 体内 生理环境。
Abstract
心肌细胞培养已经经历了大量的发展,从二维(2D)细胞培养到iPSC衍生的类器官。2019年,展示了一种从人体心脏样本中获得的离 体 培养心肌切片的方法,同时接近心肌收缩的 体内 状态。这些样本主要来自心脏移植或左心室辅助装置放置。使用振动切片机和专门开发的培养系统,在固定线和弹簧线之间放置300μm厚的切片,允许稳定和可重复的培养数周。在栽培过程中,切片根据个体设置不断受到刺激。可以实时显示和记录收缩,并且可以很容易地应用药理学药物。可以安排和执行用户定义的刺激方案,以评估重要的收缩参数,如暂停后增强、刺激阈值、力-频率关系和不应期。此外,该系统可实现可变的前负荷和后负荷设置,以实现更生理的培养。
在这里,我们提出了一个分步指南,介绍如何使用商业仿生培养解决方案成功长期培养人类左心室心肌切片。
Introduction
在过去的十年中,心肌细胞的体外培养取得了很大的进步,从2D和三维(3D)技术到使用类器官和诱导多能干细胞分化成心肌细胞1,2,3。离体和原代细胞培养已被证明具有重要价值,特别是对于遗传研究和药物开发4,5,6。使用人体组织可提高结果的转化价值。然而,具有完整几何形状的心肌组织的长期3D培养尚未得到很好的证实。完整的几何形状是模拟体内条件的关键特征,因为适当的心脏功能,不同细胞之间的通信以及细胞 - 基质相互作用是先决条件。心肌组织培养经历了不同的发展阶段。离体心肌组织培养的成功率和稳定性最初相当低,但最近的方法已经产生了有希望的结果7,8,9,10,11。
其中,Fischer等人是第一个证明人心肌组织的活力和收缩性能可以在离体细胞培养中维持数周7的人。他们的技术基于从外植的人类心肌中切割的薄组织切片,这些切片被安装在新开发的培养室中,提供明确的生物力学条件和连续的电刺激。这种培养方法与心肌组织的体内功能非常相似,并且已被几个独立的研究小组2,12,13,14,15重现。重要的是,Fischer等人使用的腔室还使已发展的力量连续注册长达4个月,从而为完整人类心肌7的生理和药理学研究开辟了前所未有的机会。
其他研究小组独立开发了类似的技术,并应用于人,大鼠,猪和兔心肌7,10,11。Pitoulis等人随后开发了一种更生理的方法,该方法在收缩周期中再现了正常的力-长度关系,但不太适合于高通量分析16。因此,仿生培养的一般方法可以被视为动物实验的还原,精炼和替换(3R)的又一步。
然而,利用这种潜力需要标准化的程序、高含量分析和高通量水平。我们提出了一种技术,该技术将活体心肌的自动切片与 体外 维护相结合,在已经商业化的仿生培养系统中(见 材料表)。使用所提出的方法,可以从单个透壁心肌标本中生成的单个切片的数量仅受处理时间的限制。具有足够大小和质量(3 cm x 3 cm)的标本通常产生20-40个组织切片,使用自动振动切片机可以方便地切割。这些切片可以放置在属于系统的培养室中。腔室允许电刺激,其参数可以调制(即脉冲持续时间,极性,速率和电流),以及使用腔室内的弹簧线调整前负和后载荷。每个切片的收缩由附着在弹簧线上的小磁铁的运动记录下来,并显示为可解释的图形。数据可以随时记录,并使用免费提供的软件进行分析。除了恒定的基线起搏外,还可以执行预定的方案,以功能评估其不应期,刺激阈值,暂停后增强和力 - 频率关系。
这种来自个体心脏的多个心肌切片的长期仿生培养为未来人类和动物组织的 离体 研究铺平了道路,并有助于筛查心血管医学中的治疗和心脏毒性药物作用。它已经应用于各种实验方法2,12,13,15。在这里,我们对人体组织的制备进行了详细的分步描述,并为经常遇到的栽培问题提供了解决方案。
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Protocol
这里描述的实验的组织收集得到了慕尼黑大学机构和波鸿鲁尔大学的机构审查委员会的批准。研究是根据《赫尔辛基宣言》指南进行的。患者在组织采集前给予书面知情同意。
1. 组织获取
- 从接受心脏移植或心脏手术的患者身上获取人体组织。
- 在获取组织之前,准备2L心肌停搏溶液(进一步称为切片缓冲液(表1))。
- 在获得4cm x 4cm大小的透壁左心室(LV)活检后,立即(切除后5分钟内)将组织置于含有约70mL冷(4°C)切片缓冲液的可封闭塑料一次性无菌烧杯中。保持在4°C。
注意:该协议中使用的切片缓冲液允许对组织进行冷存储(4°C)长达36小时。这允许从不靠近实验室的诊所冷运输组织。然而,24小时≤运输时间已被证明是最佳的。
2. 准备琼脂糖和振动筛
- 确保准备足够的培养室并进行灭菌(图1A)。
- 将腔室和石墨电极浸没在1L的10%异丙醇溶液中并搅拌过夜。第二天,将腔室转移到100%异丙醇溶液中3分钟,并在120°C下高压灭菌石墨电极10分钟。
- 让腔室和石墨电极在层流罩下风干。
- 根据摇臂上的可用位置将电路板连接到每个腔室。按照制造商的说明将两个石墨电极放在电路板上。
- 将35毫米培养皿盖放在腔室顶部以防止污染。
- 通过将系统连接到计算机,在37°C和5%CO2的培养箱中设置Myodish培养系统(参见材料表)(图1B)。
- 在切片缓冲液中制备4%低熔点琼脂糖(无葡萄糖; 表 2)。琼脂糖可以在4°C下储存6个月。
- 在实验当天,使用设置为80°C的水浴熔化储备体积的琼脂糖溶液。 根据数量,熔化大约需要30分钟。
- 当琼脂糖为液体时,将8 mL液体琼脂糖吸入10 mL注射器中,再吸入2 mL空气。用无菌帽关闭注射器,并将其倒置在37°C水浴中20分钟,以防止琼脂糖凝固,并平衡其温度以防止样品的热疗损伤。
- 如果存在,请在组织切片前至少30分钟打开振动切片仪的水冷却装置,以允许足够的冷却能力。将水循环温度设置为4°C。
注意:这里使用的切割盘和冷却板都包含内置的水循环。强烈建议将其用于冷却并降低污染风险。然而,也可以使用冰作为冷却技术。此外,在实验方案的此时,水冷装置不需要连接到振动筛的切割托盘和/或冷却板。 - 通过用100%异丙醇冲洗所有表面至少3分钟来清洁振动切片托盘和样品板。
注意:根据所使用的振动筛系统,振动筛的设置可能会有所不同。有关设置和叶片校准方法的信息,请参阅实验室中的振动传感器手册。 - 用切片缓冲液填充切割托盘,最高可达90%-95%。在目前使用的设置中,这相当于大约400 mL。将水冷装置的管子连接到振动仪切割盘和冷却板上的阀门上。
- 通过将制备所需的所有工具浸没在100%异丙醇溶液中5秒来消毒。从异丙醇溶液中取出工具,在层流罩下风干。
3. 修剪和嵌入样本
- 将组织样品转移到充满冷切片缓冲液的100mm培养皿中。将培养皿保持在4°C的冷却板上(连接到冷却器或放在冰上)。
- 用镊子握住心内膜,用剪刀切除约3毫米的心内膜组织,切除心内膜小梁。以同样的方式,去除外包下方的过量脂肪组织(如果存在)。
- 使用四个0.9 mm x 70 mm 20 G针将切开的组织样品(心内膜一面朝上)固定在2 cm x 2 cm橡胶贴片上,这些针固定在正方形位置(0.9 cm x 0.9 cm; 图 1C、D)。确保每个针尖的对角线边缘指向内部。这增强了固定并防止心肌损伤。
注意:上述正方形的方向应与预期的主要肌纤维方向正交。 - 用手术刀切掉四针方块外的所有多余组织。如果原始样品的大小允许,则在从同一原始样品制备过程中使用两个心肌组织样品。
- 使用镊子,将修剪后的样品放在无菌的组织上,以除去样品上残留的任何多余的切片缓冲液。为防止样品干燥,请勿将样品放在纸巾上超过10秒。
- 将样品置于35mm培养皿中,使得刀片垂直于心肌细胞排列切开并且外包朝下。如果制剂包括两个样品,请确保样品居中并且不要相互接触。
- 从水浴中取出琼脂糖注射器,将样品浸没在琼脂糖中。(图 2A)。让琼脂糖在冷却板上固化5分钟。样品必须与培养皿保持接触,这将确保切割平面平行于主要的心肌纤维方向。
注意:不要完全排空注射器,以防止气泡。注意样品浸没期间注射器中残留的琼脂糖的量。在样品皿中出现气泡的情况下,小心地将气泡拉回注射器中。
4. 将样品放在切割托盘上
- 使用刮刀或类似工具从35mm培养皿中取出含有样品的固化琼脂糖,将其楔入样品和培养皿的侧面之间。使用手术刀切掉一些琼脂糖,同时保持样品覆盖。
注意:不要去除过多的琼脂糖。在X / Z平面的长边和短边上应该至少留下5毫米琼脂糖。
注意:步骤 4.2-4.4 需要快速连续执行(即最多 5 秒)。在开始之前,所有必需的工具都触手可及。放置后无法重新定位样品。尽量限制胶水暴露在空气和湿气中。与空气或流体接触会使胶水凝固,使其无法使用。 - 用移液管将60μL胶水放入切割平台中心及其周围。
- 使用镊子将琼脂糖中所含样品的外周侧放在粘合区域的顶部。不要重新定位。样本的心内膜侧必须在琼脂糖中可见。让胶水凝固1分钟。用钝器(例如镊子)从顶部轻轻按压含有样品的琼脂糖,同时防止切割或损坏琼脂糖。
- 将样品平台放在振动切片机切割托盘的指定位置,并填充切片缓冲液。
5. 启动振动筛
- 将振动幅度设置为 1 mm,将初始切割速度设置为 0.07 mm/s。将切片的厚度设置为300μm以切割切片。
- 只要刀片只切割琼脂糖,就要将切割速度提高到最大值,在这种情况下为1.50 mm/s。一旦振动切片机开始切割组织,立即将速度降低到0.07 mm / s。
注意:如果组织切片不光滑,例如,如果样品中有较大的纤维化区域,则可能有助于将切割幅度增加到1.5 mm并将切割速度降低到0.04 mm / s。
6. 切片过程中的培养基和培养箱制备
- 在每个培养室中填充2.4 mL完全培养基(表3)。
- 将培养基中装满培养基的培养箱置于培养箱中,培养箱设置为37°C,5%CO2,21%O2和湿度为80%。使培养基平衡至少20分钟。
- 将栽培系统与计算机连接,然后启动相应的软件程序。
- 将摇臂速度设置为60 rpm,并预设刺激参数(刺激脉冲和频率)。对于人体心脏切片,将标准刺激设置为双相脉冲,电流为50 mA,每个脉冲由3 ms正电流,1 ms暂停和3 ms反向电流脉冲组成,起搏率为每分钟30次(BPM)。
注意:在保存完好的组织中,典型的刺激阈值约为15 mA。为了确保可靠的刺激并考虑刺激阈值的任何可能增加,建议将电流设置为超过刺激阈值两到三倍的值。 - 检查软件的电极指示器,以验证培养室的电极是否正常工作。
注:每当栽培软件中的通道指示器变为红色时,都需要执行操作。在这种情况下,双极性脉冲电荷不平衡。
7. 准备切片
注意:初始心内膜下切片通常不适合组织培养,由于形态不均匀,需要丢弃。在前5到10片后,切片的质地和形态得到改善。理想的切片至少为1 cm x 1 cm,没有或只有有限的纤维化贴片,不破碎,并且具有均匀的纤维对准(图2B,D)。间质纤维化位于肌细胞纤维之间,常出现在衰竭的人心肌中。令人惊讶的是,这并不是修炼成功的负面预测因素。
- 将适量的冷切片缓冲液倒入5厘米培养皿盖中,以确保切片不会变干。将切片放入含有冷切片缓冲液的培养皿盖中。
- 使用镊子将琼脂糖与组织分离。防止触摸组织。小心处理组织,因为对组织的任何损坏都会降低培养的成功率。
- 通过对光源的仔细检查来确定心肌纤维的方向。在步骤7.6中将塑料三角形附着到组织上时,这一点很重要。
注意:步骤 7.4 和 7.5 需要在 5 秒内快速连续执行。 - 使用胶水将两个塑料三角形连接到样品上,以便将组织固定在培养室内。
- 将1μL胶水放在无菌培养皿盖上。使用钩式镊子捡起其中一个高压灭菌的塑料三角形。快速将三角形的前边缘浸入胶水中,并将三角形粘贴到样品上,垂直于心肌细胞对准。对另一个三角形重复上述步骤。
- 用手术刀修剪掉超过三角形宽度的组织(图2C)。将带有两个已安装三角形的切片放回切割盘的切片缓冲区中。
注意:重复步骤7.2至7.5,直到准备足够的切片来填充培养室。我们建议准备一些额外的切片,以替换收缩不良的切片。
8. 安装切片
注意:余载荷由培养室中弹簧钢丝的刚度决定。根据弹簧钢丝的厚度,有三种不同的类型可供选择。
- 从培养箱中取一个充满培养基的培养室。选择一个准备好的切片,并通过将一个三角形连接到每个引脚将其插入腔室中。
- 根据样品大小调整安装销之间的距离。确保样品浸没在介质中。将培养箱中的腔室放回培养系统的指定插座中。
注意:不要过度拉伸组织,也不要过度弯曲弹簧线! - 将培养皿放在摇臂上后,设置预紧力。
- 通过逆时针旋转调节螺钉来降低预载荷。执行此操作,直到计算机屏幕上相应图形的基线不再更改。
- 通过顺时针转动调节螺钉,小心地增加预载荷(即增加张力)。对于刚度最高的腔室,继续操作,直到图中相应的基线增加了1000-1200个单位,对应于1 mN的预载荷。
注意:确切的调整将取决于培养室的单个弹簧常数,这可以通过在实验前根据制造商的说明进行校准来确定。记录软件允许考虑单个腔室校准,以便力以μN均匀显示。建议从栽培开始就应用电刺激。因此,切片很可能在预紧力调整期间开始收缩。在这种情况下,应关注舒张基线以评估预负荷。
9. 更改介质
- 根据 表3中的配方制备培养基。在使用培养基前不久,向50μL管中加入50μL β-巯基乙醇(50mM)。储存在4°C。
- 每2天一次,部分更换培养基。如果需要长期培养心肌切片,每2天刷新一次培养基。
- 在37°C的水浴或热风培养箱中预热新鲜培养基30-45分钟。从培养箱中取出培养室,并将其置于层流罩下。
注意:必须将腔室以及介质保持在37°C(>35°C)的温度,以防止由于低温引起的过度挛缩。不太明显的损伤可能表现为中度置换后数小时内舒张张力增加。这似乎可以恢复,但反复的压力可能会导致累积恶化。 - 从培养室中取出培养基,在培养室内留下约0.8 mL。将1.6 mL新鲜培养基加入同一腔室。培养基的总体积应约为每腔室2.4 mL。
- 将腔室的盖子放回原处,然后将培养室放回其各自的位置。
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Representative Results
将培养室插入其相应的连接器后,心肌切片的收缩显示在计算机屏幕上(图3)。人体心肌切片的收缩在刺激后立即开始。切片超收缩5-10分钟。这可见于舒张力的增加,由受损组织部分的强直挛缩引起。该过程在1-1.5小时内不同程度地恢复。稳定后,人左心室组织切片在刺激时显示出1 mN至3 mN之间的抽搐力变化。收缩期显示为收缩力的强烈增加,随后是舒张,收缩力同样急剧下降。
心肌切片的收缩由培养软件记录并保存在指定的文件中。每个生成的原始数据文件都转换为可读的Axon二进制文件格式(.abf),以便于分析和量化数据。对于初始分析,.abf 文件已在适当的程序中打开。选择大约5分钟的收缩数据来建立在此期间的平均收缩幅度。这是为记录的数据文件中的多个时间点完成的。绘制这些收缩值随时间变化的图产生了一个有用的图形,用于比较控制和实验环境中的收缩发展。为了更深入地了解生成的切片的性能,运行了刺激协议。在这些方案中,大约需要45分钟,刺激参数被改变以评估收缩耦合的参数。
目前的刺激方案由四个不同的部分组成:暂停后增强,刺激阈值,力频率关系和不应期(图4, 表4)。在暂停后增强期间,在短暂停止 3、12、50 或 120 秒后恢复刺激。为了确定刺激阈值,刺激电流以每10秒3 mA的步长增加,从8 mA开始,增加到90 mA。通过此测试,可以确定每个切片的最小刺激电流。这不会改变刺激方案之外的一般刺激设置。力-频率关系通过刺激频率(20、30、45、60、80、100、120、150、180、210 和 240 BPM)的逐步增加来评估,同时平行缩短每个步骤的相应持续时间。除前两个频率设置外,该方案在每个步骤中产生20-40次收缩。通过在正常刺激(S1; 30 BPM)之后发送过早刺激(S2)来评估每个切片的不应期。S1-S2 间隔每 10 秒缩短一次。
为了证明所提出的培养系统作为测试药物干预的工具的潜力,从同一患者制备 离体 人LV组织切片,并在培养2周后对影响细胞内钙离子(Ca2 +)水平(n = 1)的药理学试剂进行处理。L型Ca2 +通道拮抗剂硝苯地平抑制Ca2+ 流入心肌细胞,因此降低Ca2+ 的细胞内可用性并降低收缩力17。由于其血管扩张作用,硝苯地平被用作抗高血压药物。为了证明Ca2+通道拮抗剂的药理学差异,研究了卡西肽进行比较。钙西肽也是一种L型Ca2+通道拮抗剂,提取自 树状藻属多列匹斯 毒液18。因此,它共享硝苯地平的负正性肌力作用。然而,钙西肽具有不同的结合特性,与硝苯地平19相比更有效。为了研究Ca2+ 可用性的正负调节,我们还测试了钙通道激动剂Bay-K8644(1,4-二氢-2,6-二甲基-5-硝基-4-(2-[三氟甲基]苯基)吡啶-3-羧酸甲酯)20。
分别用硝苯地平(125 nM),卡西西汀(70.8 nM)和Bay-K8644(417 nM)处理三片,而第四片没有药物(对照)。比较治疗前后一般刺激参数(50 mA电流、双相脉冲持续时间3 ms、间隔1 ms和30 BPM起搏率)下的收缩力。此外,在治疗之前,运行了刺激方案以评估暂停后增强,刺激阈值,力 - 频率关系和不应期的基线值。治疗30分钟后,运行第二个刺激方案。为了消除个体间差异,在治疗前将每个切片的收缩幅度归一化至其基线水平。基线(即100%)是通过分析治疗前刺激方案开始之前的最后五个收缩周期来确定的。
当分析一般刺激下切片的收缩时,观察到用Ca2 + 拮抗剂(硝苯地平和钙西西平)处理的切片的收缩力在处理后10分钟内降低(图5),并且效果在处理后20分钟内存在。相反,电压门控Ca2+ 通道激动剂Bay-K8644增加了处理切片的收缩力。控件切片未显示值得注意的更改。以类似的方式分析了刺激方案期间生成的收缩数据。在这里,将治疗前(治疗前)进行的刺激方案产生的数据与相同刺激方案的治疗后数据进行比较。
如前所述,刺激方案从评估暂停后增强开始。在暂停期间,额外的Ca2 +被肌质网(SR)吸收,肌质网在暂停后首次刺激时释放。因此,暂停后增强反映了SR的细胞内Ca2 +释放。因此,该参数可用于评估瑞安丁受体从SR释放的Ca2 +的相对贡献。为了评估刺激暂停后切片的增强,暂停后第一次收缩的强度除以相应暂停前的平均收缩。控制切片未显示任何值得注意的更改(图6A)。观察到L型Ca2 +通道的抑制导致在至少暂停50秒后第一次收缩增强(图6B,D),反映细胞内Ca2 +释放对总收缩力的相对贡献更高。在用Bay-K8644处理的切片中观察到相反的效果,其刺激细胞外Ca2 +通过L型Ca2 +通道进入(图6C)。
通过连续将起搏率提高到180 BPM来评估力 - 频率关系。为了更好地可视化,在同一协议中,不同刺激频率下的收缩力被归一化为30 BPM时的基线收缩(= 100%)。数据分析表明,在比较治疗前和治疗后的数据时,用钙西肽治疗不会改变切片在刺激频率增加时跟随刺激的能力(图7B)。在控制切片中未观察到任何变化(图7A)。与卡西西汀相反,硝苯地平阻止了在较高起搏率下收缩力的增加,并将最大捕获率降低到80 BPM(图7D)。用Ca2 + 通道激动剂Bay-K8644处理的切片在非常低的刺激频率下显示出增加的收缩力(图7C)。然而,在频率高于50 BPM时,收缩力似乎低于治疗前的条件。治疗前和治疗后也确定了刺激阈值和不应期。但是,没有观察到差异,因此没有显示数据。
图1:所需材料和栽培系统的概述 (A)连接到绿色电路板的空栽培室。电路板(1)用传感器测量收缩,并将数据传输到控制器。(B)在摇摆主板上放置八个填充室。培养皿盖(35毫米)用于覆盖腔室。(C)修剪透壁性心肌样本所需的(手术)工具。图中描绘了各种镊子,振动器所需的刀片以及有助于修剪的橡胶贴片。(D) 四根 0.9 mm x 70 mm 20 G 的针,用一块实心塑料块固定在方形位置(0.9 cm x 0.9 cm)。使用这种结构可以防止修剪时样品的损坏和移动,并产生具有所需尺寸的组织块。 请点击此处查看此图的大图。
(A)将两个心肌组织块(约1 cm x 1 cm x 1 cm)嵌入在35mm培养皿中的固化低熔点琼脂糖中。为了演示目的,使用了猪左心室组织。(B)将含有嵌入样品的琼脂糖块从培养皿中取出,修剪并粘附在振动切片机的切割平台上。在这里,猪左心室组织用于演示目的。注意均匀的组织颜色和白色纤维化组织的存在,由红色箭头指示。(C)切片后,小心地除去琼脂糖,并垂直于心肌纤维的方向连接塑料三角形(1)。红线表示心肌纤维的方向。(D)制备人左心室组织,切片内显示白色纤维化组织。这并不一定降低栽培的成功率;但是,建议使用不显示纤维化的切片。请点击此处查看此图的大图。
图3:栽培软件。 根据所使用的通道数(最多八个),收缩登记将在最多三个指定窗口中可视化(图中可见两个)。每个培养室显示为一个收缩图。在设置窗口中,可以更改刺激参数并根据所需的实验情况进行定制。此窗口还允许启动或停止所选的刺激方案/计划。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:在典型刺激方案期间读取五个心肌切片的收缩。 在所有面板中,每个单独的切片都以相同的颜色显示。(A)暂停后增强分别评估3,12,50和120秒的短暂刺激暂停后的第一次收缩。(B)通过每10秒以3 mA的步长增加刺激电流从8 mA增加到80 mA来确定刺激阈值。(C)通过刺激频率从12 BPM逐步增加到240 BPM来评估每个切片的力频率关系。刺激周期的持续时间在较高频率下变短,以保持每个频率的节拍次数恒定。(D)为了评估不应期,切片以与先前刺激(S1)的递减间隔暴露于过早刺激(S2)。 请点击此处查看此图的大图。
图5:用L型Ca2+ 通道影响剂治疗前后的收缩力分析。 所有数据(n = 1)均归一化为基线收缩力(治疗前五次单独心跳的平均值(0))。将L型Ca2+ 通道拮抗剂硝苯地平(125 nM)、卡西西汀(70.8 nM)和L型Ca2+ 通道激动剂Bay-K8644(417 nM)添加到收缩的人左心肌切片中。对照切片未接受任何处理。 请点击此处查看此图的大图。
图 6:处理切片和对照切片的暂停后增强。 观察到停顿后增强的差异(基线与治疗后;n = 1)。在这里,暂停后第一次收缩的幅度被归一化为相应暂停之前的平均收缩幅度。基线设置为100%,类似于第一次暂停开始之前最后五个周期的平均收缩强度。Y 轴显示各种持续时间的暂停后归一化的第一次收缩。X 轴显示基线和暂停长度。(A)无需处理即可控制切片。(B)钙西肽治疗。(三)海湾K8644处理。(D)硝苯地平治疗。 请点击此处查看此图的大图。
图 7:力频率关系分析。 收缩数据(n = 1)在各自协议(= 100%)内以30 BPM归一化为收缩力。(A) 对照切片未经过任何物质处理;然而,栽培的所有其他方面都与处理过的切片相同。(B)钙西肽治疗一个左心肌切片。(三)海湾K8644处理。(D)硝苯地平治疗。省略了有关该切片在刺激频率高于80 BPM时的收缩力的数据,因为收缩不遵循刺激频率。 请点击此处查看此图的大图。
表1:用于运输和切片过程的切片缓冲液的组成。 对于琼脂糖的制备,省略了葡萄糖。 请按此下载此表格。
表2:4%琼脂糖凝胶的组成。 这种无葡萄糖低熔点琼脂糖凝胶用于包埋组织样品。 请按此下载此表格。
表3:培养基的制备。请按此下载此表格。
表4:刺激方案的细节。 刺激方案由四部分组成,所有部分都可以更改以满足项目的需要。 请按此下载此表格。
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Discussion
过去,心血管研究在心肌细胞的培养方面取得了很大进展。然而,具有完整几何形状的心肌细胞的3D培养尚未得到很好的证实。与以前用于心肌组织 离体 培养的方案相比,我们在这里描述的方案更接近 于组织的体内 环境。此外,预载和后负荷的应用允许更仿生的环境。我们能够充分分析和理解组织的收缩数据和收缩参数的连续记录。
使用类似设置的 离体 心血管组织培养技术的数量限制为11,21,22。已经发表的类似的心肌切片培养技术使用6孔板来培养心肌切片10。然而,这种特殊设置的一个重要限制是切片不会暴露在前后负荷下,也不需要处理组织,也无法产生随时间收缩的详细视图。我们在这里描述的方法降低了组织损伤或感染的风险。此外,它全面了解了每当在栽培中添加感兴趣的物质时收缩力的可能变化。除了分析每个切片的正常收缩力外,当前的设置还允许定期运行预定义的协议。这允许收集培养组织的不同相关参数的数据收集。
协议中的关键步骤
必须避免组织损伤,这在外植体手术期间已经发生。如果切除后组织未立即转移到冷藏溶液中,则可能导致组织样本受损。所描述的协议包含几个步骤,这些步骤对于获得可靠和可重复的结果至关重要。琼脂糖组织包埋化合物必须使用不含葡萄糖的切片缓冲液制备,以防止在方案开始之前的熔化过程中葡萄糖可能焦糖化。重要的是要避免由于直接从80°C水浴中使用琼脂糖引起的热疗引起的损害,而不是在37°C的注射器中孵育琼脂糖。 储存和切割期间的温度应为4°C,以减少新陈代谢并最大限度地减少缺血。此外,当在切割盘和培养皿之间移动以连接塑料三角形时,应通过抓住琼脂糖而不是组织本身来小心处理组织。最重要的是,这些三角形相对于心肌纤维的方向在正确的方向上连接。三角形的错位将导致组织损伤。
一般来说,新切割切片的刺激阈值在10-20 mA之间,应小心增加电流。通过过高的电流过度刺激组织也会导致不可逆的样品损坏。一旦刺激开始,通过摇摆培养室进行组织搅拌是必要的,并且不应停止超过5分钟,以确保组织有足够的氧气和营养物质。
故障排除和修改
过度挛缩
心肌组织样本的过度挛缩是所讨论方案的主要排除标准之一。这可能发生在心肌切片制备之前和之后。在制备之前,组织在触诊时感到僵硬的情况下,在至少70%的制剂中观察到过度收缩。组织样本的过度挛缩也可能在插入摇臂时发生,这可能取决于组织的质量或患者的疾病状态。过度挛缩可以看作是在刺激组织期间舒张张力的增加,对应于心脏缺血中受损心肌细胞的强直缩短。刺激期间的过度挛缩可以是渐进的,其中收缩超过12mN的检测限。然而,过度挛缩也可能在30-60分钟内自发逆转,表明组织可以恢复。为了提高组织的回收率,预负荷设置应在孵育1小时后以及制备后的第2,4和6天重新调整(即重复步骤8.3)。伴有或不伴有样本受刺激的收缩,都可能出现宫缩过度。然而,如果在1小时内没有观察到收缩,则不应使用样品。在这种情况下,组织已经过度收缩到无法恢复的程度或已被损坏。一般来说,按照所提出的方案培养人心肌切片,已被证明具有90%的成功率。
预期的收缩力变化
根据多种因素(例如,患者、制剂、组织损伤),最初显示可接受收缩的肌裂有可能在最初的24小时内经历收缩幅度的逐渐下降。事实上,对于从人类终末期衰竭心脏获得的切片,这种行为甚至可以被认为是正常的。在接下来的3天内,每天重新调整切片的预负荷可以缓解这个问题并改善收缩。然而,在24至48小时后,收缩力应再次开始增加。请注意,在栽培的第一天内,收缩不会恢复到最初观察到的水平。
培养基交换后不久,当样品返回培养箱时,收缩通常显示显着增加的振幅。孵化器的打开和关闭有助于这种增加,因为它会导致CO2 水平下降。这增加了碳酸氢盐缓冲培养基内的pH值,从而导致切片的正性肌力反应。在介质交换之后,切片的收缩力通常会降低数小时,直到达到或超过其初始值。为了防止刺激方案受到培养基交换的影响,刺激方案不应在培养基交换后至少1小时执行。
方法的局限性
与早期用于人心肌组织的培养方法相比,本技术的一个优点是可以将前后负荷施加(和调节)到收缩组织上。然而,很难根据壁张力来量化施加的载荷,尽管该载荷可以从弹簧常数和切片尺寸估计。假设心肌组织的活力与组织样品的收缩幅度之间存在正相关关系。然而,目前还没有一种方法可以在将每个切片安装到腔室之前对其进行可行性测试。可以在不用于培养的切割切片上进行比色MTT染色,以确定心肌细胞的活力。在活的细胞中,NADPH将减少紫色甲茛晶体中的黄色MTT盐。另一个限制是,目前,培养基中的营养物质仅限于基本成分。因此,营养物质和循环因子与获得组织的 体内 环境不同。但是,可以根据需要补充或修改培养基。
该方法的潜在应用
该方法在心脏毒性和药物测试以及了解心脏病的病理生理学方面都有几种潜在的应用。首先,所讨论的方案中使用的系统可用于药物和心脏毒性筛查。在可编程刺激方案的帮助下,可以分析响应药物给药的生理变化。关于不应期的解释,需要考虑这是一个功能参数,不能严格反映药物对动作电位持续时间的影响。其次,培养室可用于心肌与免疫细胞结合的各种共培养实验。通过使用这种共培养,可以评估免疫细胞分泌因子对心肌收缩的直接影响。最后,也可以培养非移植心肌病样本,尽管这些非移植组织样本通常较小,因此更难处理。然而,这可能为确定新的治疗靶点和开发靶向药物开辟可能性。还可以设想使用该技术进行患者特定的组织表征,使我们更接近个性化医疗。此外,所提出的方法可用于非人心肌组织,其例子是猪和兔。必须考虑的是,无法获得小型哺乳动物(小鼠/大鼠)的高生理心率,因为在使用所讨论的设置的心肌培养条件下无法满足随后的更高的O2 要求。因此,在这些情况下很难模仿接近生理的环境。
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Disclosures
JH,PS,DM和KL没有任何要披露的内容。AD和TS是提供妙咪培养系统的英飞思有限公司的股东。
Acknowledgments
研究由DZHK拨款81Z0600207(JH,PS和DM)和81X2600253(公元和TS)资助。
作者要感谢克劳迪娅·法尼,吴美平和马蒂亚斯·塞米施在准备设置方面的支持,以及组织培养的定期维护。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
H2O | BBraun | 3703452 | |
HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
Laboratory equipment | |||
Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
Incubator | Binder | CB240 | |
MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
Vibratome | Leica | VT1200s | |
Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
Materials | |||
100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
Plastic triangles | In-house made | ||
Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
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