Summary
Il presente protocollo descrive i metodi per l'espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.
Abstract
Le malattie cardiache sono la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo. A causa della facilità di manipolazione e dell'abbondanza di ceppi transgenici, i roditori sono diventati modelli essenziali per la ricerca cardiovascolare. Tuttavia, le aritmie cardiache letali spontanee che spesso causano mortalità nei pazienti con malattie cardiache sono rare nei modelli di roditori di malattie cardiache. Ciò è dovuto principalmente alle differenze di specie nelle proprietà elettriche cardiache tra uomo e roditori e rappresenta una sfida per lo studio delle aritmie cardiache utilizzando i roditori. Questo protocollo descrive un approccio per consentire un'espressione transgenica efficiente nel miocardio ventricolare di topo e ratto utilizzando iniezioni intramuscolari guidate da ecocardiografia di virus ricombinante (adenovirus e virus adeno-associati). Questo lavoro delinea anche un metodo per consentire una valutazione affidabile della suscettibilità cardiaca alle aritmie utilizzando cuori di topo e ratto isolati e perfusi da Langendorff con stimolazioni elettriche sia adrenergiche che programmate. Queste tecniche sono fondamentali per lo studio dei disturbi del ritmo cardiaco associati al rimodellamento cardiaco avverso dopo lesioni, come l'infarto del miocardio.
Introduction
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo, causando la morte di 18 milioni di persone nel solo 20171. I roditori, in particolare topi e ratti, sono diventati il modello più comunemente usato nella ricerca cardiovascolare a causa della facilità di manipolazione e della disponibilità di varie linee di sovraespressione transgenica o knockout. I modelli di roditori sono stati fondamentali per comprendere i meccanismi della malattia e per identificare potenziali nuovi bersagli terapeutici nell'infarto miocardico2, nell'ipertensione3, nell'insufficienza cardiaca4 e nell'aterosclerosi5. Tuttavia, l'uso dei roditori negli studi sulle aritmie cardiache è limitato dalle loro piccole dimensioni del cuore e dalla frequenza cardiaca più veloce rispetto ai modelli umani o animali di grandi dimensioni. Pertanto, le aritmie letali spontanee nei topi o nei ratti dopo infarto miocardico sono rare2. I ricercatori sono costretti a concentrarsi su cambiamenti secondari indiretti che potrebbero riflettere un substrato pro-aritmico, come la fibrosi o l'espressione genica, senza mostrare cambiamenti significativi nel carico di aritmia o tendenze pro-aritmiche. Per superare questa limitazione, nel presente protocollo è descritto un metodo che consente una valutazione affidabile della suscettibilità dei cuori di topo e ratto alle tachiaritmie ventricolari dopo modificazione genetica 6,7 o infarto miocardico2. Questo metodo combina la stimolazione del recettore adrenergico con la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari in8 cuori isolati di topo e ratto permeati da Langendorff.
Gli approcci standard per il trasferimento genico virale nel tessuto miocardico dei roditori spesso comportano l'esposizione del cuore mediante toracotomia 9,10,11, che è una procedura invasiva ed è associata a un ritardo nel recupero degli animali dopo la procedura. Questo articolo descrive un metodo di iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida di imaging ecografico per la sovraespressione dei transgeni. Questa procedura meno invasiva consente un recupero più rapido dell'animale dopo l'iniezione virale e meno lesioni tissutali, rispetto alla toracotomia, riduce il dolore post-operatorio e l'infiammazione nell'animale e, quindi, consente una migliore valutazione degli effetti dei geni transgenici sulla funzione cardiaca.
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Protocol
Tutti i metodi e le procedure descritti sono stati approvati dal comitato di revisione etica della ricerca animale presso l'Università di Ottawa e dal comitato di revisione della biosicurezza presso l'Heart Institute dell'Università di Ottawa. I protocolli di sicurezza sviluppati includono che tutte le procedure relative all'adenovirus ricombinante o al virus adeno-associato (AAV) sono state eseguite in un armadio di biosicurezza di livello II. Tutti gli oggetti a contatto con il virus sono stati completamente decontaminati dopo l'esperimento. Per il presente studio sono stati utilizzati topi Ctnnb1 flox/flox e αMHC-MerCreMer (8-12 settimane di età compresa tra i sessi) e ratti Sprague-Dawley (200-250g, maschio). Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite da personale formato e approvato da comitati regolatori istituzionali. Durante tutte le procedure sono stati utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale.
1. Espressione del transgene virale nei tessuti ventricolari dei roditori
NOTA: Conservare adenovirus ricombinante o AAV che esprime il gene bersaglio e il corrispondente virus di controllo, come Ad-GFP (titolo di 1 x 10 10 PFU / mL) o AAV9-GFP (titolo di 1 x 1013 GC / ml) (vedi tabella dei materiali), in un congelatore a -80 °C.
- Il giorno dell'iniezione del virus, scongelare il virus sul ghiaccio. Aspirare il virus che esprime il gene bersaglio e il virus di controllo in due siringhe separate (volume = 50 μL) con aghi da 30 G 1/2 e conservare in ghiaccio fino all'uso.
NOTA: Eventuali bolle nella siringa e nell'ago devono essere accuratamente rimosse. - Somministrare buprenorfina a ratti o topi (0,05 mg/kg per i ratti, 0,1 mg/kg per i topi, sottocutaneo), 1 ora dopo indurre l'anestesia usando isoflurano al 3% e mantenere l'isoflurano al 2% (al 100% di ossigeno ad una portata di 0,5-1,0 L/min) per la procedura successiva.
- Pizzicare delicatamente il corpo dell'animale (ad esempio, la coda) con un paio di pinze, e se l'animale non risponde al pizzico con alcun movimento del corpo, viene confermata la corretta anestesia.
- Mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando una piastra elettrica riscaldante. Rasare i capelli nella regione del torace usando un tagliacapelli.
NOTA: prestare attenzione durante l'utilizzo di una piastra riscaldante elettrica a causa della potenziale distribuzione irregolare del calore. - Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea.
- Mantenere l'animale in posizione supina e utilizzare un sistema di imaging preclinico (vedere Tabella dei materiali) per l'ecografia del cuore dell'animale con l'orientamento dell'asse corto.
NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti in un armadio di biosicurezza di livello II che fornisce un ambiente sterile. Vengono impiegate procedure di sicurezza standard, comprese quelle con manipolazione sicura dell'ago. - Sterilizzare la regione inferiore sinistra del torace dell'animale con cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina e alcol tre volte con un movimento circolare.
- Sotto guida per l'ecografia, inserire l'ago da 30 G 1/2 della siringa contenente il virus come preparato al punto 1.1. nel petto dell'animale attraverso il lato inferiore sinistro del corpo.
- Avvicinare la punta dell'ago nella parete libera anteriore ventricolare sinistra e iniettare lentamente 10-15 μL del virus. Verificare la riuscita dell'iniezione nelle immagini ecografiche grazie alla maggiore luminosità vicino alla punta dell'ago.
NOTA: La quantità di virus iniettata in ciascun sito non è superiore a 15 μL per prevenire danni fisici ai tessuti miocardici. - Ritirare l'ago dal cuore e inserirlo in altre regioni del ventricolo sinistro per una seconda e terza iniezione della stessa quantità di virus.
NOTA: Il numero totale di siti di iniezione è determinato dal disegno sperimentale. Se è richiesta l'espressione del transgene focale, è necessaria una sola iniezione; Se è richiesta un'espressione transgenica più diffusiva, di solito sono necessari più siti di iniezione (da tre a cinque). - Dopo il completamento delle iniezioni, riportare l'animale nella sua gabbia.
- Monitorare attentamente l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale e riportarlo nella sua stanza di alloggiamento.
- Somministrare buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, due volte al giorno per i topi, 0,05 mg/kg, due volte al giorno per i ratti, per via sottocutanea) all'animale per i successivi 2 giorni. Riportare gli animali al vivaio e monitorare quotidianamente eventuali segni insoliti di dolore o angoscia e, se trovati, trattare gli animali secondo i protocolli del comitato istituzionale per la cura degli animali.
2. Valutazione della suscettibilità all'aritmia cardiaca
NOTA: A 4-6 giorni dopo l'iniezione di adenovirus e 1-2 settimane dopo l'iniezione di AAV, valutare la suscettibilità dei cuori degli animali alle aritmie cardiache seguendo i passaggi 2.1.-2.2.
- Eseguire la perfusione Langendorff del cuore di ratto o topo.
- Preparare la soluzione di Tyrode aggiungendo quanto segue a 1 L di acqua: NaCl, 7,9 g (finale = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); e glucosio, 1,8 g (10 mM). Regolare il pH a 7,40 con NaOH (vedere Tabella dei materiali).
- Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm e bolla con il 100% di O 2 in modo continuo durante le fasi 2.1.6.-2.2.8 .
- Somministrare eparina al ratto o al topo (500 U/kg, iniezione intraperitoneale) e 10 minuti dopo anestetizzare l'animale con isoflurano al 3%. Garantire un'adeguata anestesia con un pizzico delicato sul corpo.
- Utilizzare un bisturi per fare un'incisione verticale di 1-1,5 cm nella linea medio-clavicolare per una toracotomia sinistra ed esporre il cuore.
- Raccogliere il cuore tagliando con un paio di forbici a livello dell'arco aortico e mettere immediatamente il cuore in soluzione di Tyrode ghiacciata.
NOTA: Si presta attenzione a non danneggiare il cuore durante la raccolta del cuore. - Cannulare l'aorta del cuore con un ago smussato (18 G per i ratti; 23 G per i topi) collegato ad un sistema di perfusione Langendorff modificato (vedi Tabella dei materiali) in modalità a flusso costante. Regolare la portata per mantenere la pressione di perfusione a 70-80 mmHg.
NOTA: Eventuali bolle nell'ago di perfusione devono essere rimosse prima dell'incannulamento aortico. L'uso di un microscopio da dissezione facilita l'incannulamento. - Porre il cuore cannulato in un piatto di plastica rivestito di elastomero siliconico da 9, 10 cm con il ventricolo sinistro rivolto verso l'alto e perfondere il cuore 9,12 con la soluzione di Tyrode a 37 °C con bolle di O.
- Verificare il corretto incannulamento aortico all'inizio della perfusione osservando il lavaggio del sangue dal cuore durante i primi due o tre battiti cardiaci e il cambiamento del colore del cuore dal rosso al pallido.
- Posizionare gli elettrodi di un sistema ECG di piccoli animali (vedi Tabella dei materiali) attorno al cuore inserendoli nel rivestimento in elastomero siliconico nel piatto (Figura 1). Registra ECG utilizzando un software compatibile.
- Eseguire la stimolazione del recettore adrenergico e la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari.
- Dopo il successo dell'incannulamento aortico, continuare a perfondere il cuore con la soluzione di Tyrode per 20 minuti per stabilizzare la preparazione del cuore.
- Aggiungere 1 μM di isoproterenolo (vedere Tabella dei materiali) alla soluzione di Tyrode utilizzata per la perfusione cardiaca nei punti 2.2.3.-2.2.8.
- Dopo 10 minuti di perfusione di isoproterenolo, stimolare il cuore all'apice con due elettrodi di platino collegati ad uno stimolatore elettrico (vedi Tabella dei materiali).
- Inizia con la procedura di stimolazione (Figura 2), che include 10 stimoli consecutivi (S1, 5 V, intervalli di 100 ms) seguiti da uno stimolo extra (S2) con un intervallo iniziale di 80 ms. Ridurre ripetutamente l'intervallo S2 di 2 ms ogni volta fino a quando il battito cardiaco non può più essere catturato (cioè raggiungere il periodo refrattario effettivo del cuore, ERP)13.
- Monitorare eventuali tachiaritmie ventricolari indotte (incluse tachicardia ventricolare e fibrillazione) mediante ECG.
- Se non vengono indotte aritmie dalla procedura di cui sopra, aggiungere un altro stimolo extra (S3) dopo S2 con gli stessi intervalli iniziali (80 ms) e di decremento (di 2 ms) fino al raggiungimento dell'ERP.
- Se le tachiaritmie ventricolari non sono ancora indotte, aggiungere un altro stimolo extra (S4) dopo S3 con gli stessi intervalli iniziali e di decremento fino al raggiungimento dell'ERP.
- Se le tachiaritmie ventricolari non sono ancora indotte (come previsto nei cuori sani di controllo), interrompere il protocollo di stimolazione elettrica e considerare il cuore non inducibile.
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Representative Results
Quando perfuso seguendo il protocollo qui descritto (Figura 1), un cuore isolato di ratto o topo batte ritmicamente e stabilmente per almeno 4 ore. Se il disegno sperimentale richiede un periodo più lungo di perfusione cardiaca, è utile aggiungere albumina nella soluzione di perfusione per ridurre l'insorgenza di edema miocardico dopo perfusione a lungo termine14. L'inclusione di isoproterenolo nella soluzione di perfusione imita l'attivazione del sistema nervoso simpatico che si verifica in molte condizioni aritmogene come l'infarto miocardico e l'insufficienza cardiaca. Durante la stimolazione elettrica programmata, il successo della stimolazione cardiaca è verificato da (1) la cattura 1: 1 del battito cardiaco durante gli stimoli S1 consecutivi e (2) il complesso QRS prolungato (o più ampio) durante la stimolazione S1 (Figura 3 e Figura 4). Quest'ultimo è dovuto al fatto che il cuore viene stimolato all'apice e la conduzione più lenta dell'attivazione nei tessuti ventricolari aumenta la durata del complesso QRS.
Come dimostrato nei dati pubblicati2,7 (Figura 3 e Figura 4), queste stimolazioni combinate adrenergiche ed elettriche non hanno indotto tachiaritmie ventricolari (definite come almeno tre complessi ventricolari prematuri consecutivi, PVC) in cuori di topo sani (cuori wild-type operati sham nella Figura 3) o in cuori di ratto di controllo (cuori di ratto iniettati con Ad-GFP di controllo nella Figura 4 ). Al contrario, lo stesso protocollo ha indotto tachiaritmie ventricolari nel 77% dei cuori di topo wild-type dopo infarto miocardico (Figura 3B) e in tre cuori di ratto su quattro dopo iniezione intramiocardica di Ad-Wnt3a (Figura 4). Ciò dimostra l'alta fedeltà di questo approccio che induce l'aritmia ventricolare.
Il successo dell'espressione del transgene intramiocardico dopo iniezione del virus può essere verificato da livelli di mRNA e proteine sovraregolati del transgene nei tessuti miocardici identificati mediante RT-PCR quantitativa in tempo reale, western blot o immunoistochimica. Se il virus esprime un gene reporter fluorescente, come la GFP, la trasduzione virale può essere verificata anche in singoli cardiomiociti isolati, vivi, dalla loro espressione di GFP9.
Figura 1: Perfusione di Langendorff di un cuore di ratto isolato. Il cuore viene raccolto dall'animale e l'aorta viene incannulata con un ago smussato da 18 G. L'ago è collegato a una siringa da 10 mL riempita con soluzione di Tyrode a 37 °C ad una pressione di 70-80 mmHg. Il cuore è posto in un piatto di plastica rivestito in elastomero siliconico da 10 cm con il ventricolo sinistro rivolto verso l'alto. Gli elettrodi (colori rosso, verde e nero) di un sistema ECG di piccoli animali vengono posizionati attorno al cuore inserendoli nel rivestimento in elastomero siliconico nel piatto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Stimolazioni adrenergiche ed elettriche del cuore perfuso di Langendorff. (A) Il cuore di ratto o di topo viene perfuso su un sistema Langendorff come mostrato nella Figura 1, e 1 μM di isoproterenolo viene aggiunto alla soluzione di Tyrode perfondente per stimolare i recettori β1 adrenergici del cuore. Il cuore viene quindi stimolato all'apice da due elettrodi di platino collegati a uno stimolatore. (B) Rappresentazione della stimolazione elettrica programmata. Per informazioni dettagliate, vedere il passaggio 2.2. La figura è stata modificata con il permesso di Wang et al.2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Tachiaritmie ventricolari indotte nei cuori di topo dopo infarto miocardico. (A) ECG rappresentativo ex vivo (Lead II) che mostra tachicardia ventricolare indotta da stimolazione elettrica programmata (PES) (VT, definita come tre o più complessi ventricolari prematuri, PVC) consecutivi in un cuore di topo wild-type (WT) (a 8 settimane dopo l'infarto miocardico, IM) quando stimolato con uno stimolo extra (S2) ma solo un singolo PVC in un cuore cardiaco-specifico β-catenina knockout (KO) cuore di topo (a 8 settimane dopo l'infarto miocardico) quando stimolato con tre stimoli extra (S4). L'isoproterenolo (1 μM) è stato incluso nella soluzione perfusiva di Tyrode durante la stimolazione PES. Topi knockout β-catenina (Ctnnb1) specifici per il cuore sono stati generati da topi incrociati Ctnnb1 flox/flox (con esoni da 2 a 6 flox) con topi αMHC-MerCreMer. All'età di 8-12 settimane, Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− topi (KO) e cucciolate Ctnnb1 flox/flox; I topi αMHC-MerCreMer−/− (usati come topi wild-type di controllo) hanno ricevuto iniezioni sottocutanee giornaliere di tamoxifene (20 mg/kg/die) per 5 giorni consecutivi prima di essere assegnati al gruppo MI o sham. (B) Riassunto dei PVC e VT indotti da PES nei cuori WT e KO a 1 settimana o 8 settimane dopo l'infarto miocardico. Un punteggio di aritmia è stato assegnato a ciascun cuore in base ai criteri nella tabella di sinistra. A 8 settimane dopo l'infarto miocardico, la VT è stata indotta con successo nel 77% dei cuori WT ma solo nel 18% dei cuori KO. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA bidirezionale e un confronto post-hoc Bonferroni. Le barre di errore indicano l'errore standard (SE). La figura è riprodotta con il permesso di Wang et al.2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Tachiaritmie ventricolari indotte nei cuori di ratto dopo iniezione intramiocardica di un virus che esprime Wnt3a. (A) Aritmie ventricolari indotte da PES nei cuori dei ratti (200-250 g, maschio, Sprague-Dawley) al giorno 4-6 dopo iniezione intramiocardica di un adenovirus che esprime Wnt3a (Ad-Wnt3a, in basso) ma non in cuori iniettati con adenovirus di controllo che esprimono GFP (Ad-GFP, in alto). I cuori sono stati isolati e perfusi su un sistema Langendorff. L'isoproterenolo (1 μM) è stato incluso nella soluzione perfusiva di Tyrode durante la stimolazione PES. Ex vivo L'ECG è stato registrato continuamente durante la stimolazione PES. Si noti che in questo esperimento sono stati utilizzati 11 stimoli S1 consecutivi (colore blu). (B) Sintesi degli studi nel gruppo (A): La tachicardia ventricolare (VT) è stata indotta da PES in tre cuori su quattro con iniezione di Ad-Wnt3a, ma in nessuno dei quattro cuori con Ad-GFP di controllo. La figura è riprodotta con il permesso di Lu et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Diversi passaggi sono fondamentali per il successo della preparazione cardiaca isolata e perfusa da Langendorff. In primo luogo, è importante evitare qualsiasi danno al cuore durante la raccolta del cuore (ad esempio, a causa di spremitura accidentale o taglio con le forbici). In secondo luogo, è fondamentale mettere il cuore raccolto in una soluzione fredda di Tyrode il prima possibile perché questo fermerà il battito cardiaco e ridurrà il consumo di ossigeno del cuore. In terzo luogo, l'inserimento dell'ago nell'aorta non deve essere troppo profondo: idealmente, la punta dell'ago è vicina al livello della valvola aortica in modo che il cuore sia ben perfuso attraverso le arterie coronarie. Infine, le bolle nell'ago di perfusione devono essere rimosse prima dell'incannulamento aortico: di solito è utile accendere la pompa per alcuni secondi subito prima dell'incannulamento per rimuovere la bolla sulla punta dell'ago.
La preparazione cardiaca Langendorff-perfusa presenta diversi vantaggi rispetto agli studi in vivo sugli animali. In primo luogo, è possibile controllare con precisione la concentrazione e la durata dei farmaci applicati al cuore (ad esempio, isoproterenolo, come utilizzato in questo studio). In secondo luogo, consente un facile accesso alle diverse regioni del cuore sia per la stimolazione (ad esempio, la stimolazione elettrica all'apice in questo manoscritto) che per la registrazione del segnale fisiologico (ad esempio, la mappatura ottica dei tessuti ventricolari dopo il caricamento con un colorante sensibile al Ca2+ o sensibile alla tensione, che non è descritto qui). Inoltre, la funzione cardiaca, come la contrattilità ventricolare, può essere facilmente misurata inserendo un palloncino nel ventricolo sinistro e collegando il palloncino a un trasduttore di pressione8. In terzo luogo, le proprietà intrinseche del cuore, come la frequenza cardiaca e la contrattilità ventricolare, possono essere studiate senza i fattori di complicazione negli studi in vivo, come il sistema nervoso autonomo e gli ormoni circolanti. Tuttavia, il limite del cuore perfuso di Langendorff è che manca il cross-talk tra diversi organi o tessuti in vivo15,16,17 attraverso fattori circolanti o il sistema nervoso autonomo, che possono essere attori critici in alcuni studi.
La registrazione ECG ex vivo del cuore perfuso di Langendorff, come descritto qui e nelle precedenti pubblicazioni 2,6,7,9, ha il vantaggio della registrazione senza contatto e non presenta alcun disturbo alla funzione del cuore rispetto ad altri approcci come la mappatura ottica, che richiede il caricamento di Ca2+ -coloranti sensibili o sensibili alla tensione e l'uso di un disaccoppiatore eccitazione-contrazione per ridurre il movimento meccanico del cuore (come la blebbistatina)12,18. Tuttavia, la mappatura ottica ha il vantaggio di fornire informazioni più dettagliate sulle attività elettriche del cuore, come l'origine del battito cardiaco, il modello di attivazione miocardica e la velocità di conduzione miocardica.
Il metodo di iniezione intramiocardica diretta di un virus, come descritto qui, può anche essere utilizzato per la somministrazione di altri materiali terapeutici 19,20,21,22,23,24, come biomateriali, esoni, mRNA modificato e cardiomiociti derivati da cellule staminali. L'iniezione intramiocardica guidata da ultrasuoni presenta diversi vantaggi rispetto al tradizionale approccio di iniezione basato sulla toracotomia. In primo luogo, è meno invasivo e consente un recupero più rapido degli animali dopo la procedura di iniezione. Ciò riduce gli effetti associati alla procedura sugli animali (ad esempio, quelli causati dal dolore post-operatorio e dall'infiammazione del tessuto toracico quando viene utilizzata una toracotomia invasiva). In secondo luogo, l'ecografia verifica il successo dell'iniezione di virus nel cuore, il che aumenta la coerenza e la riproducibilità dei risultati. Tuttavia, il limite dell'approccio di iniezione del virus guidato da ultrasuoni è che le posizioni dei siti di iniezione del virus non possono essere controllate con la stessa precisione dell'approccio basato sulla toracotomia, che consente la localizzazione visiva delle diverse regioni cardiache.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 e PJT-180533, a WL), dal CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, a WL), dalla borsa di studio McDonald della Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) e dal New Investigator Award (S-17-LI-0866, a WL), borse di studio per studenti (a JW e YX) e una borsa di studio post-dottorato (ad AL) dall'Università di Ottawa Cardiac Endowment Funds presso l'Heart Institute. Gli autori ringraziano Richard Seymour per il suo supporto tecnico. La Figura 2 è stata creata con Biorender.com con licenze approvate.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
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