Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att avsevärt minska antalet mitokondriella DNA-kopior i en bovin oocyt (P < 0,0001). Denna metod använder centrifugering och bisektion för att avsevärt minska oocytmitokondrier och kan möjliggöra en ökad chans till utveckling i de rekonstruerade interspecies somatiska cellkärnöverföringsembryon.
Abstract
Interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) kan användas för att rädda hotade arter, men två distinkta populationer av mitokondriellt DNA (mtDNA) finns inom det rekonstruerade embryot: en inom mottagarooplasma och en inom donatorns somatiska cell. Denna mitokondriella heteroplasmi kan leda till utvecklingsproblem i embryot och fostret. Handgjorda kloningsprotokoll inkluderar oocytbisektion, som kan användas för att minska mtDNA-kopieringsnumret, vilket minskar graden av mitokondriell heteroplasmi i ett rekonstruerat embryo. Centrifugering av denuderade, mogna bovina oocyter gav en synlig mitokondristät fraktion vid en pol av äggcellen. Oocyternas zonae pellucidae avlägsnades genom exponering för en pronaslösning. Bisection utfördes med hjälp av ett mikroblad för att avlägsna den synliga mitokondrifraktionen. qPCR användes för att kvantifiera mtDNA närvarande i DNA-prover extraherade från hela oocyter och bisekerade ooplaster, vilket gav en jämförelse av mtDNA-kopieringsnummer före och efter bisektion. Kopieringsnummer beräknades med hjälp av cykeltröskelvärden, en standardkurvas regressionslinjeformel och ett förhållande som inkluderade respektive storlekar på mtDNA PCR-produkter och genomiska PCR-produkter. En bovin oocyt hade ett genomsnittligt mtDNA-kopienummer (± standardavvikelse) på 137 904 ± 94 768 (n = 38). En mitokondri-utarmad ooplast hade ett genomsnittligt mtDNA-kopienummer på 8 442 ± 13 806 (n = 33). Genomsnittliga mtDNA-kopior som fanns i en mitokondririk ooplast var 79 390 ± 58 526 mtDNA-kopior (n = 28). Skillnaderna mellan dessa beräknade medelvärden indikerar att centrifugeringen och efterföljande bisektion avsevärt kan minska mtDNA-kopieringsnumren som finns i mitokondrierna-utarmad ooplast jämfört med den ursprungliga oocyten (P < 0,0001, bestämd av enkelriktad ANOVA). Minskningen av mtDNA bör minska graden av mitokondriell heteroplasmi i ett rekonstruerat embryo, vilket eventuellt främjar standard embryonal och fosterutveckling. Tillskott med mitokondriellt extrakt från den somatiska donatorcellen kan också vara avgörande för att uppnå framgångsrik embryonal utveckling.
Introduction
Somatisk cellkärnöverföring (SCNT) innefattar fusion av en enucleated oocyt från ett djur och en somatisk cell från ett djur av samma art. I de flesta fall härstammar äggcellen och den somatiska cellen från samma art, och levande födelsetal är under 6%1. Viss forskning involverar användning av interspecies SCNT (iSCNT), som inkluderar fusion av en somatisk cell och oocyt som härstammar från två olika arter. I dessa studier är levande födelsetal ännu lägre än i SCNT- vanligtvis mindre än 1%1. iSCNT har dock kapacitet att användas som en metod för att rädda hotade arter, eftersom somatiska celler från dessa djur är mer tillgängliga än deras könsceller1. Mottagaroocyter som används i iSCNT är ofta inhemska eller vanliga laboratoriearter, såsom kor, grisar och möss. Vissa försök som hittills gjorts har framgångsrikt producerat levande ungar, även om de producerade avkommorna har varit intrageneriska djur (de mottagande äggcellarterna och donatorcellarterna var medlemmar i samma släkte)2,3,4. Intergeneriska modeller (som använder en oocyt och somatisk cell från djur i olika släkten) har ännu inte producerat levande djur, och majoriteten av rekonstruerade embryon arresteras vid 8-16 cellstadiet av in vitro-utveckling 5,6,7,8. En möjlig förklaring till detta embryonala utvecklingsstopp är förekomsten av mitokondriell heteroplasmi i embryon - närvaron av mer än en mitokondri-DNA (mtDNA) -typ i en enda cell. Heteroplasmi kan leda till problem som utvecklingsineffektivitet eller misslyckande i embryot eller i det levande djuret1. Patogenes kan också inträffa senare under djurets livstid9. Även om detta problem också finns i SCNT-avkommor, förvärrar den interspecifika komponenten i iSCNT-embryon problemet.
När det embryonala mtDNA kommer från två olika arter fungerar mottagarens oocytmitokondrier, som representerar majoriteten, inte effektivt eller effektivt med donatorcellens kärna 1,10. Större taxonomiska luckor mellan de två arter som används i iSCNT intensifierar sannolikt detta problem; Intrageneriska levande avkommor producerade (Bos gaurus och Bos indicus avkommor med Bos taurus oocyter), liksom avkommor som producerades via traditionell SCNT (t.ex. Ovis aries avkommor med Ovis aries oocyter) visade sig vara chimärer (mtDNA från två individer var närvarande i dessa djur 11,12,13). Ändå utvecklades de mycket längre än de intergeneriska SCNT-embryona14,15. Utbytet av information mellan äggcellsmitokondrierna och donatorcellens kärna skulle kunna vara mer framgångsrikt i det intrageneriska embryot än i det intergeneriska embryot16.
Mängden mtDNA i en mogen bovin oocyt är ungefär 100 gånger större än den mängd som finns i en somatisk cell12. Att minska detta förhållande kan uppmuntra de somatiska cellmitokondrierna att sprida sig inom det rekonstruerade embryot, vilket möjliggör en större population av produktiva mitokondrier att vara närvarande16. Detta kan i sin tur ge mer energi för att uppfylla kraven för det utvecklande embryot15. Tidigare försök att minska mtDNA-kopieringsnumret för äggcellen eller embryot inkluderar kemisk applicering, mikromanipulering och komplettering av äggcellen eller embryot med ytterligare mitokondrier från donatorcellarten 16,17,18,19,20. Kemisk applicering (såsom 2',3'-dideoxycytidin) är emellertid inte idealisk för embryonal utveckling och har minskat oocyt mtDNA-kopieringsantalet med ungefär hälften18. Tidigare oocyt mtDNA-reduktion genom mikromanipulering har bara tagit bort i genomsnitt 64% av äggcellens mtDNA17. Även om tillskott av donatorcellsmitokondrier kan vara ett genomförbart alternativ, har dess användning ännu inte producerat ett levande intergeneriskt djur inom iSCNT-studier21.
Användningen av bisection för att minska oocyt mtDNA-kopieringsnummer har ännu inte använts i publicerade studier. Bisekerande oocyter med avsikt att smälta ooplasterna med en somatisk cell är förutsättningen för handgjord kloning (HMC), som vanligtvis använder bisektion som metod för att ta bort den polära kroppen och metafasplattan från metafas II (MII) oocyten. HMC har framgångsrikt producerat avkommor i flera arter, inklusive getter, nötkreatur, grisar, får och hästar 22,23,24,25,26, men inkluderar vanligtvis inte ett centrifugeringssteg före bisektion. Integrering av höghastighetscentrifugering av äggcellen möjliggör isolering av mitokondrier (och därmed mtDNA) vid en pol av äggcellen, som sedan kan delas med hjälp av ett mikroblad för att avlägsna de mitokondristäta fraktionerna. Två mitokondrier-utarmade ooplaster kan sedan smältas samman med en somatisk cell, vilket är fallet i HMC, för att bilda ett rekonstruerat embryo som innehåller betydligt mindre mtDNA från oocytarten.
Frågan vi försöker besvara med detta protokoll är hur man kan minska mtDNA i bovin oocyt för att producera ett livskraftigt rekonstruerat embryo som innehåller mindre heteroplasmiskt mtDNA. I detta protokoll centrifugerades och delades oocyter. Ooplast och intakta oocyt mtDNA-kopieringsnummer beräknades för att bestämma effektiviteten av denna teknik för att minska bovin oocytens mtDNA-kopieringsnummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll följer de riktlinjer för djurvård och etik som tillhandahålls av Utah State University.
1. Förberedelse av media
- Före oocythantering, bered följande lösningar, enligt beskrivningen i tabell 1: 400 μL hyaluronidaslösning, 500 μl T2-media, 1 020 μl T20-media och 800 μl T10-media.
- Dela T10-mediet i två brunnar på en platta med fyra brunnar, 400 μl per brunn. Märk en brunn med "M" och den andra brunnen med "MR". Placera i en 5% CO2-inkubator tills efter bisection.
- Förbered 500 μl cytochalasin B (CB) / syntetisk oviduktal vätska med HEPES (HSOF). Alikvot 50 μl CB/HSOF-lösning i ett separat 1,5 ml centrifugrör.
- Förbered 40 μl Pronase Solution. Centrifugera i minst 30 s vid 2 680 x g. Blanda 20 μL av supernatanten med 20 μL T2 till ett nytt centrifugrör. detta bildar en utspädd, 5 mg /ml pronaslösning.
- Förbered 3 ml HSOF. På en sökplatta, deponera separat fyra 400 μL droppar; placera denna platta under ett stereomikroskop.
- Bered 500 μl CB/T20-lösning.
2. In vitro-mognad (IVM) av bovina oocyter
- IVM: Kulturaspirerade cumulus-oocytkomplex (COC) vid 38,5 ° C i en 5% CO2-inkubator i 21 timmar i en skål med fyra brunnar av mognadsmedier innehållande 10% FBS, 0,26 IE / ml FSH och 100 U / ml penicillin / streptomycin.
- Utför följande steg för att förneka oocyterna.
- Samla upp önskat antal COC med en 200 μL pipett och deponera dem i botten av ett 1,5 μL centrifugrör.
- Tillsätt samma volym på 0,6 mg/ml hyaluronidas till centrifugröret med oocyterna (dvs. om volymen oocyter och IVM-medier är 100 μl, tillsätt 100 μl hyaluronidas).
- Pipettera lösningen upp och ner utan att skapa bubblor tills alla cumulusceller har tagits bort.
- Kontrollera mognaden av oocyterna.
- Använd pipetten för att tillsätta 200 μL HSOF från en av de fyra HSOF-dropparna på sökplattan till oocyt/hyaluronidaslösningen.
- Överför oocyterna från hyaluronidas/HSOF-droppen och placera dem i oanvänd 400 μl HSOF-droppe. Tvätta dem med ytterligare två HSOF-droppar för att hjälpa till att ta bort hyaluronidas och cumulus cellrester.
- Använd en munpipett (eller en 10 μL pipett och spets) och hög mikroskopisk förstoring, rulla och välj oocyterna baserat på polär kroppsnärvaro.
- Efter sortering av oocyterna, samla upp önskat antal MII-oocyter som ska delas och placera dem i 400 μL HSOF-droppe.
OBS: Om oocyterna har varit utanför inkubatorn längre än 30 minuter kan oocyter placeras tillbaka i en brunn av mognadsmedier och placeras i en CO2-kontrollerad inkubator för att vila i minst 30 minuter. Begränsa antalet oocyter som ska delas till en mängd som är möjlig att avsluta bisekering på cirka 30 minuter för att minimera tiden utanför inkubationen. Om ooplaster ska smälta samman med en somatisk cell, aktiveras och odlas som embryon, bör oocyter enucleeras vid denna tidpunkt.
3. Centrifugering av oocyterna
OBS: Om oocyter placerades i inkubatorn i mognadsmedier, flytta dem till HSOF-droppen från vilken de senast samlades in.
- Samla upp de valda mogna oocyterna från HSOF-droppen med hjälp av en munpipett och placera dem i 1,5 ml-röret som innehåller 50 μl av HSOF/CB-lösningen. Centrifugera oocyterna vid 15 000 x g i 12 min.
OBS: Det är inte skadligt för bubblor att vara närvarande i centrifugröret. - Medan oocyterna centrifugeras, förbered bisektionsplattan.
- Gör mönstret som visas i figur 1 på locket på en 60 mm petriskål (20 μl per droppe) och täck dropparna helt med mineralolja.
- Markera linjerna under skålen med en tunn spetsad markör, som visas i figur 2.
- Rita en ruta runt pronasdroppen och en linje mellan CB/T20-dropparna och den nedre raden med T20-droppar.
- Täck skålen med ett ogenomskinligt lock tills centrifugeringen är klar för att förhindra osmolaritetsförändringar av mikrodroppar.
- Så snart centrifugeringen är klar, använd en 200 μL pipett för att samla oocyterna i lösningen och flytta dem till en tom del av en ny sökplatta med fyra 400 μL HSOF-droppar.
- Samla och tvätta oocyterna genom de fyra HSOF-dropparna.
Figur 1: Bisektionsplatta. Alla droppar som visas har en volym på 20 μl. Plattan har en diameter på 60 mm. Droppar har täckts helt med mineralolja. Oocyter kommer först att placeras i den översta och vänstra T2-droppen (indikeras här med en stjärna). PRO/T2: 10 μL pronas och 10 μL T2, kombinerat innan mikrodroppar skapas. CB / T20: 1 μl cytochalasin B per 1 ml T20, kombinerat innan mikrodroppar skapas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Markerad bisektionsplatta. Linjer ritas med en tunnspetsad markör på botten av plattan för att ge platsreferenser för observationer och äggcells- och ooplastöverföringar som görs under mikroskopet. Oocyter kommer först att placeras i den översta och vänstra T2-droppen (indikeras här med en stjärna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Förberedelse av äggcellen för bisektion
OBS: Följande process innefattar beredning av oocyterna för bisektion.
- Slå på värmesteget till 37 °C.
- Använd en munpipett för att flytta de centrifugerade oocyterna från HSOF-droppen till den övre vänstra T2-droppen på bisektionsplattan och tvätta sedan oocyterna genom de följande tre dropparna på den övre raden (T2, T20, T20).
- Deponera oocyterna i en av pronasdropparna och se till att det finns liten eller ingen kontakt mellan dem.
OBS: Avlägsnandet av zona pellucida kan ta olika lång tid, men sker vanligtvis mellan 30-120 s med användning av ett uppvärmningssteg. Frånvaron av ett uppvärmningssteg kommer att förlängas den här gången. - Observera oocyterna tills det finns en tydlig deformation av zonae pellucidae (se figur 3).
- När en enda oocyt zona pellucida har blivit deformerad, flytta den oocyten till den närliggande T2-droppen. Upprepa när ytterligare oocyter deformeras tills alla oocyter har avlägsnats från pronasen och placerats i T2-droppen.
- Observera oocyterna tills endast ett tunt lager av zonen pellucida kvarstår.
- Tvätta oocyterna genom de följande tre dropparna i raden (T2, T20, T20) och deponera dem sedan i vertikala linjer inom CB/ T20-dropparna (se figur 4).
- Börja med färre oocyter i de vertikala linjerna och öka antalet oocyter per droppe när bisektionsförmågan fortskrider.
Figur 3: Avlägsnande av zona pellucida med hjälp av pronas (80x) En oocyt zona pellucida kommer att börja se deformerad ut när pronasen har påverkat zona pellucida tillräckligt för att äggcellen ska flyttas till den intilliggande T2-droppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Oocytorientering i bisektionsdroppar (80x) Zona-fria oocyter deponeras i en nästan vertikal orientering inom varje CB / T20-droppe före bisektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Bisektion av oocyterna
- Fokusera på den första, vänstra CB / T20 -droppen (bisektion) som innehåller oocyter och använd en munpipett för att rotera oocyterna, så att den mitokondristäta delen av varje äggcell antingen är vänd mot eller bort från mikroskopets arm.
OBS: Den mitokondristäta delen kommer inte att innehålla lipider, som framträder som den mörkaste delen av äggcellen efter centrifugering. - Vila spetsen på mikrobladet till vänster om den översta äggcellen, i linje med utrymmet direkt ovanför den mitokondristäta delen. Håll bladets spets på samma plats, sänk försiktigt bladet för att skära hela vägen genom äggcellen.
- Se till att den mitokondristäta ooplasten och mitokondrireducerade ooplasten är lika stora; bisection bör skära varje äggcell i hälften för att producera två ooplaster.
OBS: Jämförande storlekar av ooplaster som produceras från en enda äggcell kan variera beroende på forskningsmål; Om mitokondrireduceradeoplaster ska smälta samman med en somatisk cell bör deras volym vara större än de mitokondristäta ooplasterna". - Se till att bladet skär oocyten ovanför den mitokondristäta delen och under den lipidtäta delen, i det tydligaste segmentet av den centrifugerade äggcellen.
- Se till att den mitokondristäta ooplasten och mitokondrireducerade ooplasten är lika stora; bisection bör skära varje äggcell i hälften för att producera två ooplaster.
- När du lyfter bladet, se till att samma linje bibehålls och att bladets spets förblir på samma plats och lyft sedan försiktigt spetsen från plattan.
- Upprepa bisektionssteg för alla oocyter inom det första bisektionsfallet. Om oocyter är närvarande i ytterligare droppar, orientera och bisekera de återstående oocyterna.
- Använd en munpipett och samla mitokondrier-reducerade ooplaster från den första bisectiondroppen. Placera dem i den vänstra T20-droppen i den nedre raden på plattan. Upprepa för alla återstående bisektionsdroppar.
OBS: Mitokondrier-reducerade ooplaster kommer att innehålla lipider, som är mörkare i färg än resten av äggcellen. - Använd en munpipett och samla mitokondristäta ooplaster från den första bisectiondroppen. Placera dem i den högra T20-droppen i den nedre raden på plattan. Upprepa för alla återstående bisektionsdroppar.
OBS: Mitokondristäta regioner kommer att ha en synlig konglomerat av organeller som kommer att vara ljusgrå i utseende. - Hämta T10-skålen med fyra brunnar från inkubatorn. Använd en munpipett, flytta alla mitokondrier-reducerade ooplaster till den väl märkta "MR" och flytta de mitokondristäta ooplasterna till den väl märkta "M."
- Placera tillbaka fyrbrunnsplattan i den CO2-styrda inkubatorn. Låt ooplaster vila i minst 30 minuter före kvantifiering av mtDNA.
6. Kvantifiering av mtDNA
- Använd ett DNA-extraktionssats som är utformat för att extrahera material från ett litet prov för att extrahera DNA från enskilda prover (enstaka oocyter, enkla mitokondristäta ooplaster, enkla mitokondrier-utarmade ooplaster).
- Använd en valfri DNA-kvantifieringsmetod för att säkerställa att DNA extraherades framgångsrikt från varje prov. Om kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) inte kommer att slutföras vid den tidpunkten, frys det extraherade DNA i ett märkt rör i en frys på -80 °C.
- Utför qPCR
- Se tabell 2 för att bestämma volymen av varje reagens som ska tillsättas till varje qPCR-rör, tillsammans med primersekvenserna. Dessa primers är utformade för att förstärka 12S-regionen av bovin mtDNA.
- Ställ in den initiala denatureringstiden i 10 minuter, följt av 35 cykler med: 30 s denaturering vid 94 °C, 15 s glödgning vid 60 °C och 15 s förlängning vid 72 °C. När reaktionen är klar registrerar du cykeltröskelvärdena (Ct).
OBS: För att få relativa mtDNA-kopieringsnummervärden måste en standardkurva produceras med hjälp av prover med kända mängder mtDNA-kopieringsnummer, som ökar exponentiellt. Cykeltröskelvärdena måste sedan manipuleras med hjälp av följande formler för att bestämma relativa mtDNA-kopieringsnummer. - Erhålla koncentrationen av DNA med hjälp av ekvationen nedan:
Koncentration av DNA = (10(Ct-skärningspunkt/lutning)) x testad volym - Hämta kopieringsnumret med hjälp av ekvationen nedan:
Kopienummer =
- Hämta kopieringsnumret med hjälp av ekvationen nedan:
Kopienummer per cell = 2 x
Figur 5: Somatisk cell mtDNA standardkurva. Denna standardkurva skapades genom mtDNA-kvantifieringen av logaritmiska koncentrationer av bovina somatiska celler med hjälp av qPCR-reagenserna och programmet enligt beskrivningen i protokollsteg 6.3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantitativa PCR -resultat (qPCR) används för att bestämma de relativa kvantiteterna mtDNA som finns i varje ooplast. Den beskrivna reaktionen är utformad för att förstärka 12S-regionen av bovint mtDNA.
Om bisektionen lyckades kommer proverna från hela oocyter och mitokondristäta ooplaster att ha liknande Ct-värden . Proverna från mitokondrireduceradeoplaster kommer att ha högre Ct-värden jämfört med proverna från de andra två grupperna. En Ct-graf som visar framgångsrika bisektionsresultat visas nedan. Dessa resultat indikerar att bisektion effektivt minskade mtDNA-halten i mitokondrireduceradeoplaster (figur 6).
Figur 6: Framgångsrika bisektion qPCR-resultat. Diagram som jämför cykelnummer och fluorescens visar cykeltröskelvärden för enstaka oocyter, mitokondrireducerade ooplaster (representerade av lila linjer) och mitokondristäta ooplaster. Ct-värdena för mitokondrireducerade ooplaster har i genomsnitt 29,931 (lila linjer), medan det genomsnittliga Ct-värdet för de enskilda oocyterna är 20,802 (röda och gröna linjer) och det genomsnittliga Ct-värdet för de mitokondristäta ooplasterna är 21,389 (blå och guldlinjer). De ökade Ct-värdena för de mitokondrier-reducerade ooplastproverna indikerar en minskning av mtDNA-kopieringsnumret inom dessa prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett Ct-diagram som visar misslyckade bisektionsresultat visas i figur 7. Dessa resultat indikerar att bisektion inte effektivt minskade mtDNA-halten i mitokondrireduceradeoplaster:
Bild 7: Misslyckade bisektion qPCR-resultat. Linjediagram som jämför cykelnummer och fluorescens visar cykeltröskelvärden för enskilda oocyter (mörkgröna och ljusgröna linjer), mitokondrireducerade ooplaster (lila linjer) och mitokondristäta ooplaster (blå och guldlinjer), som alla har Ct-värden inom intervallet 20.232-20.757. Detta indikerar frånvaron av en signifikant förändring av mtDNA-kopieringsnumret i mitokondrireducerade ooplastprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter framställning av en standardkurva och användning av de tillhandahållna mtDNA-kopieringsnummerformlerna har en genomsnittlig oocyt mtDNA-reduktion på 93,88% uppnåtts med hjälp av detta protokoll (figur 8).
Figur 8: Boxplot som jämför relativa mitokondriella DNA-kopior som erhållits från hela oocyter, mitokondrier-reducerade ooplaster och mitokondristäta ooplaster. Hela oocyter (n = 38), mitokondrier-reducerade ooplaster (n = 34) och mitokondristäta ooplaster (n = 29). Mitokondrier-reduceradeoplaster har betydligt färre kopieringsnummer jämfört med de andra två grupperna (P < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Total volym | Lösningsmedel | Solute |
| Hyaluronidaslösning | 400 μl | 1 ml M-199 | 0,6 mg hyaluronidas |
| T2 Media | 500 μl | M-199 | 2% Fetalt bovint serum (v / v) |
| T20 Media | 1020 μl | M-199 | 20% Fetalt bovint serum (v / v) |
| T10 Media | 800 μl | 400 μl T2 | 400 μl T20 |
| CB/HSOF | 500 μl | 499,5 μl syntetisk oviduktal vätska med HEPES (HSOF) | 0,5 μl 10 mg/ml cytochalasin B (CB) |
| Pronase-lösning | 40 μl | 1 ml M-199 | 10 mg pronas |
| T20/CB | 500 μl | 499,5 μl T20 | 0,5 μl 10 mg/ml CB |
Tabell 1: Nödvändiga lösningar. Tillhandahåller volymer av lösta ämnen och lösningsmedel för varje lösning som krävs inom protokollet.
| Reagens | Volym |
| qPCR-huvudmix | 10 μl |
| Framåt grundfärg | 0,6 μl |
| Omvänd primer | 0,6 μl |
| DNA-prov | 4,4 μl |
| DNase-fritt vatten | 4,4 μl |
| Total volym | 20 μl |
| Framåt primer GGGCTACATTCTCTACACCAAG | |
| Omvänd primer GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | |
Tabell 2: Kvantitativ PCR-sammansättning. Ger framåt och bakåt primersekvenser och volymer av alla reagenser som behövs för varje kvantitativt PCR-rör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder som tidigare använts för att minska mtDNA-kopieringsnumren i oocyter har sina respektive nackdelar. Mikromanipuleringsbaserat avlägsnande av mitokondrier från oocyter minskar mtDNA-kopieringsnumren med i genomsnitt 64%27. En unik metod, som tidigare använts för enucleation, innefattar användning av Pasteur-pipetter med liten diameter och splittring av en zona pellucida-fri oocyt vid gränsen mellan en mikrodroppe av media och den omgivande mineraloljan. Tillsammans med användningen av oocytcentrifugering kan detta tillvägagångssätt producera livskraftiga mitokondrier-reducerade ooplaster28. Kombinationen av centrifugering och denna oocytdelningsmetod har dock ännu inte rapporterats producera embryon. Kemiska mitokondrier reduktionsmetoder (såsom exponering av oocyter för 2′,3′-dideoxycytidin (ddC), en mtDNA-synteshämmare) har minskat oocyt mtDNA-kopieringsnumren med upp till 50% och kräver att COC: er exponeras för kemikalien i över 40 timmar under in vitro-mognad (IVM)16,27. Även om inkubering av svinoocyter i ett ddC-kompletterat medium i 40 timmar inte har gett upphov till problem för de rekonstrueradeembryona 16, finns det ännu inte publicerade data om exponering av bovina oocyter för ddC under deras 20-22 h IVM eller någon efterföljande embryonal utveckling. Metoden som beskrivs i detta dokument minskar det relativa mtDNA-kopieringsnumret med cirka 93,88%, från i genomsnitt 45 565 ± 37 169 kopior (medelvärde ± SD) till 8 396 ± 13 287.
Flera steg inom protokollet är avgörande för att uppnå tillfredsställande resultat när det gäller att effektivt minska mitokondriernas DNA (mtDNA) kopieringsnummer för en äggcell. Centrifugering av oocyterna med optimerad hastighet (15 000 x g) och tid (12 min) kommer att skapa en mer koncentrerad mitokondrifraktion vid en pol av varje äggcell. Den korrekta volymen cytochalasin B / syntetisk oviduktal vätska med HEPES (CB / HSOF) -lösning (50 μL) kommer sannolikt att eliminera oocytlys på grund av centrifugering. Efter centrifugering avlägsnas zona pellucida (ZP) genom exponering för en pronaslösning; fullständigt avlägsnande av ZP kommer att säkerställa mer exakt bisection och bör också separera eventuella återstående cumulusceller från oocyterna. Användningen av ett uppvärmningssteg på mikroskopet medan du tar bort ZP är valfritt, men påskyndar ZP-borttagning med minst 1 min. Orienteringen av zona pellucida-fria (ZF) oocyter i bisektionsdroppar är avgörande för att dela dem exakt. Mitokondrifraktionen, som finns vid en pol av varje äggcell, bör vara tydligt synlig och placerad antingen på toppen eller botten av äggcellen före bisection. Den motsatta polen kommer att innehålla mörka lipiddroppar. Efter bisection är urval och korrekt klassificering av ooplasterna (som mitokondrier täta eller mitokondrier-utarmade) avgörande för att få en korrekt bedömning av bisektionen. Att välja vilka Metafas II (MII) oocyter som ska bisekeras är också viktigt. Att säkerställa att de använda oocyterna är sfäriska och har homogen cytoplasma kommer sannolikt att göra skillnad i mtDNA-kopieringsnumren som finns i varje oocyt och ooplast. Vid utformning och syntetisering av individuella kvantitativa polymeraskedjereaktioner (qPCR) är det viktigt att säkerställa att rätt primers och reagenskoncentrationer används i varje reaktion för att uppnå exakta resultat. Om en standardkurva produceras bör den skapas så exakt som möjligt, och alla reaktioner bör utföras i tre exemplar för att uppnå större noggrannhet. Tiderna och temperaturerna för varje qPCR-fas bör förbli desamma för varje körning.
Vissa problem kan uppstå när du följer protokollet. När du tillsätter olja till bisektionsplattan, se till att dropparna bara är täckta; för mycket olja kommer att göra pipettanvändningen mindre effektiv, medan för lite kommer att leda till avdunstning av droppar. Denna avdunstning skulle orsaka en förändring i lösningarnas osmolaritet, vilket kan vara skadligt för oocyterna och ooplasterna. Om oocyterna lyser efter matsmältningen av ZP beror detta sannolikt på ett eller båda av följande, baserat på personlig erfarenhet och observation: oocyterna centrifugerades inte under föreskriven tid och hastighet, och/eller oocyterna utsattes för pronas för länge. Vissa ZF-oocyter kanske inte återfår en helt sfärisk form i bisektionsdropparna. Tänk på att inte alla ZF-oocyter kommer att kunna placeras optimalt för bisektion. I det här fallet finns det tre alternativ: ge ZF-oocyterna ytterligare tid att återfå en sfärisk form; håll försiktigt oocyter i ett mer upprätt läge med mikrobladet före bisektion; bisekera inte oocyter som inte kan placeras korrekt. Att bestämma vilka ooplaster som är mitokondristäta eller mitokondrier-utarmade efter bisection kommer att påverka kvantifieringsresultaten. Om det är svårt att klassificera ooplasterna, placera oocyterna som kommer att delas så att mitokondrifraktionen antingen alltid pekas mot toppen eller botten av droppen och / eller leta efter en mörk del av äggcellen vid en av dess poler (dessa lipiddroppar är koncentrerade vid motsatt pol från mitokondrifraktionen). Ibland kanoplaster hålla fast vid varandra och / eller indragningen som görs av mikrobladet i plattan. Ibland kan det hjälpa till med separation att ge ooplasterna ytterligare tid för att återfå en sfärisk form. Andra alternativ inkluderar att försiktigt knacka på plattan, försiktigt suga dem in och ut ur pipetten och / eller använda pipettens kant för att försiktigt separera ooplasterna.
Denna mtDNA-metod för minskning av kopieringsnummer har sina begränsningar; den ena är baserad på oocytkälla, och den andra beror på avlägsnandet av ZP från äggcellen. Oocytkälla (själva djuret, den specifika äggstocken och den specifika follikeln) kommer i hög grad att påverka mtDNA-kopieringsnumren inom den specifika äggcellen. Det finns en stor standardavvikelse runt det genomsnittliga mtDNA-kopieringsnumret för en enda äggcell, vilket indikerar hur variabelt kopieringsnumret kan vara. Många enstaka oocytkvantifieringsreaktioner krävs för att ha ett robust enda oocytstandardkopienummer som kommer att jämföras med ooplaster och andra oocyter. Den betydande standardavvikelsen gör också jämförelsen mellan ooplast och oocyt mindre absolut, eftersom ooplastens kopieringsnummer inte kan jämföras med dess oocyt av ursprung.
Matsmältningen av äggcellens zonae pellucidae gör den resulterande ZF-oocyten och ooplasterna mycket mer ömtåliga än de var innan deras zonae pellucidae togs bort. Denna bräcklighet leder till högre lyshastigheter avoplaster och ZF-oocyterna själva, särskilt med användning av ett mikroblad - en stor mängd omsorg och precision måste användas. Om ooplasterna används för fusion kräver de vila efter bisection innan fusion kan försökas. Annars kommer många av ooplasterna sannolikt att lysera. De mitokondrier-utarmade ooplasterna tenderar att vara mer känsliga än deras mitokondristäta motsvarigheter. Oocytens mikrotubuli tenderar att migrera med mitokondrierna till samma pol av äggcellen under centrifugering, vilket lämnar mitokondrierna-utarmade ooplaster med färre strukturella komponenter29. Ytterligare forskning och färgning krävs för att avgöra om andra oocytorganeller påverkas negativt av kombinationen av centrifugering och bisektion som används för att producera ooplaster i detta protokoll.
Minskningen av oocytmitokondrier skulle minska oocytarternas mitokondrier i ett resulterande iSCNT-embryo, vilket minskar förekomsten av mitokondrier heteroplasmi i det rekonstruerade embryot. Embryots chanser att utvecklas skulle öka jämförelsevis, men skulle sannolikt kräva tillskott av mitokondrier från donatorcellsarten för att möta energibehovet under utvecklingen. Hittills har iSCNT-försök som har använt intergeneriska kors inte producerat levande avkommor. Minskande heteroplasmi i iSCNT-embryon kan öka sannolikheten för framgångsrika graviditeter. iSCNT är en metod som kan hjälpa till att rädda några av de 40 000 arter som klassificeras som hotade30. Eftersom somatiska celler från dessa arter vanligtvis är mer tillgängliga än deras könsceller, kan iSCNT använda dessa somatiska celler, tillsammans med oocyter från inhemska arter. Intrageneriska försök har varit framgångsrika med att producera levande djur 31,32,33, även om avkomman vanligtvis är chimär för mtDNA, och att hitta en intragenerisk oocytkälla är inte alltid möjligt. Bisektion av oocyter med målet att minska mtDNA-kopieringsnummer, följt av fusion av dessa ooplaster med en interspecifik somatisk cell, skulle minska chimerism och heteroplasmi i iSCNT-embryon. På grund av dessa minskningar möjliggör användningen av den beskrivna metoden en större potential för intergeneriska levande födda och fortsättningen av hotade arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka sina kollegor vid Utah State University, reproduktionsvetenskapsforskarna vid San Diego Zoo och Dr. Rebecca Krisher vid Genus PLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
