Summary
Denne protokol beskriver metoder til transgenekspression i rotte- og musehjerter ved direkte intramyokardieinjektion af virus under ekkokardiografisk vejledning. Metoder til vurdering af hjerters modtagelighed for ventrikulære arytmier ved programmeret elektrisk stimulering af isolerede, Langendorff-perfunderede hjerter forklares også her.
Abstract
Hjertesygdomme er den største årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. På grund af den lette håndtering og overflod af transgene stammer er gnavere blevet vigtige modeller for kardiovaskulær forskning. Imidlertid er spontane dødelige hjertearytmier, der ofte forårsager dødelighed hos hjertesygdomspatienter, sjældne i gnavermodeller af hjertesygdomme. Dette skyldes primært artens forskelle i hjerteelektriske egenskaber mellem mennesker og gnavere og udgør en udfordring for undersøgelsen af hjertearytmier ved hjælp af gnavere. Denne protokol beskriver en tilgang til at muliggøre effektiv transgenekspression i muse- og rotteventrikulært myokardium ved hjælp af ekkokardiografi-guidede intramuskulære injektioner af rekombinant virus (adenovirus og adeno-associeret virus). Dette arbejde skitserer også en metode til at muliggøre pålidelig vurdering af hjertemodtagelighed for arytmier ved hjælp af isolerede, Langendorff-perfunderede muse- og rottehjerter med både adrenerge og programmerede elektriske stimuleringer. Disse teknikker er afgørende for at studere hjerterytmeforstyrrelser forbundet med negativ hjertemodellering efter skader, såsom myokardieinfarkt.
Introduction
Hjerte-kar-sygdomme er den største dødsårsag på verdensplan og kostede 18 millioner mennesker livet alene i 20171. Gnavere, især mus og rotter, er blevet den mest almindeligt anvendte model inden for kardiovaskulær forskning på grund af den lette håndtering og tilgængeligheden af forskellige transgene overekspressions- eller knockout-linjer. Gnavermodeller har været grundlæggende for at forstå sygdomsmekanismerne og for at identificere potentielle nye terapeutiske mål i myokardieinfarkt2, hypertension3, hjertesvigt4 og aterosklerose5. Imidlertid er brugen af gnavere i undersøgelser af hjertearytmier begrænset af deres lille hjertestørrelse og hurtigere puls sammenlignet med humane eller store dyremodeller. Derfor er spontane dødelige arytmier hos mus eller rotter efter myokardieinfarkt sjældne2. Forskere er tvunget til at fokusere på indirekte sekundære ændringer, der kan afspejle et proarytmisk substrat, såsom fibrose eller genekspression, uden at vise meningsfulde ændringer i arytmibyrden eller proarytmiske tendenser. For at overvinde denne begrænsning beskrives en metode, der muliggør en pålidelig vurdering af muse- og rottehjerters modtagelighed for ventrikulære takyarytmier efter genetisk modifikation 6,7 eller myokardieinfarkt2 i denne protokol. Denne metode kombinerer adrenerg receptorstimulering med programmeret elektrisk stimulering for at inducere ventrikulære takyarytmier i isolerede, Langendorff-perfuserede8 muse- og rottehjerter.
Standardmetoder til viral genoverførsel i gnavermyokardievæv involverer ofte eksponering af hjertet ved thoracotomi 9,10,11, hvilket er en invasiv procedure og er forbundet med forsinket genopretning af dyrene efter proceduren. Denne artikel beskriver en metode til direkte intramyokardieinjektion af virus under ultralydsbilleddannelsesvejledning til overekspression af transgener. Denne mindre invasive procedure giver mulighed for hurtigere genopretning af dyr efter viral injektion og mindre vævsskade sammenlignet med thoracotomi, reducerer postoperativ smerte og betændelse hos dyret og muliggør således bedre vurdering af virkningerne af transgene gener på hjertefunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de beskrevne metoder og procedurer blev godkendt af dyreforskningsetisk review board ved University of Ottawa og biosikkerhedsundersøgelsesudvalget ved University of Ottawa Heart Institute. De udviklede sikkerhedsprotokoller omfatter, at alle procedurer vedrørende rekombinant adenovirus eller adenoassocieret virus (AAV) blev udført i et niveau II biosikkerhedsskab. Alle genstande i kontakt med virussen blev grundigt dekontamineret efter eksperimentet. Ctnnb1 flox/flox og αMHC-MerCreMer mus (8-12 uger gamle, af begge køn) og Sprague-Dawley rotter (200-250g, hanrotter) blev anvendt til nærværende undersøgelse. Dyrene blev hentet fra kommercielle kilder (se materialetabel). Alle procedurer vedrørende dyr blev udført af personale, der er uddannet og godkendt af institutionelle forskriftsudvalg. Passende personlige værnemidler blev brugt under alle procedurer.
1. Viral transgenekspression i gnaverventrikulært væv
BEMÆRK: Opbevar rekombinant adenovirus eller AAV, der udtrykker målgenet og den tilsvarende kontrolvirus, såsom Ad-GFP (titer på 1 x10 10 PFU/ml) eller AAV9-GFP (titer på 1 x 1013 GC/ml) (se materialetabel), i en -80 °C fryser.
- På dagen for virusinjektion optø virussen på is. Virussen, der udtrykker målgenet og kontrolvirussen, suges til to separate sprøjter (volumen = 50 μL) med 30 G 1/2 nåle og opbevares på is indtil brug.
BEMÆRK: Eventuelle bobler i sprøjten og kanylen skal fjernes forsigtigt. - Buprenorphin administreres til rotter eller mus (0,05 mg/kg for rotter, 0,1 mg/kg for mus, subkutan), 1 time senere induceres anæstesi med 3 % isofluran, og isofluran opretholdes ved 2 % (i 100 % oxygen ved en strømningshastighed på 0,5-1,0 l/min) til den efterfølgende procedure.
- Klem forsigtigt dyrets krop (f.eks. Halen) med et par tang, og hvis dyret ikke reagerer på klemmen med nogen kropsbevægelser, bekræftes korrekt bedøvelse.
- Hold kropstemperaturen på 37 °C ved hjælp af en elektrisk varmepude. Barber håret i brystområdet ved hjælp af en hårklipper.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed, når du bruger en elektrisk varmepude på grund af potentiel ujævn varmefordeling. - Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre tørring af hornhinden.
- Hold dyret i liggende stilling og brug et præklinisk billeddannelsessystem (se materialetabel) til ultralydsbilleddannelse af dyrets hjerte i kortakseorientering.
BEMÆRK: Følgende trin udføres i et niveau II biosikkerhedsskab, der giver et sterilt miljø. Der anvendes standardsikkerhedsprocedurer, herunder dem med sikker nålehåndtering. - Steriliser dyrets venstre nedre brystområde med skiftende runder af en jodbaseret eller chlorhexidinbaseret skrubbe og alkohol tre gange i en cirkulær bevægelse.
- Under vejledning i ultralydsbilleddiagnostik indsættes 30 G 1/2 kanylen på sprøjten, der indeholder virussen, som klargjort i trin 1.1. ind i dyrets bryst via venstre nederste side af kroppen.
- Gå ind i kanylespidsen i venstre ventrikels forreste frie væg og injicer langsomt 10-15 μL af virussen. Kontroller vellykket injektion i ultralydsbilleder ved den forbedrede lysstyrke nær spidsen af nålen.
BEMÆRK: Mængden af virus, der injiceres på hvert sted, er ikke mere end 15 μL for at forhindre fysisk skade på myokardievævet. - Træk nålen ud af hjertet og indsæt den i andre områder af venstre ventrikel for en anden og tredje injektion af samme mængde virus.
BEMÆRK: Det samlede antal injektionssteder bestemmes af forsøgsdesignet. Hvis fokal transgenekspression er påkrævet, er der kun behov for en injektion; Hvis der kræves mere diffus transgenekspression, er der normalt behov for flere injektionssteder (tre til fem). - Efter afslutningen af injektionerne skal du returnere dyret til buret.
- Overvåg omhyggeligt dyret, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggepladsen og returnere det til sit boligrum.
- Buprenorphin HCl (0,1 mg/kg, to gange dagligt til mus, 0,05 mg/kg, to gange dagligt til rotter, subkutan) administreres til dyret i de følgende 2 dage. Returner dyr til vivarium og overvåg dagligt for usædvanlige tegn på smerte eller nød, og hvis de findes, skal du behandle dyr i henhold til protokollerne fra Institutional animal care Committee.
2. Vurdering af hjertearytmi modtagelighed
BEMÆRK: 4-6 dage efter adenovirusinjektion og 1-2 uger efter AAV-injektion vurderes dyrehjertets modtagelighed for hjertearytmier ved at følge trin 2.1.-2.2.
- Udfør Langendorff-perfusion af rotte- eller musehjertet.
- Tyrode-opløsningen fremstilles ved tilsætning af følgende til 1 liter vand: NaCl, 7,9 g (endelig = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); og glucose, 1,8 g (10 mM). Juster pH-værdien til 7,40 med NaOH (se materialetabellen).
- Opløsningen filtreres kontinuerligt med et 0,2 μm filter og bobles med 100 %O2 under trin 2.1.6.-2.2.8.
- Administrer heparin til rotten eller musen (500 E / kg, intraperitoneal injektion) og 10 minutter senere bedøve dyret med 3% isofluran. Sørg for tilstrækkelig bedøvelse med en blid knivspids på kroppen.
- Brug en skalpel til at lave et 1-1,5 cm lodret snit i midterklavikulær linje for en venstre thoracotomi og udsætte hjertet.
- Saml hjertet ved at skære med en saks på aortabuniveau og sæt straks hjertet i iskold Tyrode-opløsning.
BEMÆRK: Der udvises forsigtighed for ikke at beskadige hjertet under hjerteindsamling. - Kannulere hjertets aorta med en stump nål (18 G for rotter; 23 G for mus) forbundet til et modificeret Langendorff-perfusionssystem (se materialetabel) i konstant strømningshastighed. Juster strømningshastigheden for at holde perfusionstrykket på 70-80 mmHg.
BEMÆRK: Eventuelle bobler i perfusionsnålen skal fjernes før aortakanylering. Brug af et dissekeringsmikroskop letter kanyleringen. - Det kanylerede hjerte anbringes i ensilikone elastomerbelagt 9,10 cm plastskål med venstre ventrikel opad, og hjertet perfuseres 9,12 med O2-boblet Tyrode-opløsning ved 37 °C.
- Kontroller den korrekte aortakanylering i begyndelsen af perfusion ved at observere udvaskning af blod fra hjertet under de første to til tre hjerteslag og ændring af hjertefarven fra rød til bleg.
- Placer elektroderne i et EKG-system til små dyr (se materialetabel) rundt om hjertet ved at indsætte dem i silikoneelastomerbelægningen i skålen (figur 1). Optag EKG ved hjælp af kompatibel software.
- Udfør adrenerg receptorstimulering og programmeret elektrisk stimulering for at inducere ventrikulære takyarytmier.
- Efter vellykket aortakanylering skal du fortsætte med at perfusere hjertet med Tyrode-opløsning i 20 minutter for at stabilisere hjertepræparatet.
- Der tilsættes 1 μM isoproterenol (se materialetabellen) til Tyrode-opløsningen, der anvendes til hjerteperfusion, i trin 2.2.3.-2.2.8.
- Efter 10 minutters isoproterenolperfusion stimulerer hjertet i toppen med to platinelektroder forbundet til en elektrisk stimulator (se materialetabel).
- Start med stimuleringsproceduren (figur 2), som omfatter 10 på hinanden følgende stimuli (S1, 5 V, 100 ms intervaller), der efterfølges af en ekstra stimulus (S2) med et indledende interval på 80 ms. Reducer gentagne gange S2-intervallet med 2 ms hver gang, indtil hjerteslaget ikke længere kan fanges (dvs. når hjertets effektive ildfaste periode, ERP)13.
- Overvåg eventuelle inducerede ventrikulære takyarytmier (herunder ventrikulær takykardi og fibrillering) med EKG.
- Hvis der ikke induceres arytmier ved ovenstående procedure, tilføjes endnu en ekstra stimulus (S3) efter S2 med de samme indledende (80 ms) og decrement (med 2 ms) intervaller, indtil ERP er nået.
- Hvis ventrikulære takyarytmier stadig ikke induceres, skal du tilføje endnu en ekstra stimulus (S4) efter S3 med de samme start- og reduktionsintervaller, indtil ERP er nået.
- Hvis ventrikulære takyarytmier stadig ikke induceres (som forventet i kontrol sunde hjerter), stoppe den elektriske stimulering protokol og overveje hjertet at være ikke-inducerbar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når et isoleret rotte- eller musehjerte perfuseres efter den her beskrevne protokol (figur 1), slår det rytmisk og stabilt i mindst 4 timer. Hvis det eksperimentelle design kræver en længere periode med hjerteperfusion, er det nyttigt at tilføje albumin i perfusionsopløsningen for at reducere forekomsten af myokardieødem efter langvarig perfusion14. Inkluderingen af isoproterenol i perfusionsopløsningen efterligner aktiveringen af det sympatiske nervesystem, som forekommer i mange arytmogene tilstande, såsom myokardieinfarkt og hjertesvigt. Under den programmerede elektriske stimulering verificeres hjertets vellykkede pacing af (1) 1: 1-indfangning af hjerteslaget under de på hinanden følgende S1-stimuli og (2) det langvarige (eller bredere) QRS-kompleks under S1-pacing (figur 3 og figur 4). Sidstnævnte skyldes, at hjertet bliver paced ved toppen, og den langsommere ledning af aktiveringen i ventrikulært væv øger QRS-kompleksets varighed.
Som påvist i de offentliggjorte data2,7 (figur 3 og figur 4) inducerede disse kombinerede adrenerge og elektriske stimuleringer ingen ventrikulære takyarytmier (defineret som mindst tre på hinanden følgende for tidlige ventrikulære komplekser, PVC'er) i sunde musehjerter (skamopererede vildtypehjerter i figur 3) eller i kontrolrottehjerter (kontrol Ad-GFP-injicerede rottehjerter i figur 4 ). I modsætning hertil inducerede den samme protokol ventrikulære takyarytmier hos 77% af vildtypemusehjerter efter myokardieinfarkt (figur 3B) og hos tre ud af fire rottehjerter efter intramyokardieinjektion af Ad-Wnt3a (figur 4). Dette demonstrerer high fidelity af denne ventrikulære arytmi-inducerende tilgang.
Vellykket intramyokardietransgenekspression efter virusinjektion kan verificeres ved opreguleret mRNA og proteinniveauer af transgenet i myokardievævet identificeret ved kvantitativ RT-PCR i realtid, western blot eller immunhistokemi. Hvis virussen udtrykker et fluorescerende reportergen, såsom GFP, kan vellykket viral transduktion også verificeres i isolerede, levende, enkelte kardiomyocytter ved deres ekspression af GFP9.
Figur 1: Langendorff-perfusion af et isoleret rottehjerte. Hjertet opsamles fra dyret, og aorta kanyleres med en stump 18 G nål. Kanylen er forbundet til en 10 ml sprøjte fyldt med 37 °C Tyrode-opløsning ved et tryk på 70-80 mmHg. Hjertet placeres i en silikone elastomerbelagt, 10 cm plastskål med venstre ventrikel opad. Elektroder (røde, grønne og sorte farver) i et EKG-system til små dyr placeres rundt om hjertet ved at indsætte dem i silikoneelastomerbelægningen i skålen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Adrenerge og elektriske stimuleringer af Langendorff-perfunderet hjerte . (A) Rotte- eller musehjerte perfuseres på et Langendorff-system som vist i figur 1, og 1 μM isoproterenol tilsættes til den perfuserende Tyrode-opløsning for at stimulere hjertets β1-adrenerge receptorer. Hjertet stimuleres derefter ved toppen af to platinelektroder forbundet til en stimulator. (B) Repræsentation af den programmerede elektriske stimulering. Du kan finde flere oplysninger i trin 2.2. Figuren er ændret med tilladelse fra Wang et al.2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ventrikulære takyarytmier induceret i musehjerter efter myokardieinfarkt. (A) Repræsentativt ex vivo-EKG (bly II), der viser programmeret elektrisk stimulering (PES)-induceret ventrikulær takykardi (VT, defineret som tre eller flere på hinanden følgende for tidlige ventrikulære komplekser, PVC'er) i et vildttypemusehjerte (8 uger efter myokardieinfarkt, MI), når det stimuleres med en ekstra stimulus (S2), men kun en enkelt PVC i en hjertespecifik β-catenin knockout (KO) musehjerte (8 uger efter MI), når det stimuleres med tre ekstra stimuli (S4). Isoproterenol (1 μM) blev inkluderet i den perfuserende Tyrodeopløsning under PES-stimuleringen. Cardiac-specifikke β-catenin (Ctnnb1) knockout-mus blev genereret ved krydsning af Ctnnb1 flox/flox-mus (med exoner 2 til 6 floxed) med αMHC-MerCreMer-mus. I en alder af 8-12 uger blev Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− mus (KO) og kuldkammerat Ctnnb1flox/flox; αMHC-MerCreMer−/− mus (anvendt som kontrolmus af vildtype) fik daglige subkutane injektioner af tamoxifen (20 mg/kg/dag) i 5 på hinanden følgende dage, før de blev tildelt enten MI- eller skingruppen. (B) Resumé af PES-induceret PVC og VT i WT- og KO-hjerter 1 uge eller 8 uger efter MI. En arytmi score blev tildelt hvert hjerte i henhold til kriterierne i venstre tabel. 8 uger efter MI blev VT med succes induceret i 77% af WT-hjerterne, men kun i 18% af KO-hjerterne. Data blev analyseret ved tovejs ANOVA og en Bonferroni post-hoc sammenligning. Fejlbjælkerne angiver standardfejl (SE). Figuren er gengivet med tilladelse fra Wang et al.2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ventrikulære takyarytmier induceret i rottehjerter efter intramyokardieinjektion af et virus, der udtrykker Wnt3a. (A) PES-inducerede ventrikulære arytmier i hjerter hos rotter (200-250 g, han, Sprague-Dawley) på dag 4-6 efter intramyokardieinjektion af et adenovirus, der udtrykker Wnt3a (Ad-Wnt3a, nederst), men ikke i hjerter injiceret med kontroladenovirus, der udtrykker GFP (Ad-GFP, øverst). Hjerter blev isoleret og perfuseret på et Langendorff-system. Isoproterenol (1 μM) blev inkluderet i den perfuserende Tyrodeopløsning under PES-stimuleringen. Ex vivo EKG blev kontinuerligt registreret under PES-stimulering. Bemærk, at 11 på hinanden følgende S1-stimuli (blå farve) blev brugt i dette eksperiment. (B) Resumé af undersøgelser i panel (A): Ventrikulær takykardi (VT) blev induceret af PES i tre ud af fire hjerter med Ad-Wnt3a-injektion, men i ingen af de fire hjerter med kontrol Ad-GFP. Figuren er gengivet med tilladelse fra Lu et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trin er afgørende for succesen med Langendorff-perfuseret, isoleret hjertepræparat. For det første er det vigtigt at undgå skader på hjertet under hjerteindsamling (f.eks. På grund af utilsigtet klemning eller skæring med saksen). For det andet er det afgørende at sætte det indsamlede hjerte i kold Tyrode-opløsning så hurtigt som muligt, fordi dette vil stoppe hjerterytmen og reducere hjertets iltforbrug. For det tredje må nålens indsættelse i aorta ikke være for dyb - ideelt set er spidsen af nålen tæt på aortaklappeniveauet, så hjertet er godt perfuseret gennem koronararterierne. Endelig skal bobler i perfusionsnålen fjernes inden aortakanylering - det er normalt nyttigt at tænde pumpen i et par sekunder lige før kanylering for at fjerne boblen ved spidsen af nålen.
Langendorff-perfuseret hjertepræparat har flere fordele i forhold til in vivo-undersøgelser på dyr. For det første er det muligt nøjagtigt at kontrollere koncentrationen og varigheden af lægemidler, der påføres hjertet (f.eks. Isoproterenol, som anvendt i denne undersøgelse). For det andet giver det nem adgang til de forskellige områder af hjertet til enten stimulering (f.eks. elektrisk pacing i toppen i dette manuskript) eller fysiologisk signaloptagelse (f.eks. optisk kortlægning af ventrikelvævet efter belastning med et Ca2+-følsomt eller spændingsfølsomt farvestof, som ikke er beskrevet her). Derudover kan hjertefunktionen, såsom ventrikulær kontraktilitet, let måles ved at indsætte en ballon i venstre ventrikel og forbinde ballonen til en tryktransducer8. For det tredje kan hjertets iboende egenskaber, såsom hjertefrekvens og ventrikulær kontraktilitet, undersøges uden de komplicerende faktorer i in vivo-undersøgelser, såsom det autonome nervesystem og cirkulerende hormoner. Begrænsningen ved Langendorff-perfuseret hjerte er imidlertid, at det mangler krydstale mellem forskellige organer eller væv in vivo15,16,17 via enten cirkulerende faktorer eller det autonome nervesystem, hvilket kan være kritiske aktører i nogle undersøgelser.
Ex vivo EKG-registreringen af Langendorff-perfuseret hjerte, som beskrevet her og i de tidligere publikationer 2,6,7,9, har fordelen ved kontaktløs registrering og forstyrrer ikke hjertets funktion sammenlignet med andre metoder såsom optisk kortlægning, som kræver belastning af Ca2+ -følsomme eller spændingsfølsomme farvestoffer og anvendelse af en excitationskontraktionsfrakobler for at reducere mekanisk hjertebevægelse (såsom blebbistatin)12,18. Den optiske kortlægning har imidlertid den fordel, at den giver mere detaljerede oplysninger om hjertets elektriske aktiviteter, såsom hjerteslagets oprindelse, mønsteret for myokardieaktivering og myokardieledningshastigheden.
Metoden til direkte intramyokardieinjektion af en virus, som beskrevet her, kan også anvendes til levering af andre terapeutiske materialer 19,20,21,22,23,24, såsom biomaterialer, exons, modificeret mRNA og stamcelleafledte kardiomyocytter. Den ultralydsbilleddannende guidede intramyokardieinjektion har flere fordele i forhold til den traditionelle thoracotomibaserede injektionsmetode. For det første er det mindre invasivt og giver mulighed for hurtigere genopretning af dyrene efter injektionsproceduren. Dette reducerer procedurerelaterede virkninger på dyrene (f.eks. dem, der er forårsaget af postoperativ smerte og brystvævsbetændelse, når der anvendes en invasiv thoracotomi). For det andet verificerer ultralydsbilleddannelse vellykket virusinjektion i hjertet, hvilket øger konsistensen og reproducerbarheden af resultaterne. Begrænsningen ved ultralydsvejledt virusinjektionsmetode er imidlertid, at placeringen af virusinjektionsstederne ikke kan kontrolleres så præcist som i den thoracotomibaserede tilgang, som muliggør visuel lokalisering af de forskellige hjerteregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 og PJT-180533, til WL), CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, til WL), Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) McDonald Scholarship og New Investigator Award (S-17-LI-0866, til WL), Student Scholarships (til JW og YX) og et postdoktoralt stipendium (til AL) fra University of Ottawa Cardiac Endowment Funds ved Heart Institute. Forfatterne takker Richard Seymour for hans tekniske support. Figur 2 blev oprettet med Biorender.com med godkendte licenser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
