Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die Ex-vivo-Kultivierung von menschlichem ventrikulärem Myokardgewebe. Es ermöglicht eine detaillierte Analyse der Kontraktionskraft und Kinetik sowie die Anwendung von Vor- und Nachlast, um die in vivo physiologische Umgebung genauer nachzuahmen.
Abstract
Die Kultivierung von Kardiomyozyten hat eine Vielzahl von Entwicklungen erlebt, die von der zweidimensionalen (2D) Zellkultivierung bis hin zu iPSC-abgeleiteten Organoiden reichen. Im Jahr 2019 wurde eine Ex-vivo-Methode zur Kultivierung von Myokardscheiben aus menschlichen Herzproben demonstriert, während man sich dem In-vivo-Zustand der Myokardkontraktion näherte. Diese Proben stammen hauptsächlich aus Herztransplantationen oder der Platzierung von linksventrikulären Unterstützungsgeräten. Mit einem Vibratom und einem speziell entwickelten Kultivierungssystem werden 300 μm dicke Scheiben zwischen einen festen und einen Federdraht gelegt, was eine stabile und reproduzierbare Kultivierung über mehrere Wochen ermöglicht. Während des Anbaus werden die Scheiben entsprechend den individuellen Einstellungen kontinuierlich stimuliert. Kontraktionen können in Echtzeit angezeigt und aufgezeichnet werden, und pharmakologische Mittel können leicht angewendet werden. Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle können geplant und durchgeführt werden, um wichtige Kontraktionsparameter wie Post-Pause-Potenzierung, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht das System eine variable Vor- und Nachlasteinstellung für eine physiologischere Kultivierung.
Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie eine erfolgreiche Langzeitkultivierung von humanen linksventrikulären Myokardschnitten unter Verwendung einer kommerziellen biomimetischen Kultivierungslösung erzeugt werden kann.
Introduction
In den letzten zehn Jahren hat die In-vitro-Kultivierung von Myokardzellen große Fortschritte gemacht, die von 2D- und dreidimensionalen (3D) Techniken bis hin zur Verwendung von Organoiden und induzierten pluripotenten Stammzellen reichen, die in kardiale Myozytendifferenziert sind 1,2,3. Ex-vivo- und primäre Zellkultivierungen haben sich als sehr wertvoll erwiesen, insbesondere für genetische Studien und die Arzneimittelentwicklung 4,5,6. Die Verwendung von menschlichem Gewebe verbessert den translationalen Wert der Ergebnisse. Die langfristige 3D-Kultivierung von Myokardgewebe mit intakter Geometrie ist jedoch nicht gut etabliert. Die intakte Geometrie ist ein Schlüsselmerkmal für die Nachahmung von In-vivo-Bedingungen, da die richtige Herzfunktion, die Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen sowie Zell-Matrix-Interaktionen Voraussetzungen sind. Die Kultivierung des Myokardgewebes durchlief verschiedene Entwicklungsphasen. Die Erfolgsrate und Stabilität der Ex-vivo-Myokardgewebekultivierung waren anfangs recht gering, aber jüngste Ansätze haben vielversprechende Ergebnisse erbracht 7,8,9,10,11.
Unter diesen waren Fischer et al. die ersten, die zeigten, dass die Lebensfähigkeit und kontraktile Leistungsfähigkeit des menschlichen Myokardgewebes in der Ex-vivo-Zellproduktion für viele Wochen aufrechterhalten werden kann7. Ihre Technik basierte auf dünnen Gewebeschnitten, die aus explantiertem menschlichem Myokard geschnitten wurden, die in neu entwickelten Kultivierungskammern montiert wurden, die definierte biomechanische Bedingungen und kontinuierliche elektrische Stimulation lieferten. Diese Kultivierungsmethode ähnelt stark der In-vivo-Funktion von Myokardgewebe und wurde von mehreren unabhängigen Forschungsgruppen 2,12,13,14,15 reproduziert. Wichtig ist, dass die von Fischer et al. verwendeten Kammern auch eine kontinuierliche Registrierung der entwickelten Kräfte für bis zu 4 Monate ermöglichten und somit beispiellose Möglichkeiten für die physiologische und pharmakologische Forschung an intaktem menschlichem Myokarderöffneten 7.
Ähnliche Techniken wurden unabhängig voneinander von anderen Gruppen entwickelt und auf Human-, Ratten-, Schweine- und Kaninchenmyokardangewendet 7,10,11. Pitoulis et al. entwickelten anschließend eine physiologischere Methode, die die normale Kraft-Längen-Beziehung während eines Kontraktionszyklus reproduziert, aber für die Hochdurchsatzanalyse weniger geeignet ist16. Daher kann der allgemeine Ansatz des biomimetischen Anbaus als ein weiterer Schritt zur Reduktion, Verfeinerung und Ersetzung (3R) von Tierversuchen angesehen werden.
Die Ausschöpfung dieses Potenzials erfordert jedoch standardisierte Verfahren, High-Content-Analysen und einen hohen Durchsatz. Wir stellen eine Technik vor, die das automatisierte Schneiden von lebendem menschlichem Myokard mit der In-vitro-Wartung in einem biomimetischen Kultivierungssystem kombiniert, das kommerziell verfügbar geworden ist (siehe Materialtabelle). Mit dem vorgeschlagenen Ansatz ist die Anzahl der einzelnen Scheiben, die aus einer einzigen transmuralen Myokardprobe erzeugt werden können, nur durch die Verarbeitungszeit begrenzt. Eine Probe von ausreichender Größe und Qualität (3 cm x 3 cm) liefert oft 20-40 Gewebescheiben, die bequem mit einem automatisierten Vibratom geschnitten werden. Diese Scheiben können in zum System gehörende Kultivierungskammern gelegt werden. Die Kammern ermöglichen eine elektrische Stimulation, deren Parameter moduliert werden können (z. B. Pulsdauer, Polarität, Rate und Strom), sowie die Einstellung von Vor- und Nachlast unter Verwendung von Federdrähten in den Kammern. Die Kontraktion jeder Scheibe wird durch die Bewegung eines kleinen Magneten, der an einem Federdraht befestigt ist, registriert und als interpretierbarer Graph angezeigt. Daten können jederzeit erfasst und mit frei verfügbarer Software analysiert werden. Abgesehen vom konstanten Baseline-Pacing können geplante Protokolle durchgeführt werden, um ihre Feuerfestperiode, die Stimulationsschwelle, die Post-Pause-Potenzierung und die Kraft-Frequenz-Beziehung funktionell zu bewerten.
Diese langfristige biomimetische Kultivierung mehrerer Myokardscheiben aus einem individuellen Herzen ebnet den Weg für zukünftige Ex-vivo-Forschung in menschlichem und tierischem Gewebe und erleichtert das Screening auf therapeutische und kardiotoxische Arzneimittelwirkungen in der kardiovaskulären Medizin. Es wurde bereits auf verschiedene experimentelle Ansätze 2,12,13,15 angewendet. Hier geben wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Aufbereitung von menschlichem Gewebe und liefern Lösungen für häufig auftretende Kultivierungsprobleme.
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Protocol
Die Gewebeentnahme für die hier beschriebenen Experimente wurde von den Institutional Review Boards der Universität München und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die Patienten gaben vor der Gewebeentnahme ihre schriftliche Einwilligung.
1. Gewebeentnahme
- Erhalten Sie menschliches Gewebe von Patienten, die sich einer Herztransplantation oder Herzoperation unterziehen.
- Bevor Sie das Gewebe beschaffen, bereiten Sie 2 l kardioplegiöse Lösung vor (im Folgenden als Schneidepuffer bezeichnet (Tabelle 1)).
- Nachdem Sie eine 4 cm x 4 cm große transmurale linksventrikuläre (LV) Biopsie erhalten haben, legen Sie das Gewebe sofort (innerhalb von 5 Minuten nach der Exzision) in ein verschließbares steriles Einwegbecherglas aus Kunststoff, das etwa 70 ml kalten (4 ° C) Schneidepuffer enthält. Bei 4 °C aufbewahren.
HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Schneidepuffer ermöglicht eine Kühllagerung (4 °C) des Gewebes für bis zu 36 h. Dies ermöglicht den Kalttransport des Gewebes aus Kliniken, die nicht in der Nähe des Labors liegen. Die Transportzeiten ≤ 24 h haben sich jedoch als optimal erwiesen.
2. Zubereitung von Agarose und Vibratom
- Stellen Sie sicher, dass ausreichende Anbaukammern vorbereitet und sterilisiert sind (Abbildung 1A).
- Tauchen Sie die Kammern und Graphitelektroden in 1 l einer 10% igen Isopropanollösung und rühren Sie über Nacht. Am folgenden Tag werden die Kammern für 3 min in eine 100% ige Isopropanollösung überführt und die Graphitelektroden bei 120 °C für 10 min autoklaviert.
- Lassen Sie die Kammern und Graphitelektroden unter einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.
- Befestigen Sie eine Leiterplatte an jeder der Kammern entsprechend den verfügbaren Positionen auf der Wippe. Platzieren Sie zwei Graphitelektroden gemäß den Anweisungen des Herstellers an der Leiterplatte.
- Legen Sie einen 35 mm langen Petrischalendeckel auf die Oberseite der Kammer, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Richten Sie das Myodish-Kultivierungssystem (siehe Materialtabelle) in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 ein, indem Sie das System an einen Computer anschließen (Abbildung 1B).
- Bereiten Sie die 4% schmelzarme Agarose in Schneidepuffer (ohne Glukose; Tabelle 2). Die Agarose kann 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Am Tag des Experiments schmelzen Sie ein Stammvolumen Agaroselösung mit einem Wasserbad, das auf 80 ° C eingestellt ist. Je nach Menge dauert das Schmelzen ca. 30 min.
- Wenn die Agarose flüssig ist, ziehen Sie 8 ml flüssige Agarose in eine 10-ml-Spritze mit zusätzlichen 2 ml Luft. Schließen Sie die Spritze mit einer sterilen Kappe und legen Sie sie 20 min lang kopfüber in ein 37 ° C warmes Wasserbad, um eine Erstarrung der Agarose zu verhindern und ihre Temperatur auszugleichen, um eine Hyperthermiebeschädigung der Probe zu vermeiden.
- Falls vorhanden, schalten Sie die Wasserkühlung des Vibratoms mindestens 30 Minuten vor dem Schneiden des Gewebes ein, um eine ausreichende Kühlleistung zu gewährleisten. Stellen Sie die Temperatur des Wasserkreislaufs auf 4 °C ein.
HINWEIS: Die hier verwendete Schneidschale und Kühlplatte enthielten beide einen eingebauten Wasserkreislauf. Dies wird dringend zur Kühlung und zur Verringerung der Kontaminationsrisiken empfohlen. Es ist jedoch auch möglich, Eis als Kühltechnik zu verwenden. Außerdem muss das Wasserkühlgerät an dieser Stelle des Protokolls nicht an die Schneidschale und/oder Kühlplatte des Vibratoms angeschlossen werden. - Reinigen Sie die Schneideschale und die Probenplatte des Vibratoms, indem Sie alle Oberflächen mindestens 3 min lang mit 100% Isopropanol spülen.
HINWEIS: Je nach verwendetem Vibratomsystem kann der Vibratomaufbau abweichen. Informationen über die Setup- und Klingenkalibrierungsmethoden finden Sie im Handbuch des Vibratoms, das im Labor vorhanden ist. - Füllen Sie das Schneidefach bis zu 90% -95% mit Schneidepuffer. Im derzeit verwendeten Setup entspricht dies ca. 400 ml. Verbinden Sie den Schlauch des Wasserkühlgeräts mit den Ventilen auf der Schneidschale und der Kühlplatte des Vibratoms.
- Desinfizieren Sie alle Werkzeuge, die für die Zubereitung benötigt werden, indem Sie sie für 5 s in eine 100% ige Isopropanollösung tauchen. Entfernen Sie die Werkzeuge aus der Isopropanollösung und trocknen Sie sie unter der Laminar-Flow-Haube an der Luft.
3. Beschneiden und Einbetten der Proben
- Die Gewebeprobe in eine 100 mm große Petrischale geben, die mit Kaltschneidepuffer gefüllt ist. Halten Sie die Schale auf einem Kühlteller bei 4 °C (an Kühler angeschlossen oder auf Eis gelegt).
- Entfernen Sie endokardiale Trabekula, indem Sie das Endokard mit einer Pinzette halten und mit einer Schere ca. 3 mm Endokardgewebe abschneiden. Entfernen Sie auf die gleiche Weise überschüssiges Fettgewebe unter dem Epikard, falls vorhanden.
- Fixieren Sie die geschnittene Gewebeprobe, endokardial mit der Seite nach oben, an einem 2 cm x 2 cm großen Gummipflaster mit vier 0,9 mm x 70 mm 20 G Nadeln, die in einer quadratischen Position (0,9 cm x 0,9 cm; Abbildung 1C, D). Stellen Sie sicher, dass die diagonale Kante jeder Nadelspitze nach innen zeigt. Dies verbessert die Fixierung und verhindert Schäden am Myokard.
ACHTUNG: Die Ausrichtung des oben genannten Quadrats sollte orthogonal zur erwarteten vorherrschenden Myofaserrichtung sein. - Schneiden Sie das gesamte überschüssige Gewebe außerhalb des Vier-Nadel-Quadrats mit einem Skalpell ab. Wenn die Größe der Originalprobe es zulässt, verwenden Sie während dieser Zubereitung zwei Myokardgewebeproben aus derselben Rohprobe.
- Legen Sie die beschnittene Probe mit einer Pinzette auf ein steriles Stück Gewebe, um überschüssigen Schneidepuffer zu entfernen, der auf der Probe verbleibt. Um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, halten Sie die Probe nicht länger als 10 s auf dem Gewebe.
- Legen Sie die Probe(n) in eine 35 mm große Petrischale, so dass die Klinge senkrecht zur Ausrichtung der Kardiomyozyten schneidet und das Epikard nach unten zeigt. Wenn die Zubereitung zwei Proben enthält, stellen Sie sicher, dass die Proben zentriert sind und sich nicht berühren.
- Nehmen Sie die Agarosespritze aus dem Wasserbad und tauchen Sie die Probe(n) in Agarose. (Abbildung 2A). Lassen Sie die Agarose 5 min auf einer Kühlplatte erstarren. Die Probe(n) muss/müssen in Kontakt mit der Petrischale bleiben, wodurch sichergestellt wird, dass die Schnittebene parallel zur vorherrschenden Myokardfaserrichtung verläuft.
ACHTUNG: Entleeren Sie die Spritze nicht vollständig, um Luftblasen zu vermeiden. Achten Sie auf die Menge an Agarose, die beim Eintauchen der Proben in der Spritze verbleibt. Bei Luftblasen in der Schale mit den Proben ziehen Sie die Luftblasen vorsichtig zurück in die Spritze.
4. Legen Sie die Proben auf das Schneidefach
- Entfernen Sie die erstarrte Agarose, die die Probe(n) enthält, mit einem Spatel oder einem ähnlichen Werkzeug aus der 35-mm-Petrischale, indem Sie sie zwischen der Probe und der Seite der Petrischale verkeilen. Schneiden Sie einen Teil der Agarose mit einem Skalpell ab, während Sie die Proben bedeckt halten.
ACHTUNG: Entfernen Sie nicht zu viel von der Agarose. Auf den langen und kurzen Seiten in der X/Z-Ebene sollten mindestens 5 mm Agarose übrig bleiben.
HINWEIS: Die Schritte 4.2-4.4 müssen in schneller Folge (d. h. maximal 5 s) ausgeführt werden. Haben Sie alle erforderlichen Werkzeuge in Reichweite, bevor Sie beginnen. Nach der Platzierung ist keine Neupositionierung der Probe möglich. Versuchen Sie, die Exposition des Klebstoffs gegenüber Luft und Feuchtigkeit zu begrenzen. Der Kontakt mit Luft oder Flüssigkeiten verfestigt den Klebstoff und macht ihn unbrauchbar. - Platzieren und verteilen Sie mit einer Pipette 60 μL Kleber in und um die Mitte der Schneidplattform.
- Legen Sie die epikardiale Seite der in Agarose enthaltenen Probe mit einer Pinzette auf die verklebte Fläche. Nicht neu positionieren. Die endokardiale Seite der Probe muss in der Agarose sichtbar sein. Lassen Sie den Kleber für 1 min erstarren. Drücken Sie die Agarose, die die Probe enthält, vorsichtig von oben mit einem stumpfen Werkzeug (z. B. Pinzette) und verhindern Sie, dass in die Agarose eingeschnitten oder beschädigt wird.
- Legen Sie die Probenplattform an die vorgesehene Position in der Schneideschale des Vibratoms, gefüllt mit Schneidepuffer.
5. Starten des Vibratoms
- Stellen Sie die Schwingungsamplitude auf 1 mm und die anfängliche Schnittgeschwindigkeit auf 0,07 mm/s ein. Stellen Sie die Dicke der Scheibe auf 300 μm ein, um die Scheiben zu schneiden.
- Solange die Klinge nur die Agarose schneidet, erhöhen Sie die Schnittgeschwindigkeit auf ihr Maximum, das in diesem Fall 1,50 mm/s beträgt. Sobald das Vibratom beginnt, das Gewebe zu schneiden, verringern Sie die Geschwindigkeit sofort auf 0,07 mm/s.
HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht glatt geschnitten wird, z. B. wenn sich große fibrotische Bereiche in der Probe befinden, kann es hilfreich sein, die Schnittamplitude auf bis zu 1,5 mm zu erhöhen und die Schnittgeschwindigkeit auf 0,04 mm/s zu reduzieren.
6. Medium- und Inkubatorvorbereitung während des Schneidevorgangs
- Füllen Sie jede Kultivierungskammer mit 2,4 ml vollständigem Kultivierungsmedium (Tabelle 3).
- Stellen Sie die mit Medium gefüllten Anbaukammern auf das Anbausystem im Inkubator-Set bei 37 °C, 5% CO 2, 21% O2 und einer Luftfeuchtigkeit von 80%. Äquivalent des Mediums für mindestens 20 min.
- Verbinden Sie das Anbausystem mit einem Computer und starten Sie das entsprechende Softwareprogramm.
- Stellen Sie die Wippgeschwindigkeit auf 60 U / min ein und stellen Sie die Stimulationsparameter (Stimulationsimpulse und Frequenz) vor. Stellen Sie für menschliche Herzschnitte die Standardstimulation auf biphasische Impulse mit 50 mA Strom ein, die jeweils aus 3 ms positivem Strom, einer Pause von 1 ms und einem Impuls von 3 ms invertiertem Strom bestehen, bei einer Schrittfrequenz von 30 Schlägen pro Minute (BPM).
HINWEIS: In gut erhaltenen Geweben liegt die typische Stimulationsschwelle bei etwa 15 mA. Um eine zuverlässige Stimulation zu gewährleisten und eine mögliche Erhöhung der Stimulationsschwelle zu berücksichtigen, wird empfohlen, den Strom auf einen Wert einzustellen, der die Stimulationsschwelle um das Zwei- bis Dreifache überschreitet. - Überprüfen Sie die Elektrodenanzeigen der Software, um sicherzustellen, dass die Elektroden der Kultivierungskammern korrekt funktionieren.
HINWEIS: Es besteht Handlungsbedarf, wenn die Kanalanzeige in der Anbausoftware rot wird. In diesem Fall sind die bipolaren Impulsladungen nicht ausgeglichen.
7. Vorbereiten der Scheiben
HINWEIS: Anfängliche subendokardiale Scheiben sind in der Regel nicht für die Gewebekultivierung geeignet und müssen aufgrund einer ungleichmäßigen Morphologie verworfen werden. Nach den ersten fünf bis 10 Scheiben verbessern sich Slice-Textur und Morphologie. Die ideale Scheibe ist mindestens 1 cm x 1 cm groß, hat keine oder nur begrenzte fibrotische Flecken, ist nicht fragmentiert und hat eine homogene Faserausrichtung (Abbildung 2B, D). Interstitielle Fibrose, die sich zwischen den Myokytenfasern befindet, ist oft im versagenden menschlichen Myokard vorhanden. Überraschenderweise ist dies kein negativer Prädiktor für den Anbauerfolg.
- Gießen Sie eine ausreichende Menge an Kaltschneidepuffer in einen 5 cm langen Petrischalendeckel, um sicherzustellen, dass die Scheiben nicht austrocknen. Legen Sie die Scheiben in den Deckel der Petrischale, der den kalten Schneidepuffer enthält.
- Trennen Sie die Agarose mit einer Pinzette vom Gewebe. Verhindern Sie, dass Sie das Gewebe berühren. Behandeln Sie das Gewebe vorsichtig, da jede Schädigung des Gewebes die Erfolgsrate der Kultivierung verringert.
- Bestimmen Sie die Richtung der Myokardfasern durch genaue Inspektion gegen eine Lichtquelle. Dies ist von Bedeutung, wenn die Kunststoffdreiecke in Schritt 7.6 am Gewebe befestigt werden.
HINWEIS: Die Schritte 7.4 und 7.5 müssen innerhalb von 5 s kurz hintereinander ausgeführt werden. - Befestigen Sie zwei Kunststoffdreiecke mit Klebstoff an einer Probe, um das Gewebe in den Kultivierungskammern zu verankern.
- Legen Sie 1 μL Kleber auf einen sterilen Petrischalendeckel. Verwenden Sie eine hakenförmige Pinzette, um eines der autoklavierten Kunststoffdreiecke aufzunehmen. Tauchen Sie schnell die Vorderkante des Dreiecks in den Kleber und kleben Sie das Dreieck senkrecht zur Kardiomyozytenausrichtung auf die Probe. Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Dreieck.
- Schneiden Sie Gewebe, das die Dreiecksbreite überschreitet, mit einem Skalpell ab (Abbildung 2C). Legen Sie die Scheibe mit den beiden montierten Dreiecken zurück in den Schneidepuffer der Schneideschale.
HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.5, bis genügend Scheiben vorbereitet sind, um die Anbaukammern zu füllen. Wir empfehlen, ein paar zusätzliche Scheiben vorzubereiten, um den Ersatz von Scheiben mit schlechter Kontraktion zu ermöglichen.
8. Mounten der Slices
HINWEIS: Die Nachlast wird durch die Steifigkeit des Federdrahtes in den Kultivierungskammern bestimmt. Je nach Dicke des Federdrahtes stehen drei verschiedene Typen zur Verfügung.
- Nehmen Sie eine mediengefüllte Kultivierungskammer aus dem Inkubator. Wählen Sie eine der vorbereiteten Scheiben aus und führen Sie sie in die Kammer ein, indem Sie ein Dreieck mit jedem Stift verbinden.
- Passen Sie den Abstand zwischen den Montagestiften entsprechend der Stichprobengröße an. Stellen Sie sicher, dass die Probe in ein Medium eingetaucht ist. Stellen Sie die Kammer wieder in die dafür vorgesehene Steckdose des Anbausystems im Inkubator.
ACHTUNG: Überdehnen Sie das Gewebe nicht und biegen Sie den Federdraht nicht zu sehr! - Stellen Sie die Vorspannung nach dem Platzieren der Schale auf die Wippe ein.
- Verringern Sie die Vorspannung, indem Sie die Einstellschraube gegen den Uhrzeigersinn drehen. Tun Sie dies, bis sich die Baseline des entsprechenden Diagramms auf dem Computerbildschirm nicht mehr ändert.
- Erhöhen Sie vorsichtig die Vorspannung (d.h. erhöhen Sie die Spannung), indem Sie die Einstellschraube im Uhrzeigersinn drehen. Fahren Sie für die Kammern mit der höchsten Steifigkeit fort, bis die entsprechende Basislinie in der Grafik um 1000-1200 Einheiten gestiegen ist, was 1 mN Vorspannung entspricht.
HINWEIS: Die genaue Einstellung hängt von der individuellen Federkonstante einer Kultivierungskammer ab, die durch Kalibrierung vor einem Experiment gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt werden kann. Die Aufzeichnungssoftware ermöglicht die Berücksichtigung der einzelnen Kammerkalibrierung, so dass Kräfte gleichmäßig in μN dargestellt werden. Es wird empfohlen, die elektrische Stimulation von Beginn der Kultivierung an anzuwenden. Daher ist es gut möglich, dass sich der Slice während der Vorspanneinstellung zusammenzieht. Konzentrieren Sie sich in diesem Fall auf die diastolische Baseline, um die Vorlast zu bewerten.
9. Wechsel des Mediums
- Bereiten Sie das Kulturmedium gemäß der Rezeptur in Tabelle 3 vor. Kurz vor der Verwendung des Mediums 50 μL β-Mercaptoethanol (50 mM) in ein 50-ml-Röhrchen geben. Bei 4 °C lagern.
- Einmal alle 2 Tage teilweise das Kulturmedium austauschen. Erfrischen Sie das Medium alle 2 Tage, wenn eine langfristige Kultivierung der Myokardscheiben gewünscht ist.
- Das frische Medium in einem Wasserbad oder Heißluftinkubator bei 37 °C für 30-45 min vorwärmen. Entfernen Sie eine Kultivierungskammer aus dem Inkubator und stellen Sie sie unter eine Laminar-Flow-Haube.
VORSICHT: Es ist wichtig, die Kammer sowie das Medium bei 37 ° C (> 35 ° C) warm zu halten, um Hyperkontrakturen aufgrund niedriger Temperaturen zu vermeiden. Weniger ausgeprägte Schäden können als Anstieg der diastolischen Spannung innerhalb weniger Stunden nach dem mittleren Austausch vorliegen. Dies scheint sich zu erholen, aber wiederholter Stress kann zu einer akkumulierenden Verschlechterung führen. - Entfernen Sie das Medium aus der Kultivierungskammer, so dass etwa 0,8 ml in der Kammer verbleiben. 1,6 ml frisches Medium in dieselbe Kammer geben. Das Gesamtvolumen des Mediums sollte etwa 2,4 ml pro Kammer betragen.
- Legen Sie die Abdeckung der Kammer zurück und stellen Sie die Kultivierungskammer wieder in ihre jeweilige Position.
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Representative Results
Die Kontraktion der Myokardscheiben wurde nach dem Einsetzen der Kultivierungskammer in den entsprechenden Anschluss auf dem Computerbildschirm angezeigt (Abbildung 3). Die Kontraktion der menschlichen Myokardscheiben begann sofort nach der Stimulation. Die Scheiben wurden für 5-10 min hyperkontrahiert. Dies war sichtbar als eine Zunahme der diastolischen Kräfte, verursacht durch eine tonische Kontraktur von beschädigten Gewebefraktionen. Dieser Prozess wurde innerhalb von 1-1,5 h in unterschiedlichem Maße rückgängig gemacht. Nach der Stabilisierung zeigten menschliche LV-Gewebeschnitte Zuckungskräfte, die bei Stimulation zwischen 1 mN und 3 mN variierten. Systole wird als eine starke Zunahme der Kontraktionskraft gezeigt, gefolgt von Diastole mit einer ebenso steilen Abnahme der Kontraktionskraft.
Die Kontraktion der Myokardscheiben wurde von der Kultivierungssoftware aufgezeichnet und in einer dafür vorgesehenen Datei gespeichert. Jede der generierten Rohdatendateien wurde zur einfachen Analyse und Quantifizierung der Daten in ein lesbares Axon-Binärdateiformat (.abf) konvertiert. Für die erste Analyse wurde die .abf-Datei in einem entsprechenden Programm geöffnet. Etwa 5 Minuten Kontraktionsdaten wurden ausgewählt, um die durchschnittliche Kontraktionsamplitude während dieses Zeitraums zu bestimmen. Dies geschah für mehrere Zeitpunkte in der aufgezeichneten Datendatei. Die Darstellung dieser Kontraktionswerte im Laufe der Zeit ergab ein nützliches Diagramm, um die Kontraktionsentwicklung in einer Kontroll- und Versuchsumgebung zu vergleichen. Um einen fortgeschritteneren Einblick in die Leistung der generierten Slices zu erhalten, wurden Stimulationsprotokolle ausgeführt. Während dieser Protokolle, die etwa 45 Minuten dauern, wurden die Stimulationsparameter geändert, um die Parameter der Kontraktionskopplung zu bewerten.
Das aktuelle Stimulationsprotokoll bestand aus vier verschiedenen Abschnitten: Post-Pause-Potenzierung, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode (Abbildung 4, Tabelle 4). Während der Post-Pause-Potenzierung wird die Stimulation nach einem kurzen Stopp von entweder 3, 12, 50 oder 120 s wieder aufgenommen. Zur Bestimmung der Stimulationsschwelle wird der Stimulationsstrom in Schritten von 3 mA alle 10 s erhöht, beginnend bei 8 mA und ansteigend auf 90 mA. Mit diesem Test kann der minimale Reizstrom für jede Scheibe bestimmt werden. Dies ändert nichts an den allgemeinen Stimulationseinstellungen außerhalb des Stimulationsprotokolls. Die Kraft-Frequenz-Beziehung wird durch eine schrittweise Erhöhung der Stimulationsfrequenz (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 und 240 BPM) bewertet, während die jeweilige Dauer jedes Schritts parallel verkürzt wird. Mit Ausnahme der ersten beiden Frequenzeinstellungen ergibt dieses Regime zwischen 20-40 Kontraktionen während jedes Schritts. Die Feuerfestperiode jeder Scheibe wird beurteilt, indem nach einem normalen Reiz (S1; 30 BPM) ein vorzeitiger Reiz (S2) gesendet wird. Das S1-S2-Intervall wird alle 10 s verkürzt.
Um das Potenzial des vorgestellten Kultivierungssystems als Werkzeug für die Prüfung pharmakologischer Interventionen zu demonstrieren, wurden ex vivo humane LV-Gewebeschnitte vom selben Patienten hergestellt und pharmakologischen Wirkstoffen ausgesetzt, die die intrazellulären Calciumionenspiegel (Ca2+) (n = 1) nach 2 Wochen Kultivierung beeinflussen. Der L-Typ Ca2+-Kanal-Antagonist Nifedipin hemmt den Ca2+-Zustrom in die Myokardzellen und senkt somit die intrazelluläre Verfügbarkeit von Ca2+ und reduziert die Kontraktilität17. Aufgrund seiner vasodilatatorischen Wirkung wird Nifedipin als blutdrucksenkendes Medikament eingesetzt. Um pharmakologische Unterschiede von Ca2+-Kanal-Antagonisten nachzuweisen, wurde Calciseptin zum Vergleich untersucht. Calciseptin ist auch ein Ca2+-Kanal-Antagonist vom L-Typ, der aus dem Dendroaspis p. polylepis venom18 extrahiert wird. Daher teilt es die negative inotrope Wirkung von Nifedipin. Calciseptin hat jedoch andere Bindungseigenschaften und ist im Vergleich zu Nifedipin19 wirksamer. Um die positiven und negativen Modulationen der Ca2+-Verfügbarkeit zu untersuchen, testeten wir auch den Calciumkanal-Agonisten Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-(2-[trifluormethyl]phenyl)pyridin-3-carbonsäuremethylester)20.
Drei Scheiben wurden mit Nifedipin (125 nM), Calciseptin (70,8 nM) und Bay-K8644 (417 nM) behandelt, während die vierte Scheibe kein Medikament (Kontrolle) erhielt. Die Kontraktionskräfte unter allgemeinen Stimulationsparametern (50 mA Strom, biphasische Impulse 3 ms Dauer, 1 ms Intervall und 30 BPM Pacingrate) wurden vor und nach der Behandlung verglichen. Darüber hinaus wurde vor der Behandlung ein Stimulationsprotokoll durchgeführt, um die Ausgangswerte für die Post-Pause-Potenzierung, die Stimulationsschwelle, die Kraft-Frequenz-Beziehung und die Refraktärperiode zu bewerten. Nach 30 Minuten Behandlung wurde ein zweites Stimulationsprotokoll durchgeführt. Um interindividuelle Unterschiede zu eliminieren, wurde die Kontraktionsamplitude jedes Streifens vor der Behandlung auf sein Ausgangsniveau normalisiert. Die Baseline (d.h. 100%) wurde durch die Analyse der letzten fünf Kontraktionszyklen vor Beginn des Stimulationsprotokolls vor der Behandlung bestimmt.
Bei der Analyse der Kontraktion der Scheiben bei allgemeiner Stimulation wurde beobachtet, dass die Kontraktionskraft der mit Ca2+ -Antagonisten (Nifedipin und Calciseptin) behandelten Scheiben innerhalb von 10 Minuten nach der Behandlung abnahm (Abbildung 5) und der Effekt bis zu 20 Minuten nach der Behandlung vorhanden war. Im Gegensatz dazu erhöhte der spannungsgesteuerte Ca2+ Kanal-Agonist Bay-K8644 die Kontraktionskraft der behandelten Scheibe. Das Steuerelementsegment zeigte keine nennenswerte Änderung an. Die während der Stimulationsprotokolle erzeugten Kontraktionsdaten wurden auf ähnliche Weise analysiert. Hierbei wurden die Daten, die durch das vor der Behandlung (Vorbehandlung) durchgeführte Stimulationsprotokoll generiert wurden, mit den Nachbehandlungsdaten desselben Stimulationsprotokolls verglichen.
Wie bereits erwähnt, begann das Stimulationsprotokoll mit der Beurteilung der Post-Pause-Potenzierung. Während der Pause wird zusätzliches Ca2+ vom sarkoplasmatischen Retikulum (SR) aufgenommen, das bei der ersten Stimulation nach der Pause freigesetzt wird. Daher spiegelt die Post-Pause-Potenzierung die intrazelluläre Ca2 + -Freisetzung aus der SR wider. Daher kann dieser Parameter verwendet werden, um den relativen Beitrag von Ca2 + zu bewerten, der vom Ryanodinrezeptor aus der SR freigesetzt wird. Um die Potenzierung der Scheiben nach einer Stimulationspause beurteilen zu können, wurde die Stärke der ersten Kontraktion nach der Pause durch die durchschnittliche Kontraktion vor der jeweiligen Pause dividiert. Das Steuerelement-Slice zeigte keine nennenswerte Änderung (Abbildung 6A). Es wurde beobachtet, dass die Hemmung der L-Typ-Ca2+-Kanäle nach einer Pause von mindestens 50 s zu einer Potenzierung der ersten Kontraktion führte (Abbildung 6B,D), was einen höheren relativen Beitrag der intrazellulären Ca2+-Freisetzung zur totalen Kontraktilität widerspiegelt. Der gegenteilige Effekt wurde in der mit Bay-K8644 behandelten Scheibe beobachtet, die den Eintritt von extrazellulärem Ca 2+ über die L-Typ Ca2+ Kanäle stimuliert (Abbildung 6C).
Die Kraft-Frequenz-Beziehung wurde durch sukzessive Erhöhung der Schrittmacherrate auf bis zu 180 BPM bewertet. Zur besseren Visualisierung wurde die Kontraktionskraft bei verschiedenen Stimulationsfrequenzen auf die Ausgangskontraktion bei 30 BPM innerhalb desselben Protokolls (=100%) normalisiert. Die Datenanalyse zeigte, dass die Behandlung mit Calciseptin die Fähigkeit des Slices, den Reizen bei Erhöhung der Stimulationsfrequenz zu folgen, beim Vergleich der Daten vor und nach der Behandlung nicht veränderte (Abbildung 7B). Im Kontrollbereich wurde keine Änderung beobachtet (Abbildung 7A). Im Gegensatz zu Calciseptin verhinderte Nifedipin eine Erhöhung der Kontraktilität bei höheren Schrittmacherraten und reduzierte die maximale Abscheidungsrate auf 80 BPM (Abbildung 7D). Die mit dem Ca2+ -Kanal-Agonisten Bay-K8644 behandelte Scheibe zeigte eine erhöhte Kontraktionskraft bei sehr niedrigen Stimulationsfrequenzen (Abbildung 7C). Bei Frequenzen von mehr als 50 BPM schien die Kontraktionskraft jedoch geringer zu sein als während des Vorbehandlungszustands. Die Stimulationsschwelle und die Refraktärperiode wurden ebenfalls vor und nach der Behandlung festgelegt. Es wurden jedoch keine Unterschiede beobachtet, und die Daten werden daher nicht angezeigt.
Abbildung 1: Übersicht über die benötigten Materialien und das Anbausystem . (A) Eine leere Kultivierungskammer, die mit einer grünen Leiterplatte verbunden ist. Die Leiterplatte (1) misst die Kontraktion mit einem Sensor und überträgt die Daten an die Steuerung. (B) Acht gefüllte Kammern auf der schaukelnden Hauptplatte. Zur Abdeckung der Kammern werden Petrischalendeckel (35 mm) verwendet. (C) Die (chirurgischen) Werkzeuge, die zum Trimmen der transmuralen Myokardprobe benötigt werden. Abgebildet sind verschiedene Pinzetten, die für das Vibratom benötigten Klingen und ein Gummipflaster zum Trimmen. (D) Vier 0,9 mm x 70 mm 20 G Nadeln, die in quadratischer Position (0,9 cm x 0,9 cm) durch einen festen Kunststoffblock fixiert werden. Die Verwendung dieses Konstrukts verhindert eine Beschädigung und Bewegung der Probe beim Beschneiden und ergibt einen Gewebeblock mit den erforderlichen Abmessungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Verarbeitung von zwei LV-Proben . (A) Zwei Myokardgewebeblöcke (ca. 1 cm x 1 cm x 1 cm), eingebettet in erstarrte Low-Melt Agarose in einer 35 mm Petrischale. Zu Demonstrationszwecken wurde porcines LV-Gewebe verwendet. (B) Der Agaroseblock mit den eingebetteten Proben wurde aus der Petrischale entfernt, beschnitten und auf die Schneidplattform des Vibratoms geklebt. Hier wurde porcines LV-Gewebe zu Demonstrationszwecken verwendet. Beachten Sie die einheitliche Gewebefarbe und das Fehlen von weißem fibrotischem Gewebe, das durch den roten Pfeil angezeigt wird. (C) Nach dem Schneiden wird die Agarose vorsichtig entfernt und Kunststoffdreiecke (1) werden senkrecht zur Richtung der Myokardfasern verbunden. Die roten Linien zeigen die Richtung der Myokardfasern an. (D) Es wurde menschliches LV-Gewebe hergestellt, das weißes fibrotisches Gewebe in den Scheiben zeigte. Dies senkt nicht unbedingt die Erfolgsrate der Kultivierung; Es wird jedoch empfohlen, Scheiben zu verwenden, die keine Fibrose aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Kultivierungssoftware. Abhängig von der Anzahl der verwendeten Kanäle (maximal acht) wird die Kontraktionsregistrierung in bis zu drei dafür vorgesehenen Fenstern (zwei in der Abbildung sichtbar) visualisiert. Jede Kultivierungskammer wird als ein Kontraktionsdiagramm dargestellt. Im Einstellungsfenster können Stimulationsparameter verändert und auf die gewünschte Versuchssituation abgestimmt werden. In diesem Fenster können Sie auch das ausgewählte Stimulationsprotokoll / den ausgewählten Zeitplan starten oder stoppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Auslesen der Kontraktion von fünf Myokardscheiben während eines typischen Stimulationsprotokolls. In allen Panels wird jedes einzelne Segment in der gleichen Farbe angezeigt. (A) Die Post-Pause-Potenzierung beurteilt die erste Kontraktion nach einer kurzen Stimulationspause von 3, 12, 50 bzw. 120 Sekunden. (B) Bestimmung der Stimulationsschwelle durch Erhöhung des Stimulationsstroms in Schritten von 3 mA alle 10 s von 8 mA auf 80 mA. (C) Das Kraft-Frequenz-Verhältnis jedes Streifens wird durch schrittweise Erhöhung der Stimulationsfrequenz von 12 BPM auf 240 BPM bewertet. Die Dauer der Stimulationsperioden wird bei höheren Frequenzen kürzer, um die Anzahl der Schläge bei jeder Frequenz konstant zu halten. (D) Zur Beurteilung der Feuerfestperiode werden die Scheiben in abnehmenden Abständen des vorhergehenden Reizes (S1) vorzeitigen Stimulationen (S2) ausgesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Analyse der Kontraktionskraft vor und nach der Behandlung mit L-Typ Ca2+ Kanal, der die Wirkstoffe beeinflusst. Alle Daten (n = 1) wurden auf die Baseline-Kontraktilität (Mittelwert von fünf separaten Schlägen vor der Behandlung (0)) normalisiert. L-Typ Ca 2+ Kanalantagonisten Nifedipin (125 nM), Calciseptin (70,8 nM) und L-Typ Ca2+ Kanalagonist Bay-K8644 (417 nM) wurden zu kontrahierenden menschlichen LV-Myokardschnitten hinzugefügt. Die Kontrollscheibe erhielt keine Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Post-Pause-Potenzierung der behandelten und Kontrollscheiben. Es wurden Unterschiede in der Post-Pause-Potenzierung beobachtet (Baseline vs. Post-Behandlung; n = 1). Hierbei wurde die Amplitude der ersten Kontraktion nach einer Pause auf die mittlere Kontraktionsamplitude vor der jeweiligen Pause normalisiert. Die Baseline wurde auf 100% festgelegt und ähnelt der durchschnittlichen Kontraktionsstärke der letzten fünf Zyklen, bevor die erste Pause beginnt. Die Y-Achse zeigt die normalisierte erste Kontraktion nach einer Pause unterschiedlicher Dauer an. Die X-Achse zeigt die Grundlinien- und Pausenlängen an. (A) Kontrollscheibe ohne Behandlung. (B) Calciseptin-Behandlung. (C) Bay-K8644 Behandlung. (D) Nifedipin-Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Analyse der Kraftfrequenzrelation. Kontraktionsdaten (n = 1) wurden innerhalb des jeweiligen Protokolls auf die Kontraktionskraft bei 30 BPM (= 100%) normalisiert. a) die Kontrollscheibe wurde mit keinem Stoff behandelt; Alle anderen Aspekte des Anbaus waren jedoch die gleichen wie die der behandelten Scheiben. (B) Calciseptin-Behandlung einer LV-Myokardscheibe. (C) Bay-K8644 Behandlung. (D) Nifedipin-Behandlung. Daten über die Kontraktionskraft dieser Scheibe während der Stimulationsfrequenzen über 80 BPM wurden weggelassen, da die Kontraktion nicht der Stimulationsfrequenz folgte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Zusammensetzung des Schneidpuffers, der für den Transport und während des Schneidevorgangs verwendet wird. Für die Herstellung von Agarose wird Glukose weggelassen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Zusammensetzung des 4% Agarosegels. Dieses glukosefreie Low-Mel-Agarosegel dient zur Einbettung der Gewebeproben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Vorbereitung des Mediums für den Anbau. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Einzelheiten des Stimulationsprotokolls. Das Stimulationsprotokoll besteht aus vier Teilen, die alle an die Bedürfnisse des Projekts angepasst werden können. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
In der Vergangenheit hat die kardiovaskuläre Forschung große Fortschritte bei der Kultivierung von Kardiomyozyten gemacht. Die 3D-Kultivierung von Kardiomyozyten mit intakter Geometrie ist jedoch noch nicht gut etabliert. Im Vergleich zu früheren Protokollen, die für die Ex-vivo-Kultivierung von Myokardgewebe angewendet wurden, ähnelt das hier beschriebene Protokoll der In-vivo-Umgebung des Gewebes genauer. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von Pre- und Afterload eine biomimetischere Umgebung. Wir sind in der Lage, die kontinuierliche Aufzeichnung der Kontraktionsdaten und Kontraktionsparameter des Gewebes vollständig zu analysieren und zu verstehen.
Die Anzahl der Ex-vivo-Techniken zur Kultivierung kardiovaskulärer Gewebe unter Verwendung ähnlicher Setups ist begrenzt 11,21,22. Eine ähnliche Technik für die Kultivierung von Myokardscheiben, die veröffentlicht wurde, verwendet eine 6-Well-Platte für die Kultivierung von Myokardscheiben10. Eine wichtige Einschränkung dieses speziellen Aufbaus besteht jedoch darin, dass die Scheiben keiner Vor- und Nachbelastung ausgesetzt sind und auch keine detaillierte Ansicht der Kontraktion im Laufe der Zeit liefern können, ohne dass das Gewebe gehandhabt werden muss. Die hier beschriebene Methode reduziert das Risiko von Gewebeschäden oder Infektionen. Darüber hinaus gibt es einen umfassenden Überblick über die möglichen Änderungen der kontraktilen Kraft, wenn dem Anbau eine Substanz von Interesse hinzugefügt wird. Neben der Analyse der normalen Kontraktionskraft jedes Slices ermöglicht das aktuelle Setup die regelmäßige Ausführung vordefinierter Protokolle. Dies ermöglicht die Datenerfassung verschiedener relevanter Parameter des kultivierten Gewebes.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Gewebeschäden müssen vermieden werden, und dies kann bereits während der Explantationsoperation auftreten. Wird das Gewebe nach der Exzision nicht sofort in die Kühllösung überführt, kann dies zu beschädigten Gewebeproben führen. Das beschriebene Protokoll enthält mehrere Schritte, die entscheidend sind, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Die Agarosegewebe-Einbettungsmasse muss unter Verwendung des Schneidepuffers ohne Glukose hergestellt werden, um eine mögliche Karamellisierung der Glucose während des Schmelzprozesses vor Beginn des Protokolls zu verhindern. Es ist wichtig, Schäden durch Hyperthermie zu vermeiden, die durch die Verwendung von Agarose direkt aus dem 80 ° C-Wasserbad verursacht werden, anstatt die Agarose in einer Spritze bei 37 ° C zu inkubieren. Die Temperatur sollte während der Lagerung und des Schneidens 4 ° C betragen, um den Stoffwechsel zu reduzieren und die Ischämie zu minimieren. Außerdem sollte das Gewebe vorsichtig behandelt werden, indem die Agarose und nicht das Gewebe selbst gegriffen wird, wenn es zwischen der Schneideschale und der Petrischale bewegt wird, um die Kunststoffdreiecke zu befestigen. Es ist von größter Wichtigkeit, dass diese Dreiecke in der richtigen Richtung in Bezug auf die Richtung der Myokardfasern befestigt sind. Eine Fehlausrichtung der Dreiecke führt zu Gewebeschäden.
Im Allgemeinen liegt die Stimulationsschwelle von neu geschnittenen Scheiben zwischen 10-20 mA, und der Strom sollte vorsichtig erhöht werden. Eine Überstimulation des Gewebes durch einen zu hohen Strom kann ebenfalls zu irreversiblen Probenschäden führen. Sobald die Stimulation begonnen hat, ist eine Gewebebewegung durch Schaukeln der Kultivierungskammern notwendig und sollte niemals länger als 5 Minuten gestoppt werden, um eine ausreichende Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen für das Gewebe sicherzustellen.
Fehlerbehebung und Änderungen
Hyperkontraktur
Die Hyperkontraktur der Myokardgewebeprobe ist eines der wichtigsten Ausschlusskriterien für das besprochene Protokoll. Dies kann vor und nach der Zubereitung der Myokardscheiben geschehen. In Fällen, in denen sich das Gewebe vor der Zubereitung beim Palpieren steif anfühlte, wurde bei mindestens 70% der Präparate eine Hyperkontraktion beobachtet. Eine Hyperkontraktur der Gewebeprobe kann auch beim Einführen auf die Wippe auftreten, was wahrscheinlich von der Qualität des Gewebes oder dem Krankheitszustand des Patienten abhängt. Hyperkontraktur kann als eine Erhöhung des diastolischen Tonus während der Stimulation des Gewebes angesehen werden, die der tonischen Verkürzung geschädigter Kardiomyozyten bei Herzischämie entspricht. Die Hyperkontraktur während der Stimulation kann progressiv sein, wobei die Kontraktion die Nachweisgrenze von 12 mN überschreitet. Die Hyperkontraktur kann sich jedoch auch spontan innerhalb von 30-60 Minuten umkehren, was darauf hindeutet, dass sich das Gewebe erholen kann. Um die Erholung des Gewebes zu verbessern, sollten die Vorbelastungseinstellungen nach 1 Stunde Inkubation sowie an den Tagen 2, 4 und 6 nach der Zubereitung nachjustiert werden (d. h. Schritt 8.3 wiederholen). Hyperkontraktur kann sowohl mit als auch ohne die stimulierte Kontraktion der Proben vorhanden sein. Wenn jedoch innerhalb von 1 h keine Kontraktion beobachtet wird, sollte die Probe nicht verwendet werden. In diesem Fall hat sich das Gewebe in einem Maße überzogen, von dem es sich nicht erholen kann oder anderweitig beschädigt wurde. Im Allgemeinen hat der Anbau von menschlichen Myokardscheiben nach dem vorgestellten Protokoll gezeigt, dass er eine Erfolgsrate von 90% aufweist.
Erwartete Änderungen der Kontraktionskraft
Abhängig von einer Vielzahl von Faktoren (z. B. Patient, Präparation, Gewebeschädigung) ist es möglich, dass Myoslices, die anfangs eine akzeptable Kontraktion zeigten, während der ersten 24 Stunden einen fortschreitenden Rückgang der kontraktilen Amplituden erfahren. In der Tat kann dieses Verhalten sogar als normal für Scheiben angesehen werden, die aus menschlichen versagenden Herzen im Endstadium gewonnen werden. Es wurde festgestellt, dass die Anpassung der Vorspannung der Scheiben jeden Tag für die folgenden 3 Tage dieses Problem lindert und die Kontraktion verbessert. Nach 24 bis 48 h sollte die Kontraktilität jedoch wieder zunehmen. Beachten Sie, dass die Kontraktion innerhalb der ersten Tage nach der Kultivierung nicht auf das ursprünglich beobachtete Niveau zurückkehrt.
Kurz nach dem Mediumsaustausch, wenn die Proben in den Inkubator zurückgeführt werden, zeigt die Kontraktion typischerweise deutlich erhöhte Amplituden. Das Öffnen und Schließen des Inkubators trägt zu diesem Anstieg bei, da es dazu führt, dass der CO2-Spiegel sinkt. Dies erhöht den pH-Wert im bicarbonatgepufferten Kultivierungsmedium, was zu einer positiven inotropen Reaktion der Scheiben führt. Nach dem Mediumsaustausch nimmt die kontraktile Kraft der Scheiben oft für mehrere Stunden ab, bis sie ihren Anfangswert erreicht oder überschreitet. Um zu verhindern, dass Stimulationsprotokolle durch den Mediumsaustausch beeinträchtigt werden, sollten Stimulationsprotokolle erst mindestens 1 Stunde nach dem Mediumsaustausch ausgeführt werden.
Einschränkungen der Methode
Ein Vorteil der vorliegenden Technik im Vergleich zu früheren Kultivierungsmethoden für menschliches Myokardgewebe ist die Möglichkeit, Vor- und Nachlast auf das kontrahierende Gewebe aufzutragen (und zu modulieren). Es ist jedoch schwierig, die aufgebrachte Last in Bezug auf die Wandspannung zu quantifizieren, obwohl diese Last aus der Federkonstante und den Schnittmaßen abgeschätzt werden konnte. Es wird angenommen, dass es einen positiven Zusammenhang zwischen der Lebensfähigkeit von Myokardgewebe und der Kontraktionsamplitude der Gewebeprobe gibt. Derzeit gibt es jedoch keine Methode, die es ermöglicht, die Lebensfähigkeit jeder einzelnen Scheibe vor der Montage an den Kammern zu testen. Eine kolorimetrische MTT-Färbung kann auf geschnittenen Scheiben durchgeführt werden, die nicht für die Kultivierung verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Myokardzellen zu bestimmen. In Zellen, die lebensfähig sind, reduziert NADPH das gelbe MTT-Salz in violetten Formazankristallen. Eine weitere Einschränkung ist, dass sich die Nährstoffe im Kulturmedium derzeit auf Grundinhaltsstoffe beschränken. Daher unterscheiden sich Nährstoffe und zirkulierende Faktoren von der In-vivo-Umgebung , aus der das Gewebe gewonnen wurde. Medium kann jedoch nach Bedarf ergänzt oder modifiziert werden.
Mögliche Anwendungen der Methode
Es gibt mehrere mögliche Anwendungen der Methode sowohl in Bezug auf die Kardiotoxizität und Drogentests als auch auf das Verständnis der Pathophysiologie von Herzerkrankungen. Erstens kann das im besprochenen Protokoll verwendete System für Arzneimittel- und Karotoxizitäts-Screenings verwendet werden. Mit Hilfe der programmierbaren Stimulationsprotokolle können physiologische Veränderungen als Reaktion auf die Arzneimittelverabreichung analysiert werden. In Bezug auf die Interpretation der Feuerfestperiode muss berücksichtigt werden, dass dies ein funktioneller Parameter ist, der die Wirkung von Arzneimitteln auf die potenzielle Aktionsdauer nicht genau widerspiegelt. Zweitens können die Kultivierungskammern für verschiedene Co-Kultivierungsexperimente von Myokard in Kombination mit Immunzellen genutzt werden. Durch die Verwendung dieser Co-Kultivierung können die direkten Auswirkungen von Immunzell-sezernierten Faktoren auf die Myokardkontraktion beurteilt werden. Schließlich können auch nicht-transplantierte Kardiomyopathie-Proben kultiviert werden, obwohl diese nicht-transplantierten Gewebeproben im Allgemeinen kleiner und daher schwieriger zu verarbeiten sind. Dennoch kann dies Möglichkeiten für die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele und die Entwicklung zielgerichteter Medikamente eröffnen. Denkbar ist auch, die Technik zur patientenspezifischen Gewebecharakterisierung einzusetzen und damit der personalisierten Medizin einen Schritt näher zu kommen. Darüber hinaus kann die vorgestellte Methode für nicht-menschliches Myokardgewebe verwendet werden, von denen Beispiele Schwein und Kaninchen sind. Es ist zu berücksichtigen, dass die hohe physiologische Herzfrequenz von Kleinsäugern (Maus/Ratte) nicht erreicht werden kann, da der nachfolgende höhereO2-Bedarf unter den Bedingungen der Myokardkultivierung mit dem besprochenen Aufbau nicht gedeckt werden kann. Dabei ist eine nahezu physiologische Umgebung in diesen Fällen schwer nachzuahmen.
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Disclosures
JH, PS, DM und KL haben nichts offenzulegen. AD und TS sind Gesellschafter der InVitroSys GmbH, die das Myodish-Kultivierungssystem bereitstellt.
Acknowledgments
Die Forschung wurde durch die DZHK-Zuschüsse 81Z0600207 (JH, PS und DM) und 81X2600253 (AD und TS) gefördert.
Die Autoren danken Claudia Fahney, Mei-Ping Wu und Matthias Semisch für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Aufbauten sowie für die regelmäßige Aufrechterhaltung der Gewebekultivierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
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