Summary
We presenteren een protocol voor ex vivo kweek van humaan ventriculaire myocardiale weefsel. Het maakt een gedetailleerde analyse van contractiekracht en kinetiek mogelijk, evenals de toepassing van pre- en afterload om de in vivo fysiologische omgeving beter na te bootsen.
Abstract
Cardiomyocytenteelt heeft een groot aantal ontwikkelingen doorgemaakt, variërend van tweedimensionale (2D) celkweek tot van iPSC afgeleide organoïden. In 2019 werd een ex vivo manier aangetoond om myocardiale plakjes verkregen uit menselijke hartmonsters te cultiveren, terwijl de in vivo toestand van myocardiale contractie werd benaderd. Deze monsters zijn meestal afkomstig van harttransplantaties of plaatsingen van linkerventrikelhulpmiddelen. Met behulp van een vibratoom en een speciaal ontwikkeld teeltsysteem worden 300 μm dikke plakken tussen een vaste en een veerdraad geplaatst, waardoor een stabiele en reproduceerbare teelt gedurende enkele weken mogelijk is. Tijdens de teelt worden de plakjes continu gestimuleerd volgens individuele settings. Contracties kunnen in realtime worden weergegeven en geregistreerd en farmacologische middelen kunnen gemakkelijk worden toegepast. Door de gebruiker gedefinieerde stimulatieprotocollen kunnen worden gepland en uitgevoerd om vitale contractieparameters zoals post-pauze-potentiatie, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode te beoordelen. Bovendien maakt het systeem een variabele voor- en nabelastingsinstelling mogelijk voor een meer fysiologische teelt.
Hier presenteren we een stapsgewijze handleiding over het genereren van een succesvolle langetermijnkweek van menselijke linkerventrikel myocardiale plakjes, met behulp van een commerciële biomimetische teeltoplossing.
Introduction
In het afgelopen decennium heeft de in vitro kweek van myocardiale cellen grote vooruitgang geboekt, variërend van 2D- en driedimensionale (3D) technieken tot het gebruik van organoïden en geïnduceerde pluripotente stamcellen gedifferentieerd tot cardiale myocyten 1,2,3. Ex vivo en primaire celkweek is van grote waarde gebleken, vooral voor genetisch onderzoek en medicijnontwikkeling 4,5,6. Het gebruik van menselijke weefsels verbetert de translationele waarde van de resultaten. Langdurige 3D-teelt van myocardiale weefsels met intacte geometrie is echter niet goed ingeburgerd. De intacte geometrie is een belangrijk kenmerk om in vivo omstandigheden na te bootsen, omdat een goede hartfunctie, communicatie tussen verschillende cellen en cel-matrixinteracties vereisten zijn. Myocardiale weefselkweek ging door verschillende ontwikkelingsfasen. Het succespercentage en de stabiliteit van ex vivo myocardiale weefselkweek waren aanvankelijk vrij laag, maar recente benaderingen hebben veelbelovende resultaten opgeleverd 7,8,9,10,11.
Fischer et al. waren de eersten die aantoonden dat de levensvatbaarheid en contractiele prestaties van menselijk myocardiaal weefsel gedurende vele weken kunnen worden gehandhaafd in ex vivo celkweek7. Hun techniek was gebaseerd op dunne weefselschijfjes gesneden uit geëxplanteerd menselijk myocardium, die werden gemonteerd in nieuw ontwikkelde kweekkamers die gedefinieerde biomechanische omstandigheden en continue elektrische stimulatie boden. Deze kweekmethode lijkt sterk op de in vivo functie van myocardiaal weefsel en is gereproduceerd door verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen 2,12,13,14,15. Belangrijk is dat de door Fischer et al. gebruikte kamers ook een continue registratie van ontwikkelde krachten gedurende maximaal 4 maanden mogelijk maakten en zo ongekende mogelijkheden openden voor fysiologisch en farmacologisch onderzoek naar intact humaan myocardium7.
Vergelijkbare technieken werden onafhankelijk ontwikkeld door andere groepen en toegepast op menselijk, ratten-, varkens- en konijnenmyocardium 7,10,11. Pitoulis et al. ontwikkelden vervolgens een meer fysiologische methode, die de normale kracht-lengterelatie tijdens een contractiecyclus reproduceert, maar minder geschikt is voor high-throughput analyse16. Als zodanig kan de algemene benadering van biomimetische teelt worden beschouwd als een verdere stap in de reductie, verfijning en vervanging (3R) van dierproeven.
Het benutten van dit potentieel vereist echter gestandaardiseerde procedures, analyses met een hoog gehalte en een hoog doorvoerniveau. We presenteren een techniek die geautomatiseerd snijden van levend menselijk myocardium combineert met in vitro onderhoud in een biomimetisch teeltsysteem dat commercieel beschikbaar is geworden (zie Materiaaltabel). Met de voorgestelde aanpak wordt het aantal afzonderlijke plakjes dat kan worden gegenereerd uit een enkel transmuraal myocardiaal specimen alleen beperkt door de verwerkingstijd. Een exemplaar van voldoende grootte en kwaliteit (3 cm x 3 cm) levert vaak 20-40 plakjes weefsel op die gemakkelijk worden gesneden met een geautomatiseerd vibratoom. Deze plakjes kunnen in teeltkamers van het systeem worden geplaatst. De kamers maken elektrische stimulatie mogelijk, waarvan de parameters kunnen worden gemoduleerd (d.w.z. pulsduur, polariteit, snelheid en stroom), evenals de aanpassing van voor- en nabelasting, met behulp van veerdraden in de kamers. De samentrekking van elke plak wordt geregistreerd door de beweging van een kleine magneet die aan een veerdraad is bevestigd en weergegeven als een interpreteerbare grafiek. Gegevens kunnen te allen tijde worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van vrij beschikbare software. Afgezien van de constante baseline pacing, kunnen geplande protocollen worden uitgevoerd om hun refractaire periode, stimulatiedrempel, post-pauze-potentiatie en kracht-frequentierelatie functioneel te beoordelen.
Deze biomimetische teelt op lange termijn van meerdere myocardiale plakjes uit een individueel hart maakt de weg vrij voor toekomstig ex vivo onderzoek in zowel menselijk als dierlijk weefsel en vergemakkelijkt de screening op therapeutische en cardiotoxische geneesmiddeleffecten in de cardiovasculaire geneeskunde. Het is al toegepast op verschillende experimentele benaderingen 2,12,13,15. Hier geven we een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de voorbereiding van menselijk weefsel en bieden we oplossingen voor vaak voorkomende teeltproblemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Weefselverzameling voor de hier beschreven experimenten werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van de Universiteit van München en de Ruhr-Universiteit Bochum. Studies werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. Patiënten gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan weefselverzameling.
1. Weefselverwerving
- Verkrijg menselijk weefsel van patiënten die een harttransplantatie of hartoperatie ondergaan.
- Voordat u het weefsel aanschaft, bereidt u 2 L cardioplege oplossing (verder aangeduid als snijbuffer (tabel 1)).
- Na het verkrijgen van een transmurale linkerventrikelbiopsie van 4 cm x 4 cm, plaatst u het weefsel onmiddellijk (binnen 5 minuten na excisie) in een afsluitbaar plastic steriel bekerglas voor eenmalig gebruik met ongeveer 70 ml koude (4 °C) snijbuffer. Bewaren bij 4 °C.
OPMERKING: De snijbuffer die in dit protocol wordt gebruikt, maakt koude opslag (4 °C) van het weefsel tot 36 uur mogelijk. Dit maakt koud transport van het weefsel mogelijk vanuit klinieken die niet dicht bij het laboratorium liggen. Transporttijden ≤ 24 uur zijn echter optimaal gebleken.
2. Bereiding van agarose en het vibratoom
- Zorg ervoor dat er voldoende kweekkamers zijn voorbereid en gesteriliseerd (figuur 1A).
- Dompel de kamers en grafietelektroden onder in 1 L van een 10% isopropanoloplossing en roer een nacht. Breng de volgende dag de kamers gedurende 3 minuten over naar een 100% isopropanoloplossing en autoclaaf de grafietelektroden bij 120 °C gedurende 10 minuten.
- Laat de kamers en grafietelektroden aan de lucht drogen onder een laminaire stromingskap.
- Bevestig een printplaat aan elk van de kamers volgens de beschikbare posities op de rocker. Plaats twee grafietelektroden op de printplaat volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats een petrischaaldeksel van 35 mm op de kamer om besmetting te voorkomen.
- Zet het Myodish teeltsysteem (zie Materiaaltabel) op in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 door het systeem aan te sluiten op een computer (figuur 1B).
- Bereid de 4% low-melt agarose in snijbuffer (zonder glucose; Tabel 2). De agarose kan 6 maanden bij 4 °C bewaard worden.
- Smelt op de dag van het experiment een voorraad agarose-oplossing met behulp van een waterbad dat is ingesteld op 80 °C. Afhankelijk van de hoeveelheid duurt het smelten ongeveer 30 minuten.
- Wanneer de agarose vloeibaar is, zuig dan 8 ml vloeibare agarose op in een spuit van 10 ml, met nog eens 2 ml lucht. Sluit de spuit met een steriele dop en plaats deze ondersteboven in een waterbad van 37 °C gedurende 20 minuten, om te voorkomen dat de agarose stolt en om de temperatuur in evenwicht te brengen om hyperthermieschade van het monster te voorkomen.
- Schakel, indien aanwezig, het waterkoelingsapparaat van het vibratoom ten minste 30 minuten voorafgaand aan het snijden van het weefsel in om voldoende koelcapaciteit mogelijk te maken. Stel de temperatuur van de watercirculatie in op 4 °C.
OPMERKING: De snijbak en koelplaat die hier werden gebruikt, bevatten beide een ingebouwde watercirculatie. Dit wordt sterk aanbevolen voor koeling en om de besmettingsrisico's te verlagen. Het is echter ook mogelijk om ijs als koeltechniek te gebruiken. Ook hoeft het waterkoelingsapparaat op dit punt in het protocol niet te worden aangesloten op de snijlade en/of koelplaat van de vibratome. - Reinig de snijbak en monsterplaat van de vibratome door alle oppervlakken gedurende ten minste 3 minuten met 100% isopropanol te spoelen.
OPMERKING: Afhankelijk van het gebruikte vibratoomsysteem kan de opstelling van het vibratoom verschillen. Raadpleeg de handleiding van het vibratoom dat in het laboratorium aanwezig is voor informatie over de opstelling en de kalibratiemethoden van het mes. - Vul de snijbak tot 90%-95% met snijbuffer. In de huidige opstelling komt dit overeen met ongeveer 400 ml. Sluit de slang van het waterkoelingsapparaat aan op de kleppen op de snijbak en koelplaat van het vibratoom.
- Desinfecteer alle gereedschappen die nodig zijn voor de bereiding door ze gedurende 5 s onder te dompelen in een 100% isopropanoloplossing. Verwijder de gereedschappen uit de isopropanoloplossing en droog aan de lucht onder de laminaire stromingskap.
3. Bijsnijden en insluiten van de monsters
- Breng het weefselmonster over in een petrischaaltje van 100 mm gevuld met koude snijbuffer. Bewaar de schaal op een koelplaat bij 4 °C (aangesloten op koeler of op ijs geplaatst).
- Verwijder endocardiale trabeculae door het endocardium met een pincet vast te houden en met een schaar ongeveer 3 mm endocardweefsel weg te snijden. Verwijder op dezelfde manier overmatig vetweefsel onder het epicard, indien aanwezig.
- Fixeer het gesneden weefselmonster, endocardiale kant naar boven, tot een rubberen lap van 2 cm x 2 cm met behulp van vier naalden van 0,9 mm x 70 mm 20 G die in een vierkante positie (0,9 cm x 0,9 cm) zijn bevestigd; Figuur 1C, D). Zorg ervoor dat de diagonale rand van elke naaldpunt naar binnen wijst. Dit verbetert de fixatie en voorkomt schade aan het myocardium.
LET OP: De oriëntatie van het bovengenoemde vierkant moet orthogonaal zijn ten opzichte van de verwachte overheersende myofiberrichting. - Snijd al het overtollige weefsel buiten het vierkant van de vier naalden weg met behulp van een scalpel. Als de grootte van het oorspronkelijke monster het toelaat, gebruikt u tijdens dit preparaat twee monsters van myocardiale weefsels uit hetzelfde onbewerkte monster.
- Plaats het bijgesneden monster met een pincet op een steriel stuk weefsel om eventuele overtollige snijbuffer op het monster te verwijderen. Om uitdroging van het monster te voorkomen, mag u het monster niet langer dan 10 s op het weefsel bewaren.
- Plaats het (de) monster(s) in een petrischaaltje van 35 mm, zodat het mes loodrecht op de uitlijning van de cardiomyocyten snijdt en het epicardium naar beneden is gericht. Als het preparaat twee monsters bevat, zorg er dan voor dat de monsters gecentreerd zijn en elkaar niet aanraken.
- Neem de agarose spuit uit het waterbad en dompel het (de) monster(s) onder in agarose. (Figuur 2A). Laat de agarose 5 min stollen op een koelplaat. De monsters moeten in contact blijven met de petrischaal, die ervoor zorgt dat het snijvlak evenwijdig is aan de overheersende myocardiale vezelrichting.
LET OP: Maak de spuit niet volledig leeg om luchtbellen te voorkomen. Let op de hoeveelheid agarose die in de spuit achterblijft tijdens het onderdompelen van de monsters. In het geval van luchtbellen in de schaal met de monsters, trekt u voorzichtig luchtbellen terug in de spuit.
4. De monsters op de snijbak plaatsen
- Verwijder de gestolde agarose met het (de) monster(s) uit de petrischaal van 35 mm met een spatel of een soortgelijk gereedschap door deze tussen het monster en de zijkant van de petrischaal te wiggen. Snijd een deel van de agarose weg met behulp van een scalpel terwijl je de monsters bedekt houdt.
LET OP: Verwijder niet te veel van de agarose. Er moet ten minste 5 mm agarose overblijven aan de lange en korte zijden in het X / Z-vlak.
OPMERKING: Stap 4.2-4.4 moet snel achter elkaar worden uitgevoerd (d.w.z. maximaal 5 s). Heb alle benodigde tools binnen handbereik voordat u begint. Na plaatsing is geen herpositionering van het monster mogelijk. Probeer de blootstelling van de lijm aan lucht en vocht te beperken. Contact met lucht of vloeistoffen zal de lijm stollen, waardoor deze onbruikbaar wordt. - Plaats en verdeel met een pipet 60 μL lijm in en rond het midden van het snijplatform.
- Plaats de epicardiale zijde van het monster in agarose met een pincet op het gelijmde gebied. Verplaats niet. De endocardiale zijde van het monster moet zichtbaar zijn in de agarose. Laat de lijm 1 min stollen. Druk de agarose met het monster voorzichtig vanaf de bovenkant aan met een stomp gereedschap (bijv. pincet) terwijl u voorkomt dat u in de agarose snijdt of deze beschadigt.
- Plaats het monsterplatform op de aangewezen plaats in de snijbak van het vibratoom, gevuld met snijbuffer.
5. Het vibratoom starten
- Stel de trillingsamplitude in op 1 mm en de initiële snijsnelheid op 0,07 mm/s. Stel de dikte van de plak in op 300 μm om plakjes te snijden.
- Zolang het mes alleen de agarose snijdt, verhoogt u de snijsnelheid tot het maximum, dat in dit geval 1,50 mm / s is. Zodra het vibratoom begint met het snijden van het weefsel, verlaagt u de snelheid onmiddellijk tot 0,07 mm / s.
OPMERKING: Als het weefsel niet soepel wordt gesneden, bijvoorbeeld als er grote fibrotische gebieden in het monster zijn, kan dit helpen om de snijamplitude tot 1,5 mm te verhogen en de snijsnelheid te verlagen tot 0,04 mm / s.
6. Medium- en incubatorvoorbereiding tijdens de snijprocedure
- Vul elke teeltkamer met 2,4 ml compleet teeltmedium (tabel 3).
- Plaats de met medium gevulde teeltkamers op het teeltsysteem in de incubator set op 37 °C, 5% CO2, 21% O2 en een vochtigheid van 80%. Breng het medium gedurende ten minste 20 minuten in evenwicht.
- Sluit het teeltsysteem aan op een computer en start het bijbehorende softwareprogramma.
- Stel de rockersnelheid in op 60 rpm en stel de stimulatieparameters in (stimulatiepulsen en frequentie). Stel voor menselijke cardiale plakjes de standaardstimulatie in op bifasische impulsen met 50 mA stroom, elk bestaande uit 3 ms positieve stroom, een 1 ms pauze en een 3 ms puls van omgekeerde stroom, met een pacing rate van 30 slagen per minuut (BPM).
OPMERKING: In goed bewaarde weefsels is de typische stimulatiedrempel ongeveer 15 mA. Om betrouwbare stimulatie te garanderen en rekening te houden met een eventuele verhoging van de stimulatiedrempel, wordt aanbevolen om de stroom in te stellen op een waarde die de stimulatiedrempel twee- tot drievoudig overschrijdt. - Controleer de elektrode-indicatoren van de software om te controleren of de elektroden van de teeltkamers correct werken.
OPMERKING: Actie is nodig wanneer de kanaalindicator in de teeltsoftware rood wordt. In dit geval zijn de bipolaire pulsladingen niet in evenwicht.
7. De plakjes voorbereiden
OPMERKING: Initiële subendocardiale plakjes zijn vaak niet geschikt voor weefselkweek en moeten worden weggegooid vanwege ongelijke morfologie. Na de eerste vijf tot 10 plakjes verbeteren de segmenttextuur en morfologie. De ideale plak is minstens 1 cm x 1 cm, heeft geen of slechts beperkte fibrotische vlekken, is niet gefragmenteerd en heeft homogene vezeluitlijning (figuur 2B, D). Interstitiële fibrose, gelegen tussen de myocytvezels, is vaak aanwezig in falend menselijk myocardium. Verrassend genoeg is dit geen negatieve voorspeller van teeltsucces.
- Giet een voldoende hoeveelheid koude snijbuffer in een petrischaaldeksel van 5 cm om ervoor te zorgen dat plakjes niet uitdrogen. Plaats de plakjes in het deksel van de petrischaal met daarin de koude snijbuffer.
- Scheid de agarose van het weefsel met behulp van een pincet. Voorkom het aanraken van het weefsel. Behandel het weefsel zorgvuldig, omdat eventuele schade aan het weefsel het succespercentage van de teelt zal verminderen.
- Bepaal de richting van de myocardiale vezels door een nauwkeurige inspectie tegen een lichtbron. Dit is van belang bij het bevestigen van de plastic driehoeken aan het weefsel in stap 7.6.
OPMERKING: Stap 7.4 en 7.5 moeten snel achter elkaar worden uitgevoerd, binnen 5 s. - Bevestig twee plastic driehoeken aan een monster met behulp van lijm om het weefsel in de kweekkamers te verankeren.
- Leg 1 μL lijm op een steriel petrischaaldeksel. Gebruik een gehaakt pincet om een van de geautoclaveerde plastic driehoeken op te pakken. Dompel snel de voorrand van de driehoek in de lijm en plak de driehoek op het monster, loodrecht op de cardiomyocytenuitlijning. Herhaal dit voor de andere driehoek.
- Knip weefsel af dat de driehoeksbreedte overschrijdt met een scalpel (figuur 2C). Plaats de plak met de twee gemonteerde driehoeken terug in de snijbuffer van de snijbak.
OPMERKING: Herhaal stap 7.2 tot en met 7.5 totdat er voldoende plakjes klaar zijn om de teeltkamers te vullen. We raden aan om een paar extra plakjes te bereiden om plakjes met slechte contractie te kunnen vervangen.
8. Montage van de plakjes
LET OP: De nabelasting wordt bepaald door de stijfheid van de veerdraad in de teeltkamers. Er zijn drie verschillende types beschikbaar, gebaseerd op de dikte van de veerdraad.
- Neem een medium gevulde kweekkamer uit de incubator. Selecteer een van de voorbereide segmenten en plaats deze in de kamer door één driehoek aan elke pin aan te sluiten.
- Pas de afstand tussen de montagepennen aan op basis van de monstergrootte. Zorg ervoor dat het monster is ondergedompeld in medium. Plaats de kamer terug in de aangewezen socket van het teeltsysteem in de incubator.
LET OP: Span het weefsel niet te veel en buig de veerdraad niet te veel! - Stel de voorspanning in na plaatsing van de schotel op de rocker.
- Verminder de voorspanning door de stelschroef tegen de klok in te draaien. Doe dit totdat de basislijn van de bijbehorende grafiek op het computerscherm niet meer verandert.
- Verhoog voorzichtig de voorspanning (d.w.z. verhoog de spanning) door de stelschroef met de klok mee te draaien. Voor de kamers met de hoogste stijfheid, ga door totdat de overeenkomstige basislijn in de grafiek is toegenomen met 1000-1200 eenheden, wat overeenkomt met 1 mN voorspanning.
OPMERKING: De exacte afstelling is afhankelijk van de individuele veerconstante van een teeltkamer, die kan worden bepaald door kalibratie voorafgaand aan een experiment volgens de instructies van de fabrikant. De opnamesoftware maakt het mogelijk om rekening te houden met de kalibratie van de individuele kamer, zodat de krachten gelijkmatig in μN worden weergegeven. Het wordt aanbevolen om elektrische stimulatie toe te passen vanaf het begin van de teelt. Als zodanig is het goed mogelijk dat de slice begint samen te trekken tijdens de preload-aanpassing. Richt u in dit geval op de diastolische basislijn om de voorbelasting te beoordelen.
9. Het medium veranderen
- Bereid het teeltmedium volgens het recept in tabel 3. Voeg kort voor gebruik van het medium 50 μL β-mercaptoethanol (50 mM) toe aan een buis van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.
- Wissel eens in de 2 dagen het teeltmedium gedeeltelijk om. Ververs het medium om de 2 dagen, als langdurige teelt van de myocardiale plakjes gewenst is.
- Verwarm het verse medium voor in een waterbad of heteluchtincubator bij 37 °C gedurende 30-45 minuten. Verwijder een kweekkamer uit de incubator en plaats deze onder een laminaire stromingskap.
LET OP: Het is essentieel om de kamer, evenals het medium, warm te houden bij 37 °C (> 35 °C) om hypercontracturen als gevolg van lage temperaturen te voorkomen. Minder duidelijke schade kan aanwezig zijn als een toename van diastolische spanning binnen enkele uren na medium uitwisseling. Dit lijkt misschien te herstellen, maar herhaalde stress kan leiden tot accumulerende verslechtering. - Verwijder het medium uit de teeltkamer en laat ongeveer 0,8 ml in de kamer achter. Voeg 1,6 ml vers medium toe aan dezelfde kamer. Het totale volume van het medium moet ongeveer 2,4 ml per kamer zijn.
- Plaats de afdekking van de kamer terug en plaats de teeltkamer terug in zijn respectieve positie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De samentrekking van de myocardiale plakjes werd weergegeven op het computerscherm na het inbrengen van de teeltkamer in de overeenkomstige connector (figuur 3). De samentrekking van de menselijke myocardiale plakjes begon onmiddellijk na stimulatie. De plakjes hypercontracteerden gedurende 5-10 min. Dit was zichtbaar als een toename van diastolische krachten, veroorzaakt door een tonische contractuur van beschadigde weefselfracties. Dit proces werd binnen 1-1,5 uur in verschillende mate teruggedraaid. Na stabilisatie vertoonden menselijke LV-weefselplakken spierkrachten variërend tussen 1 mN en 3 mN bij stimulatie. Systole wordt getoond als een sterke toename van de contractiekracht, gevolgd door diastole met een even steile afname van de contractiekracht.
De samentrekking van de myocardiale plakjes werd door de teeltsoftware geregistreerd en opgeslagen in een aangewezen bestand. Elk van de gegenereerde onbewerkte gegevensbestanden werd geconverteerd naar een leesbaar Binair Axon-bestandsformaat (.abf) voor eenvoudige analyse en kwantificering van de gegevens. Voor de eerste analyse werd het .abf-bestand geopend in een geschikt programma. Ongeveer 5 minuten contractiegegevens werden geselecteerd om de gemiddelde contractieamplitude tijdens deze periode vast te stellen. Dit werd gedaan voor meerdere tijdstippen in het opgenomen gegevensbestand. Het plotten van deze contractiewaarden in de loop van de tijd leverde een bruikbare grafiek op om de contractieontwikkeling in een controle- en experimentele setting te vergelijken. Om een geavanceerder inzicht te krijgen in de prestaties van de gegenereerde segmenten, werden stimulatieprotocollen uitgevoerd. Tijdens deze protocollen, die ongeveer 45 minuten duren, werden de stimulatieparameters gewijzigd om parameters van contractiekoppeling te beoordelen.
Het huidige stimulatieprotocol bestond uit vier verschillende secties: post-pauze-potentiatie, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode (figuur 4, tabel 4). Tijdens de post-pauze-potentiatie wordt de stimulatie hervat na een korte stop van 3, 12, 50 of 120 s. Om de stimulatiedrempel te bepalen, wordt de stimulatiestroom verhoogd in stappen van 3 mA om de 10 s, beginnend bij 8 mA en oplopend tot 90 mA. Met deze test kan de minimale stimulatiestroom voor elke plak worden bepaald. Dit verandert niets aan de algemene stimulatie-instellingen buiten het stimulatieprotocol. De kracht-frequentierelatie wordt beoordeeld door een stapsgewijze toename van de stimulatiefrequentie (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 en 240 BPM), terwijl de respectieve duur van elke stap parallel wordt verkort. Met uitzondering van de eerste twee frequentie-instellingen levert dit regime tussen de 20-40 weeën op tijdens elke stap. De refractaire periode van elke plak wordt beoordeeld door een voortijdige stimulus (S2) te sturen na een normale stimulus (S1; 30 BPM). Het S1-S2 interval wordt om de 10 s ingekort.
Om het potentieel van het gepresenteerde teeltsysteem als hulpmiddel voor het testen van farmacologische interventies aan te tonen, werden ex vivo menselijke LV-weefselplakken bereid van dezelfde patiënt en onderworpen aan farmacologische middelen die de intracellulaire calciumionen (Ca2+) niveaus (n = 1) beïnvloeden na 2 weken teelt. De L-type Ca2+-kanaals antagonist nifedipine remt Ca2+ instroom in de myocardiale cellen en verlaagt daardoor de intracellulaire beschikbaarheid van Ca2+ en vermindert de contractiliteit17. Vanwege de vaatverwijdende werking wordt nifedipine gebruikt als een antihypertensief medicijn. Om farmacologische verschillen van Ca2+-kanaals antagonisten aan te tonen, werd calciseptine onderzocht voor vergelijking. Calciseptine is ook een L-type Ca2+-kanaals antagonist, geëxtraheerd uit het Dendroaspis p. polylepis gif18. Daarom deelt het de negatieve inotrope werking van nifedipine. Calciseptine heeft echter verschillende bindingskenmerken en is krachtiger in vergelijking met nifedipine19. Om de positieve en negatieve modulaties van Ca2+ beschikbaarheid te bestuderen, hebben we ook de calciumkanaalagonist Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-(2-[trifluormethyl]fenyl)pyridine-3-carbonzuurmethylester)20 getest.
Drie plakjes werden behandeld met respectievelijk nifedipine (125 nM), calciseptine (70,8 nM) en Bay-K8644 (417 nM), terwijl de vierde plak geen medicijn (controle) kreeg. De contractiekrachten onder algemene stimulatieparameters (50 mA stroom, bifasische pulsen 3 ms duur, 1 ms interval en 30 BPM pacing rate) werden vergeleken voor en na de behandeling. Bovendien werd vóór de behandeling een stimulatieprotocol uitgevoerd om de uitgangswaarden voor post-pauze-potentiatie, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode te beoordelen. Na 30 minuten behandeling werd een tweede stimulatieprotocol uitgevoerd. Om interindividuele verschillen te elimineren, werd de contractieamplitude van elke plak vóór de behandeling genormaliseerd tot het basisniveau. De baseline (d.w.z. 100%) werd bepaald door de laatste vijf contractiecycli vóór de start van het pre-behandelingsstimulatieprotocol te analyseren.
Bij het analyseren van de samentrekking van de plakjes bij algemene stimulatie, werd waargenomen dat de contractiekracht van de met Ca 2+ antagonistenbehandelde plakjes (nifedipine en calciseptine) binnen 10 minuten na de behandeling afnam (figuur 5) en het effect was aanwezig tot 20 minuten na de behandeling. Daarentegen verhoogde de spanningsafhankelijke Ca2+ kanaalagonist Bay-K8644 de contractiekracht van de behandelde plak. Het controlesegment vertoonde geen noemenswaardige verandering. De contractiegegevens die tijdens de stimulatieprotocollen werden gegenereerd, werden op een vergelijkbare manier geanalyseerd. Hier werden de gegevens die werden gegenereerd door het stimulatieprotocol dat vóór de behandeling (voorbehandeling) werd uitgevoerd, vergeleken met de gegevens na de behandeling van hetzelfde stimulatieprotocol.
Zoals eerder besproken, begon het stimulatieprotocol met de beoordeling van de post-pauze-potentiëring. Tijdens de pauze wordt extra Ca2+ opgenomen door het sarcoplasmatisch reticulum (SR), dat vrijkomt bij de eerste stimulatie na de pauze. Vandaar dat post-pauze-potentiatie intracellulaire Ca2+ release van de SR weerspiegelt. Als zodanig kan deze parameter worden gebruikt om de relatieve bijdrage van Ca2+ die door de ryanodinereceptor uit de SR wordt vrijgegeven, te beoordelen. Om de potentiëring van de plakjes na een stimulatiepauze te beoordelen, werd de sterkte van de eerste contractie na de pauze gedeeld door de gemiddelde samentrekking vóór de respectieve pauze. Het controlesegment vertoonde geen noemenswaardige verandering (figuur 6A). Er werd waargenomen dat de remming van de L-type Ca2+ kanalen leidde tot potentiëring van de eerste contractie na een pauze van ten minste 50 s (figuur 6B,D), wat een hogere relatieve bijdrage van intracellulaire Ca2+ afgifte aan de totale contractiliteit weerspiegelt. Het tegenovergestelde effect werd waargenomen in de plak behandeld met Bay-K8644, die de binnenkomst van extracellulaire Ca2+ stimuleert via de L-type Ca2+ kanalen (figuur 6C).
De kracht-frequentierelatie werd beoordeeld door achtereenvolgens de pacing rate te verhogen tot 180 BPM. Voor een betere visualisatie werd de contractiekracht bij verschillende stimulatiefrequenties genormaliseerd naar de baseline contractie bij 30 BPM binnen hetzelfde protocol (=100%). Gegevensanalyse toonde aan dat de behandeling met calciseptine het vermogen van de plak om de stimuli te volgen bij toename van de stimulatiefrequentie bij het vergelijken van de gegevens voor en na de behandeling niet veranderde (figuur 7B). Er werd geen verandering waargenomen in het controlesegment (figuur 7A). In tegenstelling tot calciseptine voorkwam nifedipine een toename van de contractiliteit bij hogere pacingsnelheden en verlaagde de maximale opnamesnelheid tot 80 BPM (figuur 7D). De plak behandeld met de Ca2+ kanaalagonist Bay-K8644 vertoonde een verhoogde contractiekracht bij zeer lage stimulatiefrequenties (figuur 7C). Bij frequenties hoger dan 50 BPM bleek de contractiekracht echter lager te zijn dan tijdens de voorbehandeling. De stimulatiedrempel en de refractaire periode werden ook voor en na de behandeling bepaald. Er werden echter geen verschillen waargenomen en de gegevens worden daarom niet getoond.
Figuur 1: Overzicht van de benodigde materialen en het teeltsysteem. (A) Een lege teeltkamer aangesloten op een groene printplaat. De printplaat (1) meet de contractie met een sensor en verzendt de gegevens naar de controller. (B) Acht gevulde kamers geplaatst op de schommelende hoofdplaat. Petrischaaldeksels (35 mm) worden gebruikt om de kamers te bedekken. (C) De (chirurgische) hulpmiddelen die nodig zijn om het transmurale myocardiale monster te trimmen. Afgebeeld zijn verschillende pincetten, de messen die nodig zijn voor de vibratome en een rubberen patch om te helpen bij het trimmen. (D) Vier naalden van 0,9 mm x 70 mm 20 G die in vierkante positie (0,9 cm x 0,9 cm) worden bevestigd door een massief blok plastic. Het gebruik van deze constructie voorkomt schade en beweging van het monster bij het trimmen en levert een weefselblok op met de vereiste afmetingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verwerking van twee LV-monsters. (A) Twee myocardiale weefselblokken (ongeveer 1 cm x 1 cm x 1 cm) ingebed in gestolde laagsmeltende agarose in een petrischaaltje van 35 mm. Voor demonstratiedoeleinden werd lv-weefsel van varkens gebruikt. (B) Het agaroseblok met de ingebedde monsters werd uit de petrischaal verwijderd, bijgesneden en op het snijplatform van het vibratoom gelijmd. Hier werd varkens LV-weefsel gebruikt voor demonstratiedoeleinden. Let op de uniforme weefselkleur en de afwezigheid van wit fibrotisch weefsel, aangegeven door de rode pijl. (C) Na het snijden wordt de agarose zorgvuldig verwijderd en worden plastic driehoeken (1) loodrecht op de richting van de myocardiale vezels aangesloten. De rode lijnen geven de richting van de myocardiale vezels aan. (D) Er werd menselijk LV-weefsel bereid, dat wit fibrotisch weefsel in de plakjes vertoonde. Dit hoeft niet noodzakelijkerwijs het slagingspercentage van de teelt te verlagen; het wordt echter aanbevolen om plakjes te gebruiken die geen fibrose vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De teeltsoftware. Afhankelijk van het aantal gebruikte kanalen (maximaal acht), wordt de contractieregistratie gevisualiseerd in maximaal drie aangewezen vensters (twee zichtbaar in de figuur). Elke teeltkamer wordt weergegeven als één krimpgrafiek. In het instellingenvenster kunnen stimulatieparameters worden gewijzigd en aangepast aan de gewenste experimentele situatie. Dit venster maakt het ook mogelijk om het geselecteerde stimulatieprotocol / schema te starten of te stoppen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Uitlezing van de samentrekking van vijf myocardiale plakjes tijdens een typisch stimulatieprotocol. In alle deelvensters wordt elk afzonderlijk segment in dezelfde kleur weergegeven. (A) Post-pauze-potentiatie beoordeelt de eerste contractie na een korte stimulatiepauze van respectievelijk 3, 12, 50 en 120 seconden. (B) Bepaling van de stimulatiedrempel door de stimulatiestroom in stappen van 3 mA om de 10 s te verhogen van 8 mA naar 80 mA. (C) De kracht-frequentierelatie van elke slice wordt beoordeeld door stapsgewijze verhogingen van de stimulatiefrequentie van 12 BPM naar 240 BPM. De duur van stimulatieperioden wordt korter bij hogere frequenties om het aantal slagen constant te houden bij elke frequentie. (D) Om de refractaire periode te beoordelen, worden de plakjes blootgesteld aan voortijdige stimulaties (S2) met afnemende intervallen ten opzichte van de voorgaande stimulus (S1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Analyse van de contractiekracht voor en na de behandeling met L-type Ca2+ kanaal dat de middelen beïnvloedt. Alle gegevens (n = 1) werden genormaliseerd naar de baseline contractiliteit (gemiddelde van vijf afzonderlijke slagen vóór de behandeling (0)). L-type Ca2+ kanaalantagonisten nifedipine (125 nM), calciseptine (70,8 nM) en L-type Ca2+ kanaalagonist Bay-K8644 (417 nM) werden toegevoegd aan het samentrekken van menselijke LV myocardiale plakjes. De controleschijf kreeg geen behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Post-pauze-potentiëring van de behandelde en controle plakjes. Verschillen in post-pauze-potentiatie werden waargenomen (baseline versus post-behandeling; n = 1). Hier werd de amplitude van de eerste contractie na een pauze genormaliseerd naar de gemiddelde contractieamplitude vóór de respectieve pauze. Baseline werd ingesteld op 100% en lijkt op de gemiddelde contractiesterkte van de laatste vijf cycli voordat de eerste pauze begint. De Y-as geeft de genormaliseerde eerste contractie weer na een pauze van verschillende duur. De X-as toont de basislijn en pauzelengtes. (A) Controlesegment zonder behandeling. (B) Behandeling met calciseptine. C) Behandeling met Bay-K8644. (D) Behandeling met nifedipine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Analyse van de krachtfrequentierelatie. Contractiegegevens (n = 1) werden genormaliseerd naar de contractiekracht bij 30 BPM binnen het betreffende protocol (= 100%). A) het controleschijfje is met geen enkele stof behandeld; alle andere aspecten van de teelt waren echter hetzelfde als die van de behandelde plakjes. (B) Behandeling met Calciseptine van één LV-myocardiale plak. C) Behandeling met Bay-K8644. (D) Behandeling met nifedipine. Gegevens over de contractiekracht van deze slice tijdens stimulatiefrequenties boven 80 BPM werden weggelaten, omdat de contractie niet de stimulatiefrequentie volgde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van de snijbuffer die wordt gebruikt voor transport en tijdens de snijprocedure. Voor de bereiding van agarose wordt glucose weggelaten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Samenstelling van de 4% agarose gel. Deze glucosevrije low-melt agarose gel wordt gebruikt voor het inbedden van de weefselmonsters. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Bereiding van het medium voor de teelt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Details van het stimulatieprotocol. Het stimulatieprotocol bestaat uit vier delen, die allemaal kunnen worden aangepast aan de behoeften van het project. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het verleden heeft cardiovasculair onderzoek grote vooruitgang geboekt bij de teelt van cardiomyocyten. De 3D-teelt van cardiomyocyten met intacte geometrie is echter nog niet goed ingeburgerd. Vergeleken met eerdere protocollen die werden toegepast voor ex vivo kweek van myocardiaal weefsel, lijkt het protocol dat we hier beschreven meer op de in vivo omgeving van het weefsel. Bovendien zorgt de toepassing van pre- en afterload voor een meer biomimetische omgeving. We zijn in staat om de continue registratie van de contractiegegevens en contractieparameters van het weefsel volledig te analyseren en te begrijpen.
Het aantal ex vivo cardiovasculaire weefselkweektechnieken met vergelijkbare opstellingen is beperkttot 11,21,22. Een vergelijkbare techniek voor de teelt van myocardiale plakjes die is gepubliceerd, maakt gebruik van een 6-well plaat voor de teelt van myocardiale plakjes10. Een belangrijke beperking van deze specifieke opstelling is echter dat de plakjes niet worden blootgesteld aan voor- en nabelasting, noch in staat is om een gedetailleerd beeld van de samentrekking in de loop van de tijd te geven zonder de noodzaak om het weefsel te hanteren. De methode die we hier hebben beschreven, vermindert het risico op weefselbeschadiging of infectie. Bovendien geeft het een uitgebreid beeld van de mogelijke veranderingen in contractiele kracht wanneer een stof van belang aan de teelt wordt toegevoegd. Naast de analyse van de normale contractiekracht van elke slice, maakt de huidige set-up het mogelijk om regelmatig vooraf gedefinieerde protocollen uit te voeren. Dit maakt het mogelijk om gegevens te verzamelen van verschillende relevante parameters van het gekweekte weefsel.
Kritieke stappen binnen het protocol
Weefselschade moet worden vermeden en dit kan al gebeuren tijdens de explantoperatie. Als het weefsel na excisie niet onmiddellijk naar de koelceloplossing wordt overgebracht, kan dit leiden tot beschadigde weefselmonsters. Het beschreven protocol bevat verschillende stappen die van cruciaal belang zijn om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De agarose weefselinbeddingsverbinding moet worden bereid met behulp van de snijbuffer zonder glucose, om mogelijke karamelisatie van de glucose tijdens het smeltproces vóór het begin van het protocol te voorkomen. Het is belangrijk om schade als gevolg van hyperthermie veroorzaakt door het gebruik van agarose rechtstreeks uit het waterbad van 80 °C te voorkomen, in plaats van de agarose in een spuit bij 37 °C te incuberen. De temperatuur moet 4 °C zijn tijdens opslag en snijden om het metabolisme te verminderen en ischemie te minimaliseren. Ook moet weefsel met zorg worden behandeld, door de agarose te grijpen in plaats van het weefsel zelf, wanneer het tussen de snijbak en de petrischaal wordt verplaatst om de plastic driehoeken te bevestigen. Het is van het grootste belang dat deze driehoeken in de juiste richting worden bevestigd met betrekking tot de richting van de myocardiale vezels. Verkeerde uitlijning van de driehoeken zal resulteren in weefselschade.
Over het algemeen ligt de stimulatiedrempel van nieuw gesneden plakjes tussen 10-20 mA en moet de stroom voorzichtig worden verhoogd. Overstimulatie van het weefsel door een te hoge stroom kan ook leiden tot onomkeerbare monsterschade. Zodra de stimulatie is begonnen, is weefselroeren door de kweekkamers te schudden noodzakelijk en mag deze nooit langer dan 5 minuten worden gestopt om voldoende beschikbaarheid van zuurstof en voedingsstoffen voor het weefsel te garanderen.
Probleemoplossing en wijzigingen
Hypercontractuur
Hypercontractuur van het myocardiale weefselmonster is een van de belangrijkste uitsluitingscriteria voor het besproken protocol. Dit kan gebeuren voor en na de bereiding van de myocardiale plakjes. In gevallen waarin, vóór de bereiding, het weefsel stijf aanvoelde bij palpatie, werd hypercontractie waargenomen in ten minste 70% van de preparaten. Hypercontractuur van het weefselmonster kan ook optreden bij het inbrengen op de rocker, wat waarschijnlijk afhangt van de kwaliteit van het weefsel of de ziektetoestand van de patiënt. Hypercontractuur kan worden gezien als een toename van de diastolische tonus tijdens de stimulatie van het weefsel, wat overeenkomt met de tonische verkorting van beschadigde cardiomyocyten bij cardiale ischemie. Hypercontractuur tijdens stimulatie kan progressief zijn, waarbij de samentrekking de detectiegrens van 12 mN overschrijdt. De hypercontractuur kan echter ook spontaan binnen 30-60 minuten omkeren, wat suggereert dat het weefsel kan herstellen. Om het herstel van het weefsel te verbeteren, moeten de instellingen voor de voorbelasting opnieuw worden aangepast (d.w.z. herhaal stap 8.3) na 1 uur incubatie, evenals op dag 2, 4 en 6 na voorbereiding. Hypercontractuur kan zowel met als zonder de gestimuleerde samentrekking van de monsters aanwezig zijn. Als er echter binnen 1 uur geen contractie wordt waargenomen, mag het monster niet worden gebruikt. In dit geval is het weefsel zodanig gehypercontracteerd dat het niet kan herstellen of anderszins is beschadigd. Over het algemeen is gebleken dat de teelt van menselijke myocardiale plakjes volgens het gepresenteerde protocol een slagingspercentage van 90% heeft.
Verwachte veranderingen in de krimpkracht
Afhankelijk van een groot aantal factoren (bijv. Patiënt, voorbereiding, weefselschade), is het mogelijk dat myoslicenties die aanvankelijk een aanvaardbare contractie vertoonden, gedurende de eerste 24 uur een progressieve afname van contractiele amplitudes zullen ondergaan. In feite kan dit gedrag zelfs als normaal worden beschouwd voor plakjes die zijn verkregen uit menselijke eindstadium falende harten. Het aanpassen van de voorspanning van de plakjes elke dag voor de volgende 3 dagen is gebleken om dit probleem te verlichten en de contractie te verbeteren. Na 24 tot 48 uur zou de contractiliteit echter weer moeten toenemen. Merk op dat de samentrekking niet binnen de eerste dagen van de teelt terugkeert naar het aanvankelijk waargenomen niveau.
Kort na medium uitwisseling, wanneer de monsters worden teruggebracht naar de incubator, vertoont de contractie meestal duidelijk verhoogde amplitudes. Het openen en sluiten van de incubator draagt bij aan deze toename, omdat het ervoor zorgt dat het CO2-niveau daalt. Dit verhoogt de pH in het bicarbonaat gebufferde teeltmedium, wat een positieve inotrope reactie van de plakjes veroorzaakt. Na de gemiddelde uitwisseling neemt de contractiele kracht van de plakjes vaak enkele uren af totdat deze de beginwaarde bereikt of overschrijdt. Om te voorkomen dat stimulatieprotocollen worden beïnvloed door mediumuitwisseling, mogen stimulatieprotocollen pas ten minste 1 uur na mediumuitwisseling worden uitgevoerd.
Beperkingen van de methode
Een voordeel van de huidige techniek ten opzichte van eerdere kweekmethoden voor menselijk myocardiaal weefsel, is de mogelijkheid om pre- en afterload aan te brengen (en te moduleren) op het samentrekkende weefsel. Het is echter moeilijk om de toegepaste belasting te kwantificeren in termen van wandspanning, hoewel deze belasting kan worden geschat op basis van de veerconstante en de snijafmetingen. Er wordt aangenomen dat er een positieve relatie is tussen de levensvatbaarheid van myocardinverband en de contractieamplitude van weefselmonster. Toch is er momenteel geen methode die het mogelijk maakt om de levensvatbaarheid van elke afzonderlijke plak te testen voordat deze in de kamers wordt gemonteerd. Een colorimetrische MTT-kleuring kan worden uitgevoerd op gesneden plakjes die niet worden gebruikt voor de teelt, om de levensvatbaarheid van de myocardiale cellen te bepalen. In cellen die levensvatbaar zijn, zal NADPH het gele MTT-zout in paarse formazankristallen verminderen. Een andere beperking is dat de voedingsstoffen in het teeltmedium momenteel beperkt zijn tot basisingrediënten. Daarom verschillen voedingsstoffen en circulerende factoren van de in vivo omgeving waaruit het weefsel is verkregen. Medium kan echter indien nodig worden aangevuld of aangepast.
Mogelijke toepassingen van de methode
Er zijn verschillende mogelijke toepassingen van de methode, zowel in termen van cardiotoxiciteit en medicijntesten, als in het begrijpen van de pathofysiologie van hartaandoeningen. Ten eerste kan het systeem dat in het besproken protocol wordt gebruikt, worden gebruikt voor screenings van geneesmiddelen en cardiotoxiciteit. Met behulp van de programmeerbare stimulatieprotocollen kunnen fysiologische veranderingen worden geanalyseerd als reactie op toediening van geneesmiddelen. Met betrekking tot de interpretatie van refractaire periode moet worden overwogen dat dit een functionele parameter is, die niet strikt het effect van geneesmiddelen op de potentiële werkingsduur weerspiegelt. Ten tweede kunnen de kweekkamers worden gebruikt voor verschillende co-kweekexperimenten van myocardium in combinatie met immuuncellen. Door gebruik te maken van deze co-cultivatie kunnen de directe effecten van immuuncel uitgescheiden factoren op de myocardiale contractie worden beoordeeld. Ten slotte kunnen ook niet-transplantatie cardiomyopathiemonsters worden gekweekt, hoewel deze niet-transplantatieweefselmonsters over het algemeen kleiner zijn en daarom moeilijker te verwerken. Niettemin kan dit mogelijkheden openen voor de identificatie van nieuwe therapeutische doelen en de ontwikkeling van gerichte medicijnen. Het is ook denkbaar om de techniek te gebruiken voor patiëntspecifieke weefselkarakterisering, waardoor we een stap dichter bij gepersonaliseerde geneeskunde komen. Bovendien kan de gepresenteerde methode worden gebruikt voor niet-menselijk myocardiaal weefsel, waarvan voorbeelden varken en konijn zijn. Er moet rekening mee worden gehouden dat de hoge fysiologische hartslag van kleine zoogdieren (muis /rat) niet kan worden verkregen, omdat aan de daaropvolgende hogere O2-eis niet kan worden voldaan onder de omstandigheden van myocardiale teelt met behulp van de besproken opstelling. Daardoor is een bijna-fysiologische omgeving in deze gevallen moeilijk na te bootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JH, PS, DM en KL hebben niets te onthullen. AD en TS zijn aandeelhouders van InVitroSys GmbH, dat het Myodish teeltsysteem levert.
Acknowledgments
Onderzoek werd gefinancierd door DZHK-subsidies 81Z0600207 (JH, PS en DM) en 81X2600253 (AD en TS).
De auteurs willen Claudia Fahney, Mei-Ping Wu en Matthias Semisch bedanken voor hun steun bij het voorbereiden van de opstellingen, evenals voor het regelmatige onderhoud van de weefselkweek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
