Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lipidtillskott för livslängd och gentranskriptionsanalys i Caenorhabditis elegans

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64092
Automatic Translation
*1,2, 2,3,4, 2,4,5, *2
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver lipidtillskottsmetoder i flytande och på plattkulturer för Caenorhabditis elegans, i kombination med longitudinella studier och gentranskriptionsanalys från bulk eller några maskar och maskvävnader.

Abstract

Åldrande är en komplex process som kännetecknas av progressiva fysiologiska förändringar som härrör från både miljömässiga och genetiska bidrag. Lipider är avgörande för att utgöra strukturella komponenter i cellmembran, lagra energi och som signalmolekyler. Reglering av lipidmetabolism och signalering är avgörande för att aktivera distinkta livslängdsvägar. Rundmask Caenorhabditis elegans är en utmärkt och kraftfull organism för att dissekera bidraget från lipidmetabolism och signalering i livslängdsreglering. Flera forskningsstudier har beskrivit hur kosttillskott av specifika lipidmolekyler kan förlänga C. elegans livslängd; Emellertid, mindre skillnader i tillskott villkor kan orsaka reproducerbarhet frågor bland forskare i olika laboratorier. Här, två detaljerade tillskott metoder för C. elegans rapporteras med hjälp av lipidtillskott antingen med bakterier utsäde på plattor eller bakteriell suspension i flytande kultur. Här finns också detaljerna för att utföra livslängdsanalyser med livslång lipidtillskott och qRT-PCR-analys med hjälp av en hel masklysat eller dissekerade vävnader härrörande från några maskar. Med hjälp av en kombination av longitudinella studier och transkriptionella undersökningar vid lipidtillskott ger utfodringsanalyserna pålitliga metoder för att dissekera hur lipider påverkar livslängden och hälsosamt åldrande. Denna metod kan också anpassas för olika näringsscreeningsmetoder för att bedöma förändringar i en delmängd av transkript med hjälp av antingen ett litet antal dissekerade vävnader eller några djur.

Introduction

Lipider
Lipider är små hydrofoba eller amfipatiska molekyler lösliga i organiska lösningsmedel men olösliga i vatten 1,2. Distinkta lipidmolekyler skiljer sig från varandra baserat på antalet kol som finns i deras kedjor, plats, antal dubbelbindningar och bundna strukturer, inklusive glycerol eller fosfater. Lipider spelar avgörande roller inom och över distinkta celler för att reglera organismfunktioner, inklusive att utgöra membran dubbelskikt, tillhandahålla energilagring och fungera som signalmolekyler 3,4.

För det första är lipider strukturella komponenter i biologiska membran, inklusive plasmamembranet och intracellulära subcellulära membran som delar de inre facken från den extracellulära miljön. För det andra är lipider den viktigaste formen av energilagring hos ryggradsdjur och ryggradslösa djur. Neutrala lipider, inklusive triacylglyceroler, lagras under en längre period i olika vävnader, inklusive i fettvävnad. I nematoden Caenorhabditis elegans är tarmen det viktigaste metaboliska fettlagringsorganet; Dess funktion är inte bara involverad i matsmältning och absorption av näringsämnen, men också i avgiftningsprocessen, som liknar aktiviteten hos däggdjurs hepatocyter. Andra fettlagringsvävnader inkluderar bakterielinjen, där lipider är väsentliga för att utveckla oocyter, och hypodermis, som består av hudliknande epidermala celler 3,5. För det tredje har fler bevis under de senaste åren föreslagit att lipider är kraftfulla signalmolekyler som är involverade i intra- och extracellulär signalering genom att direkt verka på en mängd olika receptorer, inklusive G-proteinkopplade och nukleära receptorer, eller indirekt via membranfluiditetsmodulering eller post-translationella modifieringar 6,7,8,9 . Ytterligare studier kommer att fortsätta att belysa de underliggande molekylära mekanismerna för lipidsignalering för att främja livslängd och hälsospann.

Modellorganismer är viktiga för att ta itu med specifika biologiska frågor som är för komplexa för att studera hos människor. Till exempel är rundmask C. elegans en utmärkt modell för att genomföra genetisk analys för att dissekera biologiska processer som är relevanta för mänsklig näring och sjukdom10. De mycket bevarade molekylära vägarna som är relevanta för mänsklig fysiologi, komplexa vävnader, beteendemönster och rikliga genetiska manipulationsverktyg gör C. elegans till en anmärkningsvärd modellorganism11. Till exempel är C. elegans utmärkt när det gäller att vidarebefordra genetiska skärmar för att identifiera fenotypspecifika gener, liksom i genomomfattande omvända genetiska skärmar via RNA-interferens12.

I laboratorier odlas nematoderna på agar Petri-plattor sådda med en gräsmatta av Escherichia coli-bakterier, vilket ger makronäringsämnen som proteiner, kolhydrater och mättade och omättade fettsyror som energikällor och byggstenar och mikronäringsämnen som samfaktorer och vitaminer13. I likhet med däggdjur syntetiserar nematoder fettsyramolekyler från både palmitinsyra och stearinsyra (mättade 16-kol- respektive 18-kolmolekyler) som sekventiellt desatureras och förlängs till en mängd olika monoomättade fettsyror (MUFA) och fleromättade fettsyror (PUFA)14,15,16,17,18. Intressant nog kan C. elegans de novo-syntes av alla nödvändiga fettsyror och kärnenzymer som är involverade i fettsyrabiosyntes, desaturering och förlängning, vilket underlättar syntesen av långkedjiga PUFA19. Till skillnad från andra djurarter kan C. elegans omvandla 18-kol och 20-kol ω-6 fettsyror till ω-3 fettsyror med sina egna ω-3 desaturasenzymer. Dessutom har maskar ett Δ12-desaturas som katalyserar bildandet av linolsyra (LA) från oljesyra (OA, 18:1)20,21. De flesta djur eller växter saknar både Δ12- och ω-3-desaturaser och förlitar sig därför på kostintag av ω-6 och ω-3 för att få sina PUFA, medan C. elegans inte kräver dietfettsyror22. Isolerade mutanter som saknar funktionella desaturasenzymer har använts för att studera funktionerna hos specifika fettsyror i distinkta biologiska processer, inklusive reproduktion, tillväxt, livslängd och neurotransmission. Effekten av enskilda fettsyror på specifika biologiska vägar kan hanteras med hjälp av både ett genetiskt tillvägagångssätt och kosttillskott16,17,23. Hittills har lipidforskning fokuserat på att karakterisera gener som är involverade i lipidsyntesen, nedbrytningen, lagringen och nedbrytningen vid neurologiska och utvecklingsförhållanden24. Emellertid, lipidernas roller i livslängdsreglering börjar bara avslöjas.

Lipidsignalering vid reglering av livslängd
Lipider spelar avgörande roller i livslängdsreglering genom att aktivera cellulära signalkaskader i distinkta vävnader och celltyper. Nyligen genomförda studier har belyst lipidernas aktiva roller för att modulera transkription och cell-cellkommunikation via lipidbindande proteiner eller igenkänning av membranreceptorer25. Dessutom erbjuder kosttillskott av lipider ett utmärkt verktyg för att dissekera hur lipidmetabolism påverkar livslängden i C. elegans. Distinkta MUFA: er och PUFA har visat sig främja livslängd genom att aktivera transkriptionsfaktorer26,27.

Livslängdsmodeller, inklusive insulin / IGF-1-signalering och ablation av bakterieprekursorceller, är associerade med MUFA-biosyntesvägen, och MUFA-tillskott, inklusive oljesyra, palmitolsyra och cis-vaccensyra, är tillräcklig för att förlänga C. elegans livslängd26. Även om livslängdseffekten från MUFA-administrationen kräver ytterligare undersökning, kommer den underliggande mekanismen sannolikt att förmedlas av transkriptionsfaktorn SKN-1/Nrf2, som är en viktig aktivator för oxidativ stressrespons och livslängdsreglering28,29. Bland MUFA spelar en viss klass av fettacyletanolamider som kallas N-acyletanolaminer (NAE) avgörande roller i distinkta mekanismer inklusive inflammation, allergier, inlärning, minne och energimetabolism30. Särskilt har lipidmolekylen som kallas oleoyletanolamid (OEA) identifierats som en positiv regulator av livslängd genom att främja translokationen av det lipidbindande proteinet 8 (LBP-8) i kärnan för att aktivera kärnhormonreceptorerna NHR-49 och NHR-807. Tillskott av OEA-analogen KDS-5104 är tillräcklig för att förlänga livslängden och inducerar uttrycket av gener som är involverade i oxidativa stressreaktioner och mitokondriell β-oxidation 7,8.

Samtidigt har PUFA:s roll också kopplats till reglering av livslängd. Administrering av PUFA ω-3 fettsyra α-linolensyra (ALA) främjar livslängden genom att aktivera NHR-49 / PPARα, SKN-1 / NRF transkriptionsfaktorer och inducera mitokondriell β-oxidation31. Intressant nog aktiverar peroxiderade produkter av ALA, kallade oxylipiner, SKN-1 / NRF, vilket tyder på att både PUFA och deras oxidativa derivat kan ge livslängdsfördelar23. Tillskott av ω-6-fettsyra-arakidonsyra (AA) och dihomo-γ-linolensyra (DGLA) förlänger livslängden via autofagiaktivering, främjar proteinkvalitetskontroll och resulterar i nedbrytning av bortkastade och giftiga proteinaggregat27,32. På senare tid har en cell-icke-autonom signalreglering medierad av det lipidbindande proteinet 3 (LBP-3) och DGLA visat sig vara avgörande för att främja livslängd genom att skicka perifera signaler till neuroner, vilket tyder på en långväga roll för lipidmolekyler i kommunikation mellan vävnader på systemiska nivåer33. Den aktuella studien rapporterar varje steg för att utföra lipidtillskott med bakterier sådda på plattor eller bakteriell suspension i flytande kultur. Dessa metoder används för att bedöma livslängd och transkriptionell analys, med användning av hela kroppsinnehåll eller dissekerade vävnader härledda från några maskar. Följande tekniker kan anpassas till en mängd olika näringsstudier och erbjuder ett giltigt verktyg för att dissekera hur lipidmetabolism påverkar livslängd och hälsosamt åldrande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1 visar ett schema över lipidmatning med olika experimentella inställningar.

1. Beredning av lipidkonditionerade bakterier

  1. Bered baslösningen för bakteriell utspädning av kostbegränsning (BDR) genom att lösa upp 5,85 g NaCl, 1,0 gK2HPO4 och 6,0 gKH2PO4(se materialtabell) i 999 ml avjoniserat vatten. Justera pH-värdet till 6,0 med 0,5 M KOH och filtrera sedan genom ett 0,22 μm-filter.
    OBS: BDR-lösningen kan förvaras vid rumstemperatur för långvarig lagring.
  2. Bered BDR-mediet genom att tillsätta 10 μl 5 mg / ml kolesterol (upplöst i 200-bevisad etanol) till varje 10 ml BDR-baslösning.
  3. Stryk OP50-bakterierna (se materialförteckningen) från -80 °C stam till LB-agarplattor och inkubera vid 37 °C över natten.
    OBS: Efter inkubationen över natten vid 37 °C kan OP50-plattan förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka för stabila matningsresultat.
  4. Inokulera OP50-bakterierna från OP50 LB-agarplattan till LB-medium och inkubera i en 37 °C shaker över natten (16 timmar).
    OBS: Den LB-medelvolym som behövs beror på de experimentella inställningarna. Det rekommenderas att använda 200 μL 5x koncentrerade bakterier sådda på var och en av 6 cm plattorna och 1 ml 5x koncentrerade bakterier för var och en av 10 cm plattorna och varje replikat av de flytande matningsförhållandena. Således måste 1 ml och 5 ml initial LB-inokulering beredas för respektive lipidmatningskultur.
  5. Samla bakterier genom centrifugering vid 4 000 x g i 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
  6. Suspendera bakteriepelleten i 20 ml BDR-bas och centrifugera vid 4 000 x g i 10 minuter. Kassera supernatanten.
    OBS: Detta steg är avgörande för att tvätta bort resterna av LB i bakteriepelleten.
  7. Suspendera varje bakteriepellet i BDR-mediet för att göra ett 20x BDR-bakterielager. Späd 20x BDR-bakteriebuljongen med BDR-medium till 5x före användning.
    OBS: Använd en 1/20 volym BDR-medium av den ursprungliga LB-volymen för att nå en 20x koncentration för bakterierna. 20x bakteriebeståndet kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
  8. Bered en lipidstamlösning med etanol eller dimetylsulfoxid (DMSO) som lösningsmedel i en ny autoklaverad glasflaska och fyll injektionsflaskan med argon eller kväve för att förhindra oxidation.
    OBS: Stamlösningskoncentrationen är vanligtvis mellan 250 mM och 1 mM.
  9. Överför lipidstamlösningen till önskad mängd BDR-bakterielösning för att uppnå önskad slutlig koncentration under utfodringsförhållanden. Blanda noggrant genom att virvla i 20 s.
    OBS: Den slutliga koncentrationen av lipiderna vid utfodring är vanligtvis 1 μM till 1 mM, beroende på lipid- och testförhållandena. Det rekommenderas att köra ett pilotexperiment först för att testa olika koncentrationer från 0,1 μM till 1 mM om man arbetar med nya lipider. Blanda lipidstamlösningen med BDR-bakterier omedelbart innan du sår den på plattan eller lägger den i flytande maskkulturer. Förbered de lipidkonditionerade bakterierna inte längre än 1 h innan de matas till maskarna.
  10. Blanda samma volymer filtrerad etanol eller DMSO (beroende på vilken som används för lipidmatningsgruppen) med BDR-bakterier för att fungera som fordonskontroll.

2. Beredning av synkroniserade C. elegans för lipidtillskott

  1. Bered M9-bufferten genom att blanda (med specificerade slutkoncentrationer) 22 mM KH 2 PO 4, 22 mMNa2HPO4, 85 mM NaCl och2mM MgSO4 (se materialtabell). Autoklavera bufferten för att sterilisera.
  2. Förbered en ny blekmedelslösning med 60% husblekmedel (v / v, se materialtabell) och en slutlig koncentration på 1,6 M NaOH.
  3. Samla gravida vuxna i ett 15 ml koniskt rör med 10 ml M9-buffert.
    OBS: Antalet maskar och plattor som behövs för synkronisering beror på experimentinställningarna (dvs. antalet förhållanden och replikat och matningsmetoder). Helst bör varje hel 6 cm platta med vuxna maskar kunna ge minst 600 L1 maskar efter synkronisering.
  4. Snurra ner maskarna på 1 450 x g i 30 s. Ta bort supernatanten och skölj maskarna en gång till med 10 ml M9-buffert.
  5. Snurra ner maskarna på 1 450 x g i 30 s. Aspirera supernatanten och lämna en alikvot på 4 ml i det koniska röret. Tillsätt 2 ml blekmedelslösning och skaka kraftigt i 1 min.
  6. Snurra ner maskarna vid 1 450 x g i 30 s vid rumstemperatur.
  7. Ta bort supernatanten och tillsätt 4 ml M9-buffert och 2 ml blekmedelslösning. Skaka röret tills maskkropparna är upplösta.
  8. Snurra ner äggen vid 1 450 x g i 30 s vid rumstemperatur.
  9. Ta bort supernatanten och tvätta äggen med 10 ml M9-buffert.
  10. Upprepa steg 2.8 och 2.9 3x.
  11. Suspendera embryona med 6 ml M9-buffert. Gunga embryona på en rotator vid 20 °C i 2 dagar för att låta dem kläckas och synkroniseras.
  12. Överför L1 larver till OP50 utsädesplattor. Inkubera vid 20 °C i 48 timmar för att samla synkroniserade L4-maskar, 72 timmar för dag-1 vuxna och 96 timmar för dag-2 vuxna.
    OBS: OP50-plattor framställs genom att tillsätta 1 ml 20x OP50-bakterier till varje 10 cm nematodtillväxtmedium (NGM) platta34. 30 000 L1-maskar kan sås till var och en av OP50-plattorna om de syftar till att skörda maskarna i L4-steget, och 20 000 L1-maskar kan sås till var och en av OP50-plattorna om de syftar till att skörda dag-1 vuxna i nuvarande experimentella miljöer. Det kan vara olika för olika laboratorieinställningar, så det rekommenderas att testa maskantalet som kan sås för att säkerställa att maskarna har tillräckligt med mat kvar innan de skördas.
  13. Samla L4, dag-1 vuxna eller dag-2 vuxna maskar i ett 15 ml koniskt rör med 10 ml M9-buffert. Använd ytterligare 5 ml M9-buffert för att skölja bort de kvarvarande maskarna från plattorna.
  14. Snurra ner maskarna på 1 450 x g i 30 s och kassera supernatanten. Tvätta maskpelleten med 10 ml BDR-medium, centrifugera vid 1 450 x g i 30 s och kassera supernatanten.
  15. För maskar i vätskematningsmetoden, överför BDR-mediet till maskarna för att uppnå en maskkoncentration på 3 000 maskar / ml. För maskar i matningsmetoder på plattan, minska volymen av BDR-medium som läggs till maskarna för att minska torktiden på plattan.

3. Lipidtillskott för C. elegans

  1. Utför lipidtillskott i flytande kultur enligt stegen nedan.
    OBS: Denna metod är lämplig för att testa transkriptionella förändringar med bulkmaskar kompletterade med lipider.
    1. Överför önskad mängd lipid- eller fordonskontroll till var och en av brunnarna i en 12-brunnsplatta. Förbered tre till fyra brunnar för varje utfodringstillstånd som en biologisk replikation.
    2. Blanda masksuspensionen från steg 2.15 med 5x BDR-bakterier i förhållandet 1:1 för att uppnå en slutlig koncentration på 1 500 maskar/ml och 2,5x för bakterier.
    3. Överför 2 ml av mask-bakterieblandningen i BDR-medium till varje brunn på 12-brunnsplattan.
    4. Vik in 12-brunnsplattan med folie och skaka i en 20 °C inkubator vid 100 rpm för önskad inkubationslängd.
      OBS: För att testa olika utfodringsförhållanden, inkubera lipiderna med maskar under olika lång tid, till exempel i 6 h, 12 h och 24 h. Dessutom kan olika maskstadier testas för optimala resultat, inklusive lipidmatning från L4 eller dag-1 vuxenstadiet.
  2. Utför lipidtillskott på 10 cm NGM agarplattor enligt stegen nedan.
    OBS: Denna metod är lämplig för att testa transkriptionella förändringar med bulkmaskar kompletterade med lipider.
    1. Frö 1 ml av de lipidkonditionerade bakterierna från steg 1.9 till mitten av var och en av de 10 cm plattorna. När ett stort antal plattor har förberetts, virvlar den slutliga arbetslösningen flera gånger mellan sådd. Torka plattorna i mörkret med en biosäkerhetshuv.
    2. Överför 3 000 maskar från steg 2.15 till var och en av de 10 cm plattorna. Torka plattorna i en biosäkerhetshuv tills maskarna kan krypa på de lipidkompletterade plattorna istället för att simma.
    3. Inkubera maskarna på de lipidkonditionerade plattorna i en 20 °C inkubator under önskad tid. Skydda mot ljus om du använder fleromättade lipider.
      OBS: För att testa olika utfodringsförhållanden, inkubera lipiderna med maskar under olika lång tid, såsom 6 h, 12 h och 24 h. Dessutom kan olika maskstadier testas för optimala resultat, inklusive lipidmatning vid L4 eller dag-1 vuxenstadiet.
  3. Utför lipidtillskott på 6 cm NGM-agarplattorna för transkriptionsanalys.
    OBS: Denna metod är lämplig för att testa transkriptionella förändringar i några maskar kompletterade med lipider.
    1. Frö 300 μL lipidkonditionerade bakterier från steg 1.9 till mitten av var och en av 6 cm plattan. När ett stort antal plattor har förberetts, virvlar den slutliga arbetslösningen flera gånger mellan sådd. Torka plattorna i mörkret med en biosäkerhetshuv.
    2. Överför upp till 300 maskar från steg 2.15 till var och en av 6 cm plattorna. Torka plattorna i en biosäkerhetshuv tills maskar kan krypa på de lipidkompletterade plattorna istället för att simma.
    3. Inkubera maskarna på de lipidkonditionerade plattorna i en 20 °C inkubator under önskad tid. Skydda mot ljus om du använder fleromättade lipider.
      OBS: För att testa olika utfodringsförhållanden, inkubera lipiderna med maskar vid olika tidpunkter, såsom 6 h, 12 h och 24 h. Dessutom kan olika maskstadier testas för optimala resultat, inklusive lipidmatning vid L4 eller dag-1 vuxenstadiet.
  4. Utför lipidtillskott på 6 cm NGM-agarplattorna för longitudinell livslängdsanalys.
    1. Frö 200 μL lipidkonditionerade bakterier (med 1x lipidkoncentration och 5x koncentrerade bakterier) på mitten av var och en av de 6 cm NGM-plattorna. Förbered tre plattor för varje matningstillstånd.
      OBS: Plattorna måste tillagas nyligen på användningsdagen (helst strax före användning).
    2. Torka plattorna i en biosäkerhetshuv. Håll lamporna i huven och rummet släckta om du använder polyomättade lipider.
    3. Välj 30-40 synkroniserade L4-maskar till var och en av plattorna. Förvara plattorna med maskarna i en 20 °C inkubator. Om du matar med fleromättade lipider, förvara plattorna i en ljusskyddad låda i 20 °C inkubatorn.
      OBS: Det är möjligt att använda OP50 från en normal 6 cm passageplatta (okonditionerad OP50) som lim för att plocka upp maskar, men det är viktigt att inte lämna en bulkmängd av den okonditionerade OP50 i analysplattan.
    4. Överför maskarna till nya, nygjorda lipidkonditionerade plattor dagligen eller varannan dag, beroende på önskat utfodringsförhållande. Överlevnad poängsätts på samma sätt som tidigare beskrivits4.

4. RNA-extraktion för transkriptionell analys

  1. Utför RNA-extraktion från ett stort antal hela maskar.
    1. Överför maskar i vätskekulturen från steg 3,1 till 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tvätta maskar från 10 cm-plattorna från steg 3.2 med M9-buffert och överför maskarna i M9-buffert till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    2. Centrifugera maskarna kort med en minicentrifug på bordsskivan (se materialtabell) i 10 s och aspirera snabbt supernatanten.
    3. Överför kvarvarande maskar från de flytande matningsbrunnarna eller tvätta från plattmatningarna till samma rör och snurra ner. Ta bort supernatanten.
    4. Tvätta maskpelletsen med 1 ml iskall M9, snurra kort i 10 s med en minicentrifug och aspirera supernatanten. Upprepa 1x eller 2x beroende på supernatantens transparens.
    5. Ställ mikrocentrifugrören på is i 2 minuter och ta bort så mycket supernatant som möjligt med en pipett på 200 μL och lämna en packad maskpellet med en volym på högst 15 μl.
    6. Överför 15 μL RNA-extraktionslösning innehållande fenol och guanidinisotiocyanat (materialtabell) till vart och ett av mikrocentrifugrören och slipa maskarna med en motorkvarn i cirka 30 s tills inga intakta maskar är synliga.
      VARNING: RNA-extraktionslösningen är giftig och brandfarlig, och varje steg som involverar en öppen behållare med detta reagens måste användas i en kemisk huva.
    7. Överför 285 μL av RNA-extraktionslösningen till mikrocentrifugröret medan du sköljer eventuellt maskinnehåll från motorkvarnspetsen till mikrocentrifugröret. Vortex att blanda noggrant.
      OBS: Detta är en pauspunkt. Prover kan förvaras i RNA-extraktionslösningen vid -80 °C i ett par månader. När proverna tas ur -80 °C, tina vid rumstemperatur.
    8. Överför 60 μl kloroform till varje prov och virvel kraftigt. Låt proverna sätta sig i rumstemperatur i 10 min.
      VARNING: Kloroform är giftigt och måste hanteras i en kemisk huva.
    9. Centrifugera vid 21 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Överför försiktigt 140 μL av det vattenhaltiga skiktet på toppen till ett nytt och RNasfritt mikrocentrifugrör med en 200 μL pipett och överför 2x med 70 μL varje gång.
      OBS: Från och med detta steg framåt måste alla pipettspetsar och behållare som har direkt kontakt med provet vara RNas-fria. Det föreslås också att använda RNase-dekontamineringslösning för att torka av all utrustning och arbetsutrymmet.
    10. Överför 140 μl isopropanol till provröret. Virvla kraftigt och låt provet sätta sig i rumstemperatur i 10 min. Centrifugera vid 21 000 x g i 20 minuter vid 4 °C och avlägsna försiktigt all supernatant.
    11. Överför 0,5 ml iskall 80% etanol (v / v) till provröret med RNA-pelleten. Vortex kraftigt tills RNA-pelleten lämnar rörets botten och flyter runt i etanollösningen. Centrifugera vid 21 000 x g i 10 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten.
    12. Centrifugera kort provrören i minicentrifugen i 15 s för att snurra ner eventuellt lösningsmedel som fäster vid rörväggen och ta sedan bort så mycket etanollösning som möjligt med en pipett.
    13. Låt rörlocket vara öppet för att torka RNA-pelleten. Om pelleten tvättades noggrant med etanollösningen bör torkningssteget ta mindre än 10 min.
      OBS: Detta är en pauspunkt. Den torkade RNA-pelleten kan förvaras vid -80 °C i upp till 1 månad.
    14. Lös upp den torra RNA-pelleten med 40 μl nukleasfritt vatten och bearbeta med ett DNA-borttagningssats enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
      OBS: Det rekommenderas att lösa upp RNA i nukleasfritt vatten först. Om 40 μL vatten blandas med 10x DNas-bufferten innan den överförs till RNA-röret, kommer RNA-pelleten inte att lösas upp helt. RNA-proverna måste förvaras på is när RNA-pelleten löses upp i vatten. Frys-tina cykler minskar RNA-kvaliteten; fortsätt därför till det omvända transkriptionssteget samma dag som DNase-behandlingen.
  2. RNA-extraktion från ett litet antal hela maskar.
    1. Plocka 15-20 maskar från deras bakteriegräsmatta till en färsk osådd NGM-platta för att ta bort bakterierna från masken.
    2. Enligt tillverkaren av qRT-PCR 2-stegssatsen (se materialtabell), förbered 20 μL slutlig lyslösning för varje prov genom att blanda 0,2 μL DNas med 19,8 μL lyslösning i PCR-rör. Blanda lyslösningen genom att pipettera upp och ner 5x.
    3. Överför 15-20 maskar från den osådda NGM-plattan till PCR-röret som innehåller 20 μL av den slutliga lyslösningen med det minsta antalet bakterier. Inkubera lysreaktionen i 5 minuter vid rumstemperatur.
    4. Sond-sonicate (se Materialförteckning) maskarna med 30% amplitud med hjälp av följande program: ultraljudsbehandling för 5 s, paus för 5 s och upprepa 4x med en total ultraljudsbehandling tid på 20 s. Förvara proverna i ett iskallt vattenbad under ultraljudsbehandling.
    5. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
      OBS: Tillsätt mer DNase före inkubation om den negativa kontrollen utan RT visar DNA-kontaminering på en oroande nivå.
    6. Överför 2 μL stopplösning till lysreaktionen och blanda genom att försiktigt knacka. Inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur och ställ sedan på is.
      OBS: Proverna kan lämnas på is i upp till 2 timmar innan du fortsätter till det omvända transkriptionssteget.
  3. Utför RNA-extraktion från maskvävnader enligt stegen nedan.
    1. Plocka cirka 20 maskar från deras bakteriegräsmatta och lägg dem på en färsk osådd NGM-platta för att ta bort bakterierna från dem.
    2. Flytta de 20 maskarna (med så få bakterier som möjligt) till ett urglas som innehåller 500 μL M9-lösning som innehåller 4 μM levamisol (se Materialförteckning). Immobiliseringen kommer att ske inom några sekunder.
    3. När maskarna är immobiliserade, dissekera bakterien eller tarmen med en 25 G nål som kan fästas på 1 ml sprutan.
      1. Under dissektionsomfånget, utför ett snitt vid positionen för den andra svalglampan för att möjliggöra naturlig extrudering av tarmen och bakterien. De två vävnaderna kan lätt särskiljas baserat på deras morfologi och olika kontrast. Använd pincett eller nålar för att försiktigt separera vävnaderna och undvik att skada dem.
        OBS: Det rekommenderas att dissekera inom 5-10 min. Om snittet inte ger en bra vävnadssträngsprutning, föreslås att man flyttar till nästa mask och dissekerar så många som möjligt inom 10 minuter. Den här proceduren kräver en kort tidsram för att undvika transkriptionella ändringar från miljön.
    4. Enligt qRT-PCR 2-stegs kittillverkaren, förbered 20 μL slutlig lyslösning för varje prov genom att blanda 0,2 μL DNas I till 19,8 μL lyslösning i PCR-rören. Blanda lyslösningen genom att pipettera upp och ner 5x.
    5. Använd en autoklaverad glaspipett för att överföra de dissekerade vävnaderna till ett PCR-rör. Sätt PCR-rören på is i 2 minuter för att tillåta materialavsättning i botten. Ta bort supernatanten, tillsätt 20 μl slutlig lyslösning i PCR-röret och blanda genom att knacka.
    6. Inkubera lysreaktionen i 5 minuter vid rumstemperatur. Överför sedan 2 μL stopplösning till lysreaktionen och blanda genom att knacka. Inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur.
      OBS: Proverna kan lämnas på is i upp till 2 timmar innan du fortsätter till det omvända transkriptionssteget.

5. Omvänd transkription och qRT-PCR

  1. Utför omvänd transkription och qRT-PCR från bulkmaskar.
    1. Mät RNA-koncentrationen och förbered 5 μg totalt RNA för omvänd transkription.
    2. Bered ett poolat RNA-prov genom att blanda lika stora mängder RNA från varje prov och justera den slutliga RNA-koncentrationen till 0,556 g / L (5 μg / 9 μL). Använd det poolade RNA-provet för qRT-PCR-standardkurvan och RT-negativa kontroller.
    3. Utför omvänd transkription enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Kör följande omvända transkriptionsreaktioner för kvalitetskontroll tillsammans med de enskilda RNA-proverna.
      1. Utför omvänd transkription med det poolade RNA-provet som mall (för qRT-PCR-standardkurva).
      2. Utför omvänd transkription med det poolade RNA-provet som mall, utan omvänd transkriptas (RT-negativ kontroll; kvalitetskontroll för potentiell genom-DNA-kontaminering).
      3. Utför omvänd transkription med det nukleasfria vattnet som mall (RT-negativ kontroll; kvalitetskontroll för potentiell RNA-kontaminering i reagenser).
        OBS: Detta är en pauspunkt. Proverna kan lämnas i termocykeln över natten eller förvaras vid -20 °C i några månader.
    4. Späd cDNA som genereras från de poolade RNA-proverna fyra gånger, 20 gånger, 100 gånger och 500 gånger med nukleasfritt vatten för qRT-PCR-standardkurvor.
    5. Späd cDNA som genereras från varje RNA-prov 20-100 gånger för att användas som mallar för qRT-PCR-reaktionerna.
      OBS: Utspädningsförhållandet beror på överflödet av genen av intresse. För höguttryckta gener, såsom hushållningsgener eller egl-3 och egl-21 som används i denna studie, rekommenderas en 100x utspädning. För låguttryckta gener, såsom lbp-8, rekommenderas en 20x utspädning.
    6. Utför qRT-PCR med qRT-PCR-reagenser enligt tillverkarens instruktioner enligt följande: 95 °C i 10 minuter, upprepa 40 gånger med 95 °C i 15 s och 60 °C i 1 min, följt av standardprogrammet för smältkurva och håll vid 8 °C på obestämd tid.
  2. Utför omvänd transkription och qRT-PCR från några maskar eller maskvävnader.
    1. Överför 25 μL RT-buffert och 2,5 μL 20x RT-enzymblandning från qPCR 2-stegssatsen (se materialförteckning) till varje rör som innehåller masklysat från antingen steg 4.2.6 eller steg 4.3.6.
      OBS: En RT-negativ kontroll är avgörande för qRT-PCR från några maskar. Varje experiment måste inkludera ett prov av masklysat (från steg 4.2.6) med RT-buffert men utan RT-enzym för att undersöka DNA-kontamineringen i proverna. Om DNA-kontaminering är ett problem, överväg att lägga till mer DNase till lysbufferten eller mer DNase till provet efter att maskarna har lyserats. Alternativt kan man utföra RT-negativ kontroll för varje prov genom att använda hälften av lysatet i en normal RT-reaktion och den andra halvan i en RT-reaktion utan omvänd transkriptas.
    2. Blanda genom att försiktigt knacka. Snurra ner med en minicentrifug i 10 s.
    3. Ladda proverna i termocyklerna enligt tillverkarens anvisningar: 37 °C i 60 minuter, 95 °C i 5 minuter och 8 °C på obestämd tid.
      OBS: Detta är en pauspunkt. Proverna kan lämnas i termocykeln över natten eller förvaras vid -20 °C i några månader.
    4. Förvara alla reagenser och prover på is och skydda qRT-PCR-reagenserna från ljus.
    5. Bered en 96-brunns qPCR-platta och blanda i varje brunn 6 μl nukleasfritt vatten, 10 μL qRT-PCR-reagens, 2 μL 5 μM primerblandning (framåt och bakåt) och 2 μL cDNA. Täck den 96-brunns qPCR-plattans yta med en skyddande optisk film och tryck ner för att täta.
    6. Kör qRT-PCR-programmet på en termisk cyklist enligt tillverkarens instruktioner enligt följande: 50 ° C i 2 minuter, 95 ° C i 2 min, upprepa 40 gånger med 95 ° C i 3 s och 60 ° C i 30 s, följt av 8 ° C på obestämd tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av transkriptionella förändringar med hjälp av några hela maskar vid lipidtillskott
För att undersöka om protokollet för att extrahera och retrotranskribera RNA till cDNA från några få hela maskar är reproducerbart och jämförbart med data från bulkmaskar, användes en långlivad maskstam som överuttryckte lysosomalsyran liplas-4 i tarmen 7,8,33,35. Den transkriptionella induktionen av neuropeptidbearbetningsgenerna egl-3 och egl-21 som rapporterats itidigare studier 7,8,33 validerades (figur 2A,B). Denna induktion indikerar att RNA-extraktionsmetoden från ett fåtal djur är ett giltigt alternativ till standard cDNA-syntestekniker från bulkmaskkulturer.

Validering av transkriptionella utvärderingar med dissekerade maskvävnader vid lipidtillskott
I C. elegans är syntesen av 20-kol-PUFA beroende av aktiviteten hos desaturasfett-316,17. Tidigare studier har rapporterat att fett-3-mutanter saknar 20-kol-PUFA, inklusive DGLA16. Tidigare upptäcktes att förlusten av Δ6-desaturas FAT-3 i lipl-4g-maskar undertrycker transkriptionen av neuropeptidbearbetningsgenerna egl-3 och egl-2133. Dessutom räddar DGLA-tillskott sådan induktion33. Genen som kodar för egl-21 uttrycks i nervceller, medan egl-3 detekteras i både nervceller och tarmar36,37. För att ytterligare testa om DGLA-tillskott återställer induktionen av egl-3 och egl-21 i tarmen eller i neuronerna, dissekerades tarmen ut och deras transkriptionsnivåer bedömdes med hjälp av qRT-PCR-analys som beskrivs i steg 4.3 och 5.2 i detta protokoll. DGLA kompletterades i källmaten i 12 timmar vid dag-1 vuxen ålder. Ingen transkriptionell induktion av varken egl-3 eller egl-21 hittades i tarmen (figur 2C), vilket överensstämmer med tidigare fynd36,38.

Validering av livslängdsanalys vid lipidtillskott
Förhållandet mellan 20-kol-PUFA och livslängdsmekanismen som inaktiverar fett-3 har tidigare utforskats, särskilt i tarmen hos lipl-4g-maskar 33. Det visade sig att fett-3-knockdownen helt undertrycker livslängdsförlängningen som lipl-433 ger. För att bedöma om DGLA återställer den livslängd som påverkas av lipl-4, kompletterades DGLA nyligen varannan dag till källmaten vid dag 1 i vuxen ålder. Det konstaterades att vid fett-3 knockdown, DGLA tillskott räddar livslängden förlängning (Figur 2D)33, vilket indikerar en framgångsrik lipid tillskott förfarande i kombination med livslängd analys.

Figure 1
Figur 1: Schematisk för lipidmatning med olika experimentella inställningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Validering av neuropeptidbearbetningsgenernas transkriptionella utvärdering med hjälp av en stor population av maskar, några maskar och dissekerade vävnader. (A) RNA extraherat från en stor population av maskar visar induktionen av neuropeptidbearbetningsgenernas egl-3- och egl-21-transkriptnivåer hos lipl-4 Tg-djur. Felstaplar representerar ±1 SEM. **** p < 0,0001 av tvåsidiga Students t-test. (B) RNA-extraktion från några maskar bekräftar induktionen av neuropeptidbearbetningsgenernas egl-3- och egl-21-transkriptnivåer i lipl-4 Tg-maskar. Felstaplar representerar ±1 SEM. **** p < 0,0001 av tvåsidiga Students t-test. (C) Neuronala neuropeptidbearbetningsgener egl-3 och egl-21 induceras inte i dissekerade tarmar. Felstaplar representerar ±1 SEM. Statistisk analys med tvåsidigt Students t-test. (D) DGLA-tillskott i olika koncentrationer, inklusive 10 μm, 100 μm och 1 mM räddar lipl-4Tg livslängdseffekten på fett-3 RNAi. p < 0,001 genom log-rank test. Denna siffra är anpassad från Savini et al.33. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lipidtillskott har använts i åldrande forskning för att belysa den direkta effekten av vissa lipidarter på friska åldrande 6,7,23,26,27,31. Emellertid, lipid tillskott förfarande kan vara utmanande, och eventuella inkonsekvens mellan experiment kan orsaka icke-reproducerbara resultat. Här dokumenteras det första detaljerade steg-för-steg-protokollet för att vägleda nya forskare för att undvika de potentiella fallgroparna som orsakas av teknisk inexakthet. De kritiska stegen i detta protokoll kommer att diskuteras i detalj i följande stycken. Lipidforskningsverktygslådan utökas också genom att införa RNA-isolering från endast några få maskar och specifika maskvävnader efter lipidtillskott. När man överväger metoden för att undersöka transkriptnivåer är qRT-PCR med några maskar eller dissekerade vävnader enastående för att analysera några transkript eller undersöka vissa vävnadsspecifika transkriptionsförändringar. Dessutom kan användning av dessa metoder övervinna steget med maskförstärkning som kan ta cirka 5-6 extra dagar. Samtidigt är lipidmatning följt av bulk-RNA-extraktion mer kostnadseffektivt och ett giltigt alternativ när en större uppsättning målgener behöver analyseras.

Flera steg kan vara avgörande för reproducerbarheten av lipidmatningseffekter. Den första aspekten är relaterad till bakterieförhållandena. Det föreslås att använda färska bakterieplattor som inte är äldre än 7 dagar för ympning. Det rekommenderas att använda bakterier framställda i BDR-medium inom 1 vecka. Bakterier som har blandats med lipider måste användas direkt. Lipider med bakterier bör inte förvaras ens vid 4 °C, eftersom bakterierna kommer att metabolisera lipiderna. Tvättstegen i BDR-basen och resuspension i BDR-mediet är avgörande för bakterieförhållanden, eftersom bakterier odlades i LB, och matas direkt till maskar eliminerar alltid de djupa effekterna av lipidtillskott. Den andra faktorn är förknippad med maskförhållanden. C. elegans måste vara icke-svälta i minst tre generationer före blekningssteget för äggberedning för att säkerställa att de är i ett hälsosamt och stabilt metaboliskt tillstånd. Det är också avgörande att odla C. elegans på agarplattor före lipidtillskott; Detta inkluderar före och efter synkroniseringssteget.

Ormar som anpassade sig till flytande kulturer under längre tider svälter delvis; Svält höjer baslinjen för pro-livslängdsgener, vilket leder till en försvagad effekt av lipidtillskott. Om den metaboliska driften och förändringar med hjälp av arresterade L1-larver är bekymmer, skulle ett giltigt alternativ vara att direkt platta äggen. När endast ett fåtal maskar behövs för att utföra livslängds- eller genuttrycksanalys är det möjligt att platta ägg direkt på lipidkonditionerade plattor och synkronisera dem igen genom handplockning i L4-stadiet för efterföljande experiment. Men om stora mängder maskar behövs när handplockning av L4 inte är tillämpligt, är plätering av ägg direkt inte idealiskt. Äggkläckning efter blekning från gravida vuxna kan förekomma vid olika tidpunkter och orsaka att befolkningen är osynkroniserad, vilket skulle störa transkriptionsanalysen. Den tredje kritiska delen är kopplad till lipidlagringsförhållandena; när du kompletterar PUFA: er behövs extra uppmärksamhet eftersom dessa molekyler är känsliga för ljus och benägna att oxidera i luften.

Flera lipid-utfodring villkor, inklusive mask steg, tillskott längd, och koncentrationer, kräver ytterligare utredning när man testar nya lipidmolekyler. L4, dag-1 vuxna och dag-2 vuxna maskar är vanligtvis utgångspunkten för testning i olika maskstadier. I synnerhet vid utfodring av L4-maskar, om inkubationstiden slutar runt nematodsmältfasen, förväntas en stor variation, vilket i hög grad påverkar resultatens betydelse och reproducerbarhet. En ytterligare utmaning för att använda dag-1 eller dag-2 vuxna maskar är relaterad till avkomman som kan komplicera genuttrycksanalysen. I detta fall är RNA-extraktion från några hela maskar mer tillförlitlig än bulkpopulationer. Olika lipidmolekyler har olika koncentrationsintervall för att producera fysiologiska effekter; Således föreslås en serie koncentrationer från 1 μM till 1 mM att testas.

Det finns några begränsningar att tänka på när du väljer utfodringsmetod. Först, när lipider inte kan absorberas eller intas av maskarna, Det är utmanande att använda en tillskottsmetod för att testa deras biologiska effekt i C. elegans. Med nuvarande teknik är masspektrometri eller SRS i kombination med 13C- eller 2H-märkta lipidföreningar39 giltiga verktyg för att testa lipidupptag i maskkroppen. För det andra är dessa utfodringsmetoder inte optimerade för undersökningstekniker med hög genomströmning. För lipidtillskott med bulkmaskar är provberedningen från vätskematningsmetoden snabbare än utfodring på plattan, eftersom vätskekulturerna kan överföras direkt till mikrocentrifugrör istället för att tvättas bort från matningsplattorna. För att säkerställa att det extraherade RNA är i skördetillstånd föreslås att man inte låter mer än 15-20 minuter passera mellan punkten att sätta maskarna på is för att mala dem i RNA-extraktionslösningen. Det rekommenderas att bearbeta färre förhållanden var 15: e minut när ett stort antal prover behöver bearbetas. För extraktion av hela mask-RNA från några få djur är handplockningssteget det hastighetsbegränsande steget, medan det för dissekering av vävnader är avgörande att agera på ett tidseffektivt sätt för att undvika långvarig exponering för en icke-fysiologisk miljö. I likhet med bulk-RNA-extraktion är det att föredra att plocka maskar eller dissekera vävnadsprover inom 10 minuter.

Trots begränsningarna, dessa tillskott metoder kan användas utöver lipid forskning för att underlätta identifieringen av eventuella näringsmässiga och medicinska effekter. De procedurer som rapporteras här är inte bara begränsade till åldrande forskning utan alternativa fenotyper för att bedöma organell fitness och cell metabolisk homeostas. Tillskottsmetoden med bulkpopulation kan kombineras med RNA-seq för transkriptomanalys, masspektrometri för metabolomisk och proteomisk analys, eller Western blot för analys av specifika proteinmarkörer, medan lipidtillskottet med några maskar kan kombineras med avbildning och beteendeanalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar P. Svay för underhållsstöd. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI-utredare (M.C.W.) och NIH T32 ES027801 pre-doktorandstipendiat (MS). Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Pestle Genesee Scientific 93-165P15 For worm grinding with Trizol
Agarose Sigma A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix GenDEPOT R5600 For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR ThermoFisher A28567 For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge Benchmark Scientific C1248 For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip Branson Ultrasonic Corporation 100-132-888R
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cholesterol Sigma C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge Eppendorf 22620444R For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro Eppendorf 950030010 For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate Neta Scientific 665180 12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm Neta Scientific 664161 For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm Neta Scientific 628161 For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher AM9937
Isoproanol Sigma PX1835-2
Levamisole hydrochloride VWR SPCML1054
lipl-4Tg MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22) MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
Luria Broth Base ThermoFisher 12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode ThermoFisher 4483354 96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied BioSystem 4311971 For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System Sigma Z00Q0V0WW Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2 Caenorhabditis Genetics Center N/A C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher N/A For measuring RNA concentration
OP50 Caenorhabditis Genetics Center N/A Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) Sigma P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit ThermoFisher 4402953 For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4367659 For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach  KIK International LLC. 59647210143 6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution ThermoFisher AM9780
Sodium cloride (NaCl) Sigma S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) Sigma S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge Thermo 7500-4337 For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge Thermo 7500-7200 For worm egg preparation
TRIzol Reagent TheroFisher 15596018 RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit ThermoFisher AM1907 For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59 Denville Scientific INV S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor VWR 47747-370 For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 VWR N/A For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker WormStuff 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

Tags

Biologi utgåva 190
Lipidtillskott för livslängd och gentranskriptionsanalys i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., … More

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter