Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekonstituering av septinmontering vid membran för att studera biofysiska egenskaper och funktioner

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/64090
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill
* These authors contributed equally

Summary

Cellfri rekonstituering har varit ett viktigt verktyg för att förstå cytoskelettsammansättningen, och arbetet under det senaste decenniet har etablerat metoder för att studera septindynamik i minimala system. Här presenteras tre kompletterande metoder för att observera septinmontering i olika membransammanhang: plana dubbelskikt, sfäriska stöd och stavstöd.

Abstract

De flesta celler kan känna av och ändra sin form för att utföra grundläggande cellprocesser. I många eukaryoter är septincytoskelettet en integrerad komponent för att samordna formförändringar som cytokinese, polariserad tillväxt och migration. Septiner är filamentbildande proteiner som samlas för att bilda olika strukturer av högre ordning och i många fall finns i olika delar av plasmamembranet, framför allt i regioner med positiv krökning i mikronskala. Övervakning av processen för septinmontering in vivo hindras av begränsningarna av ljusmikroskopi i celler, liksom komplexiteten i interaktioner med både membran och cytoskelettelement, vilket gör det svårt att kvantifiera septindynamik i levande system. Lyckligtvis har det skett betydande framsteg under det senaste decenniet när det gäller att rekonstituera septincytoskelettet i ett cellfritt system för att dissekera mekanismerna som styr septinmonteringen vid höga rumsliga och tidsmässiga upplösningar. Kärnstegen för septinmontering inkluderar septin heterooligomerassociation och dissociation med membranet, polymerisation i filament och bildandet av högre ordningsstrukturer genom interaktioner mellan filament. Här presenterar vi tre metoder för att observera septinmontering i olika sammanhang: plana dubbelskikt, sfäriska stöd och stavstöd. Dessa metoder kan användas för att bestämma de biofysiska parametrarna för septiner vid olika monteringsstadier: som enkla oktamer som binder membranet, som filament och som sammansättningar av filament. Vi använder dessa parametrar i kombination med mätningar av krökningsprovtagning och preferensadsorption för att förstå hur krökningsavkänning fungerar på olika längd- och tidsskalor.

Introduction

Cellernas former och många av deras inre fack är beroende av lipidmembranen som omger dem. Membran är viskoelastiska strukturer som kan deformeras genom interaktioner med proteiner, lipidsortering och verkande inre och yttre krafter för att generera en mängd olika former 1,2,3,4. Dessa former beskrivs ofta i termer av membrankrökning. Celler använder en mångsidig uppsättning proteiner som företrädesvis kan monteras på, eller "avkänna", särskilda membrankrökningar för att säkerställa definierad spatio-temporal kontroll över processer inklusive cellhandel, cytokinese och migration 5,6. Dynamiken i cellmaskineriet vid membranet är särskilt svår att observera på grund av svårigheten att balansera tid och rumslig upplösning med cellhälsa. Även om superupplösningstekniker kan erbjuda en detaljerad bild av sådana strukturer, kräver de långa förvärv som inte är mottagliga för tidsskalorna för montering / demontering för de flesta maskiner. Dessutom gör den molekylära komplexiteten hos dessa sammansättningar i deras ursprungliga miljö och de många roller som en enda komponent kan spela minimala rekonstitueringssystem till ett värdefullt verktyg för att studera molekylernas funktionella kapacitet.

Minimal membranmimetik har utvecklats för att studera membranegenskaper och protein-membraninteraktioner utanför cellen. Membranmimetika varierar från fristående lipid-dubbelskikt, såsom liposomer eller gigantiska unilamellarblåsor, till stödda lipid-dubbelskikt (SLBs)7,8,9,10. SLB är biomimetiska membran förankrade i underliggande stöd, vanligtvis bestående av glas, glimmer eller kiseldioxid 11,12. En mängd olika geometrier kan användas, inklusive plana ytor, sfärer, stavar och till och med böljande eller mikromönsterade substrat för att undersöka protein-membraninteraktioner på både konkava och konvexa krökningar samtidigt1 3,14,15,16,17,18 . Dubbelskiktsbildning börjar med vesikeladsorption på en hydrofil yta, följt av fusion och brott för att bilda ett kontinuerligt dubbelskikt (figur 1)19. Stödda dubbelskikt är särskilt mottagliga för ljus- och elektronmikroskopi, vilket ger både bättre tid och rumslig upplösning än vad som ofta kan uppnås i celler. Böjda SDB ger särskilt ett attraktivt sätt att undersöka proteinkrökningskänslighet i frånvaro av signifikant membrandeformation, vilket gör att man kan skilja mellan krökningsavkänning och krökningsinduktion, som ofta är omöjliga att separera i fristående system.

Septiner är en klass av filamentbildande cytoskelettproteiner som är kända för sin förmåga att montera på positivt krökta membran 6,18,20. Under cellcykeln i jäst samlas septiner i en ring och måste omorganiseras för att bilda timglas- och dubbelringstrukturerna associerade med knoppuppkomst respektive cytokinese21. Medan vackert arbete har gjorts med platinareplikelektronmikroskopi för att observera septinarkitektur vid olika cellcykelstadier22, har man sett septinmontering över tid med ljusmikroskopi i jäst mött begränsad rumslig upplösning. Tidigare arbete med septiner med lipidmonolager visualiserade genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) kunde rekonstituera flera intressanta septinstrukturer såsom ringar, buntar och gasbindor23. EM-tekniker är emellertid också begränsade i sin tidsmässiga upplösning, till skillnad från fluorescensmikroskopi. För att bättre lösa de kinetiska parametrarna för den flerskaliga processen för septinmontering vände vi oss till stödd membranmimetik, där man noggrant kan styra membrangeometri, provförhållanden och avbildningsmodalitet.

Protokollen som beskrivs här använder plana eller krökta SLP, renat protein och en kombination av mikroskopitekniker. Kvantitativ fluorescenskonfokal mikroskopi och total intern reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) användes för att mäta både bulkproteinbindning på olika membrankrökningar, samt för att mäta bindningskinetiken hos enskilda molekyler. Dessutom har detta protokoll anpassats för att användas med svepelektronmikroskopi (SEM) för att undersöka protein ultrastruktur på olika membrankrökningar. Medan fokus för dessa protokoll ligger på septincytoskeletten, kan protokollen enkelt modifieras för att undersöka krökningskänsligheten hos alla proteiner som läsaren tycker är intressanta. Dessutom kan de som arbetar inom områden som endocytos eller vesikulär handel hitta dessa tekniker användbara för att undersöka de krökningsberoende sammansättningarna av multiproteinkomplex.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Att bilda lipid-dubbelskikt som stöds kräver beredning av monodisperserade små unilamellarblåsor (SUV). Se ett tidigare publicerat protokoll24 om SUV-bildning. Kortfattat bildas alla SUV: er genom sond ultraljudsbehandling för 12 min totalt vid 70% amplitud via 4 min ultraljudsbehandling perioder följt av 2 min viloperioder i isvatten. SUV-lösningar måste vara väl förtydligade och monodisperserade i storlek. Storleksfördelningar av stadsjeepar kan mätas till exempel genom dynamisk ljusspridning25.

1. Plana lipid dubbelskikt

  1. Plasmarengöring av bilderna
    OBS: Plasmarengöring tar bort organiska föroreningar och ökar glasets hydrofilicitet, vilket säkerställer effektiv lipidadsorption. Följande steg kan ändras eller behöva optimeras beroende på vilken plasmarengörare och glasöverdrag som används.
    1. Rensa plasmarengöraren i 5 minuter med syre för att ta bort luft från ledningarna och kammaren. Detta för att säkerställa att det, när plasmarengöraren körs, främst finns syre i ledningarna och kammaren, vilket ger mer konsekventa dubbelskiktspreparat.
    2. Under rensning, strömma en inert gas, såsomN2 eller Ar, över mikrolockglasglasskivorna för att avlägsna damm och partiklar.
      VALFRITT: Täckglasglas kan tvättas genom att spraya varje sida med 100% isopropanol följt av vatten. Upprepa isopropanolvattentvätten 3x och torka sedan med enN2-ström .
    3. Ordna torra täckglasskivor i en keramisk vagga. Placera vaggan på baksidan av plasmakammaren så att täckglasen är parallella med kammarens långa kant (detta håller dem på plats under plasmarengöring). Kör plasmarengöraren i 15 min med syre med maximal effekt.
  2. Förberedelse av kammare
    OBS: Metoden som beskrivs här använder hemlagade kamrar från PCR-rör av plast för att stödja reaktionsvolymerna, men andra material med låg vidhäftning, såsom silikonbrunnar, kan också vara lämpliga.
    1. Skär av locket strax under den frostade delen av ett 0,2 ml PCR-rör med ett 0,2 ml PCR-rör (figur 2) med ett rakblad eller en sax.
    2. Måla PCR-rörets kant med UV-aktiverat lim och undvik rörets insida. Placera försiktigt PCR-rörets lim i mitten av ett plasmarengjort täckglas.
      OBS: För att undvika lim inuti kammaren, använd minsta mängd lim för att få en tätning och behandla omedelbart med UV utan att stöta eller störa kammaren.
    3. Placera kammaren under UV-ljus med lång våglängd i 5-7 minuter för att härda limet.
  3. Tvåskiktsbildning
    OBS: Monodispersed SUV bör användas i detta steg för effektiv tvåskiktsbildning. Tabell 1 innehåller recept för alla buffertar som används vid bildandet av två lager, inklusive lagerkoncentrationer och slutliga buffertkoncentrationer.
    1. Tillsätt 40 μL lipid-dubbelskiktsbuffert som stöds (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabell 1), 10 μl 5 mM SUV och 1 μL 100 mM CaCl2 till brunnen. Skaka försiktigt kamrarna från sida till sida för att störa stadsjeeparna och inkubera sedan vid 37 °C i 20 minuter.
      OBS: För att begränsa avdunstningen, inkubera i en täckt petriskål med en våtservett.
  4. Tvätta bort överflödiga lipider
    OBS: Detta steg tar bort överflödiga stadsjeepar och fungerar som ett buffertutbytessteg. Det är mycket viktigt att inte skrapa dubbelskiktet med pipettspetsen under tvätt; om glaset exponeras kommer septiner och många andra proteiner att binda irreversibelt, vilket minskar den effektiva proteinkoncentrationen.
    1. Efter inkubation, skölj dubbelskiktet 6x med 150 μL SLBB, pipettera upp och ner för att blanda varje gång samtidigt som du undviker bubblor.
      OBS: Tillsätt 150 μL direkt till 50 μL buffert och stadsjeepar som redan finns för totalt 200 μL i reaktionsbrunnen.
    2. När du är redo att börja inkubera med septinerna eller ett annat valfritt protein, tvätta dubbelskiktet 6x med 150 μL reaktionsbuffert (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg / ml BSA, 0,14% metylcellulosa, 1 mM BME).
      OBS: För bästa resultat, gör reaktionsbufferten färsk och var mycket försiktig när du blandar in reaktionen väl för att undvika bubblor.
    3. Vid det sista tvättsteget, ta bort 125 μL reaktionsbuffert och lämna 75 μL i brunnen. Tillsätt 25 μL septiner utspädda i septinlagringsbuffert (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) vid önskad koncentration och bild med TIRF-mikroskopi26.
      OBS: När du ställer in denna analys för första gången eller införlivar en ny lipidkomposition är det god praxis att se till att lipider fritt diffunderar på ytan med hjälp av fluorescensåtervinning efter fotoblekning (FRAP). Medan återhämtningshastigheten kommer att vara annorlunda för olika lipidkompositioner och i sig lägre än för fristående system, bör lipiderna inte vara immobila.

Lipid-dubbelskiktsbuffert som stöds (SLBB)
Lager Volym Slutlig koncentration
2 miljoner kCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 200 μl 20 mM
500 mM MgCl2 20 μl 1 mM
Vatten 8 ml
Buffert före reaktion (PRB)
Lager Volym Slutlig koncentration
2 miljoner kCl 166 μl 33,3 mM
1 M HEPES 500 μl 50 mM
Vatten 9,33 ml
Reaktionsbuffert
Lager Volym Slutlig koncentration
2 miljoner kCl 166 μl 33,3 mM
1 M HEPES 300 μl 50 mM
10 mg/ml BSA 1,39 ml 1.39 mg / ml
1% metylcellulosa 1,39 ml 0.0014
Vatten Upp till 10 ml
Bme 0,7 μl 1 mM
Septin lagringsbuffert (SSB)
Lager Volym Slutlig koncentration
2 miljoner kCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 500 μl 50 mM
Vatten Upp till 10 ml
Bme 0,7 μl 1 mM

Tabell 1: Buffertkomponenter för beredning av lipid-dubbelskikt och reaktioner som stöds. Volymer av stamlösningar som införlivas i buffertar och de slutliga koncentrationerna av varje komponent visas. SLB och PRB kan lagras vid rumstemperatur och återanvändas mellan experimenten. Reaktionsbuffert och SSB görs färska för varje experiment.

2. Sfäriska lipid-dubbelskikt som stöds

OBS: Detta protokoll använder kiseldioxidmikrosfärer suspenderade i ultrarent vatten vid 10% densitet. För allt arbete med de kinetiska parametrarna för proteinmontering är det viktigt att strikt kontrollera den totala membranytan mellan experiment och krökningar. Tabell 2 visar de korrigerade volymerna av pärlor och buffert för att bibehålla 5 mm2 av den totala membranytan. Detta protokoll bygger vidare på en tidigare publicerad metod 8,18.

  1. Tvåskiktsbildning
    OBS: När det gäller plana dubbelskikt är det viktigt att ha högkvalitativa SUV: er för robust dubbelskiktsbildning. Tabell 2 visar volymen pärlor från en 10% densitetslösning och deras respektive SLBB-volymer som används för att erhålla en slutlig ytarea på 5 mm2 för ett intervall av pärldiametrar.
    1. Kiseldioxidmikrosfärer (även kallade pärlor) tenderar att bosätta sig och klumpa ihop sig; att blanda pärlorna och bryta upp eventuella kluster, virvla flaskan i 15 s, sedan bad-sonicate i 1 min och virvel igen i 15 s.
    2. Blanda lämplig volym pärlor (tabell 2) med motsvarande volym SLBB och 10 μL 5 mM SUV i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör med låg vidhäftning.
    3. Rock pärl-lipidblandningen end-over-end i 1 h vid rumstemperatur. Se till att denna inkubation görs på en rotator för att förhindra sedimentering.
  2. Förbered kamrar på PEGylated coverlips
    OBS: När det gäller plana dubbelskikt används hemlagade kamrar från PCR-rör av plast för att stödja reaktionsvolymerna, men andra material med låg vidhäftning, såsom silikonbrunnar, kan fungera lika bra.
    1. Medan pärlorna gungar, tina en PEGylated coverlip vid rumstemperatur. Skär ett 0,2 ml PCR-rör och limma fast det på täckglaset enligt beskrivningen i steg 1.2. För 24 mm x 50 mm glidbanor kan upp till 10 kammare passa på en bild.
      OBS: Detta protokoll använder 24 mm x 50 mm PEGylated glasöverdrag som är förberedda i förväg. Kortfattat rengörs glasöverdrag noggrant genom ultraljudsbehandling i aceton, metanol och 3 M KOH. Coverslips funktionaliseras sedan med n-2-aminoetyl-3-aminopropyltrimetoxisilan och kovalent kopplat till mPEG-succinimidylvalerat. Färdiga PEGylated täckglas förvaras vakuumförseglade vid −80 °C. För ett liknande passiveringsprotokoll, se Gidi et al.27:s arbete. Medan PEGylated glasöverdrag föreslås här, kan andra passiveringsmedel, såsom BSA eller poly-L-lysinmetoder, vara effektiva.
  3. Tvätta bort överflödiga lipider
    OBS: Detta steg fungerar för att ta bort överflödiga SUV: er och utföra ett buffertutbyte. Pärlor tvättas totalt 4x med förreaktionsbuffert (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Tabell 3 visar rotationshastigheterna i RCF för ett antal pärldiametrar.
    1. Snurra pärlor vid den angivna RCF i 30 s (tabell 3). Om du använder flera pärlstorlekar, håll pärlorna gunga tills det är dags att tvättas.
      OBS: Det är inte värt att sedimentera större pärlor i samma snurr som mindre pärlor med den mindre pärlsedimenteringshastigheten för att spara tid. Detta kan leda till att pärlor fastnar på varandra och äventyrar dubbelskiktets integritet.
    2. Efter den första snurrningen, ta bort 50 μL supernatant och tillsätt 200 μL PRB. Efter den andra och tredje snurrningen, ta bort 200 μL och tillsätt 200 μL PRB. Efter det fjärde snurret, ta bort 200 μL och tillsätt 220 μL PRB. Pipettera kraftigt för varje tvätt.
      OBS: Den slutliga resuspensionsvolymen är annorlunda än tvättarna. Virvla inte pärlorna efter inkubation med lipiderna eftersom detta kan lämna luckor i dubbelskikten. För att undvika sedimentering när du arbetar med de andra pärlstorlekarna eller ställer in andra delar av analysen, placera pärlblandningarna tillbaka på rotatorn från ände till ände.
  4. Förbereda reaktionen
    OBS: Denna reaktion är utformad för att bevara reaktionens totala membranyta vid 5 mm2 och för att producera ett slutligt reaktionstillstånd på 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg / ml BSA, 0,1% metylcellulosa och 1 mM BME.
    1. Om du gör en tävlingsanalys med flera pärlstorlekar, gör en 1: 1-blandning genom att blanda lika stora volymer av varje pärlstorlek tillsammans. Blanda sedan 29 μl av den önskade pärlblandningen (eller av en enda pärla) med 721 μl RXN-buffert.
      OBS: Det är viktigt att blanda pärlorna noggrant vid varje steg med en pipett för att undvika täta kluster av pärlor; detta kommer att resultera i en jämnare pärlfördelning och exakt total ytarea.
    2. Blanda 75 μl utspädda pärlor och 25 μl protein utspätt i SSB till brunnarna.
      OBS: Författarna avbildar vanligtvis jästseptinkomplex vid 1-50 nM.
    3. Om du mäter septiner i stabilt tillstånd, inkubera vid rumstemperatur i 1 timme och avbilda sedan med antingen nära TIRF eller konfokalmikroskopi.
Pärlans diameter (μm) Volym välblandade pärlor (μl) Volym SLB-buffert (μl) Volym av stadsjeepar (μl)
6.46 8.94 61.1 10
5.06 7 63 10
3.17 4.39 65.6 10
0.96 1.33 68.7 10
0.54 0.75 69.3 10
0.31 0.43 69.6 10

Tabell 2: Normaliserade volymer av mikrosfärer. För att bibehålla en lika stor yta av varje pärlstorlek och för att hålla den totala membranytan konsekvent mellan experimenten beräknades volymer för varje pärlstorlek och buffert som normaliserade den totala ytan.

Pärlans diameter (μm) Sedimenteringshastighet (RCF)
0.31 4.5
0.54 4.5
0.96 2.3
3.17 0.8
5.06 0.3

Tabell 3: Sedimentationshastigheter för mikrosfärer med varierande diametrar. För varje pärldiameter användes de visade minsta sedimenteringshastigheterna för att pelletera pärlorna för att tvätta bort obundna liposomer.

3. Stavstödda lipid dubbelskikt

OBS: Till skillnad från de andra analyserna som presenteras här tillåter stavanalysen inte noggrann kontroll av den totala membranytan. Man kan vara konsekvent i mängder och volymer mellan experimenten, men eftersom detta resulterar i stavar av olika längder och diametrar är det svårt att extrapolera den totala membranytan i reaktionen. Även om detta är en utmärkt analys för att utforska krökningsavkänning med flera krökningar på en enda yta och har varit användbar för att utforska septin ultrastruktur, rekommenderas det inte för kinetiska mätningar. Denna metod har tidigare rapporterats18 och utökas här.

  1. Erhålla borosilikatstavar från glasmikrofiberfilter
    1. Riv ett enda 42,5 mm GF / C-glasmikrofiberfilteri små bitar och placera dem i en 100 ml bägare med 60 ml 100% etanol. Bath-sonicate tills lösningen blir ogenomskinlig; detta kan ta så lite som 20-30 min med ett fint strimlat filter.
      OBS: Sonicate grundligt för att bryta upp stora bitar; ju mer dissocierad/ogenomskinlig, desto bättre.
    2. Täck lösningen med film och förvara lösningen vid rumstemperatur över natten.
  2. Formning av dubbelskikt på stavarna
    OBS: Detta steg utförs med överskott av lipider för att uppnå fullständig stavtäckning eftersom det är omöjligt att kvantifiera den totala ytan i denna metod.
    1. Nästa dag kommer etanollösningen att lösas (steg 3.1.2.), så blanda den väl innan du använder den. Kombinera 10 μL stavlösning och 70 μL SLBB.
    2. Snurra med toppfart i en minicentrifug i 30 s och ta bort 50 μL av supernatanten. Resuspendera i ytterligare 50 μL SLBB och upprepa spinnet i totalt fyra tvättar för att späda ut etanolen.
      OBS: Stångstöd kommer inte att bilda en fast pellet i botten av röret. De smutsas istället längs rörets sida; detta gör dem svåra att helt bevara vid tvätt. Eftersom den totala ytan i denna analys inte kontrolleras är det bra om de störs.
    3. Kombinera 10 μL välblandad stavlösning med 50 μL 5 mM SUV och 20 μL SLBB. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur, rotera ände-över-ände som när du bildar dubbelskikt på mikrosfärerna.
  3. Tvätta bort överflödiga lipider
    1. I likhet med steg 3.2.2, snurra lipidstavslösningen med topphastighet i en minicentrifug i 30 s för att pelletera de membranbelagda stavarna ur lösningen.
    2. Efter det första snurret, ta bort 50 μL av supernatanten och tillsätt 200 μL PRB. Efter den andra och tredje snurrningen, ta bort 200 μL och tillsätt 200 μL PRB. Efter det fjärde snurret, ta bort 200 μL, tillsätt 220 μL PRB och pipettera kraftigt för att blanda.
  4. Förbereda reaktionen
    1. Blanda 721 μL reaktionsbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med 29 μl stavlösning. Blanda väl.
    2. I ett 0,2 ml PCR-rör, kombinera 75 μL stavar i reaktionsbuffert och 25 μl septiner vid önskad koncentration, utspädd i SSB. Låt den inkubera vid rumstemperatur i minst 1 timme.
  5. Förberedelser för svepelektronmikroskopi
    1. Efter inkubation tillsätt 100 μL septinstångsblandningen på en rund, PEG-belagd 12 mm täckglas och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme i en sluten petriskål.
    2. Fixa provet genom att fylla botten av petriskålen (10 ml bör räcka) med 2,5% glutaraldehyd i 0,05 M natriumkacodylat (NaCo), pH 7,4, i 30 minuter. Aspirera vätskan med en glaspipett. Tvätta provet genom att inkubera det med 10 ml 0,05 M NaCo i 5 minuter och upprepa i totalt två tvättar.
    3. Postfix i 0,5% OsO4 cacodylate buffer i 30 min, och tvätta sedan 3x i 0,05 M NaCo (5 min/tvätt).
    4. Inkubera provet med 1% garvsyra i 15 min och tvätta sedan i NaCo 3x. Inkubera i 15 min i 0,5% OsO4 och tvätta 3x med NaCo.
    5. Dehydrera proverna med ökande etanolkoncentrationer: 30% EtOH i 5 min, 2x; 50% EtOH i 5 minuter; 75% EtOH i 5 minuter; och 100% EtOH i 5 min, 2x. Följ upp med ytterligare 10 min inkubation.
    6. Inkubera i övergångsvätska (hexametyldisilazan) 3x (5 min, 10 min, sedan 5 min).
    7. Låt lufttorka och placera sedan proverna i en exsickator tills sputterbeläggningen. Sputterbelägg 4 nm-skiktet med en guld/palladiumlegering och sedan bild på ett svepelektronmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter beredningen av varje SLB kan septiner eller proteinet av intresse inkuberas med önskat stöd och avbildas via TIRFM, konfokalmikroskopi eller SEM. Resultaten som visas här använder septiner rekombinant uttryckta och renade från E. coli17. Med hjälp av TIRFM på plana SDB är det möjligt att bestämma filamentens längd och deras flexibilitet, mäta diffusionskoefficienterna och observera montering över tiden28,29. För att samla in mätningar av högsta kvalitet är det först nödvändigt att fastställa kvaliteten på dubbelskikt, särskilt när de förbereds för första gången eller vid förändring av lipidkompositioner. En visuell inspektion av proteinfördelningen på dubbelskikten av TIRFM kan hjälpa till att identifiera regioner i dubbelskiktet som har repats eller är missbildade. Proteinfördelningen ska vara homogen (figur 3A) och det ska inte finnas hål eller luckor i dubbelskiktet (figur 3B). Det är bäst att undvika membran med hål, som kan bildas av dammförorening eller fläckar från glidhantering, eftersom detta kan förändra proteinfördelningen i andra delar av dubbelskiktet. För att visualisera själva membranet kan spår rhodamin-PE införlivas i stadsjeepar för dubbelskiktsbildning. I högkvalitativa dubbelskikt kommer fältet att visas jämnt (bilder visas inte), men om liposomer är gamla eller om tvättarna inte är tillräckligt stränga kan unburst och tubulerade liposomer ackumuleras på ytan (figur 3C). Dessutom, medan fasta stöd kommer att hämma den fria diffusionen av lipider8, bör lipiderna inte vara orörliga. FRAP-experiment kan användas för att bedöma rörligheten för lipider på plana dubbelskikt, som kan variera beroende på sammansättning och bör visa återhämtningshastigheter i storleksordningen sekunder30.

Sfäriska stöd kan användas för att undersöka proteinbindning på membran med definierade krökningar antingen isolerat (en krökning) eller med flera membrankrökningar i samma brunn för att observera konkurrens mellan krökningar 6,18. Nära-TIRFM på pärlor >1 μm kan också användas för att mäta antalet föreningsevenemang för ett visst område27. Som med plana dubbelskikt använder vi rhodamin-PE för att leta efter jämn dubbelskiktsavsättning (figur 4A), dvs inga lipidklumpar, vilket indikerar multi-lamellaritet eller unburst liposomer (figur 4B) och inga luckor i dubbelskiktet (figur 4C). För att mäta den totala proteinadsorptionen eller proteinadsorptionen över tid på böjda ytor är det nödvändigt att isolera enskilda pärlor från varandra för att skapa en diskret volym för vilken summa lipidintensitet och summa septinintensitet kan mätas. Således bör pärlorna vara väl separerade snarare än klumpade ihop som i figur 4D. Vi tar upp felsökningsalternativ för alla dessa potentiella problem i diskussionsavsnittet.

Denna SLB-analys kan också appliceras på stavstöd, som erbjuder en miljö för proteiner att prova flera krökningar på en enda yta. Genom att para ihop denna analys med svepelektronmikroskopi kan användaren undersöka krökningspreferens, inriktning och längdfördelning av septiner18 eller andra proteiner av intresse. Även om den liknar de andra analyserna som presenteras här, tillåter stavanalysen inte noggrann kontroll av den totala membranytan på grund av substratets heterogena natur som härrör från filterpapper. Materialegenskaperna hos det filterpapper som används här resulterar i stavar med olika längder och diametrar (figur 5A); Detta är användbart för att utforska proteinkrökningsavkänning och organisation på krökta ytor (figur 5B), men eftersom förhållandet mellan protein och membranet inte kan kontrolleras är stavarna av begränsad nytta för att generera mättnadsbindande kurvor eller mäta parametrar som bindningskonstanter.

Figure 1
Figur 1: Översikt över stödd lipid-dubbelskiktsbildning på stöd med olika krökningar. SUV: er inkuberas med fasta stöd av olika geometrier för att ändra de krökningar som är tillgängliga för provtagning på ett givet membran. SUV: er adsorberar på den fasta stödytan och brister för att skapa lipid-dubbelskikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk över uppsatt reaktionskammare. För att förbereda anpassade kamrar skärs ett 0,2 ml PCR-rör där röret börjar avsmalna och vid locket (röda streckade linjer). Den oklippta kanten på det skurna röret beläggs sedan med ett tunt lager UV-aktiverat lim (blått) och placeras lim på ett täckglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa TIRF-mikrografer av plana dubbelskikt. (A) En representativ bild av ett högkvalitativt lipid-dubbelskikt (75% DOPC, 25% Soy PI)med icke-polymeriserbara septiner bundna (gröna). Protein är inte kluster i några specifika regioner, och det finns inga liposomer fästa vid membranet och inga hål. (B) Detta dubbelskikt gjordes med dåligt rengjorda glasöverdrag och uppvisar vad som verkar vara "hål" (vita pilar) i membranet där det finns färre septiner. Septiner kan ses trångt vid kanterna av dessa defekter i dubbelskiktet (betecknat med de vita pilarna i det zoomade området till höger). (C) En representativ bild av ett dubbelskikt av låg kvalitet med spår rhodamin-PE. Unburst liposomer och tubulerade lipider är synliga på ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa mikrografer av lipidbelagda mikrosfärer. Representativa bilder från konkurrensanalyser där lipidbelagda pärlor (75% DOPC, 25% Soy PI, 0,1% Rhodamine PE) med diametrar på 0,3 μm, 0,5 μm, 1 μm, 3 μm och 5 μm blandades. Alla bilder är maximala Z-projektioner. (A) Representativ bild av en högkvalitativ blandning av lipidbelagda mikrosfärer. De sfäriska stöden är jämnt belagda av membranet, och det finns få pärlkluster. (B) Representativ bild av ojämn membranbeläggning, sannolikt orsakad av otillräcklig tvättning av överskott av lipider. (C) Representativ bild av pärlor med luckor i membrantäckningen (vita pilar) på grund av felaktig hantering. D) Representativ bild av tätt klustrade pärlor, som sannolikt orsakas av otillräcklig blandning under hela förfarandet, särskilt när de olika pärlorna kombineras tillsammans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativa elektronmikrografer av lipid- och septinbelagda stavar. (B) Kanten på en isolerad membranbelagd stång med septinfilament inriktade längs axeln med positiv krökning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellmembran får många olika former, krökningar och fysikalisk-kemiska egenskaper. För att studera nanometerskalan genom vilken celler bygger mikrometerskaliga enheter är det nödvändigt att designa minimala rekonstitueringssystem för membranmimetik. Detta protokoll presenterar tekniker som exakt styr både membrankrökning och sammansättning samtidigt som användaren enkelt kan ta kvantitativa fluorescensmätningar med hjälp av allmänt tillgängliga mikroskopitekniker.

De mest kritiska komponenterna i detta protokoll är montering av brunnar på lämplig yta och hantering av lipiderna. Brunnarna som beskrivs här är handgjorda med PCR-rör och UV-aktiverade lim; det är viktigt att inte få lim inuti reaktionsområdet under montering. Detta kan kontrolleras under experimentet genom att avbilda längs brunnens kanter och leta efter hög proteinadsorption på täckglaset. Användaren kan välja att använda alternativa material för brunnar, såsom silikon, som kan beställas kommersiellt, men den presenterade metoden ger robusta brunnar som inte kommer att skifta eller läcka och kan stödja större reaktionsvolymer. Ytan på täckglaset, i våra händer, har varit mycket viktig för att bilda plana dubbelskikt. Optimering av plasmarengöringstider eller till och med märket av täckglas kan behövas för att se jämn bildning av dubbelskikten, eftersom lämplig ytbehandling och laddning är avgörande för vesikeladsorption och fusion 31,32,33. När man ställer in dessa experiment för första gången eller arbetar med nya lipidkompositioner bör fluorescensåtervinning efter fotoblekningsexperiment (FRAP) användas för att bedöma membranets fluiditet jämfört med fristående system30. Det förväntas att stödsystem kommer att vara mindre flytande än sina fristående motsvarigheter men inte orörliga12.

Vid bedömning av dubbelskiktskvaliteten genom fluorescens är det viktigt att leta efter obehagliga liposomer eller defekter i dubbelskiktet (figur 3C), eftersom dessa kan förändra lokal proteinadsorption. Följande felsökningsalternativ kan övervägas. a) Man kan justera SUV-förberedelsen för att förbättra dubbelskiktskvaliteten. Ultraljudsbehandling, frys-tina, och extrudering är alla vanliga metoder som kan variera i lätthet och framgång baserat på lipid kompositioner. I våra händer resulterar en helt klargjord SUV-lösning med en monodisperserad storleksfördelning i de mest homogena dubbelskikten. Dynamisk ljusspridning (DLS) kan användas för att bedöma storleksfördelning25. b) Man kan öka skillnaden i saltkoncentration mellan insidan av suvarna och den externa bufferten. Genom att minska den inre jonkoncentrationen (eller öka den yttre) ökar osmotisk stress på SUV: erna sannolikheten för brott31. Alternativt kan ändring av den närvarande monovalenta katjonen förändra kinetiken för SLB-bildning och hjälpa till att optimera SLB för nya lipidkompositioner34. c) Man kan öka antalet eller kraften av tvättar. Enligt författarnas erfarenhet leder kraftig blandning under tvättarna till renare dubbelskikt och verkar inte vara störande; istället kommer det största problemet från att av misstag skrapa dubbelskiktet med pipettspetsar, vilket kommer att visas som en gash i membranet. För böjda dubbelskikt är det bäst att minimera hanteringen med smala pipettspetsar och blanda försiktigt när du utför tvättstegen, särskilt för större (>1 μm) pärlor, eftersom membranet kan skjuvas från glaspärlorna. Om ihållande luckor i de sfäriska membranbilagren observeras (figur 4C) kan det hjälpa att öka bredden på pipettspetsarna (genom att skära av spetsens ände eller köpa breda spetsar) och minska hanteringen så mycket som möjligt, samtidigt som pärllösningarna blandas helt. Ett vanligt tekniskt problem med denna teknik är pärlornas tendens att klumpa ihop sig (figur 4D). Detta kan delvis lösas genom att öka ultraljudsbehandling tid före tvålager bildning; viss klustring är dock oundviklig eftersom membranbelagda pärlor också kan tendera att klumpa ihop sig över tiden i brunnen. Klumpiga pärlor bör undvikas för kvantitativa analyser.

Begränsningar för kvantitativa mätningar av enmolekylär dynamik på plana dubbelskikt inkluderar behovet av att stanna vid låga koncentrationer för att exakt spåra och räkna partiklarna. Detta kan dock åtgärdas genom att undermärka proteinet av intresse under förvärvet för att minska antalet partiklar som är synliga under spårning35. Dessutom utvecklades sfäriska och stav-SLB: er specifikt för att kvantifiera proteinernas krökningskänslighet på membran i mikrometerskala, och kiseldioxidmikrosfärerna som används här är endast tillgängliga ner till 100 nm i diameter, vid vilken tidpunkt de är diffraktionsbegränsade puncta när de ses med ljusmikroskopi. Således kommer de som vill bedöma exakt krökningsspecificitet på mindre diametrar inte att kunna göra det med denna metod. Denna teknik kommer emellertid fortfarande att ge värdefull information om trenden med krökningspreferens och möjliggöra dissektion av krökningsberoende enheter.

Jämfört med fristående lipid-dubbelskiktssystem är denna teknik mottaglig för ett brett spektrum av buffertförhållanden och kräver inte noggrann osmotisk balansering under beredningen. Dessutom, eftersom det använder glasstöd, sjunker dubbelskikten lätt till botten av brunnen, vilket tar bort behovet av uppbindning eller användning av sackaros eller andra förtjockningsmedel36. Medan fristående lipid-dubbelskiktssystem ger ett användbart sätt att undersöka membrandeformation av membranbindande proteiner, är det svårt att studera förhållandet mellan membrankrökning och komplex montering. Till skillnad från lätt deformerbara membransystem tillåter detta tillvägagångssätt användaren att använda en mängd olika lipidkompositioner utan den inneboende formen hos enskilda lipidarter som dikterar membranets globala geometri. Slutligen tillåter stavformade SLP: er provtagning av flera krökningar på samma kontinuerliga membran för proteiner av intresse (figur 5B), vilket är unikt informativt för utvärdering av krökningsberoende enheter eller samlokalisering av flera komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grant nr. R01 GM-130934 och National Science Foundation (NSF) beviljar MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. och K.S.C. stöddes delvis av ett bidrag från National Institute of General Medical Sciences under tilldelning T32 GM119999.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural Watson 137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes USA Scientific 1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips Thermo Scientific 152450 Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
Egg Liss Rhodamine PE Avanti Polar Lipids 810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade VWR 16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer VWR 11652
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-223EA
HEPES Sigma Aldrich H3375-1KG
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191
Magnesium chloride VWR 7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers Matsunami Discontinued 22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres Bangs Laboratories, Inc. Depends on size: SS0200*-SS0500* Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive Norland Thorlabs NOA 68 Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide Millipore Sigma 20816-12-0
Parafilm VWR 52858-000
Plasma Cleaner Plasma Etch PE-25 Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride VWR 0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm   VWR 64-0712
Sonicator bath Branson 1510R-MT Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI Avanti Polar Lipids 840044
Tabletop centrifuge Eppendorf 22331
UV Lamp Spectroline ENF-260C 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper VWR 28455-030 42.5 mm diameter, Grade GF/C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Tags

Biokemi utgåva 185
Rekonstituering av septinmontering vid membran för att studera biofysiska egenskaper och funktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D.,… More

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D., Cannon, K. S., Gladfelter, A. S. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (185), e64090, doi:10.3791/64090 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter