我们提出了一种实验方案 离体 人室心肌组织的培养。它允许对收缩力和收缩动力学进行详细分析，并可施加前负荷和后负荷以模拟 在体 更接近生理环境。
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本文内容
摘要
摘要
心肌细胞培养已取得众多进展，从二维（2D）细胞培养发展到诱导多能干细胞（iPSC）来源的类器官。2019年，研究人员展示了一种在体外（ex vivo）培养源自人类心脏样本心肌切片的方法，该方法更接近体内（in vivo）心肌收缩的生理条件。这些样本主要来源于心脏移植手术或左心室辅助装置植入术。利用振动切片机和专门开发的培养系统，将厚度为300 µm的切片置于一根固定丝和一根弹簧丝之间，从而实现数周内稳定且可重复的培养。在培养过程中，切片可根据个体化设置持续接受电刺激。收缩活动可实时显示并记录，药物也可方便地施加。用户可设定并执行自定义的刺激方案，以评估关键的收缩参数，如停搏后增强效应、刺激阈值、力-频率关系以及不应期。此外，该系统还支持可变的前负荷和后负荷设置，使培养条件更接近生理状态。
本文介绍了一种使用商用仿生培养液成功建立人类左心室心肌片长期培养的逐步操作指南。
引言
在过去的十年中， 体外 心肌细胞的培养已取得重大进展，涵盖了从二维（2D）和三维（3D）技术到类器官以及诱导多能干细胞分化为心肌细胞的应用1,2,3. 离体 原代细胞培养已被证明具有重要价值，尤其在遗传学研究和药物开发领域4,5,6使用人体组织可提高研究结果的转化价值。然而，目前尚未建立成熟的心肌组织长期三维培养技术，尤其是保持组织完整几何形态的培养。完整的几何结构是模拟心肌组织生理特征的关键要素 体内 条件，因为正常的心脏功能、不同细胞之间的通讯以及细胞与基质的相互作用都是必要前提。心肌组织培养经历了多个发展阶段。其成功率与稳定性 离体 心肌组织培养的初始效率较低，但近期的方法已取得令人鼓舞的成果7,8,9,10,....
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方案
本研究所述实验的组织采集已获得慕尼黑大学和波鸿鲁尔大学机构审查委员会的批准。研究按照《赫尔辛基宣言》指南进行。患者在组织采集前均签署了书面知情同意书。
1. 组织获取
- 从接受心脏移植或心脏手术的患者处获取人体组织。
- 在获取组织前，配制 2 L 心肌停跳液（以下简称切片缓冲液（表 1））。
- 获取一块 4 cm × 4 cm 大小的透壁左心室（LV）活检组织后，立即将其（在切除后 5 分钟内）放入一个可密封的一次性无菌塑料烧杯中，烧杯内含约 70 mL 冷（4 °C）切片缓冲液。保持在 4 °C。
注意：本方案所用切片缓冲液允许组织在低温（4 °C）下保存长达 36 小时，便于从远离实验室的临床机构进行低温运输。然而，运输时间 ≤ 24 小时已被证明为最佳。
2. 准备琼脂糖和振动切片机
- 确保准备好足够数量的培养室并进行灭菌处理（图1A）。
- 将培养室和石墨电极浸入1 L的10%异丙醇溶液中，振荡过夜。次日，将培养室转移至100%异丙醇溶液中浸泡3分钟，并将石墨电极在120 °C条件下高压灭菌10分钟。 ....
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结果
将培养室插入相应的连接器后，心肌片的收缩情况会显示在计算机屏幕上（图3）。人源心肌片在受到刺激后立即开始收缩。在最初的5-10分钟内，心肌片出现过度收缩现象，表现为舒张期张力升高，这是由受损组织部分发生强直性收缩所致。该过程在1-1.5小时内不同程度地恢复。稳定后，人左心室（LV）组织片在刺激下产生的颤搐力介于1 mN至3 mN之间。收缩期表现为收缩力迅速显著上升，随后舒张期收缩力同样迅速下降。
心肌片的收缩由培养软件记录，并保存至指定文件中。每个生成的原始数据文件均被转换为可读的Axon二进制文件格式（.abf），以便于对数据进行分析和定量。在初步分析中，使用适当的程序打开.abf文件，并选取约5分钟的收缩数据，以确定该时间段内的平均收缩幅度。此操作针对记录数据文件中的多个时间点进行。将这些随时间变化的收缩值绘制成图，可得到用于比较对照组与实验组收缩发展情况的有用图表。为了更深入地了解所制备心肌片的功能表现，还进行了刺激方案实验。这些实验持续约45分钟，在此期间改变刺激参数，以评估收缩耦合的相关指标。
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讨论
过去，心血管研究在心肌细胞培养方面取得了巨大进展。然而，具有完整几何结构的心肌细胞三维培养技术尚未成熟。与以往所采用的方案相比 离体 心肌组织的培养，我们在此描述的方案类似于 体内 更接近组织的体内环境。此外，施加前负荷和后负荷可实现更接近生物体的仿生环境。我们能够全面分析并理解组织收缩数据及收缩参数的连续记录。
数量 离体 使用类似装置的心血管组织培养技术受到限制11,21,22一种已发表的类似心肌切片培养技术采用6孔板进行心肌切片的培养10然而，这种特定设置的一个重要局限性在于，组织切片未受到前负荷和后负荷的作用，且在不接触组织的情况下无法获得随时间变化的收缩情况的详细视图。本文所述方法降低了组织损伤或感染的风险。此外，当向培养体系中添加感兴趣的物质时，该方法能够全面观察收缩力可能发生的各种变.......
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披露
JH、PS、DM 和 KL 无任何利益冲突需要披露。AD 和 TS 是 InVitroSys GmbH 的股东，该公司提供 Myodish 培养系统。
致谢
研究由DZHK基金81Z0600207（JH、PS和DM）和81X2600253（AD和TS）资助。
作者感谢Claudia Fahney、Mei-Ping Wu和Matthias Semisch在准备实验装置以及组织培养的日常维护中提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | |||
| 低熔点琼脂糖 | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-丁二酮单肟) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| 葡萄糖*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| 异丙醇 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X 补充剂 | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| 硝苯地平 | Sigma | N7634-1G | |
| 青霉素/链霉素 x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-巯基乙醇 | AppliChem | A1108.0100 | |
| 实验设备 | |||
| 超净工作台 | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix 水泵及冷却装置 + BBraun Thermomix BM | BBraun | 自制的冷却与加热组合系统 | |
| 培养箱 | Binder | CB240 | |
| MyoDish 培养系统 | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish 培养系统 |
| 振动切片机 | Leica | VT1200s | |
| 37°C 水浴锅 | Haake | SWB25 | |
| 80°C 水浴锅 | Daglef Patz KG | 7070 | |
| 材料 | |||
| 100 mL 塑料一次性烧杯 | Sarstedt | 75.562.105 | |
| 滤器，Steritop 快速释放型 | Millipore | S2GPT05RE | |
| 针头 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| 塑料三角刮刀 | 自制 | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| 一次性手术刀片 | Feather | 02.001.30.020 | |
| 10 mL 鲁尔接头注射器 BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| 组织培养皿 10 cm | Falcon | 353003 | |
| 组织培养皿 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| 50 mL 离心管 | Falcon | 352070 |
参考文献
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781(2020).
- Lu, K., et al.
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重印与许可
