Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Storstilet gravitaxis-analyse af Caenorhabditis Dauer-larver

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

Den nuværende protokol skitserer metoder til udførelse af et stort gravitaxisassay med Caenorhabditis dauer larver. Denne protokol giver mulighed for bedre påvisning af gravitakseadfærd sammenlignet med et pladebaseret assay.

Abstract

Tyngdekraftsfornemmelse er en vigtig og relativt undervurderet proces. At mærke tyngdekraften gør det muligt for dyr at navigere i deres omgivelser og letter bevægelse. Derudover er tyngdekraftsfornemmelse, der forekommer i pattedyrs indre øre, tæt forbundet med hørelse - således har forståelse af denne proces konsekvenser for auditiv og vestibulær forskning. Gravitaxis assays findes for nogle modelorganismer, herunder Drosophila. Enkelte orme er tidligere blevet analyseret for deres orienteringspræference, når de sætter sig i opløsning. Imidlertid er et pålideligt og robust assay for Caenorhabditis gravitaxis ikke blevet beskrevet. Den nuværende protokol skitserer en procedure til udførelse af gravitaxisassays, der kan bruges til at teste hundredvis af Caenorhabditis dauers ad gangen. Dette store langdistanceassay giver mulighed for detaljeret dataindsamling, der afslører fænotyper, der kan gå glip af på et standardpladebaseret assay. Dauer-bevægelse langs den lodrette akse sammenlignes med vandrette kontroller for at sikre, at retningsbestemt bias skyldes tyngdekraften. Gravitaktisk præference kan derefter sammenlignes mellem stammer eller eksperimentelle forhold. Denne metode kan bestemme molekylære, cellulære og miljømæssige krav til gravitaxis i orme.

Introduction

At mærke Jordens tyngdekraft er afgørende for mange organismers orientering, bevægelse, koordination og balance. Imidlertid er de molekylære mekanismer og neurokredsløb af tyngdekraftsfornemmelse dårligt forstået sammenlignet med andre sanser. Hos dyr interagerer tyngdekraftsfornemmelsen med og kan udkonkurreres af andre stimuli for at påvirke adfærd. Visuelle signaler, proprioceptiv feedback og vestibulær information kan integreres for at skabe en følelse af kropsbevidsthed i forhold til et dyrs omgivelser 1,2. Omvendt kan gravitaktisk præference ændres i nærværelse af andre stimuli 3,4,5. Derfor er gravitaktisk adfærd ideel til at studere tyngdekraftsfornemmelse og forstå nervesystemets komplekse sensoriske integration og beslutningstagning.

C. elegans er en særlig nyttig modelorganisme til undersøgelse af gravitakse på grund af dens polyphene livscyklus. Når de udsættes for stressfaktorer under udvikling, herunder varme, overbelægning eller mangel på mad, udvikler C. elegans larver sig til dauers, som er meget stressresistente6. Som dauers udfører orme karakteristisk adfærd, såsom nictation, hvor orme "står" på halen og vinker med hovedet, hvilket kan lette spredningen til bedre levesteder7. Gravitaxis assays af C. elegans og C. japonica tyder på, at dauer larver negativt gravitax, og at denne adfærd er lettere observeret hos dauers end hos voksne 8,9. Test af gravitaxis i andre Caenorhabditis-stammer kan afsløre naturlig variation i gravitatisk adfærd.

Mekanismer til tyngdekraftsfornemmelse er blevet karakteriseret i Euglena, Drosophila, Ciona og forskellige andre arter ved hjælp af gravitaxisassays 3,10,11. I mellemtiden gav gravitakseundersøgelser i Caenorhabditis oprindeligt blandede resultater. En undersøgelse af C. elegans orienteringspræference viste, at orme orienterer sig med hovedet nedad i opløsning, hvilket tyder på positiv gravitaktisk præference12. I mellemtiden, selvom C. japonica dauers tidligt blev identificeret som værende negativt gravitaktisk8, er denne adfærd først for nylig blevet beskrevet i C. elegans9. Der opstår flere udfordringer ved at udvikle et repræsentativt gravitaxis-assay i orme. Caenorhabditis stammer opretholdes på agar plader; Af denne grund bruger adfærdsmæssige assays typisk Agar-plader som en del af deres eksperimentelle design13,14,15. Det tidligste rapporterede gravitaxis-assay i Caenorhabditis blev udført ved at stå en plade på siden i en vinkel på 90° i forhold til den vandrette kontrolplade8. Imidlertid er gravitakseadfærd ikke altid robust under disse forhold. Mens voksne orme kan analyseres for orienteringspræference i løsning12, kan denne retningsbestemte præference også være kontekstafhængig, hvilket fører til forskellig adfærd, hvis ormene kravler snarere end svømning. Derudover er C. elegans følsom over for andre stimuli, herunder lys og elektromagnetiske felter16,17, som forstyrrer deres reaktioner på tyngdekraften9. Derfor er et opdateret gravitakseassay, der beskytter mod andre miljøvariabler, vigtigt for at dissekere mekanismerne i denne sensoriske proces.

I denne protokol beskrives et assay til observation af Caenorhabditis gravitaxis. Opsætningen af denne undersøgelse er delvist baseret på en metode udviklet til at studere neuromuskulær integritet18,19. Dauerlarver dyrkes og isoleres ved hjælp af standardprocedurer20. De injiceres derefter i kamre fremstillet af to 5 ml serologiske pipetter fyldt med agar. Disse kamre kan orienteres lodret eller vandret og placeres i et mørkt Faraday-bur i 12-24 timer for at beskytte mod lys og elektromagnetiske felter. Placeringen af hver orm i kamrene registreres og sammenlignes med de lodrette taxaer for en referencestamme som C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De stammer, der anvendes i denne undersøgelse, er C. elegans (N2) og C. briggsae (AF16) (se materialeoversigt). En blandet køn population af dauers blev brugt til hver analyse.

1. Forberedelse af kammeret

  1. Arbejd i en røghætte. Indstil arbejdsområdet med en Bunsen-brænder, 1-2 barberblade, tang, pincet og en plastskæreflade (se Materialetabel).
  2. For hvert kammer samles to 5 ml serologiske pipetter. Fjern bomuldsproppen fra en pipette med pincet. Hold et barberblad over Bunsen-brænderen, indtil det er varmt med en tang. Brug det opvarmede blad til at skære den tilspidsede ende af den anden pipette af, så hele pipetten har en ensartet diameter (figur 1A).
  3. Arbejd hurtigt, bring de to modificerede pipetteender tæt på flammen og smelte dem lidt. Deltag i disse ender ved at trykke dem fast sammen, hvilket sikrer, at væggene i begge pipetter er kontinuerlige. Hvis der er synlige huller efter sammenføjning, skal du bryde dem fra hinanden og gentage dette trin (figur 1A, B).

2. Fyldning af kamrene med agar

  1. Forbered NGM med 4% agar i henhold til standard ormprocedurer21. Mens agaren stadig er smeltet, fyldes hvert kammer ved at fastgøre det til en serologisk pipettor og langsomt trække opløsningen op. Forsegl spidsen med paraffinfilm, inden kammeret fjernes fra pipettoren. Læg kammeret fladt (parallelt med bordpladen) for at afkøle.
    BEMÆRK: Dækning af kolben med klæbende wrap (se Materialetabel) efter autoklavering hjælper med at forhindre, at der dannes bobler i opløsningen18.
    1. For at minimere eventuelle variationer i agarens konsistens på grund af ujævn afkøling skal du holde pipettoren (se Materialetabel) parallelt med bordpladen, mens du trækker agaren op. Læg kamrene fladt på bordpladen og lad agaren hærde, før den bevæger sig.
      BEMÆRK: Agarprocenten og medieindholdet kan skræddersys til eksperimentet. 4% agar er stivere end den ca. 2% koncentration, der bruges til tallerkenhældning og forhindrer orme i at grave sig gennem mediet i vores hænder. Andre eksperimenter har imidlertid observeret gravningsadfærd hos voksne orme i op til 9% agar18,19.
  2. Når den er afkølet, opvarmes en 3 mm hex-nøgle (eller et andet metalværktøj af samme størrelse, se Materialetabel) over en Bunsen-brænder. Tryk det fast ind i væggen i hvert kammer ca. 5 mm til den ene side af midterlinjen, hvilket skaber en lille åbning i plasten (figur 1C). Brug et opvarmet blad til at fjerne bomulden og de tilspidsede ender af kammeret og forsegle disse ender med paraffinfilm.
    BEMÆRK: Når det er klargjort, skal hvert kammer bruges inden for 1 dag eller opbevares ved 4 °C i flere dage. Dæk eventuelle udsatte åbninger med paraffinfilm for at forhindre agaren i at tørre ud.

3. Isolering af dauer larver

  1. 10-15 dage før eksperimentet klumper hver stamme på 2-3 store NGM-plader med OP50-bakterier og pakkes ind med paraffinfilm. Efter 10-15 dage skal hver plade være fuldt udsultet med tusindvis af dauer larver til stede på agar, vægge og låg.
    BEMÆRK: Lav tallerkener på forhånd ved hjælp af en tyk OP50 opskrift på maksimal trængsel (se Materialetabel). Dauerdannelse kan også induceres gennem andre metoder, herunder tilsætning af feromoner eller ved at vokse ved højere temperaturer22.
  2. Opsamling af orme ved at skylle låg og plader med M9-buffer og pipettere opløsningen i 15 ml centrifugerør. Drej ved 1.600 x g i 30-60 s ved stuetemperatur, og opsug det meste af M9-bufferen med en pipette eller vakuumaspirator.
  3. Isoler dauers ved at behandle med 1% SDS efterfulgt af en 30% saccharoseflotationsgradient efter den tidligere offentliggjorte rapport20.
    1. Tilsæt 7 ml 1% SDS-opløsning til hver ormpille. Lad ormene stå i SDS i 30 min; Drej rørene kontinuerligt i løbet af denne tid for at muliggøre beluftning. Skyl 3-5x med M9 for at fjerne vaskemidlet.
    2. Derefter tilsættes 5 ml M9 efterfulgt af 5 ml kold, filtreret 60% saccharoseopløsning. Bland grundigt, og centrifuger derefter ved 1.600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at skabe en separationsgradient.
  4. Fyld nye 15 ml centrifugerør med 2 ml M9-buffer. Knus enderne af pasteurpipetter af glas for at udvide boringen, og brug disse pipetter til at overføre det øverste lag af opløsningen (indeholdende isolerede dauers) fra saccharosegradienten til de nye rør. Skyl dauers 3-5x med M9.
    BEMÆRK: Der vil være tusindvis af isolerede dauers i opløsning på dette tidspunkt. De kan anvendes straks eller opbevares luftet ved at rotere i 5-7 ml M9 natten over.

4. Tilføjelse af dauers til kammeret

  1. Centrifugedauers ved 1.600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og opsuge det meste af M9-opløsningen med en pipette eller vakuumaspirator. For at estimere ormtætheden skal du manuelt tælle antallet af orme i tre separate 1 μL dråber under et dissekerende mikroskop. Brug gennemsnittet af disse tællinger til at tilnærme antallet af orme pr. μL.
    BEMÆRK: Nogle pipettorer med lille volumen kan muligvis ikke nå bunden af et 15 ml centrifugerør; I dette tilfælde kan en koncentreret dråbe orme først overføres til et stykke paraffinfilm.
  2. Skær enden af en 10, 20 eller 200 μL pipettespids for at udvide boringen. Indstil mikropipetten til et lidt større volumen end det tilsigtede aspirationsvolumen. Aspirer ca. 1-2 μL af den koncentrerede ormopløsning (ideelt mellem 100-300 orme) og lad en lille mængde luft komme ind i spidsen.
    BEMÆRK: Et stort antal orme (1.000+) i et kammer kan øge rækkevidden af tilbagelagte afstande på grund af overbelægning9.
  3. Skub forsigtigt pipettespidsen ind i agaren, mens mikropipetten trykkes ned. Dette vil skabe et injektionssted i agar uden tilstopning af spidsen. Slip ormene i agaren. Brug paraffinfilm til at forsegle åbningen.

5. Løb og scoring af analysen

BEMÆRK: Gravitaxis kan testes under forskellige forhold, der kan påvirke adfærd9.

  1. For at eliminere så mange variabler som muligt skal du placere kamrene i et mørkt Faraday-bur (se Materialetabel) ved stuetemperatur.
  2. Mærk hvert kammer og hæng det lodret i Faraday-buret (udfør dette ved hjælp af mærkningstape). Test vandrette kontroller samtidigt ved at lægge nogle kamre fladt inden for de samme miljøforhold. Test de eksperimentelle stammer mod lodret orienterede N2-orme som en positiv kontrol. Brug vandret orienterede kamre, der indeholder N2-dauers, som en ekstra negativ kontrol.
    BEMÆRK: Vandrette og lodrette assays skal udføres i samme indstilling i laboratoriet for at minimere miljøvariationen mellem de to forhold. En stor inkubator kan bruges til at huse begge Faraday bure.
  3. Dauers begynder at sprede sig fra startstedet efter et par timer og tager flere timer at nå hver ende af kammeret. Lad kamrene være uforstyrrede i løbet af denne tid og score inden for 12-24 timer efter injektion.
    BEMÆRK: Brug ikke en paralytisk (såsom natriumazid) til at immobilisere orme, der har nået enderne af kamrene. Fordi den samlede fordeling af orme måles i stedet for et præferenceindeks (som i et to-valgs assay), er natriumazid unødvendigt og kan ændre resultaterne.
  4. Fjern og scor gravitaksekamre et ad gangen. Se efter levende dauers under et dissekerende mikroskop og marker deres placeringer med blæk (figur 1C, D). Norm må ikke placeres inden for 2,5 cm på hver side af injektionsstedet, da disse orme sandsynligvis ikke vil vise en retningsbestemt præference.
    1. Undgå også at score orme, der ser døde ud eller er fanget i væsken. Kassér kamre, der indeholder >50% døde eller svømmende orme.
      BEMÆRK: Når kammeret er fjernet fra testområdet, skal det scores hurtigt for nøjagtighed. Dauers må kun være synlige mellem agarens overflade og pipettens væg. Hvis der observeres gravningsadfærd, skal du overveje at øge agarkoncentrationen i fremtidige assays.
  5. For at kvantificere resultaterne skal du bruge en markør til at opdele hver halvdel af kammeret i syv 3,5 cm sektioner, der starter 2,5 cm væk fra injektionsstedet (på nogle pipetter 3,5 cm = 1 ml volumen). Brug en manuel tælletæller (se Materialetabel) til at tælle antallet af orme, der observeres i hvert afsnit.
    BEMÆRK: Der skal være syv sektioner på hver side af oprindelsen, som kan nummereres fra -7 (bund) til +7 (øverst). Disse tal skal svare til de samme relative placeringer baseret på, hvordan kamrene blev konstrueret; agar trækkes fra -7-enden til +7-enden i trin 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammenligning af gravitaxis på tværs af arter
Efter den ovenfor beskrevne procedure kan C. briggsae dauer gravitaxis sammenlignes med C. elegans gravitaxis og vandrette kontroller. Den lodrette fordeling (rødbrun) af C. briggsae dauers er skæv mod toppen af kamrene, hvor en stor procentdel af ormene når +7 (figur 2A). I modsætning til vandrette kontroller (aqua), hvor dauers fordeles i en groft klokkeformet kurve omkring midten af kamrene, indikerer denne tendens negativ gravitaktisk adfærd. Disse data kan sammenlignes med C. elegans gravitaxis udført på de samme forsøgsdage (figur 2B).

En Kruskal-Wallis-test efterfulgt af Dunns test med Bonferroni-korrektion for flere sammenligninger fastslog eventuelle signifikante forskelle mellem assays 9,23. I dette eksperiment blev 1.108 C. briggsae dauers scoret på tværs af tre lodrette kamre fra to uafhængige eksperimentelle dage. Disse orme vandrede betydeligt opad end vandrette kontroller (p < 0,001; 1.639 dauers i tre vandrette kamre over 2 eksperimentelle dage). Desuden var de lodrette C. briggsae og lodrette C. elegans fordelinger ikke forskellige (s > 0,05; 386 C. elegans dauers i to lodrette kamre over 2 eksperimentelle dage). Disse resultater tyder på, at C. briggsae dauers viser en negativ gravitaxis adfærd svarende til C. elegans dauers.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af gravitaxisanalysekammer. Billeder, der viser trin i gravitaxis assay kammer forberedelse. (A) Individuelle 5 ml pipetter blev forberedt til fusion i et enkelt kammer. Fjernelse af bomuldsprop angivet med sort pilespids; fjernelse af spids angivet med en hvid pilespids. Rørene, der anvendes i denne undersøgelse, har en indvendig diameter på 6 mm og er hver 34,5 cm lange (før skæring). (B) Færdiggjort kammer inden tilsætning af NGM-agar. Pipetter er blevet smeltet ved først at smelte over en Bunsen-brænder. (C) Eksempler på kamre fyldt med NGM-agar. Injektionsstedet er angivet med en pil og forstørret i indsatsen. Orme er blevet markeret med blæk, og linjer er tegnet for at skelne afstande sammen med kammeret samt for at lette scoring. (D) Visning af kamre i deres helhed (taget efter scoring). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Gravitaxis i C. briggsae vs. C. elegans. Resultater af gravitaxis i C. briggsae og C. elegans. (A) Histogram af C. briggsae gravitaxis. Bevægelse i lodrette kamre (maroon) sammenlignes med vandrette kontroller (aqua). Afstanden fra injektionspunktet (-7 er længst nede, +7 længst over) afbildes som procentdelen af de samlede orm analyseret (x-akse). Der afbildes ingen data for oprindelsen (+0), da orme ikke tælles inden for 2,5 cm til hver side af injektionsstedet. N = 1.639 orme over tre rør i vandret tilstand; lodret N = 1.108 orme på tværs af tre rør. (B) Boxplots, der sammenligner fordelingen af C. briggsae vandrette og lodrette orme versus C. elegans lodrette orme. C. briggsae prøvestørrelser er angivet ovenfor. C. elegans lodret N = 386 orme på tværs af to rør. Midler er angivet med hvide diamanter; lodrette forhold er i rødbrun og er mærket "V", og vandrette forhold ("H") er i vand. Sammenligninger blev foretaget ved hjælp af Kruskal-Wallis-testen, efterfulgt af Dunns test med Bonferroni-korrektion for flere sammenligninger. Ingen stjerner = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenligning med tidligere metoder
I modsætning til kemotaxis kan gravitaxis i Caenorhabditis ikke pålideligt observeres ved hjælp af et traditionelt agarpladeeksperimentelt design. En standard petriskål er 150 mm i diameter, hvilket resulterer i, at der kun er 75 mm til rådighed i begge retninger for dauers at demonstrere gravitaxispræference. Selvom C. elegans orienteringspræference kan analyseres i opløsning12, er denne metode lav gennemstrømning, da orme skal analyseres en ad gangen. Derudover kan gravitaktiske præferencer og adfærd variere mellem orme, der flyder i medier versus kravler på en overflade. Af disse grunde udviklede vi et assay med høj kapacitet med forbedret følsomhed, der kan bruges til at analysere gravitakseadfærd i kravle- eller klatreorme. Fordi C. elegans er følsomme over for lys og elektromagnetiske felter, som begge forstyrrer gravitaktisk præference9, skal disse assays udføres uden nogen af stimulanserne. Hvis der anvendes et hjemmelavet Faraday-bur, er det nødvendigt og anbefales at kontrollere burets styrke og forstærke det.

De analysekamre, der er beskrevet i denne protokol, måler ca. 54 cm i længden og placeres i Faraday-bure for at beskytte mod lys og elektromagnetiske felter. Det blev konstateret, at ændring af "arenaen" for observation af gravitaxisadfærd har flere fordele. For det første giver det mulighed for detaljeret kvantificering og beskrivende analyse. De relative tilbagelagte afstande og den samlede fordeling af orme kan indsamles og sammenlignes i stedet for at tælle antallet af negativt versus positivt gravitaktiske orme. For det andet replikerer det lukkede miljø i en agarfyldt pipette nærmere de forhold, der kan fremme tyngdekraften i naturen. Som nævnt ovenfor er dauer-scenen en spredningsfase, der gør det muligt at flygte fra ugunstige forhold6. Fordi Caenorhabditis lever i kompost, hvor vejledende signaler som lys muligvis ikke er tilgængelige, kan tyngdekraften gøre det muligt for orme at navigere til overfladen 6,9. Todimensionelle pladebaserede assays vil sandsynligvis ikke replikere disse tilstande, selvom de testes uden andre stimuli. Endelig tester dette større apparat større mængder orme i et enkelt assay.

Begrænsninger og andre overvejelser
Mens denne protokol effektivt måler gravitaktisk præference i et stort antal dauers, er det upraktisk for små eller enkelt ormeksperimenter på grund af den tid og materialer, der kræves for at konstruere hvert kammer. Ved at kombinere tællinger på tværs af forsøg i stedet for at bruge et gravitakseindeks øges den statistiske effekt, fordi hver orm behandles som en uafhængig begivenhed. Mens denne forbedrede følsomhed er nyttig til differentiering af gravitaktiske og ikke-gravitaktiske orme, er det vigtigt at bemærke, at C. elegans dauers udviser social adfærd 7,24, der kan påvirke den samlede gravitaxis. Vi fandt ud af, at højere ormtætheder er korreleret med et større interval i den tilbagelagte afstand over det store assay, selvom denne effekt er minimal, når det samlede antal er mindre end ca. 1.000 orme9. Interaktionseffekter som følge af faktorer som de samlede orme i hvert kammer bør overvåges, når dataene analyseres. Som med alle adfærdsmæssige assays bør scoring blændes, når det er muligt.

At finde en gennemsnitlig tæthed af orme i opløsningen kan minimere variabiliteten i antallet af orme injiceret fra kammer til kammer. Orme sætter sig hurtigt i opløsning, så det er vigtigt at blande ormene inden pipettering, enten ved at svirpe rørene eller pipettere op og ned med en bredboret spids. Selv når der opnås en ensartet tæthed, kan antallet af tilføjede orme variere, fordi orme sandsynligvis klæber til indersiden af plastpipettespidserne. Belægning af pipettespidser med BSA eller andre løsninger kan minimere denne effekt. Orme skal injiceres med så lidt opløsning som muligt; Hvis der tilsættes for meget væske til kammeret, bliver orme fanget i opløsningen og kan endda drive. Af denne grund må der kun scores levende, krybende orme, og ethvert kammer, der indeholder mere end 50% døde eller svømmende orme, må ikke anvendes. Kamre skal fjernes fra Faraday-buret en ad gangen og scores inden for 10-15 min for den største nøjagtighed.

Potentielle anvendelser
Dette assay kan bruges til at teste de miljømæssige, genetiske og cellulære krav til gravitaxis i en række Caenorhabditis stammer. Hidtil er lys og elektromagnetiske felter blevet identificeret som stimuli, der forstyrrer gravitaxis9. Imidlertid er C. elegans følsomme over for andre stimuli, herunder temperatur, flygtige og ikke-flygtige kemikalier, tekstur, fugtighed og lyd, som påvirker deres adfærd25,26,27,28. At forstå, hvordan forskellige sensoriske input er integreret i nervesystemet, er et udestående spørgsmål inden for neurovidenskab, især når integration sker på niveau med individuelle neuroner 9,29,30,31,32. Sensorisk integration er især vigtig i proprioception, som i sig selv er en integrativ modalitet, der trækker fra flere sensoriske signaler1.

Forståelse af tyngdekraftsfornemmelse i Caenorhabditis har konsekvenser for menneskers sundhed. Millioner af individer lider af vestibulær dysfunktion i USA alene33, og mange af disse lidelser har underliggende genetiske årsager34,35. Af denne grund er identifikation af genkandidater og målrettede terapier et aktivt forskningsområde36. Da hvirveldyrs vestibulære og auditive systemer er tæt forbundet udviklingsmæssigt og evolutionært33,36,37, kan belysning af tyngdekraftsfornemmelse også give indsigt i høre- og høreforstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af forskningsbevillinger fra National Institutes of Health til JHR (#R01 5R01HD081266 og #R01GM141493). Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi vil gerne anerkende Pradeep Joshi (UCSB) for hans redaktionelle input. Statistisk konsultation leveret af UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

Adfærd udgave 183
Storstilet gravitaxis-analyse af <em>Caenorhabditis</em> Dauer-larver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter