Summary
Bu protokol, ekokardiyografi rehberliğinde virüsün doğrudan intramiyokard enjeksiyonu ile sıçan ve fare kalplerinde transgen ekspresyonu yöntemlerini açıklamaktadır. İzole, Langendorff perfüze edilmiş kalplerin programlanmış elektriksel stimülasyonu ile kalplerin ventriküler aritmilere duyarlılığının değerlendirilmesi için yöntemler de burada açıklanmaktadır.
Abstract
Kalp hastalığı tüm dünyada önde gelen morbidite ve mortalite nedenidir. Transgenik suşların kullanım kolaylığı ve bolluğu nedeniyle, kemirgenler kardiyovasküler araştırmalar için gerekli modeller haline gelmiştir. Bununla birlikte, kalp hastalığı hastalarında sıklıkla mortaliteye neden olan spontan ölümcül kardiyak aritmiler, kalp hastalığının kemirgen modellerinde nadirdir. Bu öncelikle insan ve kemirgenler arasındaki kardiyak elektriksel özelliklerdeki tür farklılıklarından kaynaklanmaktadır ve kemirgenleri kullanan kardiyak aritmilerin incelenmesine meydan okumaktadır. Bu protokol, rekombinant virüsün (adenovirüs ve adeno ilişkili virüs) ekokardiyografi eşliğinde intramüsküler enjeksiyonlarını kullanarak fare ve sıçan ventriküler miyokardında etkili transgen ekspresyonunu sağlamak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda, hem adrenerjik hem de programlanmış elektriksel stimülasyonlarla izole edilmiş, Langendorff perfüze fare ve sıçan kalplerini kullanarak aritmilere kardiyak duyarlılığın güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayacak bir yöntemi özetlemektedir. Bu teknikler, miyokard enfarktüsü gibi yaralanmalardan sonra olumsuz kardiyak yeniden yapılanma ile ilişkili kalp ritmi bozukluklarını incelemek için kritik öneme sahiptir.
Introduction
Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve sadece 2017 yılında 18 milyon insanın hayatına mal olmuştur1. Kemirgenler, özellikle fareler ve sıçanlar, kullanım kolaylığı ve çeşitli transgenik aşırı ekspresyon veya nakavt çizgilerinin mevcudiyeti nedeniyle kardiyovasküler araştırmalarda en yaygın kullanılan model haline gelmiştir. Kemirgen modelleri, hastalık mekanizmalarını anlamak ve miyokard enfarktüsü2, hipertansiyon3, kalp yetmezliği4 ve ateroskleroz5'te potansiyel yeni terapötik hedefleri belirlemek için temel olmuştur. Bununla birlikte, kardiyak aritmiler çalışmalarında kemirgenlerin kullanımı, insan veya büyük hayvan modellerine kıyasla küçük kalp boyutları ve daha hızlı kalp atış hızları ile sınırlıdır. Bu nedenle, miyokard enfarktüsü sonrası farelerde veya sıçanlarda spontan ölümcül aritmiler nadirdir2. Araştırmacılar, aritmi yükünde veya pro-aritmik eğilimlerde anlamlı değişiklikler göstermeden, fibroz veya gen ekspresyonu gibi pro-aritmik bir substratı yansıtabilecek dolaylı ikincil değişikliklere odaklanmak zorunda kalmaktadır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, fare ve sıçan kalplerinin genetik modifikasyon 6,7 veya miyokard enfarktüsü2 sonrası ventriküler taşiaritmilere duyarlılığının güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan bir yöntem mevcut protokolde tanımlanmıştır. Bu yöntem, izole edilmiş, Langendorff perfüzeedilmiş 8 fare ve sıçan kalplerinde ventriküler taşiaritmileri indüklemek için adrenerjik reseptör stimülasyonunu programlanmış elektriksel stimülasyonla birleştirir.
Kemirgen miyokard dokusunda viral gen transferi için standart yaklaşımlar genellikle kalbin torakotomi 9,10,11 ile maruz kalmasını içerir, bu da invaziv bir prosedürdür ve işlemden sonra hayvanların gecikmiş iyileşmesi ile ilişkilidir. Bu makalede, transgenlerin aşırı ekspresyonu için ultrason görüntüleme rehberliğinde doğrudan intramiyokard virüs enjeksiyonu yöntemi açıklanmaktadır. Bu daha az invaziv prosedür, torakotomi ile karşılaştırıldığında, viral enjeksiyondan sonra daha hızlı hayvan iyileşmesine ve daha az doku hasarına izin verir, hayvandaki ameliyat sonrası ağrı ve iltihabı azaltır ve böylece transgenik genlerin kalp fonksiyonu üzerindeki etkilerinin daha iyi değerlendirilmesini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm yöntem ve prosedürler, Ottawa Üniversitesi'ndeki hayvan araştırmaları etik inceleme kurulu ve Ottawa Üniversitesi Kalp Enstitüsü'ndeki biyogüvenlik inceleme komitesi tarafından onaylanmıştır. Geliştirilen güvenlik protokolleri, rekombinant adenovirüs veya adeno ilişkili virüs (AAV) ile ilgili tüm prosedürlerin seviye II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirildiğini içerir. Virüsle temas eden tüm maddeler deneyden sonra iyice dekontamine edildi. Bu çalışmada Ctnnb1flox/flox ve αMHC-MerCreMer fareleri (8-12 haftalık, her iki cinsiyetten) ve Sprague-Dawley sıçanları (200-250g, erkek) kullanılmıştır. Hayvanlar ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz. Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, kurumsal düzenleyici komiteler tarafından eğitilmiş ve onaylanmış personel tarafından gerçekleştirilmiştir. Tüm işlemler sırasında uygun kişisel koruyucu ekipmanlar kullanıldı.
1. Kemirgen ventrikül dokularında viral transgen ekspresyonu
NOT: Hedef geni ve ilgili kontrol virüsünü ifade eden Ad-GFP (1 x 10 10 PFU/mL titre) veya AAV9-GFP (1 x 10 13 GC/mL titre) gibi rekombinant adenovirüs veya AAV (bkz.
- Virüs enjeksiyonu gününde, virüsü buz üzerinde çözün. Hedef geni ve kontrol virüsünü eksprese eden virüsü 30 G 1/2 iğne ile iki ayrı şırıngaya (hacim = 50 μL) aspire edin ve kullanıma kadar buz üzerinde tutun.
NOT: Şırınga ve iğnedeki kabarcıklar dikkatlice çıkarılmalıdır. - Sıçanlara veya farelere buprenorfin uygulayın (sıçanlar için 0.05 mg / kg, fareler için 0.1 mg / kg, deri altı), 1 saat sonra% 3 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin ve sonraki prosedür için% 2'de (0.5-1.0 L / dak akış hızında% 100 oksijende) izofluranı koruyun.
- Hayvanın vücudunu (örneğin kuyruğu) bir çift forseps ile hafifçe sıkıştırın ve hayvan sıkışmaya herhangi bir vücut hareketiyle cevap vermezse, uygun anestezi onaylanır.
- Elektrikli ısıtma yastığı kullanarak vücut ısısını 37 ° C'de tutun. Göğüs bölgesindeki saçları saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin.
NOT: Potansiyel düzensiz ısı dağılımı nedeniyle elektrikli ısıtma yastığı kullanırken dikkatli olunmalıdır. - Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
- Hayvanı sırtüstü pozisyonda tutun ve kısa eksen oryantasyonunda hayvanın kalbinin ultrasonla görüntülenmesi için klinik öncesi bir görüntüleme sistemi kullanın (bkz.
NOT: Aşağıdaki adımlar, steril bir ortam sağlayan seviye II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Güvenli iğne kullanımı olanlar da dahil olmak üzere standart güvenlik prosedürleri uygulanır. - Hayvanın sol alt göğüs bölgesini, dairesel bir hareketle üç kez iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovma ve alkolün alternatif turlarıyla sterilize edin.
- Ultrason görüntüleme rehberliği altında, virüsü içeren şırınganın 30 G 1/2 iğnesini adım 1.1'de hazırlandığı gibi yerleştirin. Vücudun sol alt göğüs tarafından hayvanın göğsüne girer.
- İğne ucunu sol ventrikül ön serbest duvarına yaklaştırın ve yavaşça 10-15 μL virüs enjekte edin. İğnenin ucuna yakın gelişmiş parlaklık ile ultrason görüntülerinde başarılı enjeksiyonu doğrulayın.
NOT: Her bölgeye enjekte edilen virüs miktarı, miyokard dokularına fiziksel zarar gelmesini önlemek için 15 μL'den fazla değildir. - İğneyi kalpten çekin ve aynı miktarda virüsün ikinci ve üçüncü enjeksiyonu için sol ventrikülün diğer bölgelerine yerleştirin.
NOT: Toplam enjeksiyon bölgesi sayısı deney tasarımı ile belirlenir. Fokal transgen ekspresyonu gerekiyorsa, sadece bir enjeksiyon gereklidir; Daha fazla difüzif transgen ekspresyonu gerekiyorsa, genellikle çoklu enjeksiyon bölgelerine (üç ila beş) ihtiyaç duyulur. - Enjeksiyonların tamamlanmasından sonra, hayvanı kafesine geri getirin.
- Sternal yatışlığı korumak ve konut odasına geri döndürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı dikkatlice izleyin.
- Buprenorfin HCl'yi (0.1 mg / kg, fareler için günde iki kez, 0.05 mg / kg, sıçanlar için günde iki kez, deri altı) sonraki 2 gün boyunca hayvana uygulayın. Hayvanları vivaryuma geri döndürün ve olağandışı ağrı veya sıkıntı belirtileri için günlük olarak izleyin ve bulunursa, Kurumsal hayvan bakım komitesi protokollerine göre hayvanları tedavi edin.
2. Kardiyak aritmi duyarlılığının değerlendirilmesi
NOT: Adenovirüs enjeksiyonundan 4-6 gün sonra ve AAV enjeksiyonundan 1-2 hafta sonra, 2.1.-2.2 adımlarını izleyerek hayvan kalplerinin kardiyak aritmilere duyarlılığını değerlendirin.
- Sıçan veya fare kalbinin Langendorff perfüzyonunu gerçekleştirin.
- 1 L suya aşağıdakileri ekleyerek tirot çözeltisi hazırlayın: NaCl, 7.9 g (son = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); ve glikoz, 1.8 g (10 mM). NaOH ile pH'ı 7,40'a ayarlayın ( bkz.
- Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre ve 2.1.6.-2.2.8 adımları sırasında sürekli olarak %100 O2 kabarcığı ile filtreleyin.
- Heparini sıçan veya fareye uygulayın (500 U / kg, intraperitoneal enjeksiyon) ve 10 dakika sonra hayvanı% 3 izofluran ile uyuşturun. Vücutta hafif bir tutam ile yeterli anestezi sağlayın.
- Sol torakotomi için orta klaviküler çizgide 1-1.5 cm'lik dikey bir kesi yapmak ve kalbi açığa çıkarmak için bir neşter kullanın.
- Aort kemeri seviyesinde bir çift makasla keserek kalbi toplayın ve hemen kalbi buz gibi soğuk Tyrode çözeltisine koyun.
NOT: Kalp toplanması sırasında kalbe zarar vermemek için dikkatli olunmalıdır. - Kalbin aortunu, sabit akış hızı modunda modifiye edilmiş bir Langendorff perfüzyon sistemine (bakınız Malzeme Tablosu) bağlı künt bir iğne (sıçanlar için 18 G; fareler için 23 G) ile kanüle edin. Perfüzyon basıncını 70-80 mmHg'de tutmak için akış hızını ayarlayın.
NOT: Perfüzyon iğnesindeki kabarcıklar aort kanülasyonundan önce çıkarılmalıdır. Diseksiyon mikroskobu kullanmak kanülasyonu kolaylaştırır. - Kanüllenmiş kalbi, sol ventrikül yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı 9, 10 cm'lik plastik bir kaba yerleştirin ve kalbi 9,12'yi 37 ° C'de O2 kabarcıklı Tirode çözeltisi ile perfüze edin.
- Perfüzyonun başlangıcında, ilk iki ila üç kalp atışı sırasında kalpten kanın yıkanmasını ve kalp renginin kırmızıdan solukluğa değiştiğini gözlemleyerek doğru aort kanülasyonunu doğrulayın.
- Küçük bir hayvan EKG sisteminin elektrotlarını (bakınız Malzeme Tablosu) kabın içindeki silikon elastomer kaplamaya yerleştirerek kalbin etrafına yerleştirin (Şekil 1). Uyumlu bir yazılım kullanarak EKG'yi kaydedin.
- Ventriküler taşiaritmileri indüklemek için adrenerjik reseptör stimülasyonu ve programlanmış elektriksel stimülasyon gerçekleştirin.
- Başarılı aort kanülasyonundan sonra, kalp hazırlığını stabilize etmek için kalbi 20 dakika boyunca Tyrode çözeltisi ile perfüze etmeye devam edin.
- Adım 2.2.3.-2.2.8'de kalp perfüzyonu için kullanılan Tyrode çözeltisine 1 μM izoproterenol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 10 dakikalık izoproterenol perfüzyonundan sonra, bir elektrik stimülatörüne bağlı iki platin elektrot ile tepedeki kalbi uyarın (bkz.
- 10 ardışık uyaranı (S1, 5 V, 100 ms aralıkları) içeren stimülasyon prosedürü (Şekil 2) ile başlayın ve bunu 80 ms'lik bir başlangıç aralığına sahip ekstra bir uyaran (S2) izler. Kalp atışı artık yakalanamayana kadar S2 aralığını her seferinde tekrar tekrar 2 ms azaltın (yani, kalbin etkili refrakter periyoduna, ERP'ye ulaşmak)13.
- İndüklenmiş ventriküler taşiaritmileri (ventriküler taşikardi ve fibrilasyon dahil) EKG ile izleyin.
- Yukarıdaki prosedür tarafından herhangi bir aritmi indüklenmezse, ERP'ye ulaşılana kadar S2'den sonra aynı başlangıç (80 ms) ve azalma (2 ms) aralıklarla başka bir ekstra uyaran (S3) ekleyin.
- Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa, ERP'ye ulaşılana kadar S3'ten sonra aynı başlangıç ve azalma aralıklarıyla bir ekstra uyaran (S4) daha ekleyin.
- Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa (kontrol sağlıklı kalplerde beklendiği gibi), elektriksel stimülasyon protokolünü durdurun ve kalbin indüklenemez olduğunu düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokolü izleyerek perfüze edildiğinde (Şekil 1), izole edilmiş bir sıçan veya fare kalbi en az 4 saat boyunca ritmik ve kararlı bir şekilde atar. Deneysel tasarım daha uzun bir kalp perfüzyonu süresi gerektiriyorsa, uzun süreli perfüzyondan sonra miyokard ödemi oluşumunu azaltmak için perfüzyon çözeltisine albümin eklemek yararlıdır14. İzoproterenolün perfüzyon çözeltisine dahil edilmesi, miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi birçok aritmojenik durumda ortaya çıkan sempatik sinir sisteminin aktivasyonunu taklit eder. Programlanmış elektriksel stimülasyon sırasında, kalbin başarılı temposu (1) ardışık S1 uyaranları sırasında kalp atışının 1: 1 yakalanması ve (2) S1 pacing sırasında uzun süreli (veya daha geniş) QRS kompleksi (Şekil 3 ve Şekil 4) ile doğrulanır. İkincisi, kalbin tepede tempolu olması ve ventriküler dokulardaki aktivasyonun daha yavaş iletilmesinin QRS kompleks süresini arttırmasıdır.
Yayınlanan veri 2,7'de (Şekil 3 ve Şekil 4) gösterildiği gibi, bu kombine adrenerjik ve elektriksel stimülasyonlar, sağlıklı fare kalplerinde (Şekil 3'te sahte olarak ameliyat edilen vahşi tip kalpler) veya kontrol sıçan kalplerinde (Şekil 4'te Ad-GFP enjekte edilen sıçan kalplerini kontrol edin) ventriküler taşiaritmilere (en az üç ardışık prematüre ventrikül kompleksi, PVC'ler olarak tanımlanan) indüklememiştir. ). Buna karşılık, aynı protokol, miyokard enfarktüsünden sonra vahşi tip fare kalplerinin% 77'sinde (Şekil 3B) ve Ad-Wnt3a'nın intramiyokard enjeksiyonundan sonra dört sıçan kalbinden üçünde ventriküler taşiaritmileri indükledi (Şekil 4). Bu, bu ventriküler aritmi indükleyici yaklaşımın yüksek sadakatini göstermektedir.
Virüs enjeksiyonundan sonra başarılı intramiyokardiyal transgen ekspresyonu, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR, batı lekesi veya immünohistokimya ile tanımlanan miyokard dokularındaki transgenin yukarı regüle edilmiş mRNA ve protein seviyeleri ile doğrulanabilir. Virüs, GFP gibi bir floresan muhabir geni ifade ederse, başarılı viral transdüksiyon, GFP9 ekspresyonuyla izole edilmiş, canlı, tek kardiyomiyositlerde de doğrulanabilir.
Resim 1: İzole edilmiş bir sıçan kalbinin Langendorff perfüzyonu. Kalp hayvandan toplanır ve aort künt bir 18 G iğne ile kanüle edilir. İğne, 70-80 mmHg basınçta 37 °C Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngaya bağlanır. Kalp, sol ventrikül yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı, 10 cm'lik plastik bir kaba yerleştirilir. Küçük bir hayvan EKG sisteminin elektrotları (kırmızı, yeşil ve siyah renkler), çanaktaki silikon elastomer kaplamaya yerleştirilerek kalbin etrafına yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Langendorff perfüze edilmiş kalbin adrenerjik ve elektriksel stimülasyonları. (A) Sıçan veya fare kalbi, Şekil 1'de gösterildiği gibi bir Langendorff sistemi üzerinde perfüze edilir ve kalbin β1 adrenerjik reseptörlerini uyarmak için perfüze edici Tirod çözeltisine 1 μM izoproterenol eklenir. Kalp daha sonra tepede bir uyarıcıya bağlı iki platin elektrot tarafından uyarılır. (B) Programlanmış elektriksel stimülasyonun temsili. Ayrıntılar için adım 2.2'ye bakın. Şekil Wang ve ark.2'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Miyokard enfarktüsünden sonra fare kalplerinde indüklenen ventriküler taşiaritmiler. (A) Bir ekstra uyaranla (S2) uyarıldığında vahşi tip (WT) fare kalbinde (miyokard enfarktüsünden 8 hafta sonra, MI) uyarıldığında programlanmış elektriksel stimülasyona (PES) bağlı ventriküler taşikardi (VT, üç veya daha fazla ardışık prematüre ventriküler kompleks, PVC olarak tanımlanır) gösteren temsili ex vivo EKG (Lead II) β-katenin nakavt (KO) fare kalbi (MI'den 8 hafta sonra) üç ekstra uyaranla (S4) uyarıldığında. İzoproterenol (1 μM), PES stimülasyonu sırasında perfüze edici Tirode çözeltisine dahil edildi. Kardiyak-spesifik β-katenin (Ctnnb1) nakavt fareleri, αMHC-MerCreMer fareleri ile melezleme Ctnnb1flox / flox fareleri (ekzonları 2 ila 6 floksed ile) tarafından üretildi. 8-12 haftalıkken, Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− fareler (KO) ve çöp arkadaşı Ctnnb1 flox/flox; αMHC-MerCreMer−/− fareler (kontrol vahşi tip fareler olarak kullanılır), MI veya sahte gruba atanmadan önce art arda 5 gün boyunca günlük deri altı tamoksifen enjeksiyonları (20 mg / kg / gün) aldı. (B) M'DEN 1 hafta veya 8 hafta sonra WT ve KO kalplerinde PES kaynaklı PVC'lerin ve VT'lerin özeti. Sol tablodaki kriterlere göre her kalbe bir aritmi skoru atandı. MI'den 8 hafta sonra, VT, WT kalplerinin% 77'sinde, ancak KO kalplerinin sadece% 18'inde başarıyla indüklendi. Veriler iki yönlü ANOVA ve Bonferroni post-hoc karşılaştırma ile analiz edildi. Hata çubukları standart hatayı (SE) gösterir. Şekil, Wang ve ark.2'nin izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Wnt3a eksprese eden bir virüsün intramiyokard enjeksiyonundan sonra sıçan kalplerinde indüklenen ventriküler taşiaritmiler. (A) PES, Wnt3a (Ad-Wnt3a, alt) eksprese eden bir adenovirüsün intramiyokard enjeksiyonundan sonra 4-6. günde sıçanların kalplerinde (200-250 g, erkek, Sprague-Dawley) ventriküler aritmilere neden oldu, ancak GFP eksprese eden kontrol adenovirüsü enjekte edilen kalplerde (Ad-GFP, üstte) değil. Kalpler izole edildi ve Langendorff sistemi üzerinde perfüze edildi. İzoproterenol (1 μM), PES stimülasyonu sırasında perfüze edici Tirode çözeltisine dahil edildi. Ex vivo PES stimülasyonu sırasında EKG sürekli olarak kaydedildi. Bu deneyde 11 ardışık S1 uyaranının (mavi renk) kullanıldığını unutmayın. (B) Panel (A)'daki çalışmaların özeti: Ventriküler taşikardi (VT), Ad-Wnt3a enjeksiyonu ile dört kalpten üçünde PES tarafından indüklendi, ancak kontrol Ad-GFP'li dört kalbin hiçbirinde PES ile indüklendi. Şekil, Lu ve ark.7'nin izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Langendorff perfüzyonlu, izole kalp preparatının başarısı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kalp toplanması sırasında kalbe herhangi bir zarar gelmesini önlemek önemlidir (örneğin, makasla kazara sıkma veya kesme nedeniyle). İkincisi, toplanan kalbi mümkün olan en kısa sürede soğuk Tyrode çözeltisine koymak çok önemlidir, çünkü bu kalp atışını durduracak ve kalbin oksijen tüketimini azaltacaktır. Üçüncüsü, aort içine iğne yerleştirilmesi çok derin olmamalıdır – ideal olarak, iğnenin ucu aort kapak seviyesine yakındır, böylece kalp koroner arterlerden iyi perfüze edilir. Son olarak, perfüzyon iğnesindeki kabarcıkların aort kanülasyonundan önce çıkarılması gerekir – iğnenin ucundaki kabarcığı çıkarmak için kanülasyondan hemen önce pompayı birkaç saniye açmak genellikle yararlıdır.
Langendorff perfüze kalp preparatı, hayvanlardaki in vivo çalışmalara göre çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, kalbe uygulanan ilaçların konsantrasyonunu ve süresini doğru bir şekilde kontrol etmek mümkündür (örneğin, bu çalışmada kullanıldığı gibi izoproterenol). İkincisi, stimülasyon (örneğin, bu makalede tepedeki elektriksel hız) veya fizyolojik sinyal kaydı (örneğin, burada açıklanmayan Ca2 + duyarlı veya voltaja duyarlı bir boya ile yüklendikten sonra ventrikül dokularının optik haritalanması) için kalbin farklı bölgelerine kolay erişim sağlar. Ek olarak, ventriküler kontraktilitesi gibi kardiyak fonksiyon, sol ventriküle bir balon yerleştirilerek ve balonu bir basınç dönüştürücüsüne bağlayarak kolayca ölçülebilir8. Üçüncüsü, kalp atış hızı ve ventriküler kontraktilitesi gibi kalbin içsel özellikleri, otonom sinir sistemi ve dolaşımdaki hormonlar gibi in vivo çalışmalarda karmaşık faktörler olmadan araştırılabilir. Bununla birlikte, Langendorff perfüze kalbinin sınırlaması, dolaşım faktörleri veya bazı çalışmalarda kritik oyuncular olabilecek otonom sinir sistemi yoluyla in vivo15,16,17 farklı organlar veya dokular arasında çapraz konuşmadan yoksun olmasıdır.
Langendorff perfüze kalbin ex vivo EKG kaydı, burada ve önceki yayınlardaaçıklandığı gibi 2,6,7,9, temassız kayıt avantajına sahiptir ve Ca2+ yüklenmesini gerektiren optik haritalama gibi diğer yaklaşımlara kıyasla kalbin işlevine herhangi bir rahatsızlık vermez. -hassas veya voltaja duyarlı boyalar ve mekanik kalp hareketini azaltmak için uyarılma-kasılma çözücünün kullanılması (blebbistatin gibi)12,18. Bununla birlikte, optik haritalama, kalp atışının kökeni, miyokard aktivasyon paterni ve miyokard iletim hızı gibi kalbin elektriksel aktiviteleri hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlama avantajına sahiptir.
Burada açıklandığı gibi, bir virüsün doğrudan intramiyokard enjeksiyonu yöntemi, biyomateryaller, ekzonlar, modifiye mRNA ve kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler gibi diğer terapötik materyallerin 19,20,21,22,23,24 verilmesi için de kullanılabilir. Ultrason görüntüleme eşliğinde intramiyokardiyal enjeksiyonun, geleneksel torakotomi tabanlı enjeksiyon yaklaşımına göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, daha az invazivdir ve enjeksiyon işleminden sonra hayvanların daha hızlı iyileşmesini sağlar. Bu, hayvanlar üzerindeki prosedürle ilişkili etkileri azaltır (örneğin, invaziv bir torakotomi kullanıldığında ameliyat sonrası ağrı ve göğüs dokusu iltihabının neden olduğu etkiler). İkincisi, ultrason görüntüleme kalpteki başarılı virüs enjeksiyonunu doğrular ve bu da sonuçların tutarlılığını ve tekrarlanabilirliğini arttırır. Bununla birlikte, ultrason rehberliğinde virüs enjeksiyonu yaklaşımının sınırlaması, virüs enjeksiyon bölgelerinin yerlerinin, farklı kalp bölgelerinin görsel lokalizasyonuna izin veren torakotomi tabanlı yaklaşımda olduğu kadar hassas bir şekilde kontrol edilememesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Proje Hibeleri (PJT-148918 ve PJT-180533, WL'ye), CIHR Erken Kariyer Araştırmacı Ödülü (AR8-162705, WL'ye), Kanada Kalp ve İnme Vakfı (HSFC) McDonald Bursu ve Yeni Araştırmacı Ödülü (S-17-LI-0866, WL'ye), Öğrenci Bursları (JW ve YX'e) ve Ottawa Üniversitesi Kardiyak Bağış Fonlarından Doktora Sonrası Bursu (AL'ye) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Richard Seymour'a teknik desteği için teşekkür eder. Şekil 2 , onaylanmış lisanslara sahip Biorender.com oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
