Summary
无细胞重建一直是了解细胞骨架组装的关键工具，并且在过去十年中的工作已经建立了研究最小系统中隔膜蛋白动力学的方法。这里介绍的是三种在不同膜环境中观察隔膜组装的互补方法：平面双层，球形支撑和棒状支撑。
Abstract
大多数细胞可以感知并改变它们的形状，以执行基本的细胞过程。在许多真核生物中，隔膜细胞骨架是协调形状变化（如细胞分裂，极化生长和迁移）的组成部分。Septins是形成细丝的蛋白质，它们组装形成各种高阶结构，并且在许多情况下，存在于质膜的不同区域，最显着的是微米级正曲率区域。监测 体内 隔膜组装过程受到细胞中光学显微镜的局限性以及与膜和细胞骨架元件相互作用的复杂性的阻碍，使得难以量化生命系统中的隔膜蛋白动力学。幸运的是，在过去十年中，在无细胞系统中重建隔膜蛋白细胞骨架以剖析以高空间和时间分辨率控制隔膜蛋白组装的机制方面取得了实质性进展。隔膜蛋白组装的核心步骤包括隔膜杂高分子缔合和解离，聚合成细丝，以及通过细丝之间的相互作用形成高阶结构。在这里，我们提出了三种在不同情况下观察隔膜组装的方法：平面双层，球形支撑和杆支撑。这些方法可用于确定隔膜在不同组装阶段的生物物理参数：作为结合膜的单个八聚体，作为细丝，以及作为细丝的组装。我们将这些参数与曲率采样和优先吸附的测量值相结合，以了解曲率传感如何在各种长度和时间尺度上工作。
Introduction
细胞的形状及其许多内部隔室取决于它们周围的脂质膜。膜是粘弹性结构，可以通过与蛋白质的相互作用，脂质分选以及作用的内部和外部力来产生各种形状而变形1，2，3，4。这些形状通常用膜曲率来描述。细胞使用一套多样化的蛋白质，能够优先组装或“感知”特定的膜曲率，以确保对包括细胞运输，细胞分裂和迁移在内的过程进行定义的时空控制5，6。由于难以平衡时间和空间分辨率与细胞健康，因此很难观察到膜上细胞机制的动力学。虽然超分辨率技术可以提供这些结构的详细视图，但它们需要长时间的采集，而这些采集不适合大多数机械的装配/拆卸时间尺度。此外，这些组件在其天然环境中的分子复杂性以及单个组分可以发挥的众多作用使得最小重构系统成为研究分子功能能力的宝贵工具。
已经开发了最小膜模拟物来研究细胞外的膜特性和蛋白质 - 膜相互作用。膜模拟物从独立的脂质双分子层（例如脂质体或巨型单层囊泡）到支撑脂质双分子层（SLBs）7，8，9，10不等。SLB是锚定在下层支撑物上的仿生膜，通常由玻璃，云母或二氧化硅11，12组成。可以使用各种几何形状，包括平面，球体，棒，甚至起伏或微图案底物，以同时探测凹曲率和凸曲率上的蛋白质 - 膜相互作用1 3，14，15，16，17，18.双层形成始于囊泡吸附到亲水表面上，然后熔合和破裂以形成连续的双层（图1）19。支撑的双层特别适合光学和电子显微镜检查，提供比细胞中通常可以实现的更好的时间和空间分辨率。弯曲的SLB特别提供了一种有吸引力的方法，可以在没有显着的膜变形的情况下探测蛋白质曲率灵敏度，使人们能够区分曲率传感和曲率感应，这在独立系统中通常是不可能分离的。
Septins是一类形成细丝的细胞骨架蛋白，以其在正弯曲膜上组装的能力而闻名6，18，20。在酵母细胞周期的过程中，隔膜蛋白组装成一个环，并且必须重新排列以形成与芽出现和细胞分裂相关的沙漏和双环结构，分别为21。虽然已经使用铂复制电子显微镜在不同的细胞周期阶段22观察隔膜蛋白结构，但使用酵母中的光学显微镜观察隔膜蛋白随时间的组装已经遇到了有限的空间分辨率。以前使用透射电子显微镜（TEM）可视化的脂质单层的隔膜蛋白的工作能够重建几个有趣的隔膜结构，如环，束和纱布23。然而，与荧光显微镜不同，EM技术在时间分辨率方面同样受到限制。为了更好地解决隔膜组装的多尺度过程的动力学参数，我们转向了支持的膜模拟物，在那里人们可以仔细控制膜的几何形状，样品条件和成像模态。
这里描述的方案使用平面或弯曲的SLB，纯化的蛋白质和显微镜技术的组合。定量荧光共聚焦显微镜和全内反射荧光显微镜（TIRFM）用于测量本体蛋白质与各种膜曲率的结合，以及测量单分子的结合动力学。此外，该方案已被调整为与扫描电子显微镜（SEM）一起使用，以检查不同膜曲率上的蛋白质超微结构。虽然这些方案的重点是隔膜细胞骨架，但可以很容易地修改实验方案，以研究读者感兴趣的任何蛋白质的曲率敏感性。此外，那些在内吞作用或水泡运输等领域工作的人可能会发现这些技术可用于探测多蛋白复合物的曲率依赖性组装体。
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Protocol
注意：形成支撑的脂质双分子层需要制备单分散的小单层囊泡（SUV）。请参阅之前发布的关于SUV形成的协议24 。简而言之，所有SUV都是通过探针超声处理形成的，总共70%的幅度为12分钟，通过4分钟的超声处理周期，然后在冰水中休息2分钟。SUV解决方案必须明确，尺寸必须单分散。SUV的尺寸分布可以例如通过动态光散射25来测量。
1. 平面脂质双层
- 等离子清洗载玻片
注意：等离子清洗可去除有机污染物并增加玻璃的亲水性，确保有效的脂质吸附。以下步骤可能会根据所使用的等离子清洁剂和玻璃盖玻片进行更改或需要优化。- 用氧气吹扫等离子体清洁剂5分钟，以从管路和腔室中除去空气。这是为了确保在等离子体清洗机运行时，管路和腔室中主要有氧气，从而提供更一致的双层制剂。
- 吹扫时，将惰性气体（如 N2 或 Ar）流过微盖玻片，以除去灰尘和颗粒。
可选：盖玻片可以通过喷洒100%异丙醇然后用水冲洗每面来清洗。重复异丙醇水洗涤3x，然后用N2 流干燥。 - 将干燥的盖玻片放入陶瓷底座中。将底座放在等离子体室的背面，使盖玻片与腔室的长边缘平行（这在等离子清洗过程中将它们保持在适当的位置）。用最大功率的氧气运行等离子清洗机15分钟。
- 腔室制备
注意：这里描述的方法使用来自塑料PCR管的自制腔室来支持反应体积，但其他低粘附性材料，如硅酮孔，也可能是合适的。- 使用剃须刀片或剪刀，切下0.2 mL PCR管磨砂部分的正下方的盖子（图2）。
- 用紫外活化粘合剂涂上PCR管的边缘，避免管内部。轻轻地将PCR管胶合在血浆清洁的盖玻片的中心。
注意：为避免腔室内出现胶水，请使用最少量的胶水进行密封，并立即用紫外线处理，而不会碰撞或干扰腔室。 - 将腔室置于长波长UV光下5-7分钟以固化粘合剂。
- 双层形成
注意：此步骤中应使用单分散SUV，以实现高效的双层形成。 表1 提供了双层地层中使用的所有缓冲液的配方，包括储备和最终缓冲液浓度。- 加入40μL负载的脂质双层缓冲液（SLBB：300 mM氯化物，20 mMHEPES，pH 7.4，1 mMMgCl2; 表1），将10微升5 mM SUV和1 μL 100 mM CaCl2 加入孔中。轻轻地从一侧到另一侧摇动腔室以破坏SUV，然后在37°C下孵育20分钟。
注意：为了限制蒸发，用湿巾在有盖的培养皿中孵育。
- 加入40μL负载的脂质双层缓冲液（SLBB：300 mM氯化物，20 mMHEPES，pH 7.4，1 mMMgCl2; 表1），将10微升5 mM SUV和1 μL 100 mM CaCl2 加入孔中。轻轻地从一侧到另一侧摇动腔室以破坏SUV，然后在37°C下孵育20分钟。
- 洗去多余的脂质
注：此步骤将删除多余的 SUV 并充当缓冲区交换步骤。在洗涤时不要用移液器吸头刮擦双层非常重要;如果玻璃暴露，隔膜和许多其他蛋白质将不可逆地结合，降低有效蛋白质浓度。- 孵育后，用150μLSL SLBB冲洗双层6x，每次上下移液以混合，同时避免气泡。
注意：将150 μL直接加入到50 μL缓冲液和SUV中，在反应孔中总共加入200 μL。 - 当准备开始用隔膜蛋白或另一种选择的蛋白质孵育时，用150μL反应缓冲液（RXN：33.3mM氯化碳，50mM HEPES，pH 7.4，1.4mg / mL BSA，0.14%甲基纤维素，1mM BME）洗涤双层6x。
注意：为获得最佳效果，使反应缓冲液新鲜，并在反应中充分混合时要非常小心，以避免气泡。 - 在最后一个洗涤步骤中，除去125μL反应缓冲液，在孔中留下75μL。加入25μL稀释在隔膜储存缓冲液（SSB：300mM KCl，50mM HEPES，pH 7.4，1mM BME）中稀释的隔膜，并通过TIRF显微镜26成像。
注意：首次设置该测定或加入新的脂质组合物时，最好使用光漂白（FRAP）后的荧光恢复来确保脂质在表面上自由扩散。虽然不同脂质组合物的恢复率会有所不同，并且本质上低于独立式系统，但脂质不应是静止的。
- 孵育后，用150μLSL SLBB冲洗双层6x，每次上下移液以混合，同时避免气泡。
| 支持的脂质双层缓冲液 （SLBB） | ||
| 股票 | 卷 | 最终浓度 |
| 2 M 氯化钾 | 1.5 毫升 | 300 米 |
| 1 米赫普斯 | 200 微升 | 20 米 |
| 500 mM 氯化镁2 | 20 微升 | 1 百万 |
| 水 | 8 毫升 | |
| 反应前缓冲液 | ||
| 股票 | 卷 | 最终浓度 |
| 2 M 氯化钾 | 166 μL | 33.3 百万 |
| 1 米赫普斯 | 500 微升 | 50 米 |
| 水 | 9.33 毫升 | |
| 反应缓冲液 | ||
| 股票 | 卷 | 最终浓度 |
| 2 M 氯化钾 | 166 μL | 33.3 百万 |
| 1 米赫普斯 | 300 微升 | 50 米 |
| 10 毫克/毫升双链氨基酸 | 1.39 毫升 | 1.39毫克/毫升 |
| 1%甲基纤维素 | 1.39 毫升 | 0.0014 |
| 水 | 高达 10 毫升 | |
| 断续器 | 0.7 微升 | 1 百万 |
| 隔膜储存缓冲液 | ||
| 股票 | 卷 | 最终浓度 |
| 2 M 氯化钾 | 1.5 毫升 | 300 米 |
| 1 米赫普斯 | 500 微升 | 50 米 |
| 水 | 高达 10 毫升 | |
| 断续器 | 0.7 微升 | 1 百万 |
表1：用于制备负载脂质双层和反应的缓冲液组分。 图中显示了掺入缓冲液中的储备溶液的体积和每种组分的最终浓度。SLB和PRB可以在室温下储存，并在实验之间重复使用。反应缓冲液和SSB在每个实验中都是新鲜的。
2. 球形支撑脂质双层
注意：该方案使用悬浮在超纯水中的二氧化硅微球，密度为10%。对于蛋白质组装动力学参数的任何工作，严格控制实验和曲率之间的总膜表面积非常重要。 表2 显示了校正后的微球和缓冲液的体积，以保持5毫米2 的总膜表面积。该协议扩展了先前发布的方法8，18。
- 双层形成
注意：对于平面双层，重要的是要有高质量的SUV，以实现坚固的双层形成。 表 2 列出了来自 10% 密度溶液的磁珠体积及其各自的 SLBB 体积，这些体积用于在一系列磁珠直径下获得 5 mm2 的最终表面积。- 二氧化硅微球（也称为珠子）倾向于沉降并聚集在一起;将珠子混合并分解任何簇，涡旋瓶子15秒，然后浴超声处理1分钟，然后再次涡旋15秒。
- 在0.5 mL低粘附微量离心管中将适当体积的磁珠（表2）与相应体积的SLBB和10μL的5 mM SUV混合。
- 在室温下将珠状脂质混合物端部上下摇1小时。确保在旋转器上进行此孵育，以防止沉淀。
- 在PEGyl化盖玻片上准备腔室
注意：对于平面双层，使用塑料PCR管自制的腔室来支持反应体积，但其他低粘附性材料（如硅酮孔）也可能同样有效。- 当珠子摇晃时，在室温下解冻PEGyl化盖玻片。按照步骤1.2中所述，切割0.2 mL PCR管并将其粘附在盖玻片上。对于 24 mm x 50 mm 的载玻片，一张载玻片上最多可以安装 10 个腔室。
注意：本实验方案使用预先制备的 24 mm x 50 mm 聚四氟乙烯化玻璃盖玻片。简而言之，玻璃盖玻片通过丙酮，甲醇和3 M KOH的超声处理彻底清洁。然后用n-2-氨基乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷官能化盖玻片，并与戊酸琥珀酰亚胺共价连接。成品PEGyl化盖玻片在-80°C真空密封下储存。 有关类似的钝化方案，请参阅Gidi等人的工作27。虽然这里建议使用PEGyl化玻璃盖玻片，但其他钝化方法，例如BSA或聚-L-赖氨酸方法，可能是有效的。
- 当珠子摇晃时，在室温下解冻PEGyl化盖玻片。按照步骤1.2中所述，切割0.2 mL PCR管并将其粘附在盖玻片上。对于 24 mm x 50 mm 的载玻片，一张载玻片上最多可以安装 10 个腔室。
- 洗去多余的脂质
注：此步骤的功能是去除多余的SUV并执行缓冲液更换。用预反应缓冲液（PRB：33.3 mM氯化钾，50mM HEPES，pH 7.4）总共洗涤4次珠子。 表 3 列出了一系列磁珠直径的旋转速度（以 RCF 为单位）。- 在指定的RCF处旋转磁珠30秒（表3）。如果使用多种尺寸的珠子，请保持珠子摇晃，直到需要清洗。
注意：为了节省时间，不值得以与较小珠子沉降速度较小的磁珠相同的旋转方式沉淀较大的磁珠。这可能导致磁珠相互粘附并损害双层的完整性。 - 第一次旋转后，除去50μL上清液并加入200μLPRB。第二次和第三次旋转后，除去200μL并加入200μLPRB。第四次旋转后，除去200μL并加入220μLPRB。每次洗涤时用力移液。
注意：最终的重悬量与洗涤量不同。不要在与脂质孵育后涡旋磁珠，因为这会在双层中留下间隙。为了避免在处理其他磁珠尺寸或设置测定的其他部分时沉淀，请将磁珠混合物放回端对端旋转器上。
- 在指定的RCF处旋转磁珠30秒（表3）。如果使用多种尺寸的珠子，请保持珠子摇晃，直到需要清洗。
- 准备反应
注意：该反应旨在将反应的总膜表面积保持在5 mm2 ，并产生100 mM KCl，50 mM HEPES，1 mg / mL BSA，0.1%甲基纤维素和1 mM BME的最终反应条件。- 如果使用多种磁珠尺寸进行竞争性测定，则通过将每个磁珠尺寸的相等体积混合在一起来制成1：1的混合物。然后，将29μL所需的微球混合物（或单个珠子）与721μLRXN缓冲液混合。
注意：重要的是在每一步用移液器彻底混合磁珠，以避免密集的磁珠簇;这将导致更均匀的磁珠分布和准确的总表面积。 - 将75μL稀释的微球和25μL在SSB中稀释的蛋白质混合到孔中。
注意：作者通常在1-50 nM下对酵母隔膜复合物进行成像。 - 如果在稳态下测量隔膜，则在室温下孵育1小时，然后通过近TIRF或共聚焦显微镜成像。
- 如果使用多种磁珠尺寸进行竞争性测定，则通过将每个磁珠尺寸的相等体积混合在一起来制成1：1的混合物。然后，将29μL所需的微球混合物（或单个珠子）与721μLRXN缓冲液混合。
| 磁珠直径（微米） | 混合良好的微球体积 （μL） | 负载均衡缓冲液体积（μL） | 单反车辆容积（μL） |
| 6.46 | 8.94 | 61.1 | 10 |
| 5.06 | 7 | 63 | 10 |
| 3.17 | 4.39 | 65.6 | 10 |
| 0.96 | 1.33 | 68.7 | 10 |
| 0.54 | 0.75 | 69.3 | 10 |
| 0.31 | 0.43 | 69.6 | 10 |
表2：微球的标准化体积。 为了保持每个磁珠尺寸的相等表面积，并保持实验之间的总膜表面积一致，计算每个磁珠尺寸的体积和归一化总表面积的缓冲液。
| 磁珠直径（微米） | 沉降速度 |
| 0.31 | 4.5 |
| 0.54 | 4.5 |
| 0.96 | 2.3 |
| 3.17 | 0.8 |
| 5.06 | 0.3 |
表3：不同直径微球的沉降速度。 对于每个珠径，使用所示的最小沉降速度来沉淀磁珠以洗去未结合的脂质体。
3. 棒状支撑脂质双分子层
注意：与此处介绍的其他测定方法相比，棒状测定不允许仔细控制总膜表面积。实验之间的数量和体积可以保持一致，但由于这导致不同长度和直径的棒，因此很难推断出反应中的总膜表面积。因此，虽然这是在单个表面上探索具有多个曲率的曲率传感的出色测定方法，并且对于探索隔膜蛋白超微结构很有用，但不建议用于动力学测量。这种方法以前曾被报道过18 次，现在正在这里进行扩展。
- 从玻璃超细纤维过滤器中获取硼硅酸盐棒
- 将单个42.5 mm级GF / C玻璃超细纤维过滤器撕成小块，并将它们放入装有60 mL 100%乙醇的100 mL烧杯中。浴超声处理，直到溶液变得不透明;这可能需要20-30分钟，使用精细的过滤器。
注意：彻底超声处理以分解大块;越解离/不透明越好。 - 用薄膜覆盖溶液，并将溶液在室温下储存过夜。
- 将单个42.5 mm级GF / C玻璃超细纤维过滤器撕成小块，并将它们放入装有60 mL 100%乙醇的100 mL烧杯中。浴超声处理，直到溶液变得不透明;这可能需要20-30分钟，使用精细的过滤器。
- 在棒材上形成双层
注意：此步骤是用过量的脂质执行的，以实现完全的棒覆盖，因为在这种方法中不可能量化总表面积。- 第二天乙醇溶液将被沉淀（步骤3.1.2），因此请在使用前充分混合。将10 μL棒状溶液和70 μL SLBB混合。
- 在小型离心机中以最高速度旋转30秒，并除去50μL上清液。在另一个50μLS SLBB中重悬，并重复旋转共洗涤四次以稀释乙醇。
注意：杆支撑不会在管的底部形成固体颗粒。相反，它们沿着管子的侧面涂抹;这使得它们在洗涤时难以完全保存。由于该测定中的总表面积不受控制，因此如果它们受到干扰也没关系。 - 将10μL充分混合的棒状溶液与50μL5 mM SUV和20μLSL SLBB混合。在室温下孵育1小时，在微球上形成双层时端到端旋转。
- 洗去多余的脂质
- 与步骤3.2.2.类似，在小型离心机中以最高速度旋转脂质棒溶液30秒，以将膜包被的棒从溶液中沉淀出来。
- 第一次旋转后，除去50μL上清液并加入200μLPRB。第二次和第三次旋转后，除去200μL并加入200μLPRB。第四次旋转后，取出200μL，加入220μLPRB，并用力移液混合。
- 准备反应
- 在1.5 mL微量离心管中，将721μL反应缓冲液与29μL棒状溶液混合。搅拌均匀。
- 在0.2 mL PCR管中，将75μL棒在反应缓冲液中和25μL隔膜蛋白以所需浓度混合，在SSB中稀释。让它在室温下孵育至少1小时。
- 扫描电子显微镜的准备
- 孵育后，将100μL隔膜棒混合物加入圆形PEG包被的12mm盖玻片上，并在室温下在封闭的培养皿中孵育1小时。
- 通过在培养皿的底部（10mL应足够）中用2.5%戊二醛在0.05M二甲酸钠（NaCo），pH 7.4中固定样品，持续30分钟。用玻璃移液管吸出液体。通过用10 mL 0.05 M NaCo孵育样品5分钟来洗涤样品，并重复总共洗涤两次。
- 在0.5%OsO4 二甲苯二甲酸盐缓冲液中后固定30分钟，然后在0.05M NaCo中洗涤3x（每洗涤5分钟）。
- 将样品与1%单宁酸孵育15分钟，然后在NaCo 3x中洗涤。在0.5%OsO4 中孵育15分钟，并用NaCo洗涤3x。
- 使用增加乙醇浓度对样品进行脱水：30%EtOH 5分钟，2x;50%环氧乙烷酮5分钟;75%环氧乙烷持续5分钟;和 100% 环氧乙烷 5 分钟，2 倍。然后再进行10分钟的孵育。
- 在过渡液（六甲基二硅氮烷）中孵育3x（5分钟，10分钟，然后5分钟）。
- 风干，然后将样品放入干燥器中，直到溅射涂层。用金/钯合金溅射涂覆4nm层，然后在扫描电子显微镜上成像。
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Representative Results
在制备每个SLB之后，可以将分隔蛋白或目标蛋白质与所需的支持物一起孵育，并通过TIRFM，共聚焦显微镜或SEM成像。这里显示的结果使用从 大肠杆菌17重组表达和纯化的隔膜蛋白。在平面SLB上使用TIRFM，可以确定灯丝的长度及其柔韧性，测量扩散系数并观察28，29随时间变化的装配。为了收集最高质量的测量结果，首先需要确定双层的质量，特别是在首次制备它们或改变脂质组合物时。通过TIRFM对双层上的蛋白质分布进行目视检查可以帮助识别双层中被划伤或畸形的区域。蛋白质分布应该是均匀的（图3A），双层中不应有孔或间隙（图3B）。最好避免使用带孔的膜，这些孔可能由灰尘污染或载玻片处理产生的污迹形成，因为这会改变双层其他区域的蛋白质分布。为了可视化膜本身，可以将痕量罗丹明-PE掺入SUV中以进行双层形成。在高质量的双层中，场将均匀出现（未显示图像），但如果脂质体较旧或洗涤不够严格，则未爆破和管状脂质体可能会在表面上积聚（图3C）。此外，虽然固体支撑物会阻碍脂质8的自由扩散，但脂质不应该是固定的。FRAP实验可用于评估脂质在平面双层上的流动性，其可能因组成而异，并且应以秒30的顺序显示回收率。
球形载体可用于单独检查具有定义曲率的膜上的蛋白质结合（一个曲率）或在同一孔中具有多个膜曲率，以观察曲率6，18之间的竞争。磁珠上的近TIRFM>1μm也可用于测量给定区域的关联事件数27。与平面双层一样，我们使用罗丹明-PE来寻找光滑的双层沉积（图4A），即没有脂质团块，这表明多层状或未爆裂的脂质体（图4B），并且双层中没有间隙（图4C）。为了测量总蛋白质吸附或蛋白质在弯曲表面上随时间的吸附，有必要将单个磁珠彼此分离，以创建一个离散的体积，可以测量该体积的总和脂质强度和隔膜强度的总和。因此，磁珠应该很好地分离，而不是像 图4D那样聚集在一起。我们将在讨论部分介绍所有这些潜在问题的疑难解答选项。
这种SLB测定也可以应用于棒状载体，为蛋白质在单个表面上采样多个曲率提供了环境。将该测定与扫描电子显微镜配对，用户可以检查隔膜蛋白18 或其他感兴趣蛋白质的曲率偏好，比准和长度分布。虽然与这里介绍的其他测定方法类似，但由于来自滤纸的基材的异质性，棒状测定不允许仔细控制总膜表面积。这里使用的滤纸的材料特性导致不同长度和直径的棒材（图5A）;这对于探索弯曲表面上的蛋白质曲率传感和组织非常有用（图5B），但由于蛋白质与膜的比例无法控制，因此杆对于生成饱和结合曲线或测量参数（如结合常数）的效用有限。
图1：具有各种曲率的支撑物上支撑脂质双层形成的概述。 SUV与不同几何形状的固体支撑一起孵育，以改变给定膜上可用于采样的曲率。SUV吸附在固体支撑表面上并破裂以形成脂质双层。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：反应室设置示意图。 为了准备定制腔室，将0.2 mL PCR管切割在管开始变细的地方和盖子处（红色虚线）。然后将切割管的未切割边缘涂上一层薄薄的紫外线活化胶水（蓝色），并将胶水向下放置在盖玻片上。 请点击此处查看此图的大图。
图3：平面双层的代表性TIRF显微照片 （A）高质量脂质双层（75%DOPC，25%大豆PI）与不可聚合的隔板结合（绿色）的代表性图像。蛋白质没有聚集在任何特定区域，并且没有脂质体附着在膜上，也没有孔。（B）这种双层是用清洁不良的玻璃盖玻片制成的，并且在膜上显示出似乎是“孔”（白色箭头），其中隔膜较少。可以看到隔膜拥挤在双层中这些缺陷的边缘（由右侧缩放区域中的白色箭头表示）。（C） 使用痕量罗丹明-PE的低质量双层的代表性图像。未爆裂的脂质体和管状脂质在表面上可见。 请点击此处查看此图的大图。
图4：脂质包被微球的代表性显微照片。 来自竞争分析的代表性图像，其中混合了直径为0.3μm，0.5μm，1μm，3μm和5μm的脂质包被珠（75%DOPC，25%大豆PI，0.1%罗丹明PE）。所有图像均为最大 Z 投影。（A）高质量脂质包被微球混合物的代表性图像。球形支撑物被膜均匀地覆盖，并且几乎没有珠簇。（B）膜包衣不均匀的代表性图像，可能是由于过量脂质洗涤不足引起的。（C）由于处理不当而具有膜覆盖间隙（白色箭头）的磁珠的代表性图像。（D）密集聚集的磁珠的代表性图像，可能是由于在整个过程中混合不足引起的，特别是在将不同的磁珠组合在一起时。 请点击此处查看此图的大图。
图5：脂质和隔膜包被棒的代表性电子显微镜照片 （A）SEM图像显示脂质包被（75%DOPC，25%大豆PI，0.1%罗丹明PE）棒的长度和直径的分布。（B）隔离的膜涂层棒的边缘，其隔膜长丝沿正曲率轴对齐。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
细胞膜具有许多不同的形状、曲率和物理化学性质。为了研究细胞构建微米级组件的纳米级机械，有必要设计膜模拟物的最小重构系统。该协议提供了精确控制膜曲率和成分的技术，同时允许用户使用广泛使用的显微镜技术轻松进行定量荧光测量。
该协议的最关键组成部分是在适当的表面上组装孔并处理脂质。这里描述的孔是使用PCR管和UV活化粘合剂手工制作的;重要的是，在组装过程中不要将胶水粘在反应区域内部。这可以通过沿着孔的边缘成像并寻找高蛋白吸附到盖玻片上来检查实验过程。用户可以选择使用替代材料进行孔，例如硅胶，这些材料可以在商业上订购，但所提出的方法提供了坚固的孔，不会移动或泄漏，并且可以支持更大的反应量。在我们手中，盖板玻璃的表面对于形成平面双层非常重要。优化等离子清洗时间甚至品牌的盖板玻璃可能需要看到双层的均匀形成，因为适当的表面处理和装料对于囊泡吸附和熔融至关重要31，32，33。当首次设置这些实验或使用新的脂质组合物时，应使用光漂白（FRAP）实验后的荧光恢复来评估与独立系统30相比膜的流动性。预计支持系统的流动性将低于独立式系统，但不会无法移动12。
当通过荧光评估双层质量时，重要的是要寻找双层中的未爆脱脂质体或缺陷（图3C），因为这些可以改变局部蛋白质吸附。可以考虑以下故障排除选项。a） 可以调整SUV的准备工作，以提高双层质量。超声处理，冻融和挤出都是常用的方法，根据脂质成分，其易用性和成功率可能会有所不同。在我们手中，具有单分散尺寸分布的完全澄清的SUV解决方案会产生最均匀的双层。动态光散射（DLS）可用于评估尺寸分布25。b）可以增加SUV内部和外部缓冲液之间盐浓度的差异。通过降低内部离子浓度（或增加外部离子浓度），SUV上的渗透应力增加了破裂31的可能性。或者，改变存在的一价阳离子可以改变SLB形成的动力学并有助于优化新脂质组合物34的SLB。c）可以增加洗涤次数或力。根据作者的经验，在洗涤过程中剧烈混合会导致更清洁的双层，并且似乎没有破坏性;相反，最大的问题是意外地用移液器吸头刮擦双层，这将在膜中显示为气体。对于弯曲的双层，最好尽量减少使用窄移液器吸头的处理，并在执行洗涤步骤时轻轻混合，特别是对于较大的（>1μm）磁珠，因为膜可能会从玻璃珠上剪切。如果观察到球形膜双层中持续存在间隙（图4C），增加移液器吸头的宽度（通过切断吸头的末端或购买宽吸头）并尽可能减少处理，同时仍然完全混合珠溶液，可能会有所帮助。这种技术的一个常见技术问题是磁珠聚集在一起的趋势（图4D）。这可以通过增加双层形成前的超声时间部分解决;然而，一些聚类是不可避免的，因为膜包被的磁珠也可能随着时间的推移在孔中聚集在一起。定量分析应避免结块的磁珠。
对平面双层上单分子动力学进行定量测量的局限性包括需要保持在低浓度，以便准确跟踪和计数颗粒。然而，这可以通过在采集期间低估目标蛋白质来纠正，以减少在跟踪35期间可见的颗粒数量。此外，球形和棒状SLB专门用于量化微米级膜上蛋白质的曲率灵敏度，并且这里使用的二氧化硅微球的直径仅为100nm，此时当通过光学显微镜观察时，它们是衍射极限的pucta。因此，那些希望评估较小直径上精确曲率特异性的人将无法使用这种方法。然而，这种技术仍将提供有关曲率偏好趋势的宝贵信息，并允许解剖曲率依赖性组件。
与独立式脂质双层体系相比，该技术适用于各种缓冲条件，并且在制备过程中不需要仔细的渗透平衡。此外，由于它使用玻璃支撑物，双层容易沉入井底，从而消除了拴系或使用蔗糖或其它增稠剂36的需要。虽然独立式脂质双层系统为研究膜结合蛋白的膜变形提供了有用的手段，但很难研究膜曲率与复杂组装之间的关系。与易于变形的膜系统不同，这种方法允许用户使用各种脂质组合物，而不会使单个脂质物种的固有形状决定膜的整体几何形状。最后，杆状SLB允许对目标蛋白质的同一连续膜上的多个曲率进行采样（图5B），这对于评估曲率依赖性组件或多个组分的共定位具有独特的信息。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款号的支持。R01 GM-130934和美国国家科学基金会（NSF）授予MCB-2016022。B.N.C.、E.J.D.V.和K.S.C.部分得到了国家普通医学科学研究所在T32 GM119999奖项下的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22x22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
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