Summary
Her præsenterer vi en protokol for signifikant at reducere mitokondrie-DNA-kopinumrene i en bovin oocyt (P < 0,0001). Denne metode anvender centrifugering og bisektion til væsentligt at reducere oocyt mitokondrier og kan give mulighed for en øget chance for udvikling i de rekonstruerede interspecies somatiske celle nukleare overførselsembryoner.
Abstract
Interspecies somatisk celle nuklear overførsel (iSCNT) kan bruges til at redde truede arter, men der findes to forskellige populationer af mitokondrie-DNA (mtDNA) i det rekonstruerede embryo: en inden for recipient-ooplasmaet og en inden for donorens somatiske celle. Denne mitokondrie heteroplasma kan føre til udviklingsproblemer i embryoet og fosteret. Håndlavede kloningsprotokoller inkluderer oocytbisektion, som kan bruges til at reducere mtDNA-kopinummeret, hvilket reducerer graden af mitokondrie-heteroplasma i et rekonstrueret embryo. Centrifugering af denuderede, modne bovinoocytter frembragte en synlig mitokondri-tæt fraktion ved en pol af oocyten. Oocytternes zonae pellucidae blev fjernet ved eksponering for en pronaseopløsning. Bisection blev udført ved hjælp af en mikroblade for at fjerne den synlige mitokondrierfraktion. qPCR blev brugt til at kvantificere mtDNA til stede i DNA-prøver ekstraheret fra hele oocytter og gennemskårne ooplaster, hvilket giver en sammenligning af mtDNA-kopinumre før og efter bisektion. Kopinumre blev beregnet ved hjælp af cyklustærskelværdier, en standardkurves regressionslinjeformel og et forhold, der omfattede de respektive størrelser af mtDNA PCR-produkter og genomiske PCR-produkter. En kvægoocyt havde et gennemsnitligt mtDNA-kopinummer (± standardafvigelse) på 137.904 ± 94.768 (n = 38). En mitokondrier-udtømt ooplast havde et gennemsnitligt mtDNA-kopinummer på 8.442 ± 13.806 (n = 33). Gennemsnitlige mtDNA-kopier til stede i en mitokondri-rig ooplast var 79.390 ± 58.526 mtDNA-kopier (n = 28). Forskellene mellem disse beregnede gennemsnit indikerer, at centrifugeringen og den efterfølgende bisektion signifikant kan reducere mtDNA-kopinumrene, der er til stede i den mitokondri-udtømte ooplast sammenlignet med den oprindelige oocyt (P < 0,0001, bestemt af envejs ANOVA). Reduktionen i mtDNA bør nedsætte graden af mitokondrieheteroplasma i et rekonstrueret embryon, hvilket muligvis fremmer standard embryonal og føtal udvikling. Tilskud med mitokondrieekstrakt fra den somatiske donorcelle kan også være afgørende for at opnå en vellykket embryonal udvikling.
Introduction
Somatisk cellekerneoverførsel (SCNT) omfatter fusion af en enukleeret oocyt fra et dyr og en somatisk celle fra et dyr af samme art. I de fleste tilfælde stammer oocyten og den somatiske celle fra samme art, og levende fødselsrater er under 6%1. Nogle undersøgelser involverer brugen af interspecies SCNT (iSCNT), som omfatter fusion af en somatisk celle og oocyt, der stammer fra to forskellige arter. I disse undersøgelser er levende fødselsrater endnu lavere end i SCNT - typisk mindre end 1%1. iSCNT har imidlertid kapacitet til at blive brugt som en metode til redning af truede arter, da somatiske celler fra disse dyr er mere tilgængelige end deres kimceller1. Modtageroocytter, der anvendes i iSCNT, er ofte indenlandske eller almindelige laboratoriearter, såsom køer, svin og mus. Nogle forsøg hidtil har med succes produceret levende unger, selvom de producerede afkom har været intrageneriske dyr (recipient-oocytarterne og donorcellearterne var medlemmer af samme slægt)2,3,4. Intergeneriske modeller (som anvender en oocyt og somatisk celle fra dyr i forskellige slægter) har endnu ikke produceret levende dyr, og størstedelen af rekonstruerede embryoner arresteres på 8-16 cellestadiet af in vitro-udvikling 5,6,7,8. En mulig forklaring på denne embryonale udviklingsstop er forekomsten af mitokondrieheteroplasma i embryonerne - tilstedeværelsen af mere end en mitokondri-DNA-type (mtDNA) i en enkelt celle. Heteroplasma kan føre til problemer som udviklingsmæssig ineffektivitet eller svigt i embryoet eller i det levende dyr1. Patogenese kan også forekomme senere i dyrets levetid9. Selvom dette problem også er til stede i SCNT-afkom, forværrer den interspecifikke komponent i iSCNT-embryoner problemet.
Når den embryonale mtDNA kommer fra to forskellige arter, fungerer recipienten oocyt mitokondrier, som repræsenterer flertallet, ikke effektivt med donorcellens kerne 1,10. Større taksonomiske huller mellem de to arter, der anvendes i iSCNT, intensiverer sandsynligvis dette problem; intrageneriske levende afkom produceret (Bos gaurus og Bos indicus afkom ved hjælp af Bos taurus oocytter) samt afkom produceret via traditionel SCNT (f.eks. Ovis aries afkom ved hjælp af Ovis aries oocytter) viste sig at være kimærer (mtDNA fra to individer var til stede i disse dyr 11,12,13). Alligevel udviklede de sig meget længere end de intergeneriske SCNT-embryoner 14,15. Udvekslingen af oplysninger mellem oocyt mitokondrierne og donorcellens kerne kan være mere vellykket i det intrageneriske embryo end i det intergeneriske embryo16.
Mængden af mtDNA i en moden bovin oocyt er ca. 100 gange større end den mængde, der findes i en somatisk celle12. Reduktion af dette forhold kan tilskynde de somatiske celle mitokondrier til at sprede sig i det rekonstruerede embryo, hvilket gør det muligt for en større population af produktive mitokondrier at være til stede16. Dette kan igen give mere energi til at opfylde kravene i det udviklende embryo15. Tidligere forsøg på at reducere mtDNA-kopinummeret af oocyten eller embryoet inkluderer kemisk anvendelse, mikromanipulation og supplering af oocyten eller embryoet med yderligere mitokondrier fra donorcellearten 16,17,18,19,20. Imidlertid er kemisk anvendelse (såsom 2',3'-dideoxycytidin) ikke ideel til embryonal udvikling og har reduceret oocyt mtDNA-kopinumre med ca. halvdelen18. Tidligere oocyt mtDNA reduktion ved mikromanipulation har kun fjernet et gennemsnit på 64% af oocytens mtDNA17. Selvom tilskud af donorcelle mitokondrier kunne være en levedygtig mulighed, har dets anvendelse endnu ikke produceret et levende intergenerisk dyr inden for iSCNT-undersøgelser21.
Brugen af bisection til at reducere oocyt mtDNA kopi nummer er endnu ikke blevet brugt i offentliggjorte undersøgelser. Bisecting oocytter med det formål at fusionere ooplasterne med en somatisk celle er forudsætningen for håndlavet kloning (HMC), som typisk bruger bisection som metode til at fjerne polarlegemet og metafasepladen fra metafase II (MII) oocyten. HMC har med succes produceret afkom i flere arter, herunder geder, kvæg, svin, får og heste 22,23,24,25,26, men inkluderer typisk ikke et centrifugeringstrin før bisektion. Integrering af højhastighedscentrifugering af oocyten muliggør isolering af mitokondrier (og derfor mtDNA) ved en pol af oocyten, som derefter kan gennemskæres ved hjælp af et mikroblad for at fjerne disse mitokondri-tætte fraktioner. To mitokondrier-udtømte ooplaster kan derefter smeltes sammen med en somatisk celle, som det er tilfældet i HMC, for at danne et rekonstrueret embryo, der indeholder betydeligt mindre mtDNA fra oocytarterne.
Det spørgsmål, vi forsøger at besvare med denne protokol, er, hvordan man reducerer mtDNA i kvægoocyten for at producere et levedygtigt rekonstrueret embryo, der indeholder mindre heteroplasmisk mtDNA. I denne protokol blev oocytter centrifugeret og gennemskåret. Ooplast og intakte oocyt mtDNA-kopinumre blev beregnet for at bestemme effektiviteten af denne teknik til at reducere kvægoocytens mtDNA-kopinummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol følger retningslinjerne for dyrepleje og etik fra Utah State University.
1. Forberedelse af medier
- Før håndtering af oocyt fremstilles følgende opløsninger som beskrevet i tabel 1: 400 μL Hyaluronidase-opløsning, 500 μL T2-medier, 1.020 μL T20-medier og 800 μL T10-medier.
- Opdel T10-mediet i to brønde af en fire-brøndplade, 400 μL pr. Brønd. Mærk en brønd med "M" og den anden brønd med "MR". Anbring i en 5% CO2 inkubator indtil efter bisection.
- Forbered 500 μL cytochalasin B (CB)/syntetisk oviduktal væske med HEPES (HSOF). Aliquot 50 μL CB/HSOF-opløsning i et separat 1,5 ml centrifugerør.
- Forbered 40 μL Pronase-opløsning. Centrifuge i mindst 30 s ved 2.680 x g. 20 μL supernatanten blandes med 20 μL T2 til et nyt centrifugeglas. dette danner en fortyndet 5 mg/ml pronaseopløsning.
- Forbered 3 ml HSOF. På en søgeplade skal du separat deponere fire 400 μL dråber; placer denne plade under et stereomikroskop.
- Der fremstilles 500 μL CB/T20 opløsning.
2. In vitro-modning (IVM) af bovin oocytter
- IVM: Dyrkningssugede cumulus-oocytkomplekser (COC'er) ved 38,5 ° C i en 5% CO2-inkubator i 21 timer i en fire-brønds skål med modningsmedier indeholdende 10% FBS, 0,26 IE / ml FSH og 100 U / ml penicillin / streptomycin.
- Udfør følgende trin for at denude oocytterne.
- Det ønskede antal COC'er opsamles ved hjælp af en 200 μL pipette, og dem anbringes i bunden af et 1,5 μL centrifugerør.
- Der tilsættes det samme volumen på 0,6 mg/ml hyaluronidase til centrifugerøret med oocytterne (dvs. hvis volumenet af oocytter og IVM-medier er 100 μL, tilsættes 100 μL hyaluronidase).
- Pipetter opløsningen op og ned uden at skabe bobler, indtil alle cumuluscellerne er fjernet.
- Kontroller modningen af oocytterne.
- Pipetten anvendes til at tilsætte 200 μL HSOF fra en af de fire HSOF-dråber på søgepladen til oocyt-/hyaluronidaseopløsningen.
- Overfør oocytterne fra hyaluronidase / HSOF-dråben og læg dem i ubrugt 400 μL HSOF-dråbe. Vask dem med to ekstra HSOF-dråber for at hjælpe med at fjerne hyaluronidase og cumulus cellerester.
- Brug en mundpipette (eller en 10 μL pipette og spids) og høj mikroskopisk forstørrelse, rul og vælg oocytterne baseret på polær kropstilstedeværelse.
- Efter sortering af oocytterne opsamles det ønskede antal MII-oocytter, der skal gennemskæres, og placeres i 400 μL HSOF-dråbe.
BEMÆRK: Hvis oocytterne har været uden for inkubatoren i mere end 30 minutter, kan oocytter placeres tilbage i en brønd med modningsmedier og anbringes i en CO2-kontrolleret inkubator for at hvile i mindst 30 minutter. Begræns antallet af oocytter, der skal gennemskæres, til en mængde, der er mulig for at afslutte skæring på ca. 30 minutter for at minimere tiden uden for inkubation. Hvis ooplaster skal smeltes sammen med en somatisk celle, aktiveres og dyrkes som embryoner, skal oocytter enukleres på dette tidspunkt.
3. Centrifugering af oocytterne
BEMÆRK: Hvis oocytter blev anbragt i inkubatoren i modningsmedier, skal du flytte dem til HSOF-dråben, hvorfra de senest blev indsamlet.
- Ved hjælp af en mundpipette opsamles de udvalgte modne oocytter fra HSOF-dråben, og de anbringes i 1,5 ml-røret indeholdende 50 μL HSOF/CB-opløsningen. Oocytterne centrifugeres ved 15.000 x g i 12 min.
BEMÆRK: Det er ikke skadeligt for bobler at være til stede i centrifugerøret. - Mens oocytterne centrifugeres, skal du forberede bisesektionspladen.
- Lav mønsteret som vist i figur 1 på låget af en 60 mm petriskål (20 μL pr. Dråbe), og dæk dråberne helt med mineralolie.
- Brug en tyndspidset markør til at markere linjerne under skålen, som vist i figur 2.
- Tegn en kasse rundt om pronasefaldet og en linje mellem CB /T20-dråberne og den nederste række af T20-dråber.
- Dæk fadet med et uigennemsigtigt låg, indtil centrifugeringen er afsluttet for at forhindre osmolaritetsændringer af mikrodråber.
- Så snart centrifugeringen er afsluttet, skal du bruge en 200 μL pipette til at opsamle oocytterne i opløsningen og flytte dem ind i en tom del af en ny søgeplade med fire 400 μL HSOF-dråber.
- Saml og vask oocytterne gennem de fire HSOF-dråber.
Figur 1: Bissektion plade. Alle viste dråber har et volumen på 20 μL. Pladen har en diameter på 60 mm. Dråber er blevet helt dækket med mineralolie. Oocytter placeres først i den øverste og venstre T2-dråbe (angivet her med en stjerne). PRO/T2: 10 μL pronas og 10 μL T2, kombineret før der dannes mikrodråber. CB / T20: 1 μL cytochalasin B pr. 1 ml T20, kombineret inden der dannes mikrodråber. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Markeret bisection plade. Linjer er tegnet med en tyndspidset markør på bunden af pladen for at give placeringsreferencer til observationer og oocyt- og ooplastoverførsler foretaget under mikroskopet. Oocytter placeres først i den øverste og venstre T2-dråbe (angivet her med en stjerne). Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Forberedelse af oocyten til bisection
BEMÆRK: Følgende proces involverer fremstilling af oocytterne til bisektion.
- Tænd varmetrinnet til 37 °C.
- Brug en mundpipette til at flytte de centrifugerede oocytter fra HSOF-dråben til den øverste venstre T2-dråbe af bisektionspladen, og vask derefter oocytterne gennem de næste tre dråber på øverste række (T2, T20, T20).
- Indbetal oocytterne i en af pronasedråberne, hvilket sikrer, at der er ringe eller ingen kontakt mellem dem.
BEMÆRK: Fjernelsen af zona pellucida kan tage varierende tid, men sker typisk mellem 30-120 s ved brug af et opvarmningstrin. Fraværet af et opvarmningsstadium vil forlænge denne gang. - Overhold oocytterne, indtil der er klar deformation af zonae pellucidae (se figur 3).
- Når en enkelt oocyt zona pellucida er blevet deformeret, skal du flytte den oocyt til den nærliggende T2-dråbe. Gentag, når yderligere oocytter deformeres, indtil alle oocytter er fjernet fra pronasen og anbragt i T2-dråben.
- Overhold oocytterne, indtil kun et tyndt lag af zonen pellucida forbliver.
- Oocytterne vaskes gennem de næste tre dråber i rækken (T2, T20, T20), og de anbringes derefter i lodrette linjer i CB/T20-dråberne (se figur 4).
- Begynd med færre oocytter i de lodrette linjer og øg antallet af oocytter pr. Dråbe, efterhånden som bisektionsfærdigheder skrider frem.
Figur 3: Fjernelse af zona pellucida ved hjælp af pronase. (80x) En oocyt zona pellucida vil begynde at virke deformeret, når pronasen har påvirket zona pellucida nok til, at oocyten kan flyttes til den tilstødende T2-dråbe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Oocytorientering i bisektionsdråber. (80x) Zona-frie oocytter deponeres i en næsten lodret orientering inden for hver CB / T20-dråbe før bisektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Bissektion af oocytterne
- Fokuser på den første, venstre CB / T20 (bisection) dråbe, der indeholder oocytter, og brug en mundpipette til at rotere oocytterne, så den mitokondri-tætte del af hver oocyt enten vender mod eller væk fra mikroskopets arm.
BEMÆRK: Den mitokondri-tætte del vil ikke indeholde lipider, der fremstår som den mørkeste del af oocyten efter centrifugering. - Hvil spidsen af mikrobladet til venstre for den øverste oocyt, på linje med rummet direkte over den mitokondri-tætte del. Hold spidsen af bladet på samme sted, sænk forsigtigt bladet for at skære hele vejen gennem oocyten.
- Sørg for, at den mitokondri-tætte ooplast og mitokondriereducerede ooplast er ens i størrelse; bisection bør skære hver oocyt i halvdelen for at producere to ooplaster.
BEMÆRK: Sammenlignende størrelser af ooplaster fremstillet af en enkelt oocyt kan variere baseret på forskningsmål; hvis mitokondriereducerede ooplaster skal smeltes sammen med en somatisk celle, skal deres volumen være større end de mitokondri-tætte ooplaster«. - Sørg for, at bladet skærer oocyten over den mitokondri-tætte del og under den lipidtætte del i det klareste segment af den centrifugerede oocyt.
- Sørg for, at den mitokondri-tætte ooplast og mitokondriereducerede ooplast er ens i størrelse; bisection bør skære hver oocyt i halvdelen for at producere to ooplaster.
- Når du løfter bladet, skal du sikre dig, at den samme linje opretholdes, og at spidsen af bladet forbliver på samme sted, og løft derefter forsigtigt spidsen fra pladen.
- Gentag bisektionstrin for alle oocytter inden for den første bisection drop. Hvis oocytter er til stede i yderligere dråber, skal du orientere og skære de resterende oocytter.
- Brug en mundpipette til at samle mitokondriereducerede ooplaster fra den første bisection drop. Placer dem i venstre T20-dråbe placeret i nederste række af pladen. Gentag for alle resterende bisection dråber.
BEMÆRK: Mitokondriereducerede ooplaster vil indeholde lipider, der er mørkere i farven end resten af oocyten. - Brug en mundpipette til at samle mitokondri-tætte ooplaster fra den første bisection drop. Placer dem i den højre T20-dråbe placeret i nederste række af pladen. Gentag for alle resterende bisection dråber.
BEMÆRK: Mitokondrier-tætte regioner vil have en synlig konglomeration af organeller, der vil være lysegrå i udseende. - Hent T10 fire-brønd skålen fra inkubatoren. Brug en mundpipette til at flytte alle mitokondriereducerede ooplaster til det godt mærkede "MR" og flyt de mitokondri-tætte ooplaster til brønden mærket "M".
- Placer pladen med fire brønde tilbage i den CO2-styrede inkubator. Lad ooplaster hvile i mindst 30 minutter før kvantificering af mtDNA.
6. Kvantificering af mtDNA
- Brug et DNA-ekstraktionssæt designet til at ekstrahere materiale fra en lille prøve til at ekstrahere DNA fra individuelle prøver (enkeltoocytter, enkelt mitokondrier-tætte ooplaster, enkelt mitokondrier-udtømte ooplaster).
- Brug en DNA-kvantificeringsmetode efter eget valg for at sikre, at DNA blev ekstraheret med succes fra hver prøve. Hvis kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) ikke vil blive afsluttet på det tidspunkt, skal det ekstraherede DNA fryses i et mærket rør i en -80 ° C fryser.
- Udfør qPCR
- Se tabel 2 for at bestemme volumenet af hvert reagens, der skal tilsættes til hvert qPCR-rør sammen med primersekvenserne. Disse primere er designet til at forstærke 12S-regionen af kvæg mtDNA.
- Den indledende denatureringstid indstilles til 10 minutter efterfulgt af 35 cyklusser på: 30 s denaturering ved 94 °C, 15 s glødning ved 60 °C og 15 s forlængelse ved 72 °C. Når reaktionen er fuldført, registreres cyklustærskelværdierne (Ct).
BEMÆRK: For at opnå relative mtDNA-kopinummerværdier skal der fremstilles en standardkurve ved hjælp af prøver med kendte mængder mtDNA-kopinumre, der stiger eksponentielt. Cyklustærskelværdierne skal derefter manipuleres ved hjælp af følgende formler for at bestemme relative mtDNA-kopinumre. - Opnå koncentrationen af DNA'et ved hjælp af nedenstående ligning:
Koncentration af DNA = (10 (Ct-skæringspunkt/hældning)) x testet volumen - Få kopinummeret ved hjælp af nedenstående ligning:
Kopi nummer =
- Få kopinummeret ved hjælp af nedenstående ligning:
Kopinummer pr. celle = 2 x
Figur 5: Somatisk celle mtDNA standardkurve. Denne standardkurve blev skabt gennem mtDNA-kvantificeringen af logaritmiske koncentrationer af bovine somatiske celler ved anvendelse af qPCR-reagenserne og -programmet som beskrevet i protokoltrin 6.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantitative PCR (qPCR) resultater anvendes til at bestemme de relative mængder mtDNA til stede i hver ooplast. Den beskrevne reaktion er designet til at forstærke 12S-regionen af bovin mtDNA.
Hvis bisektionen var vellykket, vil prøverne fra hele oocytter og mitokondri-tætte ooplaster have lignende Ct-værdier . Prøverne fra mitokondriereducerede ooplaster vil have højere Ct-værdier sammenlignet med prøverne fra de to andre grupper. En Ct graf , der viser vellykkede bisection resultater er vist nedenfor. Disse resultater indikerer, at bisektion effektivt reducerede mtDNA-indholdet i de mitokondriereducerede ooplaster (figur 6).
Figur 6: Succesfulde bisection qPCR resultater. Grafsammenligning af cyklusnummer og fluorescens viser cyklustærskelværdier for enkeltoocytter, mitokondriereducerede ooplaster (repræsenteret af lilla linjer) og mitokondri-tætte ooplaster. Ct-værdierne for mitokondriereducerede ooplaster har et gennemsnit på 29.931 (lilla linjer), mens den gennemsnitlige Ct-værdi af de enkelte oocytter er 20.802 (røde og grønne linjer), og den gennemsnitlige Ct-værdi af de mitokondri-tætte ooplaster er 21.389 (blå og guldlinjer). De øgede Ct-værdier for de mitokondriereducerede ooplastprøver indikerer et fald i mtDNA-kopinummer inden for disse prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
En Ct-graf , der viser mislykkede bisektionsresultater, er vist i figur 7. Disse resultater indikerer, at bisektion ikke effektivt reducerede mtDNA-indholdet i de mitokondriereducerede ooplaster:
Figur 7: Mislykkede bisection qPCR-resultater. Linjegraf, der sammenligner cyklusnummer og fluorescens, viser cyklustærskelværdier for enkelte oocytter (mørkegrønne og lysegrønne linjer), mitokondriereducerede ooplaster (lilla linjer) og mitokondri-tætte ooplaster (blå og gyldne linjer), som alle har Ct-værdier inden for området 20.232-20.757. Dette indikerer fraværet af en signifikant ændring i mtDNA-kopinummer i de mitokondriereducerede ooplastprøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter udarbejdelsen af en standardkurve og anvendelse af de medfølgende mtDNA-kopinummerformler er der opnået en gennemsnitlig oocyt mtDNA-reduktion på 93,88% ved hjælp af denne protokol (figur 8).
Figur 8: Boxplot sammenligning af relative mitokondrie DNA-kopinumre opnået fra hele oocytter, mitokondriereducerede ooplaster og mitokondri-tætte ooplaster. Hele oocytter (n = 38), mitokondriereducerede ooplaster (n = 34) og mitokondri-tætte ooplaster (n = 29). Mitokondriereducerede ooplaster har signifikant færre kopital sammenlignet med de to andre grupper (P < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning | Samlet volumen | Opløsningsmiddel | Opløst stof |
| Hyaluronidase opløsning | 400 μL | 1 ml M-199 | 0,6 mg Hyaluronidase |
| T2 Medier | 500 μL | M-199 | 2% Føtalt kvægserum (v/v) |
| T20 Medier | 1020 μL | M-199 | 20% Føtalt kvægserum (v/v) |
| T10 Medier | 800 μL | 400 μL T2 | 400 μL T20 |
| Cb/HSOF | 500 μL | 499,5 μL syntetisk oviduktal væske med HEPES (HSOF) | 0,5 μL 10 mg/ml cytochalasin B (CB) |
| Pronase-løsning | 40 μL | 1 ml M-199 | 10 mg pronase |
| T20/CB | 500 μL | 499,5 μL T20 | 0,5 μL 10 mg/ml CB |
Tabel 1: Nødvendige løsninger. Giver mængder opløste stoffer og opløsningsmidler for hver opløsning, der kræves i protokollen.
| Reagens | Lydstyrke |
| qPCR master mix | 10 μL |
| Fremadgående primer | 0,6 μL |
| Omvendt primer | 0,6 μL |
| DNA-prøve | 4,4 μL |
| DNase-frit vand | 4,4 μL |
| Samlet volumen | 20 μL |
| Fremadgående primer GGGCTACATTCTCTACACCAAG | |
| Omvendt primer GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | |
Tabel 2: Kvantitativ PCR-sammensætning. Giver fremadgående og omvendte primersekvenser og volumener af alle reagenser, der er nødvendige for hvert kvantitativt PCR-rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder, der tidligere blev brugt til at reducere mtDNA-kopinumre i oocytter, har deres respektive ulemper. Mikromanipulationsbaseret fjernelse af mitokondrier fra oocytter reducerer mtDNA-kopinumre med et gennemsnit på 64%27. En unik metode, der tidligere blev brugt til enukleation, involverer anvendelse af Pasteur-pipetter med lille diameter og opdeling af en zona pellucida-fri oocyt ved grænsen mellem en mikrodråbe af medier og den omgivende mineralolie. Sammen med brugen af oocytcentrifugering kunne denne tilgang producere levedygtige mitokondriereducerede ooplaster28. Imidlertid er kombinationen af centrifugering og denne oocytopdelingsmetode endnu ikke rapporteret at producere embryoner. Kemiske mitokondrierreduktionsmetoder (såsom eksponering af oocytter for 2′,3′-dideoxycytidin (ddC), en mtDNA-syntesehæmmer) har reduceret antallet af oocyt mtDNA-kopier med op til 50% og kræver, at COC'er udsættes for kemikaliet i over 40 timer under in vitro-modning (IVM)16,27. Selv om inkubation af svineoocytter i et ddC-suppleret medie i 40 timer ikke har givet problemer for de rekonstruerede embryoner16, er der endnu ikke offentliggjort data vedrørende eksponeringen af kvægoocytter for ddC under deres 20-22 h IVM eller nogen efterfølgende embryonal udvikling. Metoden beskrevet i dette papir reducerer det relative mtDNA-kopinummer med ca. 93.88%, fra et gennemsnit på 45.565 ± 37.169 eksemplarer (gennemsnitlig ± SD) til 8.396 ± 13.287.
Flere trin i protokollen er afgørende for at opnå tilfredsstillende resultater med hensyn til effektivt at reducere mitokondriernes DNA (mtDNA) kopinummer af en oocyt. Centrifugering af oocytterne ved den optimerede hastighed (15.000 x g) og tid (12 min) vil skabe en mere koncentreret mitokondrifraktion ved en pol af hver oocyt. Det korrekte volumen af Cytochalasin B / Syntetisk Oviduktal væske med HEPES (CB / HSOF) opløsning (50 μL) vil sandsynligvis eliminere oocytlysis på grund af centrifugering. Efter centrifugering fjernes zona pellucida (ZP) ved udsættelse for en pronaseopløsning; fuldstændig fjernelse af ZP vil sikre mere præcis bisection og bør også adskille eventuelle resterende cumulusceller fra oocytterne. Brug af et opvarmningstrin på mikroskopet under fjernelse af ZP er valgfri, men fremskynder ZP-fjernelse med mindst 1 min. Orienteringen af zona pellucida-fri (ZF) oocytter i bisection dråber er afgørende for at skære dem nøjagtigt. Mitokondriefraktionen, der findes ved en pol af hver oocyt, skal være tydeligt synlig og placeret enten øverst eller nederst på oocyten før bisection. Den modsatte pol vil indeholde mørke lipiddråber. Efter bisection er udvælgelse og korrekt klassificering af ooplasterne (som mitokondri-tætte eller mitokondrier-udtømte) afgørende for at opnå en nøjagtig vurdering af bisektionen. Det er også vigtigt at vælge, hvilke metafase II (MII) oocytter der skal skæres. Sikring af, at de anvendte oocytter er sfæriske og har homogen cytoplasma, vil sandsynligvis gøre en forskel i mtDNA-kopinumrene indeholdt i hver oocyt og ooplast. Ved design og syntetisering af individuelle kvantitative polymerasekædereaktioner (qPCR) er det vigtigt at sikre, at de korrekte primere og reagenskoncentrationer anvendes i hver reaktion for at opnå nøjagtige resultater. Skal der produceres en standardkurve, skal den oprettes så præcist som muligt, og alle reaktioner skal udføres i tre eksemplarer for at opnå større nøjagtighed. Tiderne og temperaturerne for hver qPCR-fase skal forblive de samme for hver kørsel.
Nogle problemer kan opstå, mens du følger protokollen. Når du tilføjer olie til bisesektionspladen, skal du sikre dig, at dråberne lige er dækket; for meget olie vil gøre pipettebrug mindre effektiv, mens for lidt vil føre til fordampning af dråber. Denne fordampning ville medføre en ændring i opløsningernes osmolaritet, hvilket kan være skadeligt for oocytterne og ooplasterne. Hvis oocytterne lyser efter fordøjelsen af ZP, skyldes dette sandsynligvis et eller begge af følgende, baseret på personlig erfaring og observation: oocytterne blev ikke centrifugeret i den foreskrevne tid og hastighed, og / eller oocytterne blev udsat for pronase for længe. Nogle ZF-oocytter genvinder muligvis ikke en fuldstændig sfærisk form i bisektionsdråberne. Husk, at ikke alle ZF-oocytter vil kunne placeres optimalt til bisektion. I dette tilfælde er der tre muligheder: Giv ZF-oocytterne ekstra tid til at genvinde en sfærisk form; hold forsigtigt oocytter i en mere opretstående position med mikrobladet inden bisektion; skær ikke oocytter, der ikke kan placeres korrekt. Bestemmelse af, hvilke ooplaster der er mitokondri-tætte eller mitokondrier-udtømte efter bisektion, vil påvirke kvantificeringsresultaterne. Hvis det er vanskeligt at klassificere ooplasterne, skal du placere de oocytter, der vil blive gennemskåret, så mitokondrifraktionen enten altid peger mod toppen eller bunden af dråben og / eller kigge efter en mørk del af oocyten ved en af dens poler (disse lipiddråber er koncentreret ved den modsatte pol fra mitokondriefraktionen). Til tider kan ooplaster klæbe til hinanden og / eller indrykningen foretaget af mikrobladet i pladen. Nogle gange vil det hjælpe med adskillelse at give ooplasterne ekstra tid til at genvinde en sfærisk form. Andre muligheder omfatter forsigtigt at banke på pladen, suge dem forsigtigt ind og ud af pipetten og/eller bruge pipettens kant til forsigtigt at adskille øreplasterne.
Denne mtDNA-metode til reduktion af kopinumre har sine begrænsninger; den ene er baseret på oocytkilde, og den anden skyldes fjernelsen af ZP fra oocyten. Oocytkilde (dyret selv, den specifikke æggestok og den specifikke follikel) vil i høj grad påvirke mtDNA-kopinumrene inden for den specifikke oocyt. Der er en stor standardafvigelse omkring det gennemsnitlige mtDNA-kopinummer for en enkelt oocyt, hvilket indikerer, hvor variabel kopinummeret kan være. Mange enkelt oocytkvantificeringsreaktioner skal have et robust enkelt oocytstandardkopinummer, der sammenlignes med ooplaster og andre oocytter. Den betydelige standardafvigelse gør også sammenligningen af ooplast med oocyt mindre absolut, da ooplastens kopinummer ikke kan sammenlignes med dets oprindelsesoocyt.
Fordøjelsen af oocytens zonae pellucidae gør den resulterende ZF oocyt og ooplaster meget mere skrøbelige, end de var før fjernelsen af deres zonae pellucidae. Denne skrøbelighed fører til højere lysishastigheder af ooplaster og ZF-oocytterne selv, især ved brug af en mikroblade - en stor mængde omhu og præcision skal anvendes. Skal ooplasterne bruges til fusion, kræver de hvile efter bisection, før fusion kan forsøges. Ellers vil mange af ooplasterne sandsynligvis lyse. De mitokondrier-udtømte ooplaster har tendens til at være mere sarte end deres mitokondrier-tætte modstykker. Oocytens mikrotubuli har tendens til at migrere med mitokondrierne til den samme pol af oocyten under centrifugering, hvilket efterlader de mitokondrier-udtømte ooplaster med færre strukturelle komponenter29. Yderligere forskning og farvning er nødvendig for at afgøre, om andre oocytorganeller påvirkes negativt af kombinationen af centrifugering og bisektion, der anvendes til fremstilling af ooplaster i denne protokol.
Reduktionen i oocyt mitokondrier ville reducere oocytarternes mitokondrier i et resulterende iSCNT-embryo og dermed mindske forekomsten af mitokondrier heteroplasma i det rekonstruerede embryo. Embryoets chancer for udvikling ville stige relativt, men ville sandsynligvis kræve tilskud af mitokondrier fra donorcellearten for at opfylde energibehovet under udviklingen. Hidtil har iSCNT-forsøg, der har brugt intergeneriske kryds, ikke produceret levende afkom. Faldende heteroplasma i iSCNT-embryoner kan øge sandsynligheden for vellykkede graviditeter. iSCNT er en metode, der kan hjælpe med at redde nogle af de 40.000 arter, der er klassificeret som truede30. Da somatiske celler fra disse arter typisk er mere tilgængelige end deres kimceller, kan iSCNT udnytte disse somatiske celler sammen med oocytter fra indenlandske arter. Intrageneriske forsøg har haft succes med at producere levende dyr 31,32,33, selvom afkomene typisk er kimære for mtDNA, og det er ikke altid muligt at finde en intragenerisk oocytkilde. Bissektion af oocytter med det formål at reducere mtDNA-kopinumre efterfulgt af fusion af disse ooplaster med en interspecifik somatisk celle ville reducere chimerisme og heteroplasma i iSCNT-embryonerne. På grund af disse reduktioner giver brugen af den beskrevne metode mulighed for et større potentiale for intergeneriske levendefødte og fortsættelse af truede arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke deres kolleger ved Utah State University, reproduktive videnskabsforskere ved San Diego Zoo og Dr. Rebecca Krisher ved Genus PLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
