Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

कृंतक हृदय में वायरल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और कार्डियक अतालता जोखिम का आकलन

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64073
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,3, 1,2, 1, 1,2
1University of Ottawa Heart Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल इकोकार्डियोग्राफी मार्गदर्शन के तहत वायरस के प्रत्यक्ष इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन द्वारा चूहे और माउस के दिल में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के तरीकों का वर्णन करता है। पृथक, लैंगेंडॉर्फ-परफ्यूज्ड दिलों की क्रमादेशित विद्युत उत्तेजना द्वारा वेंट्रिकुलर अतालता के लिए दिल की संवेदनशीलता के आकलन के तरीके भी यहां बताए गए हैं।

Abstract

हृदय रोग दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण है। ट्रांसजेनिक उपभेदों की हैंडलिंग और बहुतायत में आसानी के कारण, कृंतक कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान के लिए आवश्यक मॉडल बन गए हैं। हालांकि, सहज घातक कार्डियक अतालता जो अक्सर हृदय रोग के रोगियों में मृत्यु दर का कारण बनती है, हृदय रोग के कृंतक मॉडल में दुर्लभ है। यह मुख्य रूप से मानव और कृन्तकों के बीच कार्डियक विद्युत गुणों में प्रजातियों के अंतर के कारण है और कृन्तकों का उपयोग करके कार्डियक अतालता के अध्ययन के लिए एक चुनौती है। यह प्रोटोकॉल पुनः संयोजक वायरस (एडेनोवायरस और एडेनो से जुड़े वायरस) के इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन का उपयोग करके माउस और चूहे वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम में कुशल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को सक्षम करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। यह काम एड्रीनर्जिक और प्रोग्राम्ड विद्युत उत्तेजना दोनों के साथ पृथक, लैंगेंडॉर्फ-परफ्यूज्ड माउस और चूहे के दिल का उपयोग करके अतालता के लिए हृदय संवेदनशीलता के विश्वसनीय मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए एक विधि को भी रेखांकित करता है। ये तकनीकें चोटों के बाद प्रतिकूल कार्डियक रीमॉडेलिंग से जुड़े हृदय ताल विकारों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि मायोकार्डियल रोधगलन।

Introduction

कार्डियोवैस्कुलर बीमारी दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है, अकेले 2017 में 18 मिलियन लोगों की जानचली गई। कृंतक, विशेष रूप से चूहे और चूहे, हैंडलिंग में आसानी और विभिन्न ट्रांसजेनिक ओवरएक्प्रेशन या नॉकआउट लाइनों की उपलब्धता के कारण कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल बन गए हैं। कृंतक मॉडल रोग तंत्र को समझने और मायोकार्डियल रोधगलन2, उच्च रक्तचाप3, दिल की विफलता4 और एथेरोस्क्लेरोसिस 5 में संभावित नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए मौलिक रहेहैं। हालांकि, कार्डियक अतालता के अध्ययन में कृन्तकों का उपयोग मानव या बड़े पशु मॉडल की तुलना में उनके छोटे हृदय आकार और तेज हृदय गति से सीमित है। इसलिए, मायोकार्डियल रोधगलन के बाद चूहों या चूहों में सहज घातक अतालतादुर्लभ हैं। जांचकर्ताओं को अप्रत्यक्ष माध्यमिक परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए मजबूर किया जाता है जो एक प्रो-अरिदमिक सब्सट्रेट को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जैसे फाइब्रोसिस या जीन अभिव्यक्ति, अतालता बोझ या प्रो-लयबद्ध प्रवृत्तियों में सार्थक परिवर्तन दिखाए बिना। इस सीमा को दूर करने के लिए, एक विधि जो आनुवंशिक संशोधन 6,7 या मायोकार्डियल रोधगलन2 के बाद वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया के लिए माउस और चूहे के दिल की संवेदनशीलता का विश्वसनीय मूल्यांकन करने की अनुमति देती है, वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित है। यह विधि पृथक, लैंगेंडॉर्फ-परफ्यूज्ड8 माउस और चूहे के दिलों में वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया को प्रेरित करने के लिए प्रोग्राम्ड विद्युत उत्तेजना के साथ एड्रीनर्जिक रिसेप्टर उत्तेजना को जोड़ती है।

कृंतक मायोकार्डियल ऊतक में वायरल जीन हस्तांतरण के लिए मानक दृष्टिकोण में अक्सर थोराकोटॉमी 9,10,11 द्वारा हृदय के संपर्क में आना शामिल होता है, जो एक आक्रामक प्रक्रिया है और प्रक्रिया के बाद जानवरों की देरी से वसूली से जुड़ा होता है। यह लेख ट्रांसजेन के ओवरएक्प्रेशन के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग मार्गदर्शन के तहत वायरस के प्रत्यक्ष इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन की एक विधि का वर्णन करता है। यह कम आक्रामक प्रक्रिया थोराकोटॉमी की तुलना में वायरल इंजेक्शन और कम ऊतक की चोट के बाद तेजी से पशु वसूली की अनुमति देती है, पशु में पोस्ट-ऑपरेटिव दर्द और सूजन को कम करती है, और इस प्रकार, हृदय समारोह पर ट्रांसजेनिक जीन के प्रभावों का बेहतर मूल्यांकन करने की अनुमति देती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

वर्णित सभी तरीकों और प्रक्रियाओं को ओटावा विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान नैतिक समीक्षा बोर्ड और ओटावा हार्ट इंस्टीट्यूट विश्वविद्यालय में जैव सुरक्षा समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। विकसित सुरक्षा प्रोटोकॉल में शामिल है कि पुनः संयोजक एडेनोवायरस या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) से निपटने वाली सभी प्रक्रियाएं स्तर द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में की गई थीं। प्रयोग के बाद वायरस के संपर्क में आने वाली सभी वस्तुओं को पूरी तरह से परिशोधन कर दिया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए Ctnnb1फ्लोक्स/फ्लोक्स और αMHC-MerCreMer चूहों (8-12 सप्ताह के, या तो लिंग के) और स्प्राग-डॉवले चूहों (200-250 ग्राम, पुरुष) का उपयोग किया गया था। जानवरों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। जानवरों से निपटने वाली सभी प्रक्रियाएं कर्मचारियों द्वारा की गई थीं जिन्हें संस्थागत नियामक समितियों द्वारा प्रशिक्षित और अनुमोदित किया गया है। सभी प्रक्रियाओं के दौरान उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग किया गया था।

1. कृंतक वेंट्रिकुलर ऊतकों में वायरल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति

नोट: पुनः संयोजक एडेनोवायरस या एएवी स्टोर करें जो लक्ष्य जीन और संबंधित नियंत्रण वायरस को व्यक्त करता है, जैसे कि एडी-जीएफपी (1 x 1010 पीएफयू / एमएल का टिटर) या एएवी 9-जीएफपी (1 x 1013 जीसी / एमएल का टिटर) ( सामग्री की तालिका देखें), -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में।

  1. वायरस इंजेक्शन के दिन, बर्फ पर वायरस को पिघलाएं। लक्ष्य जीन और नियंत्रण वायरस को व्यक्त करने वाले वायरस को 30 जी 1/2 सुइयों के साथ दो अलग-अलग सिरिंज (वॉल्यूम = 50 μL) में विभाजित करें और उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।
    नोट: सिरिंज और सुई में किसी भी बुलबुले को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाना चाहिए।
  2. चूहों या चूहों को ब्यूप्रेनोर्फिन दें (चूहों के लिए 0.05 मिलीग्राम / किग्रा, चूहों के लिए 0.1 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे), 1 घंटे बाद 3% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके संज्ञाहरण को प्रेरित करें, और बाद की प्रक्रिया के लिए 2% (0.5-1.0 एल / मिनट की प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में) पर आइसोफ्लुरेन बनाए रखें।
  3. धीरे से जानवर के शरीर (जैसे, पूंछ) को बल की एक जोड़ी के साथ चुटकी लें, और यदि जानवर किसी भी शरीर के आंदोलनों के साथ चुटकी का जवाब नहीं देता है, तो उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि की जाती है।
  4. एक इलेक्ट्रिक हीटिंग पैड का उपयोग करके शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। हेयर क्लिपर का उपयोग करके छाती क्षेत्र में बालों को शेव करें।
    नोट: संभावित असमान गर्मी वितरण के कारण इलेक्ट्रिक हीटिंग पैड का उपयोग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए।
  5. कॉर्निया को सूखने से रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
  6. जानवर को लापरवाह स्थिति में रखें और शॉर्ट-एक्सिस ओरिएंटेशन में जानवर के दिल की अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए प्रीक्लिनिकल इमेजिंग सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    नोट: निम्नलिखित चरणों को एक स्तर II जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है जो एक बाँझ वातावरण प्रदान करता है। सुरक्षित सुई हैंडलिंग सहित मानक सुरक्षा प्रक्रियाओं को नियोजित किया जाता है।
  7. आयोडीन-आधारित या क्लोरहेक्सिडाइन-आधारित स्क्रब और अल्कोहल के वैकल्पिक राउंड के साथ जानवर के बाएं निचले छाती क्षेत्र को एक गोलाकार गति में तीन बार निष्फल करें।
  8. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग मार्गदर्शन के तहत, चरण 1.1 में तैयार किए गए वायरस युक्त सिरिंज की 30 जी 1/2 सुई डालें। शरीर के बाएं निचले छाती के माध्यम से जानवर की छाती में प्रवेश करें।
  9. सुई की नोक को बाएं वेंट्रिकुलर फ्रंट फ्री दीवार में जाएं और धीरे-धीरे वायरस के 10-15 μL इंजेक्ट करें। सुई की नोक के पास बढ़ी हुई चमक द्वारा अल्ट्रासाउंड छवियों में सफल इंजेक्शन की पुष्टि करें।
    नोट: मायोकार्डियल ऊतकों को शारीरिक क्षति को रोकने के लिए प्रत्येक साइट पर इंजेक्ट किए गए वायरस की मात्रा 15 μL से अधिक नहीं है।
  10. सुई को दिल से निकालें और वायरस की समान मात्रा के दूसरे और तीसरे इंजेक्शन के लिए इसे बाएं वेंट्रिकल के अन्य क्षेत्रों में डालें।
    नोट: इंजेक्शन साइटों की कुल संख्या प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्धारित की जाती है। यदि फोकल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है, तो केवल एक इंजेक्शन की आवश्यकता होती है; यदि अधिक प्रभावी ट्रांसजेन अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है, तो आमतौर पर कई इंजेक्शन साइटों (तीन से पांच) की आवश्यकता होती है।
  11. इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, जानवर को उसके पिंजरे में वापस कर दें।
  12. सावधानीपूर्वक जानवर की निगरानी करें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने और इसे अपने आवास कक्ष में वापस करने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
  13. अगले 2 दिनों के लिए जानवर को ब्यूप्रेनोर्फिन एचसीएल (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, चूहों के लिए दिन में दो बार, 0.05 मिलीग्राम / किग्रा, चूहों के लिए दिन में दो बार, चमड़े के नीचे) का उपयोग करें। जानवरों को विवेरियम में वापस करें और दर्द या संकट के किसी भी असामान्य संकेत के लिए दैनिक निगरानी करें, और यदि पाया जाता है, तो संस्थागत पशु देखभाल समिति प्रोटोकॉल के अनुसार जानवरों का इलाज करें।

2. हृदय अतालता संवेदनशीलता का आकलन

नोट: एडेनोवायरस इंजेक्शन के 4-6 दिनों और एएवी इंजेक्शन के 1-2 सप्ताह बाद, चरण 2.1.-2.2 के बाद कार्डियक अतालता के लिए पशु हृदय की संवेदनशीलता का आकलन करें।

  1. चूहे या माउस के दिल का लैंगनडॉर्फ छिड़काव करें।
    1. 1 लीटर पानी में निम्नलिखित जोड़कर टायरोड समाधान तैयार करें: NaCl, 7.9 g (अंतिम = 135 mM); केसीएल, 0.37 ग्राम (5.0 एमएम); CaCl2, 0.27 ग्राम (1.8 mM); एमजीसीएल2, 0.24 ग्राम (1.2 एमएम); HEPES, 2.38 ग्राम (10 mM); और ग्लूकोज, 1.8 ग्राम (10 एमएम)। पीएच को एनएओएच के साथ 7.40 में समायोजित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. चरण 2.1.6.-2.2.8 के दौरान लगातार 100%O2 के साथ 0.2 μm फ़िल्टर और बुलबुले के साथ समाधान फ़िल्टर करें।
    3. चूहे या माउस को हेपरिन दें (500 यू / किग्रा, इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन) और 10 मिनट बाद जानवर को 3% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें। शरीर पर एक कोमल चुटकी के साथ पर्याप्त एनेस्थेटाइजेशन सुनिश्चित करें।
    4. बाएं थोराकोटॉमी के लिए मध्य-क्लेवकुलर लाइन में 1-1.5 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाने और दिल को उजागर करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें।
    5. महाधमनी आर्क स्तर पर कैंची की एक जोड़ी के साथ काटकर दिल को इकट्ठा करें और तुरंत दिल को बर्फ-ठंडे टायरोड समाधान में डालें।
      नोट: हृदय संग्रह के दौरान दिल को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधानी बरती जाती है।
    6. निरंतर प्रवाह दर मोड में एक संशोधित लैंगेंडोर्फ छिड़काव प्रणाली ( सामग्री की तालिका देखें) से जुड़े कुंद सुई (चूहों के लिए 18 ग्राम; चूहों के लिए 23 ग्राम) के साथ हृदय की महाधमनी को कैनुला करें। छिड़काव दबाव को 70-80 मिमीएचजी पर रखने के लिए प्रवाह दर समायोजित करें।
      नोट: महाधमनी प्रवेशनी से पहले छिड़काव सुई में किसी भी बुलबुले को हटा दिया जाना चाहिए। विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से प्रवेशनी की सुविधा मिलती है।
    7. कैनुलेटेड दिल को सिलिकॉन इलास्टोमेर-लेपित9, 10 सेमी प्लास्टिक डिश में बाएं वेंट्रिकल के साथ रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ 2-बबल टायरोड समाधान के साथ दिल 9,12 को भरें।
    8. छिड़काव की शुरुआत में पहले दो से तीन दिल की धड़कनों के दौरान दिल से रक्त के वॉशआउट और दिल के रंग को लाल से पीला करके सही महाधमनी प्रवेशनी को सत्यापित करें।
    9. डिश में सिलिकॉन इलास्टोमर कोटिंग में डालकर दिल के चारों ओर एक छोटे जानवर ईसीजी सिस्टम (सामग्री की तालिका देखें) के इलेक्ट्रोड रखें (चित्रा 1)। संगत सॉफ़्टवेयर का उपयोग करईसीजी रिकॉर्ड करें।
  2. वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया को प्रेरित करने के लिए एड्रीनर्जिक रिसेप्टर उत्तेजना और प्रोग्राम्ड विद्युत उत्तेजना करें।
    1. सफल महाधमनी प्रवेशनी के बाद, हृदय की तैयारी को स्थिर करने के लिए 20 मिनट के लिए टायरोड समाधान के साथ दिल को संक्रमित करना जारी रखें।
    2. चरण 2.2.3.-2.2.8 में हृदय छिड़काव के लिए उपयोग किए जाने वाले टायरोड समाधान में 1 μM आइसोप्रोटेरोल ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
    3. आइसोप्रोटेनोल छिड़काव के 10 मिनट के बाद, एक विद्युत उत्तेजक से जुड़े दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के साथ शीर्ष पर दिल को उत्तेजित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. उत्तेजना प्रक्रिया (चित्रा 2) से शुरू करें, जिसमें 10 लगातार उत्तेजनाएं (एस 1, 5 वी, 100 एमएस अंतराल) शामिल हैं, जिसके बाद 80 एमएस के प्रारंभिक अंतराल के साथ एक अतिरिक्त उत्तेजना (एस 2) होती है। बार-बार एस 2 अंतराल को हर बार 2 एमएस तक कम करें जब तक कि दिल की धड़कन को अब कैप्चर नहीं किया जा सकता है (यानी, दिल की प्रभावी दुर्दम्य अवधि, ईआरपी) 13 तक पहुंचना।
    5. ईसीजी द्वारा किसी भी प्रेरित वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया (वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया और फाइब्रिलेशन सहित) की निगरानी करें।
    6. यदि उपरोक्त प्रक्रिया से कोई अतालता प्रेरित नहीं होती है, तो ईआरपी तक पहुंचने तक समान प्रारंभिक (80 एमएस) और ह्रास (2 एमएस द्वारा) अंतराल के साथ एस 2 के बाद एक और अतिरिक्त उत्तेजना (एस 3) जोड़ें।
    7. यदि वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया अभी भी प्रेरित नहीं हैं, तो ईआरपी तक पहुंचने तक समान प्रारंभिक और ह्रास अंतराल के साथ एस 3 के बाद एक और अतिरिक्त उत्तेजना (एस 4) जोड़ें।
    8. यदि वेंट्रिकुलर टैचीयारिथमिया अभी भी प्रेरित नहीं हैं (जैसा कि स्वस्थ दिल को नियंत्रित करने में अपेक्षित है), विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल को रोकें और हृदय को गैर-इंड्यूसेबल मानें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का पालन करते समय, एक पृथक चूहा या माउस दिल कम से कम 4 घंटे के लिए लयबद्ध और स्थिर रूप से धड़कता है। यदि प्रयोगात्मक डिजाइन को हृदय छिड़काव की लंबी अवधि की आवश्यकता होती है, तो लंबे समय तक छिड़काव14 के बाद मायोकार्डियल एडिमा की घटना को कम करने के लिए छिड़काव समाधान में एल्बुमिन जोड़ना सहायक होता है। छिड़काव समाधान में आइसोप्रोटेरेनॉल का समावेश सहानुभूति तंत्रिका तंत्र के सक्रियण की नकल करता है जो मायोकार्डियल रोधगलन और दिल की विफलता जैसी कई अरिदमोजेनिक स्थितियों में होता है। प्रोग्राम किए गए विद्युत उत्तेजना के दौरान, दिल की सफल पेसिंग को (1) लगातार एस 1 उत्तेजनाओं के दौरान दिल की धड़कन के 1: 1 कैप्चर और (2) एस 1 पेसिंग के दौरान लंबे समय तक (या व्यापक) क्यूआरएस कॉम्प्लेक्स द्वारा सत्यापित किया जाता है (चित्रा 3 और चित्रा 4)। उत्तरार्द्ध इसलिए है क्योंकि दिल को शीर्ष पर गति दी जा रही है और वेंट्रिकुलर ऊतकों में सक्रियण का धीमा चालन क्यूआरएस जटिल अवधि को बढ़ाता है।

जैसा कि प्रकाशित डेटा 2,7 (चित्रा 3 और चित्रा 4) में दिखाया गया है, इन संयुक्त एड्रीनर्जिक और विद्युत उत्तेजनाओं ने स्वस्थ माउस दिलों (चित्रा 3 में शाम-संचालित जंगली-प्रकार के दिल) या नियंत्रित चूहे के दिल (चित्रा 4 में एडी-जीएफपी-इंजेक्शन वाले चूहे के दिल को नियंत्रित करना) में कोई वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया (कम से कम तीन लगातार समयपूर्व वेंट्रिकुलर कॉम्प्लेक्स, पीवीसी के रूप में परिभाषित) को प्रेरित नहीं किया। ). इसके विपरीत, एक ही प्रोटोकॉल ने मायोकार्डियल रोधगलन (चित्रा 3 बी) के बाद जंगली प्रकार के माउस दिलों के 77% में वेंट्रिकुलर टैचीरिथमिया को प्रेरित किया और एडी-डब्ल्यूएनटी 3 ए के इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन के बाद चार चूहों के दिलों में से तीन में (चित्रा 4)। यह इस वेंट्रिकुलर अतालता-उत्प्रेरण दृष्टिकोण की उच्च निष्ठा को दर्शाता है।

वायरस इंजेक्शन के बाद सफल इंट्रामायोकार्डियल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, वेस्टर्न ब्लॉट या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पहचाने गए मायोकार्डियल ऊतकों में ट्रांसजेन के अनियमित एमआरएनए और प्रोटीन स्तर द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। यदि वायरस जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन को व्यक्त करता है, तो सफल वायरल ट्रांसडक्शन को जीएफपी9 की अभिव्यक्ति द्वारा पृथक, जीवित, एकल कार्डियोमायोसाइट्स में भी सत्यापित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक पृथक चूहे के दिल का लैंगनडॉर्फ छिड़काव। दिल को जानवर से एकत्र किया जाता है, और महाधमनी को कुंद 18 ग्राम सुई के साथ प्रवेशित किया जाता है। सुई 70-80 मिमीएचजी के दबाव पर 37 डिग्री सेल्सियस टायरोड समाधान से भरे 10 एमएल सिरिंज से जुड़ी होती है। दिल को एक सिलिकॉन इलास्टोमर-लेपित, 10 सेमी प्लास्टिक डिश में रखा जाता है जिसमें बाएं वेंट्रिकल का सामना होता है। एक छोटे से पशु ईसीजी सिस्टम के इलेक्ट्रोड (लाल, हरे और काले रंग) को डिश में सिलिकॉन इलास्टोमर कोटिंग में डालकर दिल के चारों ओर रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: लैंगेंडॉर्फ-परफ्यूज्ड दिल की एड्रीनर्जिक और विद्युत उत्तेजनाएं। (ए) चूहे या माउस दिल को लैंगेंडॉर्फ प्रणाली पर चढ़ाया जाता है जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, और 1 μM आइसोप्रोटेरोनॉल को हृदय के 1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स को उत्तेजित करने के लिए परफ्यूजिंग टायरोड समाधान में जोड़ा जाता है। फिर दिल को एक उत्तेजक से जुड़े दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड द्वारा शीर्ष पर उत्तेजित किया जाता है। (बी) प्रोग्राम किए गए विद्युत उत्तेजना का प्रतिनिधित्व। विवरण के लिए, चरण 2.2 देखें। आंकड़े को वांग एट अल.2 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(A) प्रतिनिधि पूर्व विवो ECG (लीड II) एक वाइल्ड-टाइप (WT) माउस दिल (मायोकार्डियल रोधगलन, एमआई के 8 सप्ताह बाद) में प्रोग्राम्ड विद्युत उत्तेजना (PES) -प्रेरित वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (VT, जिसे लगातार तीन या अधिक समयपूर्व वेंट्रिकुलर कॉम्प्लेक्स, PVCs के रूप में परिभाषित किया गया है) को दर्शाता है, जब एक अतिरिक्त उत्तेजना (S2) के साथ उत्तेजित किया जाता है, लेकिन हृदय-विशिष्ट में केवल एक एकल PVC होता है। β-कैटेनिन नॉकआउट (केओ) माउस हार्ट (एमआई के 8 सप्ताह बाद) जब तीन अतिरिक्त उत्तेजनाओं (एस 4) के साथ उत्तेजित होता है। पीईएस उत्तेजना के दौरान परफ्यूजिंग टायरोड समाधान में आइसोप्रोटेरेनॉल (1 μM) को शामिल किया गया था। कार्डियक-विशिष्ट β-कैटेनिन (Ctnnb1) नॉकआउट चूहों को क्रॉस-ब्रीडिंग Ctnnb1फ्लोक्स/फ्लोक्स चूहों (एक्सॉन 2 से 6 फ्लोक्स्ड के साथ) द्वारा उत्पन्न किया गया था। 8-12 सप्ताह की उम्र में, Ctnnb1फ्लोक्स/फ्लोक्स;αMHC-MerCreMer+/− चूहे (KO) और लिटरमेट Ctnnb1फ्लोक्स/ चूहों (नियंत्रित जंगली-प्रकार के चूहों के रूप में उपयोग किया जाता है) को एमआई या शाम समूह को सौंपे जाने से पहले लगातार 5 दिनों के लिए टैमोक्सीफेन (20 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) के दैनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्राप्त हुए। (बी) एमआई के 1 सप्ताह या 8 सप्ताह बाद डब्ल्यूटी और केओ दिलों में पीईएस-प्रेरित पीवीसी और वीटी का सारांश। बाईं तालिका में मानदंडों के अनुसार प्रत्येक दिल को एक अतालता स्कोर सौंपा गया था। एमआई के 8 सप्ताह बाद, वीटी को 77% डब्ल्यूटी दिलों में सफलतापूर्वक प्रेरित किया गया था, लेकिन केवल 18% केओ दिलों में। डेटा का विश्लेषण दो-तरफ़ा एनोवा और बोनफेरोनी पोस्ट-हॉक तुलना द्वारा किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि (SE) इंगित करती हैं. यह आंकड़ा वांग एट अल.2 की अनुमति से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए) पीईएस ने चूहों (200-250 ग्राम, पुरुष, स्प्रैग-डॉवले) के दिल में वेंट्रिकुलर अतालता को प्रेरित किया, जो 4-6 दिन में डब्ल्यूएनटी 3 ए (एडी-डब्ल्यूएनटी 3 ए, नीचे) को व्यक्त करने वाले एडेनोवायरस के इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन के बाद चूहों के दिल में वेंट्रिकुलर अतालता को प्रेरित करता है। दिलों को अलग किया गया और लैंगेंडॉर्फ सिस्टम पर डाला गया। पीईएस उत्तेजना के दौरान परफ्यूजिंग टायरोड समाधान में आइसोप्रोटेरेनॉल (1 μM) को शामिल किया गया था। पूर्व विवो पीईएस उत्तेजना के दौरान ईसीजी लगातार दर्ज किया गया था। ध्यान दें कि इस प्रयोग में लगातार 11 एस 1 उत्तेजनाओं (नीला रंग) का उपयोग किया गया था। (बी) पैनल (ए) में अध्ययनों का सारांश: वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (वीटी) को एडी-डब्ल्यूएनटी 3 ए इंजेक्शन के साथ चार में से तीन दिलों में पीईएस द्वारा प्रेरित किया गया था, लेकिन नियंत्रण एड-जीएफपी के साथ चार दिलों में से किसी में भी नहीं। यह आंकड़ा लू एट अल.7 की अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

लैंगेंडॉर्फ-संक्रमित, पृथक हृदय तैयारी की सफलता के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, हृदय संग्रह के दौरान दिल को किसी भी नुकसान से बचना महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, कैंची के साथ आकस्मिक निचोड़ने या काटने के कारण)। दूसरे, एकत्रित दिल को जल्द से जल्द ठंडे टायरोड समाधान में डालना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे दिल की धड़कन रुक जाएगी और हृदय की ऑक्सीजन की खपत कम हो जाएगी। तीसरा, महाधमनी में सुई सम्मिलन बहुत गहरा नहीं होना चाहिए- आदर्श रूप से, सुई की नोक महाधमनी वाल्व स्तर के करीब होती है ताकि हृदय कोरोनरी धमनियों के माध्यम से अच्छी तरह से संक्रमित हो। अंत में, छिड़काव सुई में बुलबुले को महाधमनी प्रवेशनी से पहले हटाने की आवश्यकता होती है- आमतौर पर सुई की नोक पर बुलबुले को हटाने के लिए कैनुलाशन से ठीक पहले कुछ सेकंड के लिए पंप को चालू करना सहायक होता है।

लैंगेंडॉर्फ-परफ्यूज्ड दिल की तैयारी में जानवरों में विवो अध्ययनों की तुलना में कई फायदे हैं। सबसे पहले, हृदय पर लागू दवाओं की एकाग्रता और अवधि को सटीक रूप से नियंत्रित करना संभव है (उदाहरण के लिए, आइसोप्रोटेनोल, जैसा कि इस अध्ययन में उपयोग किया गया है)। दूसरे, यह उत्तेजना के लिए दिल के विभिन्न क्षेत्रों तक आसान पहुंच की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, इस पांडुलिपि में शीर्ष पर विद्युत पेसिंग) या शारीरिक संकेत रिकॉर्डिंग (उदाहरण के लिए, सीए2 + संवेदनशील या वोल्टेज-संवेदनशील डाई के साथ लोड होने के बाद वेंट्रिकुलर ऊतकों का ऑप्टिकल मानचित्रण, जिसे यहां वर्णित नहीं किया गया है)। इसके अलावा, कार्डियक फ़ंक्शन, जैसे वेंट्रिकुलर सिकुड़न, को बाएं वेंट्रिकल में एक गुब्बारा डालकर और गुब्बारे को दबाव ट्रांसड्यूसर 8 से जोड़कर आसानी से मापा जा सकताहै। तीसरा, हृदय के आंतरिक गुण, जैसे हृदय गति और वेंट्रिकुलर सिकुड़न, विवो अध्ययनों में जटिल कारकों के बिना जांच की जा सकती है, जैसे स्वायत्त तंत्रिका तंत्र और परिसंचारी हार्मोन। हालांकि, लैंगेंडॉर्फ-परफ्यूज्ड दिल की सीमा यह है कि इसमें परिसंचारी कारकों या स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के माध्यम से विवो15,16,17 में विभिन्न अंगों या ऊतकों के बीच क्रॉस-टॉक का अभाव है, जो कुछ अध्ययनों में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हो सकता है।

लैंगेंडॉर्फ-परफ्यूज्ड हार्ट की एक्स विवो ईसीजी रिकॉर्डिंग, जैसा कि यहां और पिछलेप्रकाशनों 2,6,7,9 में वर्णित है, में संपर्क रहित रिकॉर्डिंग का लाभ है और ऑप्टिकल मैपिंग जैसे अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में हृदय के कार्य में कोई गड़बड़ी नहीं है, जिसके लिए सीए2 + के लोडिंग की आवश्यकता होती है। -संवेदनशील या वोल्टेज-संवेदनशील रंजक और यांत्रिक हृदय आंदोलन (जैसे ब्लेबिस्टैटिन) को कम करने के लिए उत्तेजना-संकुचन अनकपलर का उपयोग 12,18। हालांकि, ऑप्टिकल मैपिंग में दिल की विद्युत गतिविधियों पर अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान करने का लाभ है, जैसे कि दिल की धड़कन की उत्पत्ति, मायोकार्डियल सक्रियण का पैटर्न और मायोकार्डियल चालन वेग।

वायरस के प्रत्यक्ष इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन की विधि, जैसा कि यहां वर्णित है, का उपयोग अन्य चिकित्सीय सामग्रियों 19,20,21,22,23,24, जैसे बायोमैटेरियल्स, एक्सॉन, संशोधित एमआरएनए और स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के वितरण के लिए भी किया जा सकता है। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग-निर्देशित इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन में पारंपरिक थोराकोटॉमी-आधारित इंजेक्शन दृष्टिकोण पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह कम आक्रामक है और इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद जानवरों की तेजी से वसूली की अनुमति देता है। यह जानवरों पर प्रक्रिया से जुड़े प्रभावों को कम करता है (उदाहरण के लिए, ऑपरेशन के बाद दर्द और छाती के ऊतकों की सूजन के कारण जब एक आक्रामक थोराकोटॉमी का उपयोग किया जाता है)। दूसरे, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग दिल में सफल वायरस इंजेक्शन की पुष्टि करता है, जो परिणामों की स्थिरता और प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है। हालांकि, अल्ट्रासाउंड-निर्देशित वायरस इंजेक्शन दृष्टिकोण की सीमा यह है कि वायरस इंजेक्शन साइटों के स्थानों को थोराकोटॉमी-आधारित दृष्टिकोण के रूप में ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, जो विभिन्न हृदय क्षेत्रों के दृश्य स्थानीयकरण की अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को कनाडाई इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर) परियोजना अनुदान (पीजेटी -148918 और पीजेटी -180533, डब्ल्यूएल), सीआईएचआर प्रारंभिक कैरियर अन्वेषक पुरस्कार (एआर 8-162705, डब्ल्यूएल को), हार्ट एंड स्ट्रोक फाउंडेशन ऑफ कनाडा (एचएसएफसी) मैकडॉनल्ड छात्रवृत्ति और नए अन्वेषक पुरस्कार (एस -17-एलआई -0866, डब्ल्यूएल के लिए), छात्र छात्रवृत्ति (जेडब्ल्यू और वाईएक्स के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक अपने तकनीकी समर्थन के लिए श्री रिचर्ड सीमोर को धन्यवाद देते हैं। चित्रा 2 अनुमोदित लाइसेंस के साथ Biorender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle Becton Dickinson (BD) 305106
adeno-associated virus (AAV9-GFP) Vector Biolabs 7007
adenovirus (Ad-GFP) Vector Biolabs 1060
adenovirus (Ad-Wnt3a) Vector Biolabs ADV-276318
Biosafety cabinet (Level II) Microzone Corporation N/A Model #: BK-2-4
Buprenorphine Vetergesic DIN 02342510
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 102378
D-Glucose Fisher Chemical D16-1
Hair clipper WAHL Clipper Corporation 78001
Hamilton syringe Sigma-Aldrich 20701 705 LT, volume 50 μL
Heating pad Life Brand E12107
Heparin Fresenius Kabi DIN 02264315
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Isoflurane Fresenius Kabi Ltd. M60303
Isoproterenol hydrochloride Sigma-Aldrich 1351005
LabChart 8 software ADInstruments Inc. Version 8.1.5 for ECG recording
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
Mice (Ctnnb1flox/flox) Jackson Labs 4152
Mice (αMHC-MerCreMer) Jackson Labs 5650
Microscope Leica S9i for Langendorff system
MS400 transducer VisualSonic Inc. N/A
Ophthalmic ointment Systane DIN 02444062
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Pressure meter NETECH DigiMano 1000 for Langendorff system
Pump Cole-Parmer UZ-77924-65 for Langendorff system
Rat (Sprague-Dawley, male) Charles River 400
Scalpel blades Fine Science Tools 10010-00
Scalpel handle Fine Science Tools 10007-12
Silicone elastomer Down Inc. Sylgard 184 for Langendorff system
Small animal ECG system ADInstruments Inc. N/A Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 567530
Stimulator IonOptix MyoPacer EP
VEVO3100 Preclinical Imaging System VisualSonic Inc. N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
  2. Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
  3. Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
  4. Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
  5. Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
  6. Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
  7. Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
  8. Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
  9. Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
  10. Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
  11. Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
  12. Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
  13. Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
  14. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
  15. Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
  16. Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
  17. Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
  18. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  19. Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
  20. Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
  21. Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
  22. McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
  23. Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
  24. Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).

Tags

जीव विज्ञान अंक 185
कृंतक हृदय में वायरल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और कार्डियक अतालता जोखिम का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, A., Wang, J., Xia, Y., Gu, R.,… More

Lu, A., Wang, J., Xia, Y., Gu, R., Kim, K. H., Mulvihill, E. E., Davis, D. R., Beanlands, R. S., Liang, W. Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk. J. Vis. Exp. (185), e64073, doi:10.3791/64073 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter