Summary
Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.
Abstract
La malaria es un importante problema de salud pública, que presenta más de 200 millones de casos por año en todo el mundo. A pesar de años de esfuerzos científicos, la inmunidad protectora contra la malaria todavía es poco conocida, principalmente debido a las limitaciones metodológicas del cultivo de Plasmodium a largo plazo, especialmente para Plasmodium vivax. La mayoría de los estudios se han centrado en la protección de inmunidad adaptativa contra la malaria por anticuerpos, que desempeñan un papel clave en el control de la malaria. Sin embargo, la protección estéril inducida por las vacunas atenuadas contra Plasmodium sporozoites está relacionada con la respuesta celular, principalmente a los linfocitos T citotóxicos, como los linfocitos T CD8+ y gamma delta (γδ T). Por lo tanto, se deben desarrollar nuevas metodologías para comprender mejor las funciones de la respuesta inmune celular y, por lo tanto, apoyar la terapia futura y el desarrollo de vacunas. Para encontrar una nueva estrategia para analizar esta inmunidad mediada por células a la infección en estadio sanguíneo por Plasmodium, nuestro grupo estableció un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados (iRBC) por linfocitos citotóxicos. Este ensayo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de respuesta inmune celular contra diferentes Plasmodium spp. en la etapa sanguínea. Las células inmunes citotóxicas innatas y adaptativas pueden eliminar directamente los glóbulos rojos iXi y el parásito intracelular en un mecanismo efector:objetivo. Los iRBC objetivo se etiquetan para evaluar la viabilidad celular y se cocultivan con células efectoras (CD8+ T, γδ T, células NK, etc.). El porcentaje de lisis se calcula en función de las condiciones probadas, en comparación con un control de lisis espontánea en un ensayo basado en citometría de flujo. En última instancia, esta metodología de ensayo de eliminación es un gran avance en la comprensión de la inmunidad mediada por células a la malaria en etapa sanguínea, ayudando a descubrir nuevos objetivos terapéuticos potenciales y acelerar el desarrollo de vacunas contra la malaria.
Introduction
La malaria sigue siendo una crisis sanitaria mundial, con más de 240 millones de casos y 627.000 muertes relacionadas con la malaria notificadas en 20201. Actualmente hay cinco especies parasitarias que pueden causar malaria en humanos, de las cuales Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax son las dos especies más prevalentes. Durante la infección por Plasmodium , la etapa hepática o preeritrocítica es asintomática, y los síntomas solo ocurren durante el ciclo asexual del parásito en la etapa eritrocítica. En esta etapa de infección, miles de merozoítos derivados de la etapa hepática se liberan en el torrente sanguíneo e infectan los glóbulos rojos (RBC). En el RBC, los parásitos se diferencian en trofozoítos y esquizontes por esquizogonía, hasta que los esquizontes rompen el eritrocito, liberando merozoítos recién formados, repitiendo este ciclo sanguíneo. Los ciclos repetidos de invasión, replicación y liberación de merozoíto dan como resultado un crecimiento exponencial de la población de parásitos y, en última instancia, desencadenan los síntomas de la enfermedad2.
Un desafío importante en el estudio de la respuesta inmune a la malaria es que el Plasmodium spp. que infecta a los seres humanos no infecta a los modelos de animales de laboratorio. Por lo tanto, las muestras de pacientes infectados con Plasmodium deben recogerse frescas y procesarse y analizarse inmediatamente. Sin embargo, en las zonas donde el paludismo es endémico, los recursos para acceder a los mecanismos inmunológicos y moleculares son limitados. Debido a estas limitaciones, los roedores son ampliamente utilizados como modelos experimentales para investigar la respuesta inmune contra la infección por Plasmodium. Mientras que P. berghei y P. chabaudi se utilizan a menudo como sustitutos de la infección por P. falciparum, la cepa no letal de P. yoelii 17XNL también tiene muchas características en común con P. vivax, como la infección restringida por reticulocitos 3,4. El desarrollo de ensayos in vitro de Plasmodio, que pueden utilizarse para muestras derivadas de modelos humanos o animales, es valioso para comprender mejor la patogénesis de la malaria y comparar la respuesta inmunológica provocada por diferentes especies del parásito.
La inmunidad antipalúdica protectora no se comprende completamente ni en la etapa preeritrocítica ni en la etapa sanguínea. Se sabe que la exposición a infecciones repetidas resulta en inmunidad adquirida parcial, pero la inmunidad estéril rara vez se desarrolla5. Durante décadas, la inmunidad protectora anti-Plasmodium se asoció principalmente con la inducción de anticuerpos neutralizantes u opsonizantes que previenen la invasión parasitaria de las células huésped o conducen a la fagocitosis por las células presentadoras de antígeno, respectivamente6. Como resultado, la mayoría de los esfuerzos para producir vacunas antipalúdicas hasta ahora se han basado en la inducción de anticuerpos protectores y duraderos 7,8. Sin embargo, la protección estéril inducida por la vacunación con un esporozoíto atenuado se correlaciona directamente con la activación y expansión de los linfocitos T citotóxicos 8,9.
Recientemente, algunos estudios de muestras de pacientes recién aisladas y cultivos in vitro han demostrado que las células inmunes citotóxicas innatas o adaptativas como CD8 + T 10, γδ T11 y las células NK12 pueden eliminar directamente los glóbulos rojos infectados por Plasmodium y su parásito intracelular de una manera de relación efector: objetivo. Estos hallazgos seminales definieron un mecanismo efector inmune completamente nuevo en el contexto de la malaria. Para diseccionar esta nueva inmunidad antipalúdica, es esencial explorar los mecanismos efectores citotóxicos de las células asesinas contra los glóbulos rojos infectados (iRBC) en la infección natural o la vacunación.
Aquí presentamos un ensayo in vitro que mide la actividad citotóxica de los linfocitos contra la malaria en la etapa sanguínea. Este ensayo puede ayudar a dilucidar los mecanismos de la respuesta inmune celular contra la etapa de eritrocitos de Plasmodium . Las células diana, los glóbulos rojos i, se marcan con éster de carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) para evaluar la viabilidad celular, y luego se cocultivan con células efectoras como los linfocitos citotóxicos (CTL). Este cocultivo se evalúa luego mediante citometría de flujo, utilizando marcadores fluorescentes para tipos específicos de células. Finalmente, el porcentaje de lisis de eritrocitos por CTL se calcula dividiendo la condición experimental por la ruptura espontánea de los glóbulos rojos y el control de la lisis espontánea, que ocurre durante la incubación sin la célula efectora. En general, esta metodología de ensayo de matanza puede contribuir a una mejor comprensión de la inmunidad de la malaria mediada por células.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las políticas de la Fundación Oswaldo Cruz y del Consejo Nacional de Ética (CAAE: 59902816.7.0000.5091). Los protocolos humanos fueron desarrollados en colaboración con el grupo de investigación clínica del Centro de Investigación en Medicina Tropical de Rondônia (CEPEM), que estuvo a cargo de inscribir a los pacientes en el estudio. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.
Para el estudio con animales, los procedimientos se realizaron siguiendo los principios de conducta de la Guía Brasileña de Práctica para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos y Didácticos del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA). Los protocolos fueron aprobados por el Consejo de Experimentación Animal de la Fiocruz (protocolo CEUA LW15/20-2).
1. Recogida de muestras de sangre humana y aislamiento de PBMC
- Recolectar sangre de pacientes infectados con Plasmodium en un tubo de recolección de sangre evacuado de 10 ml con heparina sódica. Como los pacientes con malaria muestran linfopenia, hay un rango de 5-9 x 106 células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en una muestra de sangre de 10 ml. Dado que las células T CD8 + o las células T γδ constituyen ~ 10% de las PBMC, preferiblemente recolecten 50-100 ml de sangre / paciente.
NOTA: Se debe considerar un mínimo de 1 x 105 células efectoras / condición. - Calcule el porcentaje de glóbulos rojos i" mediante frotis de sangre como se describe a continuación.
- Agregue 5 μL de sangre total a un portaobjetos transparente y prepare un frotis de sangre. Realizar tinción rápida panóptica tipo Romanowsky o tinción May-Günwald-Giemsa. Aquí se utiliza el kit de tinción rápida panóptica, que se compone de tres reactivos: reactivo A (fijación), reactivo B (tinción citoplasmática) y reactivo C (tinción diferencial nuclear y citoplasmática).
- Sumerja lentamente el portaobjetos en la solución A 10x, luego 4x en la solución B y finalmente 10x en la solución C. Drene cualquier exceso de reactivo de los portaobjetos entre las soluciones. Después de sumergir en la solución C, enjuague el portaobjetos con agua corriente del grifo y déjelo secar.
- Bajo un microscopio de luz vertical con un objetivo de inmersión en aceite de 100x, cuente 1000 glóbulos rojos en cuadrados secuenciales y calcule el porcentaje de parasitemia utilizando la siguiente ecuación:
- Diluir 15 ml de sangre en una proporción de 1:1 en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
- Añadir 15 ml de medio de separación de linfocitos (densidad de 1,077 g/ml) a un tubo de 50 ml. Coloque cuidadosamente los 30 ml de muestra de sangre diluida sobre la solución del medio de centrifugación. Al colocar la muestra en capas, no deje que la muestra de sangre y el medio de separación de linfocitos se mezclen.
- Centrifugar los tubos a 400 x g durante 40 min a 22 °C, con baja aceleración y sin ajuste de rotura.
- Extraiga la capa superior que contiene plasma utilizando una pipeta estéril, dejando la capa de células mononucleares intacta. Transfiera la capa de células mononucleares (PBMC) a un tubo estéril utilizando una pipeta estéril.
- No deseche el tubo que contiene el pellet de sangre, ya que se utilizará más adelante para el aislamiento de glóbulos rojos infectados. A partir de este paso, asegúrese de mantener los glóbulos rojos a temperatura ambiente (RT). Nunca dejes que se enfríen.
- Lave las células dos veces añadiendo PBS y centrifugar a 350 x g durante 10 min, con ajuste de rotura. Resuspender el pellet celular en 5 mL de medio RPMI suplementado con penicilina/estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS; medio completo).
- Contar las PBMC en presencia de solución de azul de tripano para comprobar la viabilidad celular, utilizando un hemacitómetro (cámara de Neubauer) o un contador celular automatizado. No cuente las células teñidas de azul, ya que representan células moribundas, que absorben el azul de tripano.
- Ajustar la concentración celular a 107 células/ml utilizando un medio completo. Purificar las poblaciones de linfocitos citotóxicos deseados (células T CD8 + , células NK, células T γδ) utilizando el aislamiento de perlas magnéticas según el protocolo del fabricante del reactivo.
2. Aislamiento de glóbulos rojos humanos
NOTA: Para el aislamiento de glóbulos rojos infectados en humanos, se recomienda comenzar con muestras de sangre que tengan un mínimo de 2% de parasitemia, preferentemente con más en la etapa de trofozoíto / parásito esquizonte temprano.
- Preparar el PERCOLL (en lo sucesivo denominado medio de separación por gradiente de densidad) a la concentración recomendada que se describe a continuación.
- Agregue 90 ml de medio de separación de gradiente de densidad al 100% y 10 ml de PBS 10x para obtener un medio de separación de gradiente de densidad isotónica del 90%.
- Para la separación de reticulocitos infectados por P. vivax, prepare medios de separación de gradiente de densidadal 45%. Agregue 50 ml de medio de separación de gradiente de densidad isotónica al 90% y 50 ml de 1x PBS para obtener un medio de separación de gradiente de densidad del 45%.
- Para la separación de eritrocitos infectada por P. falciparum, prepare medios de separación de gradiente de densidad al 65%. Agregue 72 ml de medio de separación de gradiente de densidad isotónica al 90% y 28 ml de 1x PBS para obtener un medio de separación de gradiente de densidad del 65%.
- Para la separación de reticulocitos no infectada, prepare medios de separación de gradiente de densidad al 70%. Agregue 78 ml de medio de separación de gradiente de densidad isotónica al 90% y 22 ml de 1x PBS para obtener un medio de separación de gradiente de densidad del 70%.
- Calentar el medio de separación de gradiente de densidad a 37 °C en un baño maría.
- Después de retirar la capa de PBMC, retire con cuidado la mayor cantidad posible de la capa superior del medio de centrifugación sin tocar las células. Con una pipeta Pasteur de vidrio, retire con cuidado la capa superior de neutrófilos sin alterar el pellet de RBC y calcule el volumen del pellet. Agregue 4 veces el volumen de pellets RBC del medio completo RT y resuspenda.
- En un segundo tubo cónico de 50 ml, agregue 5 veces el volumen del pellet de 45%, 65% o 70% de medio de separación de gradiente de densidad, dependiendo del tipo de celda a aislar. Coloque cuidadosamente la suspensión RBC sobre la capa del medio de separación del gradiente de densidad.
- Gira durante 15 minutos a 850 x g, con baja aceleración y sin ajuste de interrupción. Recoger la capa turbia de color rojo/marrón situada entre el sobrenadante y el medio de separación de gradiente de densidad con una pipeta de 5 ml. Transfiera a un tubo estéril de 15 ml.
- Lave las células agregando RT medio completo hasta 15 ml y gire durante 10 minutos a 860 x g. Repita el lavado agregando 10 ml de RT de medio completo y gire hacia abajo. Deseche el sobrenadante y prepare un frotis de sangre del pellet para comprobar si hay enriquecimiento de eriRBC, siguiendo el paso 1.2.
- Resuspender el pellet en 1 mL de medio completo RT y dejar reposar a temperatura ambiente mientras se cuentan las células. Añadir 10 μL de suspensión celular en un hemocitómetro (cámara de Neubauer) y contar los glóbulos rojos en la zona central subdividida en 25 cuadrados medianos. Ajuste la concentración celular a 1 x 107 iRBCs/mL en medios completos RT.
3. Infección experimental por malaria en ratón
- Descongelar una alícuota de P. yoelii 17XNL:PyGFP (MRA-817) criopedida, una cepa que expresa GFP obtenida de MR4/ATCC, e inyectar 100 μL por vía intraperitoneal (i.p.) en una hembra de ratón C57BL/6 de 8 semanas de edad.
- Siga la carga de parasitemia cada 3 días mediante la recolección de sangre de punción de venas de la cola.
- Perfore el vaso con la aguja biselada hacia arriba, entrando en la vena en un ángulo poco profundo que comienza en el extremo distal de la cola.
- Recoja la muestra de sangre con una pipeta o tubo capilar de hasta 5 o 10 ml, luego aplique presión manual para detener el sangrado.
- Prepare un frotis de sangre (como se describe en el paso 1.2) hasta que la parasitemia alcance el 10%-15% de los glóbulos rojos infectados.
- Recolectar 10 μL de sangre mediante la punción de la vena de la cola y diluir a 100 μL de PBS para inyectar i.p. en el segundo ratón donante.
NOTA: Los parásitos criopreservados deben descongelarse y transmitirse en ratones dos veces antes de ser utilizados para infecciones experimentales. - Cuando el segundo pasaje alcance el 15% de parasitemia, recolecte cinco gotas de sangre por el método de corte de cola y diluya en 1 mL de PBS. Preparar una solución de infección ajustando la concentración a 1 x 106 aRBCs/ml en PBS estéril e inyectar i.p. 100 μL (1 x 105 iRBCs) de la solución en cada ratón necesario para el experimento.
- Monitoree la parasitemia cada 2-3 días hasta que alcance ~ 30% de glóbulos rojos i, que ocurre aproximadamente 12 días después de la infección. Cuando los ratones alcanzan la parasitemia deseada, recolectar sangre por punción cardíaca como se describe a continuación.
- Aspirar 100 μL de solución de heparina (30 U/ml) en una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G.
- Anestesiar al ratón por inhalación con isoflurano al 5% y confirmar la ausencia de reflejos. Coloque el ratón de lado e inserte perpendicularmente la aguja justo debajo del codo, a través de las costillas y en el corazón. Extraiga el émbolo de la jeringa lentamente y gire la aguja hasta obtener 0.5-1 ml de sangre.
- Realizar eutanasia humana por luxación cervical bajo anestesia. Limpie asépticamente el lado izquierdo del ratón con etanol al 70%. Con tijeras quirúrgicas, haga un corte en el lado izquierdo del ratón que pasa a través de la piel y el peritoneo. Localice el bazo y retírela.
- Coloque el bazo del ratón en una placa de Petri con 5 ml de medio completo para purificar la población de células efectoras deseada (por ejemplo, células T CD8 + ).
4. Obtención de esplenocitos de ratón enteros frescos
- En la placa de Petri, corte cuidadosamente el bazo en trozos pequeños con tijeras o una navaja de afeitar.
- Coloque un filtro de células de 100 μM sobre un tubo cónico de 50 ml y transfiera el bazo extirpado al filtro celular con una pipeta. Triture el bazo a través del colador con un émbolo de jeringa.
- Lave las células a través del colador con 10 ml de medios completos. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante.
- Resuspender el pellet celular en 2 mL de tampón de lisis 1x RBC frío. Incubar la suspensión durante 5 minutos sobre hielo.
- Lavar la suspensión celular con 10 ml de medio completo a 4 °C. Repita el paso de lavado tres veces y elimine cualquier coágulo celular entre lavados para los bazos de ratones infectados con Plasmodium.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante.
NOTA: Los bazos infectados con plasmodio están agrandados y llenos de células fagocíticas que contienen hemoglobina degradada y hemozoína. - Para evitar cualquier problema durante el aislamiento de perlas magnéticas de las células efectoras, siga estos pasos para eliminar las células fagocíticas enriquecidas con hemozoína y la hemozoína. Resuspender las células esplénicas con tampón MACS y ajustar la concentración a 1 x 108 células/ml. Coloque una columna LS o LD en el campo magnético. Prepare la columna enjuagando con 3 ml de tampón MACS.
- Aplique suspensión celular sobre la columna. Lave la columna tres veces con 3 ml de tampón MACS. Recoger el flujo que contiene las células esplénicas.
- Contar los esplenocitos en una solución de azul de tripano y comprobar la viabilidad celular en un hemacitómetro (cámara Neubauer) o contador celular automatizado. Ajuste la concentración celular a 1 x 107 células/ml en medios completos RT.
5. Purificación celular efectora citotóxica (selección negativa de linfocitos T CD8a+ )
NOTA: Hay muchos reactivos de selección positiva y negativa que pueden purificar las células efectoras citotóxicas (CD8+ T, γδ T, NK, iNKT, células MAIT). En este protocolo, utilizamos una selección negativa de células T CD8a + esplénicas y seguimos las instrucciones del fabricante.
- Centrifugar todos los esplenocitos a 400 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 40 μL de tampón MACS.
- Agregue 10 μL de un cóctel de biotina y anticuerpo. Mezclar bien e incubar durante 5 min en hielo.
- Añadir 30 μL de tampón MACS. Añadir 20 μL de microperlas antibiotina. Mezclar bien e incubar durante 10 min en hielo.
- Añadir 400 μL de tampón MACS y proceder a la separación magnética de la celda. Coloque la columna MACS LS en el soporte del campo magnético. Prepare la columna enjuagando con 3 ml de tampón MACS.
- Aplique suspensión celular sobre la columna. Lave la columna tres veces con 3 ml de tampón MACS. Recoja el flujo que contiene todas las células no marcadas, que son las células T CD8a + enriquecidas.
- Contar las células T CD8a+ en una solución de azul de tripano y comprobar la viabilidad celular en un hemacitómetro (cámara Neubauer) o contador celular automatizado. Ajuste la concentración celular a 1 x 107 células/ml en medios completos RT.
6. Aislamiento de glóbulos rojos infectados por P. yoelii
- Centrifugar la sangre recolectada en un tubo de 1,5 ml a 850 x g durante 3 min. Deseche el suero y resuspenda la sangre en 1 ml de 1x RPMI sin FBS.
- Coloque la columna LS en el soporte del campo magnético y enjuague con 3 ml de RPMI 1x. Pase la suspensión RBC a través de la columna. Para aislar más glóbulos rojos i, vuelva a aplicar el flujo continuo (3 ml de RPMI y 1 ml de sangre diluida) en la columna.
- Lavar dos veces con 5 ml de 1x RPMI. Realice los pasos de lavado agregando alícuotas de tampón tan pronto como el depósito de columna esté vacío. No deje que ninguna columna se seque.
- Agregue 5 ml de RPMI, retire la columna y purgue los iRBC en un nuevo tubo de 15 ml. Contar los glóbulos rojos y ajustar la concentración a 1 x 107 glóbulos rojos/ml.
7. Etiquetado CFSE de glóbulos rojos y preparación para citometría de flujo
NOTA: Inicie el protocolo de etiquetado RBC con el doble del número de celdas que se utilizarán para el experimento, ya que ~ 50% de las células generalmente se pierden en los pasos de lavado después del paso de etiquetado CFSE. Para establecer la autofluorescencia de los glóbulos rojos/glóbulos rojos, incluya una muestra de control de células no marcadas.
- Diluir CFSE a una concentración final de 10 mM en 1x RPMI sin FBS. Lave las células una vez con 1x RPMI sin FBS en un tubo de 15 ml.
- Resuspender los glóbulos rojos en 500 μL de 1x RPMI sin FBS y añadir 500 μL del CFSE diluido. Incubar durante 8 min a RT, protegido de la luz.
- Lavar tres veces añadiendo 14 ml de medio completo (10% FBS RPMI), seguido de centrifugación a 850 x g durante 10 min. Resuspender las células en medio completo a una concentración de 1-5 x 106/ mL. Incubar durante 1 h en RT.
8. Cocultivo de linfocitos citotóxicos/eritrocitos y preparación para citometría de flujo
NOTA: Si se va a medir la afectación de receptores o moléculas específicas, incubar los anticuerpos específicos de bloqueo y control del isotipo (10 mg/ml) con las células efectoras durante 30 minutos antes del cocultivo.
- Coloque las celdas en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Agregue los linfocitos purificados y los iRBC marcados con CFSE en la proporción deseada de células efector-diana hasta un volumen final de 200 μL y homogeneice. Preparar cada condición por triplicado.
NOTA: Sugerimos ajustar la concentración de glóbulos rojos a 1-5 x 104 células/ml y elegir la proporción basada en el número de células purificadas (por ejemplo, 0.5: 1, 2.5: 1 y 5: 1). - Incluir el control de lisis espontánea, que es el iRBC objetivo sin el efector, para evaluar cualquier lisis espontánea, ya que esto se utilizará para representar una condición de viabilidad celular del 100%.
- Gire la placa durante 1 minuto a 360 x g para maximizar el contacto con la celda. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 4 h.
NOTA: Las condiciones de hipoxia (bajoO2), utilizadas sistemáticamente para el cultivo de P. falciparum , no deben usarse ya que las células efectoras no sobreviven en este ambiente. Por el contrario, los parásitos Plasmodium son viables en el aire ambiente en un 5% de CO2 durante un máximo de12 h. - Gire durante 5 minutos a 850 x g y voltee la placa para eliminar el sobrenadante.
NOTA: Si se desea, el sobrenadante se puede utilizar para medir cualquier factor soluble liberado en el cocultivo. - Etiquetar los glóbulos rojos con Ter119 1:200 anti-ratón (o anti-humano CD235 1:100 para muestras humanas) y células T CD8+ con anticuerpos anti-CD8 1:200 o anti-CD3 1:200 (anti-ratón o humano) durante 30 min a 4 °C en 1x PBS que contiene 3% FBS (tampón FACS).
NOTA: El fluoróforo de anticuerpos debe seleccionarse en función del marcador celular/reactivo de proliferación celular (p. ej., iRBC marcado con CFSE, APC-Cy7 anti-Ter119 y PerCP-Cy5.5 anti-CD8a). - Lavar las células con tampón FACS y girar hacia abajo durante 5 min a 850 x g . Transfiera las muestras a tubos FACS y agregue 30 μL de perlas de conteo a tubos individuales. Homogeneizar las cuentas de conteo mediante vórtice durante 30 s.
9. Citometría de flujo
- Analice muestras con un instrumento láser 405/488/561/640.
- Para las células humanas marcadas con CFSE (FITC), PE anti-humano γδ TCR y PE-Cy7 anti-humano CD235a anticuerpo, use filtros 530/30 (FITC), 575/25 (PE) y 780/60 (PE-Cy7) en un citómetro de configuración de tres láseres (azul, rojo, amarillo-verde).
- Para las células de ratón marcadas con CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 anti-ratón CD8a y APC-Cy7 anti-ratón Ter119, utilice filtros 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5) y 780/60 (APC-Cy7) en la configuración del citómetro de tres láseres.
- Elija la población de cuentas de conteo como puerta de parada para adquirir un mínimo de 20,000 eventos en la puerta de parada, que debe ser idéntica para todas las condiciones. Realice análisis y compensación utilizando el software apropiado de adquisición/análisis de citometría de flujo.
- Establezca la estrategia de acceso como se describe a continuación.
- Seleccione celdas individuales (singletes), excluyendo desechos utilizando la relación de altura máxima (H) a área (A) FSC. Seleccione los glóbulos rojos y excluya los linfocitos del análisis basado en la fluorescencia del marcador RBC (Ter119 o CD235a) y el anticuerpo específico de linfocitos (CD8a).
- En la clasificación de glóbulos rojos anterior, seleccione glóbulos rojos viables basados en la tinción positiva de CFSE. Analice los datos con el software de análisis de datos del citómetro de flujo.
10. Cálculo y estadísticas
- Para calcular el porcentaje de lisis iRBC, siga la estrategia de compuerta descrita en el paso 9. El porcentaje de glóbulos rojos viables es la frecuencia de células CFSE positivas dentro de la puerta RBC basada en Ter119 (ratón) o CD235a (humano) fluorescencia positiva.
- Utilice el control de lisis espontánea, glóbulos rojos sin células efectoras, condición como control para estimar la ruptura espontánea de glóbulos rojos. Esta condición se considerará lisis RBC (100% de viabilidad). Utilice la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de lisis de glóbulos rojos en cada condición probada:
NOTA: Durante la incubación del cultivo, algunos glóbulos rojos infectados pueden lisarse espontáneamente o romperse por el parásito. Utilice la frecuencia de glóbulos rojos CFSE positivos de la condición de lisis espontánea, que no contiene células efectoras, como línea de base para la citotoxicidad de linfocitos. - Calcule el promedio de triplicados para cada condición y determine la significación estadística utilizando ANOVA bidireccional en comparaciones múltiples.
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Representative Results
Aquí, se describe la metodología aplicada para el aislamiento de glóbulos rojos infectados con Plasmodium marcados con CFSE en un ensayo de cocultivo con linfocitos citotóxicos. En primer lugar, proporcionamos una representación esquemática de cómo realizar el protocolo, empleando muestras humanas infectadas con P. vivax (Figura 1). Luego, un diagrama de flujo ilustrado sobre cómo proceder con el protocolo en un modelo experimental de malaria utilizando un ratón C57BL / 6 infectado con P. yoelii (Figura 2). En la Figura 3, se muestran los resultados esperados (antes y después) para el paso 6 del protocolo (enriquecimiento de glóbulos rojos infectados por P. yoelii utilizando columnas magnéticas). Finalmente, la Figura 4 muestra un análisis de citometría de flujo representativo, detallando la estrategia de compuerta necesaria para evaluar el porcentaje de lisis de glóbulos rojos, como se describe en el paso 9. Por lo tanto, esta sección destaca las diferentes técnicas utilizadas aquí, describiendo todo el proceso de adquisición, ensamblaje y análisis de datos para evaluar la muerte de los eritrocitos iRBC por linfocitos citotóxicos.
Lisis de glóbulos rojos infectados por Plasmodium humano por células citotóxicas
En la Figura 1 se muestra una representación esquemática del protocolo para evaluar la muerte de glóbulos rojos humanos infectados por Plasmodium por células citotóxicas. Para medir la lisis celular, PBMC de pacientes infectados con Plasmodium se purificó utilizando el medio de separación, seguido de la purificación magnética de la población de linfocitos citotóxicos (CTL) de interés (por ejemplo, CD8 + T, γδ T, NK, iNKT, células MAIT, etc.). El pellet de los glóbulos rojos que quedaba del aislamiento de PBMC se utilizó para enriquecer glóbulos rojos infectados con Plasmodium utilizando medio de separación de gradiente de densidad (65% P. falciparum; 45% P. vivax). Los eriRBC se marcaron con CFSE y se incubaron con o sin linfocitos durante 4 h a 37 °C, 5% deCO2. Después del período de cocultivo, todos los glóbulos rojos (infectados o no) se marcaron con anticuerpos anti-humano CD235a (para los glóbulos rojos) y anticuerpos específicos de CTL (por ejemplo, anti-CD8, anti-γδTCR, etc.) antes del análisis de citometría de flujo. La adquisición y el análisis de muestras humanas fueron similares a los demostrados para muestras de ratón en la Figura 4.
Lisis de glóbulos rojos infectada por P. yoelii por células T CD8+ citotóxicas
En la Figura 2 se muestra un diagrama de flujo del procedimiento experimental para evaluar el mecanismo efector citotóxico en el modelo experimental de malaria, junto con datos experimentales representativos que se muestran en la Figura 3 y la Figura 4. Los ratones C57BL/6 se infectaron con 1 x 105P. yoelii (Py) iRBCs, y la parasitemia fue monitoreada hasta que alcanzó alrededor del 30%. Los Py-iRBCs fueron aislados de la sangre por separación magnética, ya que el subproducto hemo del parásito, hemozoína, está enriquecido con hierro y funciona como partículas paramagnéticas en un campo magnético13. La pureza de la muestra enriquecida se analizó mediante frotis de sangre en comparación con la muestra previa a la columna (Figura 3). Luego, los iRBC se marcaron con el reactivo trazador celular CFSE. Paralelamente, las células T CD8+ citotóxicas se purificaron a partir de esplenocitos utilizando un kit de selección magnética negativa. Como control, se utilizó el mismo protocolo para la purificación de células T CD8 + de ratones no infectados. Las células efectoras (CD8+ T) y diana (Py-iRBC marcadas con CFSE) se incubaron en diferentes relaciones efector:objetivo (E:T: 0,5:1, 2,5:1 y 5:1) durante 4 h a 37 °C 5% deCO2. Al final del cocultivo, cada condición fue marcada con anticuerpos anti-ratón Ter119 para glóbulos rojos y anti-CD8a para células citotóxicas. La estrategia de acceso y los resultados de la muestra se representan en la Figura 4.
Figura 1. Esquema del ensayo de matanza in vitro. Ejemplo de experimento de ensayo de matanza. La sangre infectada por plasmodio se recolecta y procesa utilizando un medio de gradiente de separación. Después de la centrifugación, se recoge la capa de PBMC y las células citotóxicas (CTL) se purifican utilizando perlas magnéticas. La capa RBC se procesa una vez más utilizando medios de separación de gradiente de densidad. Después de la centrifugación, la capa de Plasmodium-iRBC se recoge y se etiqueta con CFSE. Posteriormente, los CTL e iRBC purificados se cocultivaron durante 4 h a 37 °C, 5% deCO2, seguido de marcado específico de células y análisis en un citómetro de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ensayo experimental de modelo de malaria para matar. Primero, los ratones C57BL / 6 fueron infectados con 105 glóbulos rojos infectados con PyX17NL. Luego, la parasitemia se controla mediante frotis de sangre, hasta el pico de infección (30% -40% de glóbulos rojos i), aproximadamente 12 días después de la infección (dpi). Al día siguiente, los ratones fueron sangrados y sacrificados para la recolección del bazo. Se procesó la sangre y los glóbulos rojos infectados se enriquecieron mediante separación magnética, seguida de etiquetado con CFSE (arriba a la derecha). El bazo se procesó para el aislamiento de linfocitos citotóxicos, mediante selección negativa utilizando perlas magnéticas. Posteriormente, los linfocitos citotóxicos purificados y los glóbulos rojos i) se cocultivaron durante 4 h a 37 °C, 5% deCO2, seguido de marcado específico de células y análisis en un citómetro de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Enriquecimiento iRBC mediante columnas magnéticas. Los iRBC se purificaron de ratones infectados con P. yoelii utilizando columnas de LS. La purificación se destaca por frotis de sangre de sangre recolectada antes ( A ) y después de (B) enriquecimiento de columna. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Evaluación del porcentaje de lisis celular de P. yoelii-iRBCs por linfocitos CD8+. La estrategia de compuerta para el porcentaje de lisis celular. (A) Coloque la puerta de parada en la población de cuentas de conteo (~ 20,000 eventos). (B) Control de lisis espontánea, eritrocitos sin linfocitos. Comience la estrategia de compuerta seleccionando las celdas individuales, excluyendo los desechos, en función de la relación altura máxima / área FSC, seguida de la selección de la población de glóbulos rojos en APC-Cy7 Ter119 positivo y PerCP-Cy5.5 CD8 negativo. A continuación, seleccione iRBC en vivo como CFSE (FITC) alto positivo. (C) Ejemplo de análisis de experimentos utilizando diferentes efectores: proporciones objetivo, mostrando el porcentaje de glóbulos rojos vivos después del cocultivo. (D) Representación gráfica del porcentaje de lisis RBC calculado sobre la base de la fórmula descrita en la sección 10. La comparación de significación entre los grupos (CD8 citotóxico o CD8 no naïve) se evaluó mediante ANOVA bidireccional con comparaciones múltiples. P < 0,0001 (****). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos un ensayo in vitro para medir la destrucción de glóbulos rojos infectados con Plasmodium por linfocitos citotóxicos. Este ensayo puede ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad protectora celular a la etapa eritrocítica del parásito de la malaria. La principal ventaja de esta metodología es que proporciona un ensayo cuantitativo de la destrucción mediada por células de los glóbulos rojos iR que se puede utilizar para abordar muchas preguntas sobre cómo las células inmunes interactúan con diferentes especies de Plasmodium.
Es importante destacar que este método puede ser utilizado para estudiar P. vivax y otros parásitos Plasmodium que no se mantienen en cultivo in vitro 14,15. Además, este protocolo se puede adaptar a cualquier especie de Plasmodium y diferentes huéspedes, como humanos, ratones y primates no humanos. Los métodos basados en citometría de flujo son ampliamente utilizados para evaluar la activación de células citotóxicas, la producción de citoquinas y la desgranulación10,11,16, pero el método actual es el único que explora la lisis de glóbulos rojos por contacto celular directo con células asesinas.
También hay muchos métodos, como la microscopía, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la citometría de flujo, que se utilizan para estudiar la malaria midiendo la parasitemia, la invasión y la actividad antipalúdica. Sin embargo, para analizar la citotoxicidad mediada por células de los glóbulos rojos, los métodos actuales que utilizan Cr51 o la liberación de hemoglobina no son lo suficientemente sensibles como para evaluar la lisis de glóbulos rojos. La liberación de LDH también se puede usar para evaluar la muerte de glóbulos rojos por algunos CTL como las células T CD8 + , pero medir la LDH no es un método preciso, ya que las células innatas o innatas activadas pueden matarse entre sí como mecanismo regulador.
CFSE es ampliamente utilizado para rastrear células o explorar la proliferación celular en citometría de flujo o microscopía fluorescente17. Dado que los glóbulos rojos no proliferan18, la intensidad de fluorescencia CFSE debe disminuir con la lisis celular. La citometría de flujo es una técnica muy precisa, ya que puede detectar niveles muy bajos de marcadores específicos, por lo que se ha utilizado ampliamente para rastrear la parasitemia y la invasión en la infección por malaria 19,20,21,22,23. Lo más importante es que la citometría de flujo puede medir muchos parámetros en una sola célula y clasificar las células en diferentes poblaciones. Al agregar reactivos estándar cuantitativos (cuentas de conteo) a cada muestra, se puede normalizar el número de eventos adquiridos y obtener recuentos celulares absolutos24. Este método permite una comparación cuantitativa confiable entre las condiciones experimentales, lo cual es crítico para el protocolo propuesto actualmente.
Algunos pasos críticos para este protocolo incluyen garantizar la calidad de la muestra, garantizar la tinción celular adecuada e incluir controles para normalizar los cálculos. Se requiere una gran cantidad de muestras de sangre fresca para purificar los glóbulos rojos infectados. La purificación del medio de separación por gradiente de densidad debe abordarse con cuidado, ya que su concentración es crítica para obtener los iRBC de Plasmodium deseados. La superposición de sangre en el medio de separación del gradiente de densidad también debe hacerse lo más lentamente posible, y la recolección de la capa roja del anillo debe hacerse con cuidado para evitar perder glóbulos rojos i. Para facilitar el proceso de purificación, se debe utilizar una muestra de sangre de alta parasitemia, ya que la cantidad de glóbulos rojos iX será mayor. Cabe señalar que en el protocolo de aislamiento de glóbulos rojos utilizando campos magnéticos, solo se purificarán las etapas maduras del parásito (trofozoítos o esquizontes en etapa media-tardía) que producen cantidades significativas de hemozoína. Como resultado, no se recogerá ninguna etapa de anillo, y esto puede afectar el resultado final.
La tinción celular debe realizarse con cuidado para evitar la pérdida o lisis de las células. Se debe evitar el almacenamiento prolongado o la fijación antes de la tinción. Es importante tener en cuenta que las condiciones experimentales deben realizarse por triplicado utilizando relaciones efector:objetivo en serie y controles apropiados, como una condición de lisis espontánea no marcada y un control de hipótesis. La adición de perlas de conteo celular es crucial, ya que proporciona una manera fácil de determinar la concentración de células o los recuentos absolutos de células para cada muestra. Durante la adquisición del citómetro de flujo, asegúrese de establecer el número de eventos que se recolectarán en la puerta de conteo de perlas para normalizar el número de células en cada muestra después del cocultivo.
Dado que se necesitan al menos 1 x 105 células efectoras para obtener resultados consistentes en un ensayo de cocultivo, una posible limitación de la metodología descrita es el número limitado de células después de la purificación, lo que puede ser una preocupación, especialmente cuando se trabaja con poblaciones de células raras. De hecho, esto se aplica a la purificación de los glóbulos rojos i, ya que requiere tener una parasitemia muy alta que no se obtiene tan fácilmente, especialmente cuando se trabaja con muestras humanas en áreas endémicas.
Una mejora del protocolo puede ser el tiempo de incubación del cocultivo. Aunque anteriormente utilizamos un tiempo de incubación de 12 h10,11, recientemente observamos que 4 h es suficiente para diferenciar las condiciones experimentales, reduciendo así el tiempo de posible lisis espontánea y mejorando la reproducibilidad de los resultados.
Los mecanismos implicados en la matanza directa de glóbulos rojos infectados con Plasmodium se están descubriendo gradualmente. Nuestro grupo fue el primero en demostrar que las células T CD8 + pueden reconocer y matar reticulocitos infectados con P. vivax a través de la presentación HLA-I por la célula infectada11. Recientemente, otro estudio demostró que las células T γδ reconocen los glóbulos rojos infectados por P. falciparum a través del reconocimiento de fosfoantígenos por la butirofilina, una molécula presente en la superficie de los glóbulos rojos10. En ambos estudios, la lisis de glóbulos rojos es dependiente de granulisina y granzima B, y conduce a la muerte intracelular del parásito.
Aunque se han desarrollado muchos métodos a lo largo de los años para medir la parasitemia, la invasión, la actividad antimalárica y la interacción celular de imágenes, ninguno ha sido capaz de analizar la muerte directa de los glóbulos rojos iS por células citotóxicas en un ensayo cuantitativo basado en citometría de flujo 19,20,21. Utilizamos un enfoque innovador para evaluar la capacidad de lisis celular en la malaria mediante el etiquetado CFSE de glóbulos rojos infectados por Plasmodium y la evaluación de la lisis iRBC en un período específico de cocultivo con linfocitos. Por lo tanto, este ensayo de matanza in vitro presenta una estrategia novedosa para aclarar los mecanismos de inmunidad mediada por células a la malaria en etapa sanguínea, lo que ayudará a avanzar en el estudio de nuevos objetivos terapéuticos y el desarrollo de vacunas contra la malaria.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Dhelio Pereira y a los miembros del Centro de Investigación en Medicina Tropical de Rondônia (CEPEM) por la inscripción de pacientes con malaria y la recolección de sangre y a Felicia Ho por ayudar con la revisión del manuscrito. El siguiente reactivo se obtuvo a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL:PyGFP, MRA- 817, contribución de Ana Rodriguez. Esta investigación fue apoyada por el Fondo de Investigación Lemann Brasil, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4, becas (CJ, GC, CG) y Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - beca (LL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
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