Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64001
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Systems Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Howard Hughes Medical Institute

Summary

Hi-C 3.0 is een verbeterd Hi-C protocol dat formaldehyde en disuccinimidylglutaraat crosslinkers combineert met een cocktail van DpnII en DdeI restrictie enzymen om de signaal-ruisverhouding en de resolutie van chromatine interactie detectie te verhogen.

Abstract

Chromosoom conformatie capture (3C) wordt gebruikt om driedimensionale chromatine interacties te detecteren. Meestal wordt chemische crosslinking met formaldehyde (FA) gebruikt om chromatine-interacties te fixeren. Vervolgens zet chromatinevertering met een restrictie-enzym en daaropvolgende religatie van fragmenteinden driedimensionale (3D) nabijheid om in unieke ligatieproducten. Ten slotte, na omkering van crosslinks, eiwitverwijdering en DNA-isolatie, wordt DNA geschoren en voorbereid voor high-throughput sequencing. De frequentie van nabijheidsligatie van paren loci is een maat voor de frequentie van hun colocalisatie in de driedimensionale ruimte in een celpopulatie.

Een gesequencede Hi-C-bibliotheek biedt genoombrede informatie over interactiefrequenties tussen alle paren loci. De resolutie en precisie van Hi-C is afhankelijk van efficiënte crosslinking die chromatinecontacten en frequente en uniforme fragmentatie van het chromatine handhaaft. Dit artikel beschrijft een verbeterd in situ Hi-C-protocol, Hi-C 3.0, dat de efficiëntie van crosslinking verhoogt door twee crosslinkers (formaldehyde [FA] en disuccinimidylgluutaraat [DSG]) te combineren, gevolgd door een fijnere spijsvertering met behulp van twee restrictie-enzymen (DpnII en DdeI). Hi-C 3.0 is een enkel protocol voor de nauwkeurige kwantificering van genoomvouwingskenmerken op kleinere schalen zoals lussen en topologisch associërende domeinen (TAD's), evenals functies op grotere kernbrede schalen zoals compartimenten.

Introduction

Sinds 2002 wordt chromosoomconformatie-opname gebruikt1. Fundamenteel is elke conformatievangstvariant afhankelijk van de fixatie van DNA-eiwit- en eiwit-eiwitinteracties om de 3D-chromatine-organisatie te behouden. Dit wordt gevolgd door DNA-fragmentatie, meestal door restrictievertering, en ten slotte religatie van nabijgelegen DNA-uiteinden om ruimtelijk proximale loci om te zetten in unieke covalente DNA-sequenties. Initiële 3C-protocollen gebruikten PCR om specifieke, "één-op-één" interacties te bemonsteren. Latere 4C-assays maakten de detectie van "one-to-all" interacties2 mogelijk, terwijl 5C "many-to-many" interacties detecteerde3. Chromosoomconformatie-opname kwam tot volle wasdom na de implementatie van next-generation, high-throughput sequencing (NGS), die detectie van "all-to-all" genomische interacties mogelijk maakte met behulp van genoombrede Hi-C4 en vergelijkbare technieken zoals 3C-seq5, TCC6 en Micro-C 7,8 (zie ook review door Denker en De Laat9).

In Hi-C worden gebiotinyleerde nucleotiden gebruikt om 5′-overhangen na de spijsvertering en vóór ligatie te markeren (figuur 1). Dit maakt de selectie van goed verteerde en religated fragmenten mogelijk met behulp van streptavidin-gecoate kralen, waardoor het zich onderscheidt van GCC10. Een belangrijke update van het Hi-C-protocol werd geïmplementeerd door Rao et al.11, die de spijsvertering en religatie in intacte kernen (d.w.z. in situ) uitvoerden om valse ligatieproducten te verminderen. Bovendien verminderde het vervangen van HindIII-spijsvertering door MboI (of DpnII) -spijsvertering de fragmentgrootte en verhoogde het het resolutiepotentieel van Hi-C. Deze toename maakte de detectie van relatief kleinschalige structuren en een nauwkeurigere genomische lokalisatie van contactpunten mogelijk, zoals DNA-lussen tussen kleine cis-elementen, bijvoorbeeld lussen tussen CTCF-gebonden locaties gegenereerd door lusextrusie11,12. Dit potentieel brengt echter kosten met zich mee. Ten eerste vereist een tweevoudige toename van de resolutie een viervoudige (22) toename van de sequencingreads 13. Ten tweede vergroten de kleine fragmentgroottes de kans om onverteerde naburige fragmenten te verwarren met verteerde en religated fragmenten14. Zoals vermeld, verschillen in Hi-C verteerde en religated fragmenten van onverteerde fragmenten door de aanwezigheid van biotine op de ligatieverbinding. Een goede verwijdering van biotine uit niet-geliformeerde uiteinden is echter vereist om ervoor te zorgen dat alleen ligatieverbindingen14,15 naar beneden worden getrokken.

Met de dalende kosten van NGS wordt het haalbaar om chromosoomvouwing in meer detail te bestuderen. Om de grootte van DNA-fragmenten te verkleinen en daardoor de resolutie te verhogen, kan het Hi-C-protocol worden aangepast om vaker snijdende restrictie-enzymen16 te gebruiken of om combinaties van restrictie-enzymen te gebruiken 17,18,19. Als alternatief kunnen MNase 7,8 in Micro-C en DNase in DNase Hi-C20 worden getitreerd om een optimale spijsvertering te bereiken.

Een recente systematische evaluatie van de fundamenten van 3C-methoden toonde aan dat de detectie van chromosoomvouwingskenmerken op elke lengteschaal sterk verbeterde met sequentiële crosslinking met 1% FA gevolgd door 3 mM DSG17. Bovendien was Hi-C met HindIII-spijsvertering de beste optie voor het detecteren van grootschalige vouwfuncties, zoals compartimenten, en dat Micro-C superieur was in het detecteren van kleinschalige vouwfuncties zoals DNA-lussen. Deze resultaten leidden tot de ontwikkeling van een enkele, hoge resolutie "Hi-C 3.0" strategie, die de combinatie van FA en DSG crosslinkers gebruikt, gevolgd door dubbele vertering met DpnII en DdeI endonucleases21. Hi-C 3.0 biedt een effectieve strategie voor algemeen gebruik omdat het nauwkeurig vouwfuncties detecteert op alle lengteschalen17. Het experimentele gedeelte van het Hi-C 3.0-protocol wordt hier gedetailleerd en typische resultaten die na sequencing kunnen worden verwacht, worden weergegeven.

Figure 1
Figuur 1: Hi-C procedure in zes stappen. Cellen worden eerst gefixeerd met FA en vervolgens met DSG (1). Vervolgens gaat lysis vooraf aan een dubbele spijsvertering met DdeI en DpnII (2). Biotine wordt toegevoegd door overhang fill-in en proximale stompe uiteinden worden geligeerd (3) vóór DNA-zuivering (4). Biotine wordt verwijderd uit niet-geliformeerde uiteinden vóór ultrasoonapparaat en grootteselectie (5). Ten slotte maakt het naar beneden trekken van biotine adapterligatie en bibliotheekversterking door PCR mogelijk (6). Afkortingen: FA = formaldehyde; DSG = disuccinimidylglutaraat; B = Biotine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Fixatie door crosslinking

  1. Formaldehydefixatie: uitgaande van cellen in monolaag
    1. Laat cellen zaaien in het juiste medium om 5 × 106 cellen per plaat van 150 mm te oogsten.
      OPMERKING: Gebruikers kunnen elke gewenste container kiezen die zorgt voor een optimale groei van elke zoogdiercellijn. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd uit weefsel.
    2. Aspirateer het medium met een Pasteur pipet gekoppeld aan een vacuümval van 150 mm plaat, was 2x met ~10 ml HBSS.
    3. Bereid onmiddellijk voor crosslinking een 1% FA-crosslinkingoplossing in een buis van 50 ml door 22,5 ml HBSS en 625 μL 37% FA te combineren tot een uiteindelijke concentratie van 1%. Meng zachtjes door te schommelen.
      LET OP: Gebruik zuurkast; formaldehyde is giftig.
    4. Om de cellen te verknopen, giet 23,125 ml van de 1% FA-oplossing op elke plaat van 15 cm.
    5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en schommel de platen voorzichtig met de hand om de 2 minuten.
    6. Voeg 1,25 ml 2,5 m glycine (128 mM final) toe en draai de plaat voorzichtig rond om de crosslinking-reactie te doven.
    7. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en blijf gedurende ten minste 15 minuten op ijs incuberen om crosslinking te stoppen.
    8. Schraap de cellen van de platen met een celschraper of rubberen politieagent.
    9. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 ml met een pipet. Centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant door aspiratie weg.
    10. Was de celpellet eenmaal met 10 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), met behulp van een pipet om te resuspenderen. Centrifugeer vervolgens bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Ga onmiddellijk verder met DSG-crosslinking.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het wassen van de celpellet, omdat celpellets los kunnen zitten en cellen verloren kunnen gaan.
  2. Formaldehydefixatie: uitgaande van cellen in suspensie
    1. Laat cellen zaaien in het juiste medium om 5 × 106 cellen per vat te oogsten.
      OPMERKING: Gebruikers kunnen elke gewenste container kiezen die zorgt voor een optimale celgroei van elke zoogdiercellijn.
    2. Tel vlak voor de oogst de cellen en breng 5 × 106 cellen over naar een conische buis van 50 ml.
    3. Pelleteer de cellen voorzichtig door te centrifugeren op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Bereid 1% FA crosslinking-oplossing door 1,25 ml 37% FA toe te voegen aan 45 ml HBSS en meng door de buis meerdere keren om te keren.
      OPMERKING: Voeg de volledige 1,25 ml FA toe zonder de hoeveelheid te splitsen.
      LET OP: Formaldehyde is zeer giftig.
    5. Resuspendeer de celpellet in de 46,25 ml 1% FA-crosslinkingoplossing die in de vorige stap is bereid door op en neer te pipetteren.
    6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten op rotator, rocker of door zachte handmatige inversie van de buis om de 1-2 min.
    7. Doof de crosslinking reactie door 2,5 ml 2,5 m glycine (128 mM finale) toe te voegen en meng goed door de buis om te keren.
    8. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens op ijs gedurende ten minste 15 minuten om volledig te stoppen met crosslinken.
    9. Centrifugeer bij kamertemperatuur om de verknoopte cellen gedurende 10 minuten op 1.000 × g te pelleteren en gooi het supernatant door aspiratie weg.
    10. Was de cellen eenmaal met 10 ml DPBS en centrifugeer vervolgens op 1.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant volledig weg met behulp van een pipet en ga onmiddellijk over tot DSG-crosslinking.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het wassen van de celpellet, omdat celpellets los kunnen zitten en cellen verloren kunnen gaan.
  3. Crosslinking met disuccinimidylglutaraat
    1. Resuspensieer de gepelletiseerde cellen in 9,9 ml DPBS voordat 100 μL van 300 mM DSG (3 mM final) wordt toegevoegd. Meng door inversie.
      LET OP: DSG is vochtgevoelig. Het is belangrijk om op de dag van crosslinking een verse voorraad van 300 mM DSG in DMSO voor te bereiden.
      LET OP: DSG in DMSO is zeer giftig.
    2. Kruis de cellen bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten op een rotator.
    3. Voeg 1,925 ml 2,5 m glycine (400 mM final) toe, keer om om te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    4. Centrifugeer de cellen bij 2.000 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het verwijderen van het supernatant uit losse celpellets.
    5. Resuspendeer de pellet in 1 ml 0,05% runderserumalbumine (BSA)-DPBS en breng over in een buis van 1,7 ml.
      OPMERKING: De toevoeging van BSA kan helpen om het samenklonteren van cellen te verminderen.
    6. Centrifugeer de cellen bij 2.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant via de pipet.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat u de pellet verliest, verwijdert u het supernatant snel en volledig.
    7. Vries de pellet in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C of ga onmiddellijk verder met de volgende stap.

2. Chromosoom conformatie capture

  1. Cellyse en chromatinevertering
    1. Resuspendeer (pipet) de verknoopte cel aliquots (~5 × 106 cellen) in 1 ml ijskoude lysisbuffer (recept in aanvullende tabel S1) met 10 μL proteaseremmercocktail en breng over naar een douncehomogenisator gedurende een incubatietijd van 15 minuten op ijs.
      OPMERKING: Voeg proteaseremmers onmiddellijk voor gebruik toe aan de lysisbuffer.
    2. Beweeg stamper A langzaam 30 keer op en neer om de cellen op ijs te homogeniseren en incubeer op ijs gedurende 1 minuut om de cellen te laten afkoelen, voor nog eens 30 slagen.
    3. Breng het lysaat over in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.
      OPMERKING: Houd de suspensie in beweging omdat er soms cellen in de pipetpunt blijven plakken.
    4. Centrifugeer de gelyseerde suspensie bij 2.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Gooi het supernatant weg en veeg of vortex de natte pellet om te resuspenderen. Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant om een yoghurtachtige substantie te verkrijgen met minimale klonten.
    6. Resuspendeer de pellet in 500 μL ijskoude 1x restrictiebuffer (vanaf 10x; zie recept in aanvullende tabel S1) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.500 × g. Herhaal deze stap voor een tweede wasbeurt.
      OPMERKING: De pellet in 1x Restrictiebuffer is korreliger dan de vorige pellet in lysisbuffer.
    7. Resuspendeer de cellen in een eindvolume van 360 μL 1x restrictiebuffer door te pipetteren na toevoeging van ~ 340 μL aan het overdrachtsvolume van de pellet, afhankelijk van de celgrootte.
    8. Reserveer 18 μL van elk lysaat voor het testen van de chromatine-integriteit (CI). Bewaar de CI-monsters bij 4 °C.
    9. Voeg 38 μL 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe aan elke Hi-C-buis (totaal volume van 380 μL) en meng voorzichtig door te pipetteren zonder bubbels te introduceren.
      LET OP: SDS is giftig.
    10. Incubeer de monsters bij 65 °C zonder te schudden gedurende precies 10 minuten om het chromatine te openen.
    11. Plaats de buisjes onmiddellijk op ijs en bereid het digestiemengsel voor met Triton X-100 om het VIB te doven zoals beschreven in tabel 1.
    12. Voeg 107 μL van het digestiemengsel toe aan de Hi-C-buis (487 μL totaal) om het chromatine 's nachts (~ 16 uur) bij 37 °C in een thermomixer met intervalschudden (bijv. 900 tpm, 30 s aan, 4 minuten uit) te verteren.
      OPMERKING: De toevoeging van Triton aan een eindconcentratie van 1% dient om het VIB te doven.
  2. Biotinylering van DNA-uiteinden
    1. Breng de monsters na een nachtgisting gedurende 20 minuten over naar 65 °C om de resterende endonuclease-activiteit te deactiveren.
    2. Bereid tijdens de incubatie een invulmastermix zoals aangegeven in tabel 2.
    3. Na incubatie plaatst u de monsters onmiddellijk op ijs.
    4. Zet voor elk monster een vergistingscontrole (DC) van 10 μL opzij en bewaar bij 4 °C.
    5. Verwijder de condensatie van het deksel met een pipet of door te draaien. Voeg aan elk monster 58 μL biotine vulmengsel (totaal monstervolume 535 μL) toe en pipetteer voorzichtig zonder bellen te vormen.
    6. Incubeer de monsters bij 23 °C gedurende 4 uur in een thermomixer (bijv. 900 rpm, 30 s aan, 4 min uit).
  3. Ligatie van proximale DNA-fragmenten
    1. Bereid de ligatiemix zoals weergegeven in tabel 3 terwijl de biotine fill-in broedt.
    2. Voeg 665 μL van het ligatiemengsel toe aan elk monster (totaal monstervolume 1.200 μL). Meng voorzichtig door te pipetteren.
    3. Incubeer de monsters bij 16 °C gedurende 4 uur in een thermomixer met intervalschudden (bijv. 900 tpm, 30 s aan, 4 minuten uit). Bewaar deze monsters met covalent gebonden chromatine bij 4 °C gedurende enkele dagen.
  4. Omkering van crosslinking
    1. Breng de volumes van de CI- en DC-monsters op 50 μL met 1x Tris Low EDTA (TLE; zie het recept in aanvullende tabel S1).
    2. Voeg 10 μL 10 mg/ml proteïnase K toe aan CI- en DC-monsters.
    3. Incubeer 's nachts bij 65 °C met intervalschudden (bijv. 900 tpm, 30 s aan, 4 minuten uit). U kunt ook een omkering van 30 minuten van crosslinking uitvoeren voor deze controles tijdens de DNA-zuivering van de Hi-C-monsters.
    4. Voeg aan elk Hi-C-monster 50 μL 10 mg/ml proteïnase K toe en incubeer bij 65 °C gedurende ten minste 2 uur met intervalschudden (bijv. 900 rpm, 30 s aan, 4 min uit).
    5. Voeg nog eens 50 μL 10 mg/ml proteïnase K toe aan elke Hi-C-buis (totaal monstervolume 1.300 μL) en ga verder met broeden bij 65 °C 's nachts. Bewaren bij 4 °C tot dna-zuivering.
      OPMERKING: Het opsplitsen van proteïnase K-incubaties zorgt voor een totale eiwitvertering.
  5. DNA-zuivering
    1. Laat de buizen afkoelen van 65 °C tot kamertemperatuur.
    2. Breng elk monster over in een conische buis van 15 ml en voeg een 2,6 ml (2x volume) fenol: chloroform: isoamylalcohol toe aan elke buis.
      LET OP: Fenol:chloroform:isoamylalcohol is een zeer giftige irriterende stof en is mogelijk kankerverwekkend.
    3. Vortex elke buis gedurende 1 minuut en breng vervolgens de inhoud over in een fasevergrendelingsbuis van 15 ml.
    4. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten met maximale snelheid (1.500-3.500 × g) in een benchtopcentrifuge.
    5. Giet de waterige fase voorzichtig in een ultracentrifugebuis van 35 ml en voeg ultrapuur water toe aan een eindvolume van 1.250 μL.
      OPMERKING: Gebruik buizen om de beschikbare ultracentrifuge te monteren of splits in meerdere microcentrifugebuizen.
    6. Voeg een 1/10e volume (~ 125 μL) van 3 M natriumacetaat toe en meng goed door inversie.
    7. Voeg een 2,5x volume (~ 3,4 ml) ijskoude 100% ethanol toe aan elk monster, balanceer de buizen voor ultracentrifugatie door ijskoude 100% ethanol toe te voegen en meng goed door inversie.
    8. Incubeer de buizen op droogijs gedurende ~ 15 minuten (vermijd stolling).
    9. Centrifugeer de buizen bij 18.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Voor schuine rotoren: markeer de buizen voor waar de pellet zich zal bevinden.
    10. Verwijder met een pipet het supernatant volledig van de niet-pelletzijde en gooi het weg.
      OPMERKING: Op dit punt moet de pellet zichtbaar worden en kan deze op de buis worden gemarkeerd, omdat deze mogelijk niet duidelijk zichtbaar is na het drogen in de volgende stap.
    11. Droog de monsters aan de lucht gedurende ongeveer 10 minuten of totdat ze zichtbaar droog zijn.
    12. Verzacht elke pellet in 450 μL 1x TLE door pipetteren of wervelen en breng over naar 0,5 ml centrifugaalfiltereenheid (CFU) met een moleculaire gewichtsafsnijding van 3 kDa.
    13. Centrifugeer de CFU op maximale snelheid gedurende 10 minuten en gooi de flowthrough weg. Was elke ultracentrifugebuis met nog eens 450 μL 1x TLE en breng over naar de CFU voor een nieuwe wasbeurt.
      OPMERKING: Het wassen van de CFU op deze manier beperkt DNA-verlies terwijl de zoutconcentratie wordt verminderd.
    14. Centrifugeer de CFU op maximale snelheid gedurende 10 minuten en gooi de flowthrough weg.
    15. Voeg 80 μL 1x TLE toe aan de kolom en draai de kolom om in een nieuwe verzamelbuis voordat u gedurende 2 minuten met maximale snelheid centrifugeert om een eindvolume van ~ 100 μL te verkrijgen.
    16. Voeg 1 μL RnaseA (1 mg/ml; 10-voudige verdunning van 10 mg/ml bouillon) toe aan elk monster en incubeer bij 37 °C op een warmteblok, in een waterbad of een thermomixer gedurende ten minste 30 minuten.
    17. Verwijder na de Rnase-behandeling de monsters van 37 °C en bewaar bij 4 °C tot de stap van de kwaliteitscontrole.
  6. Controle van de chromatinekwaliteit, enzymvertering en monsterligatie
    1. Koel de CI- en DC-monsters af tot kamertemperatuur na het omkeren van de crosslinks in stap 2.4.5. Breng vervolgens over op een voorgespoten fasevergrendelingsbuis van 2 ml.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het gehalte aan fasevergrendeling wordt gecentrifugeerd tot een pellet (maximale snelheid gedurende 2 minuten).
    2. Voeg 200 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol toe en meng de monsters door gedurende 1 min te vortexen.
    3. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten op maximale snelheid.
    4. Breng de waterige fase van elk monster (~ 50 μL) over naar een nieuwe microfugebuis van 1,7 ml.
    5. Voeg 1 μL Rnase A (van 1 mg/ml) toe en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten.
    6. Laad de monsters op een 0,8% agarose gel zoals aanbevolen in tabel 4.
      OPMERKING: De verwachte resultaten van een kwaliteitscontrole zijn weergegeven in figuur 2.
    7. Kwantificeer het DNA door densitometrie van de gel of met behulp van Qubit of Nanodrop.
      OPMERKING: Nauwkeurige kwantificering zorgt voor het juiste invoervolume in het volgende deel van het protocol. Gebruik verschillende standaarden met een bekende grootheid om een standaardcurve te construeren.

Tabel 1: Digestiereagentia. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Biotine fill-in reagentia. *Merk op dat veranderende enzymen verschillende buffers en gebiotinyleerde dNTP's kunnen vereisen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Ligatiemengselreagentia. Afkorting: BSA = runderserumalbumine. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Gelbelastingsparameters voor kwaliteits- en grootteselectiebeoordeling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 2
Figuur 2: Agarose-gel met typische resultaten van de kwaliteitscontrole na de zuivering na de DNA-zuivering. (A) De CI-controle moet een band van DNA met een hoog molecuulgewicht aangeven. (B) De DC- en Hi-C-monsters vertonen een reeks DNA-grootten. Het Hi-C-monster, dat in grotere fragmenten is gecombineerd, moet een hoger molecuulgewicht hebben dan het DC. Het concentratiebereik van markers maakt het mogelijk om een standaardcurve te genereren. Merk op dat in dit voorbeeld het CI op een afzonderlijke gel is geladen, maar het wordt geadviseerd om alle monsters en besturingselementen samen te laden en uit te voeren. Afkortingen: CI = chromatine integriteit; DC = controle van de spijsvertering; Hi-C = nabijheid-ligated. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Hi-C sequencing bibliotheekvoorbereiding

  1. Verwijdering van biotine uit niet-geliformeerde uiteinden
    1. Bereid biotineverwijderingsreacties voor zoals weergegeven in tabel 5.
      OPMERKING: Meestal is 10 μg DNA voldoende, maar tot 30 μg kan worden gebruikt.
    2. Verdeel 2 x 65 μL aliquots van elke 130 μL reactie in twee PCR-buizen.
    3. Breng over op een thermocycler of PCR-machine en incubeer zoals beschreven in tabel 5.
      OPMERKING: Monsters kunnen hier worden opgeslagen bij 4 °C (dagen tot weken), -20 °C (lange termijn), of onmiddellijk worden overgedragen naar ultrasoonapparaat.
  2. Sonicatie
    1. Pool de monsterduplicaten van de biotineverwijderingsstap (130 μL totaal monstervolume) in een 130 μL sonicatorbuis voor ultrasoonapparaat.
    2. Soniceer de monsters met behulp van de parameters in tabel 6 om een nauwe smal verdeling onder 500 bp te bereiken.
      OPMERKING: Verschillende sonicatortypen kunnen worden gebruikt, maar voor een smalle fragmentverdeling (100-500 bp) kunnen sonicatorinstellingen optimalisatie vereisen.
  3. Maatselectie met magnetische kralen
    1. Pipetteer het gesonificeerde DNA van de sonicatorbuis(en) in een 1,7 ml lage bindingsbuis.
    2. Breng elk monster op een totaal volume van 500 μL met 1x TLE. Probeer het volume zo dicht mogelijk bij 500 μL te krijgen, omdat de verhouding tussen monster en magnetisch kralenmengsel essentieel is voor de keuze van de grootte.
    3. Voeg 400 μL magnetische kralenmengsel toe aan elke buis om een verhouding van magnetische kralenmengsel tot het monstervolume van 0,8 te bereiken.
      OPMERKING: Onder deze omstandigheden vangen kralen DNA-fragmenten > 300 bp, wat de bovenste fractie zal zijn. Het supernatant zal fragmenten <300 bp bevatten, wat de Onderste Fractie zal zijn.
    4. Meng de buizen door vortexing en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rotator. Voor deze en andere grootteselectieverhoudingen moet u ervoor zorgen dat het volledige volume van het monster goed mengt. Zoek naar de "grillige modus" die sommige rotors hebben, die goed werkt voor kleinere volumes.
    5. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een magnetische deeltjesscheider (MPS).
    6. Voeg tijdens het broeden 500 μL van het mengsel van magnetische kralen toe aan een verse 1,7 μL lage bindingsbuis voor elk monster.
      OPMERKING: Deze buizen worden gebruikt voor de volgende grootteselectie van de onderste fractie door een magnetische kralenmengsel-monsterverhouding van 1,1: 1 te genereren.
    7. Laat de buizen 5 min op de MPS zitten.
    8. Verwijder het supernatant uit de kralen en resuspendeer met 150 μL van het magnetische kralenmengsel.
      OPMERKING: Deze stap voorkomt verzadiging van de kralen met DNA door het aantal kralen te verhogen zonder het volume te verhogen.
    9. Breng het supernatant van stap 3.3.5 over naar de gelabelde buis die is voorbereid om de onderste fractie te selecteren (stap 3.3.8).
      OPMERKING: 150 μL magnetische kralenmengsel + 400 μL van 0,8x magnetisch kralenmengsel (550 μL totaal) gedeeld door 500 μL initieel monster = 1,1x magnetische kralenmengsel/monsterverhouding.
    10. Meng de lower fraction buizen door vortexing en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.
      OPMERKING: De kralen binden DNA-fragmenten >100 bp, wat resulteert in een uiteindelijke kraalgebonden fractie van 100-300 bp.
    11. Plaats de Lower Fraction tubes op de MPS gedurende 5 min (kamertemperatuur).
    12. Verwijder het supernatant en centrifugeer de buizen kort om het supernatant zoveel mogelijk verder te verwijderen.
    13. Was de kralen van beide fracties tweemaal met 200 μL 70% ethanol en win de kralen gedurende 5 minuten terug op de MPS.
    14. Na een snelle draai in een centrifuge, verwijder de ethanol volledig en droog de kralen op de MPS verder.
      LET OP: Droog tot de alcohol volledig is verdampt. De pellet moet eruit zien als pure chocolade zonder te kraken (kan ~ 10 minuten duren).
    15. Resuspendeer beide fracties in 50 μL 1x TLE buffer. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en tik of veeg om de minuut op de buisjes om het mengen en de elutie te stimuleren.
    16. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 5 minuten voor beide fracties.
    17. Bewaar het supernatant uit elk monster. Pipetteer het supernatant in een 1,7 ml lage bindingsbuis.
      OPMERKING: De monsters kunnen enkele dagen bij 4 °C of op lange termijn bij -20 °C worden bewaard.
    18. Voer een 2% agarose gel uit zoals in tabel 4 om de kwaliteit en kwantiteit van het monster te bepalen. Zie figuur 3 voor een voorbeeld van zo'n gel.
      OPMERKING: Als uit ervaring ultrasoonapparaat zeer reproduceerbaar is, kan men deze gel overslaan en onmiddellijk doorgaan met het beëindigen van de reparatie. Het wordt aanbevolen dat gebruikers de bovenste fracties vasthouden tot na titratie PCR. Suboptimale DNA-grootheden die veel PCR-amplificatie zouden vereisen, kunnen worden gered uit materiaal in de Bovenste Fractie.
    19. Kwantificeer de hoeveelheid DNA uit de gel direct na het genereren van een standaardcurve uit de bekende DNA-ladderinvoer of met behulp van een Qubit of Nanodrop.
  4. Eindreparatie
    1. Bereid de eindreparatiemix voor zoals in tabel 7 (hoeveelheid per gegeven reactie).
    2. Breng de resterende 46 μL geëlueerd DNA over van de onderste fractie naar PCR-buizen en voeg 24 μL van het voorbereide eindreparatiemengsel toe. Incubeer in een PCR-machine, zoals voorgesteld in tabel 7.
    3. Zodra het programma is voltooid, houdt u de monsters op 4 °C totdat u ze naar beneden trekt.
  5. Pull-down van gebiotinyleerde ligatieproducten met streptavidin gecoate kralen
    1. Bepaal de hoeveelheid met streptavidin beklede kralen voor elke bibliotheek uit de gekwantificeerde grootteselectie (stap 3.3.19).
      OPMERKING: Deze streptavidin-gecoate kralen (10 mg / ml oplossing) kunnen 20 μg dubbelstrengs DNA per mg kralen binden (= 20 μg / 100 μL kralen). Gebruik 2 μL voor elke 1 μg Hi-C DNA maar niet minder dan 10 μL.
    2. Meng de met streptavidin gecoate kralen en pipetteer het volume kralen dat nodig is voor elke bibliotheek (berekend in de vorige stap) in afzonderlijke 1,7 ml lage bindingsbuizen.
    3. Resuspenseer de kralen in 400 μL Tween wasbuffer (TWB; zie recept in aanvullende tabel S1) en incubeer gedurende ~3 minuten bij kamertemperatuur op een rotator (zie instructies in stap 3.3.4).
    4. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
    5. Was de kralen door nog eens 400 μL TWB te pipetteren.
    6. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
    7. Voeg 400 μL 2x Binding Buffer (BB) (recept in Aanvullende Tabel S1) toe aan de kralen en resuspend. Voeg daarnaast 330 μL 1x TLE en de oplossing van End-repair (uit stap 3.4.3) toe.
    8. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur tijdens het mengen op een rotator.
    9. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
    10. Voeg 400 μL 1x BB toe aan de kralen en resuspendeer.
    11. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
    12. Voeg 100 μL 1x TLE toe om de kralen te wassen.
    13. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
    14. Voeg ten slotte 41 μL 1x TLE toe om de kralen te resuspenderen.
  6. A-tailing
    1. Bereid het A-tailingmengsel zoals in tabel 8.
    2. Pipetteer de reacties in PCR-buizen en incubeer zoals in tabel 8.
    3. Plaats de PCR-buizen onmiddellijk na verwijdering uit de thermocycler op ijs en breng de inhoud over naar 1,7 ml lage bindingsbuizen.
    4. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg.
    5. Voeg 400 μL 1x ligatiebuffer toe, verdund uit 5x T4 DNA ligasebuffer met ultrapuur water.
    6. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 minuut en gooi het supernatant vervolgens weg.
    7. Voeg 1x ligatiebuffer toe aan een eindvolume van 40 μL.
  7. Gloeiadapter oligo's
    1. Bereid adapter oligovoorraden van 100 μM voor (tabel 9).
      OPMERKING: Bestel 250 nmolen HPLC-gezuiverde oligo's.
    2. Annealiseer de adapters in PCR-buizen zoals beschreven in tabel 9.
    3. Gebruik een PCR thermocycler om de temperatuur bij 0,5 °C/s geleidelijk op te voeren tot 97,5 °C. Houd 2,5 °C op 97,5 °C.
    4. Gebruik een PCR-thermocycler om de temperatuur geleidelijk op te voeren met 0,1 °C/s gedurende 775 cycli (tot 20 °C). Houd de temperatuur op 4 °C tot verder gebruik.
    5. Voeg 83 μL 1x Gloeibuffer toe (recept in aanvullende tabel S1) om de adapters te verdunnen tot 15 μM. Bewaar de adapters bij -20 °C.
  8. Sequencing adapter ligatie
    1. Bereid het ligatiemengsel van de adapter in een 1,7 ml lage bindingsbuis (tabel 10).
    2. Ligaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    3. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg.
    4. Voeg 400 μL TWB toe en pipetteer de kralen voorzichtig op en neer voordat ze gedurende 5 minuten op de rotator worden gebrouwen bij kamertemperatuur. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS en herhaal deze stap nogmaals.
    5. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS (~1 min), gooi het supernatant weg en voeg 200 μL 1x BB toe.
    6. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS (~1 min) en gooi het supernatant weg.
    7. Voeg 200 μL 1x pre-PCR Buffer (vanaf 10x; recept in Aanvullende Tabel S1) toe en breng over naar een nieuwe 1,7 ml lage bindingsbuis.
    8. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS (~1 min) en gooi het supernatant weg.
    9. Voeg 20 μL 1x pre-PCR Buffer toe en meng door te pipetteren.
    10. Bewaar de buisjes op ijs tijdens gebruik of bewaar bij 4 °C.
  9. Optimalisatie van het PCR-cyclusnummer door titratie
    1. Stel 30 μL mastermixreacties per monster in zoals in tabel 11 (hoeveelheid per gegeven reactie).
    2. Voer het laagste aantal cycli uit en neem een aliquot van 5 μL. Voer extra 2-3 cycli uit op de resterende reactie voordat u de volgende aliquot van 5 μL inneemt. Herhaal dit om vier aliquots te verzamelen.
    3. Gebruik PCR-parameters uit tabel 11 voor elke aliquot.
    4. Voeg 5 μL water en 2 μL 6x kleurstof toe aan elk monster van 5 μL. Voer op een 2% agarose TBE-gel (recept in aanvullende tabel S1) met 25-150 ng laagmoleculaire gewichtsladder. Zie figuur 4 voor de verwachte resultaten.
      OPMERKING: Een optimaal aantal cycli voor de uiteindelijke pcr-versterking van de bibliotheek [stap 3.10] is het laagste aantal cycli om zichtbaar product op de gel te krijgen minus één cyclus.
  10. Definitieve bibliotheek PCR-versterking
    1. Stel reacties van 12 x 30 μL in om elke uiteindelijke bibliotheek te versterken voor sequencing zoals in tabel 11.
    2. Cyclus de PCR-reacties volgens tabel 11 na het bepalen van het aantal cycli na PCR-titratie (stap 3.9.3).
    3. Zodra de PCR is voltooid, verzamelt u de replicaatmonsters in een 1,7 ml laagbindende microfugebuis.
    4. Plaats de buizen op de MPS en breng het supernatant over naar een nieuwe 1,7 ml laagbindende microfugebuis.
    5. Resuspendeer de overgebleven streptavidin-gecoate kralen in 20 μL van 1x pre-PCR Buffer.
      OPMERKING: Deze sjabloon kan worden hergebruikt wanneer deze dagen tot weken bij 4 °C of langdurig bij -20 °C wordt bewaard.
  11. Primers verwijderen met magnetisch kralenmengsel
    1. Gebruik 1x TLE buffer (recept in aanvullende tabel S1) om het volume aan te passen van stap 3.10.4 tot precies 360 μL.
    2. Voeg aan elk monster 360 μL van het magnetische kralenmengsel toe en pipetteer op en neer om te mengen.
    3. Meng op een rotator de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS bij kamertemperatuur (3-5 min).
    5. Was de kralen twee keer met 200 μL 70% ethanol en win de kralen telkens 5 minuten terug op de MPS.
    6. Snel spin in een centrifuge en pipetteer de ethanol volledig af. Droog de kralen in lucht op de MPS om de ethanol verder te verdampen.
      OPMERKING: De pellet moet eruit zien als pure chocolade zonder te kraken (kan ~ 10 minuten duren).
    7. Voeg 30 μL ultrapuur water toe en resuspendeer om het DNA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te elueren. Veeg de buizen om de 2 minuten om te helpen mengen.
    8. Scheid de kralen van het supernatant op de MPS gedurende 5 minuten.
    9. Verzamel het supernatant van elk monster in een verse buis van 1,7 ml.
    10. Voer 1 μL van de bibliotheek uit op een 2% agarose TBE (recept in Supplemental Table S1) gel om een fragmentgrootteverdeling te verkrijgen en de uiteindelijke bibliotheek te kwantificeren (figuur 5).
      OPMERKING: ClaI-vertering kan alleen optreden voor DpnII-DpnII-juncties en dient als een positieve ligatiecontrole die zou moeten resulteren in een lagere fragmentgrootteverdeling voor de uiteindelijke bibliotheek. Definitieve bibliotheken kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 °C, langdurig bij -20 °C, of onmiddellijk worden verdund en voor sequencing worden ingediend.

Tabel 5: Biotine verwijderingsreagentia en temperaturen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Parameters voor ultrasoonapparaat. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7: Eindreparatiereagentia en temperaturen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 8: A-tailing reagentia en temperaturen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 9: PCR Primers en Paired-End-adapter oligo's met reagentia die gloeien voor gloeien. Afkorting: 5PHOS = 5' fosfaat. Sterretjes geven gefosforothioeerde DNA-basen aan. # Combineer een geïndexeerd oligo met het Universal oligo om te gloeien tot een geïndexeerde adapter. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 10: Ligatiereagentia van de adapter. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 11: PCR-reagentia en cyclusparameters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 3
Figuur 3: Agarose-gel met typische post-size selectieresultaten. De bovenste en onderste fracties voor vier monsters (genummerd 1-4) van DpnII-DdeI Hi-C worden weergegeven. De eerste baan voor elk monster bevat de bovenste fractie, afgeleid van een mengsel van 0,8x magnetische kralen, en de tweede en derde baan bevatten een verdunning van de onderste fractie afgeleid van een 1,1x magnetisch kralenmengsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Agarose gel met PCR titratie resultaten. Vanaf 5 cycli PCR worden monsters genomen na elke 2 cycli (5, 7, 9 en 11 cycli) voor elk van de vier bibliotheken. Op basis van dit cijfer werden 6 cycli gekozen als de optimale cyclus voor elk monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Definitieve PCR-producten. Na reiniging en maatselectie werden PCR-producten (Hi-C) geladen naast een ClaI-verteerde fractie van dezelfde bibliotheek (ClaI). ClaI-verteerde fragmenten wijzen op de aanwezigheid van gewilde DpnII-DpnII ligaties. Merk op dat ClaI geen DpnII-DdeI-juncties verteert en daarom zullen niet alle ligaties bijdragen aan een verkleining van deze beperking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

De figuren in dit manuscript zijn voortgekomen uit een afzonderlijk, gerepliceerd experiment van het experiment dat eerder door Lafontaine et al.21 is gepubliceerd. Na het verkrijgen van high-throughput sequencing data werd het Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) gebruikt om de Hi-C data te verwerken. Een soortgelijke pijplijn is te vinden op het dataportaal van het 4D Nucleome-project (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). In het kort werd de Nextflow pipeline distiller (https://github.com/open2c/distiller-nf) geïmplementeerd om (1) de sequenties van Hi-C-moleculen uit te lijnen met het referentiegenoom, (2) .sam-uitlijning te parseren en bestanden te vormen met Hi-C-paren, (3) PCR-duplicaten te filteren en (4) geaggregeerde paren in binned matrices van Hi-C-interacties. Deze HDF5-geformatteerde matrices, koelers genaamd, kunnen vervolgens (1) worden bekeken op een HiGlass-server (https://higlass.io/) en (2) worden geanalyseerd met behulp van een grote set open source computationele tools die aanwezig zijn in de "cooltools" -collectie die wordt onderhouden door het Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) om vouwfuncties zoals compartimenten, TAD's en lussen te extraheren en te kwantificeren.

Sommige kwaliteitsindicatoren van de Hi-C3.0-bibliotheken kunnen onmiddellijk na het in kaart brengen van leesparen naar een referentiegenoom worden beoordeeld met behulp van een paar eenvoudige statistieken / indicatoren. Ten eerste kan typisch ~ 50% van de gesequencede leesparen uniek in kaart worden gebracht voor menselijke cellen. Vanwege de polymere aard van chromosomen vertegenwoordigen de meeste van deze in kaart gebrachte reads (~ 60% -90%) interacties binnen een chromosoom (cis), waarbij interactiefrequenties snel vervallen met toenemende genomische afstand (afstandsafhankelijk verval). Het afstandsafhankelijke verval kan het beste worden gevisualiseerd in een "scaling plot", die de contactkans (per chromosoomarm) toont als functie van de genomische afstand. We ontdekten dat het gebruik van verschillende crosslinkers en enzymen het afstandsafhankelijke verval op lange- en korteafstandsafstanden kan veranderen17. De toevoeging van DSG-crosslinking verhoogt de detecteerbaarheid van interacties op korte afstanden in combinatie met enzymen zoals Mnase en combinaties van DpnII-DdeI die kleinere fragmenten produceren (figuur 6A).

Afstandsafhankelijk verval kan ook rechtstreeks worden waargenomen vanuit 2D-interactiematrices: interacties worden zeldzamer wanneer ze zich verder van de centrale diagonaal bevinden (figuur 6B). Bovendien kunnen genomische vouwfuncties, zoals compartimenten, TAD's en lussen, worden geïdentificeerd uit Hi-C-matrices en schaalplots als afwijkingen van het algemene genoombrede gemiddelde afstandsafhankelijke verval. Belangrijk is dat crosslinking met DSG naast FA willekeurige ligaties vermindert, die onbeperkt zijn vanwege de polymeeraard van chromosomen en daarom waarschijnlijker voorkomen tussen chromosomen (in trans) (figuur 6C). Het verminderen van willekeurige ligatie leidt tot verhoogde signaal-ruisverhoudingen, vooral voor interchromosomale en zeer lange afstand (>10-50 Mb) intrachromosomale interacties.

Figure 6
Figuur 6: Representatieve resultaten van in kaart gebrachte en gefilterde Hi-C bibliotheken. (A) Schaalplots met contactkans en het derivaat daarvan voor verschillende enzymen, geordend op fragmentlengte (boven) en crosslinking met FA of FA + DSG (onder). Spijsvertering met MNAse (microC) of DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) verhoogt de korteafstandscontacten (boven) aanzienlijk, net als het toevoegen van DSG aan FA (onder). (B) Kolommen tonen Hi-C heatmaps van DpnII-vertering na alleen FA-crosslinking en DpnII- of DdeI-vertering na FA + DSG-crosslinking. Witte pijlen tonen een toenemende sterkte van "stippen" na DSG-crosslinking en DdeI-vertering, wat een betere detectie van DNA-lussen impliceert. Rijen tonen verschillende delen van chromosoom 3 met toenemende resolutie, uitgelijnd met paneel C: bovenste rij: volledig chromosoom 3 (0-198.295.559 Mb); middelste rij: 186-196 Mb; onderste rij: 191,0-191,5 Mb. (C) Dekkingsgrafieken voor de regio's afgebeeld in A. Zwarte pijlen tonen de lagere dekking (%cis reads) voor FA-only crosslinking. Afkortingen: FA = formaldehyde; DSG = disuccinimidylglutaraat; chr = chromosoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Niet alle in kaart gebrachte lezingen zijn nuttig. Een tweede kwaliteitsindicator is het aantal PCR-duplicaten. Het is zeer onwaarschijnlijk dat exacte dubbele aflezingen bij toeval optreden na ligatie en ultrasoonapparaat. Dergelijke metingen zijn dus waarschijnlijk het gevolg van PCR-versterking en moeten worden uitgefilterd. Duplicaten ontstaan vaak wanneer er te veel PCR-cycli nodig zijn om bibliotheken met een lage complexiteit te versterken. Over het algemeen hebben de meeste bibliotheken voor Hi-C slechts 5-8 cycli van uiteindelijke PCR-versterking nodig, zoals bepaald door titratie-PCR (zie stap 3.9; Figuur 4). Bibliotheken met voldoende complexiteit kunnen echter zelfs na 14 cycli pcr-versterking worden verkregen.

Een andere categorie duplicate reads, zogenaamde optische duplicaten, kan voortkomen uit het versterkingsproces op Illumina-sequencingplatforms die patroonstroomcellen gebruiken (zoals HiSeq4000). Optische duplicaten worden gevonden door ofwel de overbelasting van de stroomcel, waardoor (grote) clusters twee afzonderlijke clusters worden genoemd, of door lokale reclustering van het oorspronkelijke gepaarde eindmolecuul na een eerste ronde PCR. Omdat beide typen optische duplicaten lokaal zijn, kunnen ze worden geïdentificeerd en onderscheiden van PCR-duplicaten door hun locatie op de stroomcel. Terwijl bibliotheken met > 15% PCR-duplicaten moeten worden geregenereerd, kunnen bibliotheken met optische duplicaten opnieuw worden geladen na optimalisatie van het laadproces.

Aanvullende tabel S1: Buffers en oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Kritieke stappen voor celverwerking
Hoewel het mogelijk is om een lager aantal invoercellen te gebruiken, is dit protocol geoptimaliseerd voor ~ 5 × 106 cellen per sequencing lane (~ 400 M reads) om de juiste complexiteit na diepe sequencing te garanderen. Cellen kunnen het beste worden geteld voorafgaand aan fixatie. Voor het genereren van ultradeep bibliotheken vermenigvuldigen we over het algemeen het aantal lanes (en cellen) totdat de gewenste leesdiepte is bereikt. Voor een optimale fixatie moet serumhoudend medium vóór FA-fixatie worden vervangen door PBS en moeten fixatieve oplossingen onmiddellijk en zonder concentratiegradiënten15,22 worden toegevoegd. Voor het oogsten van cellen heeft schrapen de voorkeur boven trypsinisatie, omdat de overgang van een plattere naar een bolvorm na trypsinisatie de nucleaire conformatie kan beïnvloeden. Na de toevoeging van DSG gaan losse en klonterige celpellets gemakkelijk verloren. Wees voorzichtig bij het hanteren van cellen in dit stadium en voeg tot 0,05% BSA toe om klonteren te verminderen.

Wijzigingen in de methode
Dit protocol is ontwikkeld met behulp van menselijke cellen17. Maar op basis van ervaring met het vastleggen van chromosoomconformaties zou dit protocol voor de meeste eukaryote cellen moeten werken. Voor een significant lagere input (~1 × 106 cellen) adviseren wij de helft van de volumes te gebruiken voor de lysis- en conformatievangstprocedures [stappen 2.1-2.4]. Hierdoor zou DNA-isolatie [stap 2.5] ook kunnen worden uitgevoerd in een tafelcentrifuge met buizen van 1,7 ml, wat de pelletering voor lage DNA-concentraties zou kunnen verbeteren. De kwantificering van DNA (stap 2.6.6) geeft aan hoe verder te gaan. Voor lage hoeveelheden geïsoleerd DNA (1-5 μg) raden we aan de grootteselectie over te slaan (stap 3.3) en door te gaan met het verwijderen van biotine na het verminderen van het volume van 130 μL tot ~ 45 μL met een CFU.

Dit protocol is speciaal ontwikkeld om gegevens van hoge kwaliteit te garanderen na daaropvolgende crosslinking met FA en DSG en vertering met DpnII en DdeI. Alternatieve crosslinkingstrategieën zoals FA gevolgd door EGS (ethyleenglycol bis (succinimidylsuccinaat)), die ook wordt gebruikt in ChIP-seq23 en ChIA-PET24, kunnen echter even goed werken17. Evenzo kunnen verschillende enzymcombinaties, zoals DpnII en HinfI18 of MboI, MseI en NlaIII19 , worden gebruikt voor de spijsvertering. Wanneer u enzymcombinaties aanpast, moet u gebiotinyleerde nucleotiden gebruiken die de specifieke 5 'overhangen kunnen invullen en de meest optimale buffers voor elke cocktail kunnen gebruiken. DpnII wordt geleverd met een eigen buffer en de enzymfabrikant beveelt een specifieke buffer aan voor DdeI-vertering. Toch wordt voor de dubbele vertering met DpnII en DdeI in dit protocol restrictiebuffer aanbevolen omdat deze voor beide enzymen op 100% activiteit wordt beoordeeld.

Problemen met het vastleggen van conformaties oplossen
De drie belangrijkste stappen in het vastleggen van chromosoomconformatie: crosslinking, spijsvertering en religatie zijn allemaal uitgevoerd voordat de resultaten op gel kunnen worden gevisualiseerd. Om de kwaliteit van elk van deze drie stappen te bepalen en te onderscheiden waar problemen kunnen zijn ontstaan, worden aliquots voor (CI) en na de spijsvertering (DC) genomen en samen met het geligeerde Hi-C-monster op de gel geladen (figuur 2). Deze gel wordt gebruikt om de kwaliteit van het Hi-C-monster te bepalen en of het de moeite waard is om het protocol voort te zetten. Zonder het CI en DC is het moeilijk om potentiële suboptimale stap(en) aan te wijzen. Het is vermeldenswaard dat suboptimale ligatie te wijten kan zijn aan een probleem in de ligatie zelf, de invulling of een probleem met crosslinking. Om problemen met crosslinking op te lossen, moet u niet meer dan 1 × 107 cellen per bibliotheek gebruiken en beginnen met nieuwe crosslinking-reagentia en schone cellen (d.w.z. gespoeld met PBS). Zorg er voor ligatie voor dat cellen en ligatiemengsels op ijs worden gehouden. Voeg T4 DNA ligase toe vlak voor de 4 uur incubatie bij 16 °C en meng goed.

Problemen met bibliotheekvoorbereiding oplossen
Als er meer dan 10 PCR-cycli nodig zijn of als er geen PCR-product op gel te zien is na PCR-titratie (figuur 4), zijn er een paar opties om het Hi-C-monster op te slaan. Terugwerkend van de PCR-titratie, is de eerste optie om de PCR opnieuw te proberen. Als er nog steeds niet genoeg product is, is het mogelijk om nog een ronde A-tailing en adapterligatie (stap 3.6) te proberen na het tweemaal wassen van de kralen met 1x TLE-buffer. Na deze extra A-tailing en adapterligatie kan men overgaan tot de PCR-titratie zoals voorheen. Als er nog steeds geen product is, is de laatste optie om de 0,8x-fractie uit stap 3.3 te resoneren en van daaruit verder te gaan.

Beperkingen en voordelen van Hi-C3.0
Het is belangrijk om te beseffen dat Hi-C een populatie-gebaseerde methode is die de gemiddelde frequentie van interacties tussen paren loci in de celpopulatie vastlegt. Sommige computationele analyses zijn ontworpen om combinaties van conformaties van een populatie van25 te ontwarren, maar in principe is Hi-C blind voor verschillen tussen cellen. Hoewel het mogelijk is om eencellige Hi-C26,27 uit te voeren en computationele gevolgtrekkingen kunnen worden gemaakt28, is hi-c met één cel niet geschikt voor het verkrijgen van 3C-informatie met ultrahoge resolutie. Een extra beperking van Hi-C is dat het alleen paarsgewijze interacties detecteert. Om multicontactinteracties te detecteren, kan men frequente cutters gebruiken in combinatie met short-read sequencing (Illumina)16 of multicontact 3C29 of 4C30 uitvoeren, met behulp van long-read sequencing van PacBio- of Oxford Nanopore-platforms. Hi-C-derivaten om specifiek contacten tussen en langs zusterchromatiden te detecteren zijn ook ontwikkeld 31,32.

Hoewel Hi-C19 en Micro-C33 kunnen worden gebruikt om contactkaarten te genereren met subkilobase-resoluties, vereisen beide een grote hoeveelheid sequencing-reads en dit kan een kostbare onderneming worden. Om zonder de kosten tot een vergelijkbare of zelfs hogere resolutie te komen, kan verrijking voor specifieke genomische regio's (capture-C34) of specifieke eiwitinteracties (ChiA-PET35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37) worden toegepast. De kracht en het nadeel van deze verrijkingstoepassingen is dat slechts een beperkt aantal interacties wordt bemonsterd. Met dergelijke verrijkingen gaat het mondiale aspect van Hi-C (en de optie van wereldwijde normalisatie) verloren.

Belang en potentiële toepassingen van Hi-C3.0
Dit protocol is ontworpen om ultradeeps 3C met hoge resolutie mogelijk te maken en tegelijkertijd grootschalige vouwfuncties zoals TAD's en compartimenten17 te detecteren (figuur 6). Dit protocol begint met 5 × 106 cellen per buis voor elke Hi-C-bibliotheek, wat meer dan genoeg materiaal zou moeten zijn om een of twee banen op een stroomcel te sequencen om tot 1 miljard gepaarde eindwaarden te verkrijgen. Voor ultradeep sequencing moeten meerdere buizen van 5 × 106 cellen worden voorbereid, afhankelijk van het aantal toegewezen reads en PCR-duplicaten. Bij de hoogste resolutie (<1 kb) worden looping-interacties meestal gevonden tussen CTCF-sites, maar promotor-enhancer-interacties kunnen ook worden gedetecteerd. Lezers kunnen akgol Oksuz et al.17 raadplegen voor een gedetailleerde beschrijving van de data-analyse.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

We willen Denis Lafontaine bedanken voor de ontwikkeling van protocollen en Sergey Venev voor bio-informaticahulp. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program aan J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.

Dit artikel is onderworpen aan HHMI's Open Access to Publications beleid. HHMI-labhoofden hebben eerder een niet-exclusieve CC BY 4.0-licentie aan het publiek en een sublicentieerbare licentie aan HHMI verleend in hun onderzoeksartikelen. Op grond van deze licenties kan het door de auteur geaccepteerde manuscript van dit artikel onmiddellijk na publicatie vrij beschikbaar worden gesteld onder een CC BY 4.0-licentie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Ladder New England Biolabs N3232L
Agarose Invitrogen 16500100
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL Beckman Coulter A63881
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) EMD Millipore UFC500396
Annealing Buffer (5x) See recipe in supplemental materials
ATP 10 mM ThermoFisher R0441
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge Beckman Coulter
beckman ultracentrifuge tube 35 mL Beckman Coulter 357002
Binding Buffer (2x) See recipe in supplemental materials
biotin-14-dATP 0.4 mM Invitrogen 19524-016
BSA 10 mg/mL New England Biolabs B9000S dilute from 20 mg/mL
Cell scraper Falcon 353089
Cell scraper Corning 3008
Conical polypropylene tubes 50 mL Denville C1062-P
Conical tube 15 mL Denville C1017-P
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL Covaris 520045/520077
Covaris Sonicator Covaris E220/E220evolution/M220
Culture flask 175 cm2 Falcon 353112
Culture plates 150 mm x 25 mm Corning 430599
dATP 1 mM Invitrogen 56172
dATP 10 mM Invitrogen 56172
dCTP 10 mM Invitrogen 56173
DdeI New England Biolabs R0175L
dGTP 10 mM Invitrogen 56174
DMSO Sigma D2650-5x10ML
dNTP mix 25 mM Invitrogen 10297117
Dounce homogenizer DWK Life Sciences 8853010002/8853030002
DPBS Gibco 14190-144
DpnII New England Biolabs R0543M
DSG ThermoScientific 20593
dTTP 10 mM Invitrogen 56175
Ethanol 70% Fisher A409-4 Diluted from 100%
Ethidium Bromide Fisher BP1302-10
Formaldehyde (37%) Fisher BP531-500
Gel loading dye (6x ) New England Biolabs B7024S
Glycine in ultrapure water 2.5 M Sigma G8898-1KG
HBSS Gibco 14025-092
Igepal CA-630 detergent MP Biomedicals 198596
Klenow DNA polymerase 5 U/µL New England Biolabs M0210L
Klenow Fragment 3-->5’ exo-, 5 U/µL New England Biolabs M0212L
ligation buffer (10x) New England Biolabs B7203S
Liquid nitrogen
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL Eppendorf 22431021
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L
Lysis buffer See recipe in supplemental materials
Magnetic Particle separator ThermoFisher 12321D
Microfuge tubes 1.7 mL Axygen MCT-175-C
MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65001
NEBuffer 2.1 (10x) New England Biolabs B7002S
NEBuffer 3.1 (10x) New England Biolabs B7203S
PBS Gibco 70013-032
PCR (strip) tubes Biorad TBS0201/ TCS0803
PCR thermocycler Biorad T100
Pfu Ultra II Buffer (10x) Agilent Comes with Pfu Ultra
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase  Agilent 600674
Phase lock tube 15 mL Qiagen 129065
Phase lock tubes 2 mL Qiagen 129056
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol Invitrogen 15593-049
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher 78440
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL Invitrogen 25530-031
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5810R
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL Thermo Scientific EN0531
Rotator Argos technologies EW-04397-40 or rocking platform
SDS 1% Fisher BP13111
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M Sigma
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Biorad 1704401
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 100004817
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase 3 U/µL New England Biolabs M0203L
T4 ligation buffer (5x) Invitrogen Y90001
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL New England Biolabs M0201L
Tabletop centrifuge Eppendorf 5425
TBE buffer See recipe in supplemental materials
Tris Low EDTA Buffer (TLE) See recipe in supplemental materials
Triton X-100 (10%) Sigma 93443
Truseq adapter oligos Integrated DNA Technologies (IDT)) https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 250 nmole and HPLC purified
Tween 20 detergent Fisher 9005-64-5
Tween Wash Buffer See recipe in supplemental materials
Vortex Scientific Industries (G560)SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  2. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  3. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  4. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  5. Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
  6. Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling. Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).
  7. Hsieh, T. H., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  8. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  9. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  10. Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture. Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).
  11. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  12. Alipour, E., Marko, J. F. Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).
  13. Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines. Methods. 72, 65-75 (2015).
  14. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  15. Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time. Methods. 142, 47-58 (2018).
  16. Darrow, E. M., et al. Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).
  17. Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
  18. Ghuryeid, J., et al. Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly. PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).
  19. Gu, H., et al. Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not. bioRxiv. , (2021).
  20. Ramani, V., et al. Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C. Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).
  21. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
  22. Belton, J. -M. M., et al. Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  23. Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example. Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).
  24. Wang, P., et al. In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).
  25. Tjong, H., et al. Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).
  26. Nagano, T., et al. Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution. Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).
  27. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  28. Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data. Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).
  29. Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).
  30. Vermeulen, C., et al. Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies. Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).
  31. Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC. Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).
  32. Mitter, M., et al. Conformation of sister chromatids in the replicated human genome. Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).
  33. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  34. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
  35. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  36. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  37. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Tags

Genetica Chromosome conformation capture crosslinking restriction digestion chromatine loops dots topologically associating domains compartmentalization
Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker,… More

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker, J., Gibcus, J. H. Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales. J. Vis. Exp. (191), e64001, doi:10.3791/64001 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter