Summary
在这里，我们描述了一种将腺相关病毒注射与颅窗植入相结合的方案，用于同时对清醒小鼠的小胶质细胞动力学和神经元活动进行成像。
Abstract
由于大脑功能受到来自外周组织的信号的持续影响，因此阐明大脑中的神经胶质细胞如何感知外周的各种生物条件并将信号传递给神经元至关重要。小胶质细胞是大脑中的免疫细胞，参与突触发育和可塑性。因此，小胶质细胞对响应身体内部状态的神经回路构建的贡献应通过小胶质细胞动力学与神经元活动之间关系的活体成像来批判性地测试。
在这里，我们描述了一种在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动力学和神经元活动的技术。将编码R-CaMP的腺相关病毒（红色荧光蛋白的基因编码钙指示剂）注射到在小胶质细胞中表达EGFP的CX3CR1-EGFP转基因小鼠初级视觉皮层的第2/3层中。病毒注射后，在注射区域的脑表面上安装了一个颅窗。手术后4周清醒小鼠 体内双光 子成像表明，神经活动和小胶质细胞动力学可以同时以亚秒级时间分辨率记录。该技术可以揭示小胶质细胞动力学与神经元活动之间的协调，前者对外周免疫状态作出反应，后者编码内部大脑状态。
Introduction
越来越多的证据表明，身体的内部状态不断影响动物的大脑功能1，2，3，4，5。因此，为了更深入地了解大脑功能，阐明大脑中的神经胶质细胞如何监测外围的生物条件并将信息传递给神经元至关重要。
小胶质细胞是大脑中的免疫细胞，参与突触发育和可塑性，其塑造大脑中神经回路的特征6，7，8，9。例如，Wake等人的开创性工作表明，小胶质细胞过程在小鼠新皮层中以神经元活动依赖性方式与突触接触，并且人工缺血在与小胶质细胞长时间接触后诱导突触丢失10。Tremblay等人发现，视觉体验的改变改变了小胶质细胞与突触相互作用的方式。在初级视觉皮层（V1）的树突棘周转因双眼剥夺而增加的关键时期，暗适应会降低小胶质细胞突的运动性，并增加它们与突触裂隙的接触频率和小胶质细胞中细胞包涵体的数量11。这些结果表明，小胶质细胞过程感知神经活动及其周围环境以重塑神经回路。此外，最近的一项研究报告说，清醒和麻醉条件下的小胶质细胞监测不同，这表明使用清醒小鼠进行实验在生理条件下研究神经元 - 小胶质细胞通信的重要性12。
体内双光子钙成像是记录钙动力学的有力工具，反映了活体动物中数百个神经元的持续神经元放电13，14，15。神经元中的钙成像通常需要超过几赫兹的时间分辨率来跟踪快速神经元反应16，17。相比之下，先前跟踪小胶质细胞动力学的研究以小于0.1 Hz的相对较低的时间分辨率对小胶质细胞结构进行了采样18，19，20。最近的一项研究应用同步双光子成像来了解神经元-小胶质细胞的通信21。然而，目前尚不清楚动态小胶质细胞过程如何在清醒小鼠中以超过几赫兹的时间分辨率响应周围的神经活动。为了解决这个问题，我们描述了一种在清醒小鼠中具有高于1Hz的时间分辨率的神经活动和小胶质细胞动力学的同步体内双光子成像方法。该方法使我们能够以更高的帧速率（最大，30 Hz，像素帧大小为512 x 512像素）在清醒小鼠中实现稳定的成像，并为研究小胶质细胞的监视行为或其与清醒小鼠神经元活动的相互作用提供了更有利的方法。
Protocol
所有实验均由东京大学医学研究生院和医学院的动物伦理委员会和基因重组实验安全委员会批准，并根据其指南进行。
1. 准备
- 使用高压灭菌器或70%乙醇对手术所需的所有器械和器械进行消毒。
- 玻璃移液器制备。
- 将 75 μL 校准的毛细管牢固地固定在微量移液器拉拔器的支架上。将拉拔器设置为程序，推荐参数为 P（压力）= 500、热量 = 680、拉力 = 30、VEL = 60、时间 = 180。
- 完成程序后（通常为4.5至5秒），将毛细管分成两个带有锥形尾部的玻璃移液器。然后，用镊子折断尾巴的远端部分，以保持尖端直径在30-50μm以内。为此，将尾巴折断到斜面部分末端远端 1 厘米处。
- 对于开颅术，通过使用紫外光固化试剂将直径 4 毫米、厚度 0.15 ± 0.02 毫米的较大外玻璃盘粘在较小的内玻璃盘（直径 2 毫米、厚度 0.525 ± 0.075 毫米）上来准备颅窗（图 2A）。
2. AAV注射
- 注射装置的制备
- 将连接到26 G Hamilton注射器的玻璃移液器通过管子放在立体定位仪器的移液器支架上，然后将移液器支架从垂直轴向前倾斜60°（图1A，B）。
- 用液体石蜡填充玻璃移液器、注射器和连接管。将注射器放在微量注射器上。
- 手术
注意：以下手术是在灭菌室中进行的。如有必要，使用体视显微镜进行手术。- 在气密室中用3%异氟醚麻醉雄性CX3CR1-EGFP小鼠（材料 表中的详细信息）。3分钟后，当小鼠失去除呼吸外的自主运动时，将其从腔室中取出，然后通过含有2%异氟醚的鼻管切换到连续麻醉。
注意：已知异氟醚可激活小胶质细胞。然而，由于成像是在手术后4周进行的，因此异氟醚在成像过程中对小鼠没有影响。尽管在成像前将小鼠置于立体定位仪器中时，异氟醚麻醉使用几分钟（步骤4.2.1），但我们发现这种短麻醉的效果可以忽略不计。 - 在手术过程中，用37°C的加热垫保持小鼠温暖，以防止体温过低。在双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥，并皮下注射美洛昔康（5mg / kg）。将鼠标连接到辅助耳杆，然后将鼠标固定在立体定位仪器上，其背面朝上。
- 在手术过程中将异氟醚浓度调整到适当的百分比（1%-2%），同时监测呼吸和心率。使用脱毛膏去除头发，并用碘基或氯己定磨砂膏和酒精以圆周运动对头部进行几次消毒。然后，皮下注射 0.1 mL 的 1% 利多卡因，并应用无菌布以确保手术部位。
- 用剪刀沿中线切开头皮，切口长约 2 厘米，以确保右侧初级视觉皮层上方的颅骨良好暴露。切开头皮后，在整个过程中用生理盐水冲洗头部，以防止暴露的头骨和大脑干燥。
- 使用镊子去除暴露的颅骨上的骨膜。在立体定位坐标上钻颅骨：中线外侧 3 mm，λ线前方 0.5 mm，形成一个直径约 0.5 mm 的小孔。如有必要，冲洗掉钻头上的血液和组织碎屑。
- 使用以下程序以 8.3 x 1012 个载体基因组/mL22 的滴度向玻璃移液管中填充 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07。
- 推进注射器，从玻璃移液器中弹出 1 μL 液体石蜡。将一块透明薄膜（约2cm x 2cm）放在小鼠暴露的头骨上，并使用移液器在薄膜上排出1μLAAV溶液液滴。
- 将玻璃移液器吸头放入薄膜上的AAV溶液液滴中，轻轻拉动注射器以吸出AAV溶液。弹出后，转动 T 形旋塞阀以释放管内的压力和玻璃移液器。
- 通过步骤2.2.5中创建的孔将玻璃移液器从脑表面插入500μm的深度，然后使用微量注射器注入0.5μLAAV溶液（图1C）。使用2.0μL/h的进样体积流速;0.5μL的进样需要15分钟，然后等待5分钟。
- 注射后，轻轻取出玻璃移液管并用盐水冲洗脑表面。
- 在气密室中用3%异氟醚麻醉雄性CX3CR1-EGFP小鼠（材料 表中的详细信息）。3分钟后，当小鼠失去除呼吸外的自主运动时，将其从腔室中取出，然后通过含有2%异氟醚的鼻管切换到连续麻醉。
3. 颅窗植入术
注意：同一天AAV注射后进行颅窗植入。
- 在头骨上标记一个直径为 2.5 毫米的圆圈，从λ横向居中 3 毫米。通过钻孔沿着头骨上的标记创建一个圆形凹槽。清洁碎屑，因为它可能会对头骨的能见度产生不利影响，并在钻孔过程中使用盐水以防止升温。
- 要检查圆形凹槽中的钻孔深度是否足以去除中央颅骨碎片，请用镊子轻轻按压中央颅骨。如果它垂直移动且阻力很小，则钻孔深度就足够了。
- 当凹槽达到足够的深度时，将镊子的尖端插入中央颅骨碎片的底部，轻轻提起并取出它以暴露大脑表面（图1D）。
- 使用27 G针，刺破并撕裂暴露的大脑表面边缘的硬脑膜。将镊子的尖端插入硬脑膜边缘的孔中。握住硬脑膜并将其剥离以露出大脑表面。
注意：如果发生出血，请用生理盐水冲洗大脑表面，直到出血停止。 - 使用镊子，将止血纤维在3.5mm培养皿中的盐水中逐个分散，然后将止血纤维沿着存在横断硬脑膜的孔的边缘放置。
- 将步骤1.3中制备的颅窗放在暴露的脑表面上，然后用即时胶将其粘附在头骨上，同时轻轻按压窗户，使窗口与颅骨紧密接触。
- 之后，将即时胶水涂在整个暴露的头骨上，然后小心地将头板连接到头骨上，使窗口位于头板方孔的中心（图2C）。确保顶板表面与玻璃窗表面平行。
- 胶水充分硬化后，将牙科水泥涂在暴露的颅骨上，以加强头部和顶板之间的附着（图2）。
注意：如果实验包括向小鼠呈现视觉刺激，则应避免杂散光进入成像区域。建议通过将水泥与活性炭混合来使水泥变黑，以减少光反射。 - 在水泥充分硬化后（约20分钟）将鼠标从麻醉中撤出。然后，将鼠标放入新的笼子中独自恢复。
- 在确认其意识和自愿运动后，表示完全恢复，将鼠标放回家笼中。在恢复期间，如果出现明显的疼痛指示行为，给予第二次或更多（如有必要）美洛昔康剂量（每 24 小时一次，持续 1-3 天）。
4. 小胶质细胞和神经元钙动力学的 体内 双光子成像
- 小鼠对显微镜装置的习惯
- 手术后三周，用3%异氟醚诱导小鼠麻醉，并使用定制的立体定位仪器将小鼠置于双光子显微镜的25倍物镜下（图3C）。对于这里的设置，鼠标被设置在跑步机的顶部，并允许自由运行。
- 大约10分钟后，将鼠标从显微镜载物台上移开并将其放回主笼中。在双光子图像采集之前，每隔一天至少重复3次习惯。
- 双光子图像采集
注意：我们建议在手术后4周以上进行图像采集，因为小胶质细胞激活逐渐恢复到基础水平。- 如步骤4.1所示，用3%异氟醚诱导小鼠麻醉，并使用定制的立体定位仪器将小鼠置于双光子显微镜的物镜下。
- 安装定制的着色装置和LCD监视器以进行视觉刺激，如下所述（图3D）。
- 将镜头定位为聚焦在大脑表面，然后将此镜头位置设置为原始 Z 位置。保持x-y坐标恒定并抬高物镜;从物镜和跑步机上取下鼠标和立体定位仪器。
- 使用硅胶在顶板顶部安装遮阳装置，通过与木炭粉混合使其变黑，并确保顶板和遮阳装置之间的空间密封良好。
- 用蒸馏水填充遮光装置，然后将鼠标和立体定位框架再次固定在物镜下方和跑步机上。小心地重置大脑表面的焦平面，检查物镜的深度。
注意：为避免损坏物镜的风险，请先设置xyz坐标，然后应用物镜的阴影装置。先安装盖子，然后再调整坐标也是合理的，但此选项需要谨慎处理。 - 用黑色铝箔盖住物镜，以避免用于通过物镜进行视觉刺激的LCD监视器的光污染（图3D）。将 10 英寸 LCD 显示器设置在鼠标眼前 12.5 厘米处以呈现视觉刺激（图 3D）。
- 将荧光发射收集滤光片配置为EGFP荧光（525/50 nm发射滤光片）和R-CaMP荧光（593/46 nm发射滤光片），并将激发波长配置为1，000 nm。使用 25x 1.1 NA 物镜和 GaAsP PMT 采集空间分辨率为 0.25 μm/像素的图像。
- 找到 R-CaMP（+） 神经元和 EGFP（+） 小胶质细胞可以在第 2/3 层同时成像的成像区域。对于此设置，使用实时图像预览，在 图4 和 视频1 中获得的数据距离pial表面的深度为100μm。保持激发激光的功率尽可能低，以避免光漂白和成像区域局部温度升高造成的损坏。
- 以 30 Hz 的帧速率采集图像。 在图像采集的同时，以 100% 对比度、1.5 Hz、每度 0.04 个周期在 12 个方向上以 0° 到 150° 的 6 个方向以 30° 步长呈现漂移光栅视觉刺激鼠标17.
- 图像采集后，将鼠标从显微镜载物台上移开，从鼠标上拆下着色装置和立体定位仪，然后将鼠标放回其主笼。
- 数据注册
- 使用斐济或显微镜随附的软件，将采集的图像数据（在本例中为nd2格式）转换并保存为每个颜色通道的一系列tiff图像文件。
- 应用 Turboreg（斐济的一个插件）以使用 mode = 翻译执行注册。使用平均图像作为参考图像，带有EGFP通道的tiff图像文件。
- 使用 MATLAB 对每个帧执行以下处理。
注意：虽然在下面的处理中使用了MATLAB，但描述主要集中在每个步骤的意图上，以便数据可以通过其他编程软件（如Python）进行分析。- 使用imread功能分别读取同一帧配准前后的两个EGFP tiff图像。使用读取函数读取同一帧的 R-CaMP tiff 图像。
- 使用 normcorr2 函数计算步骤 4.3.3.1 中读取的两个 GFP 图像的矢量化变量之间的相关函数。
- 使用 max 函数检测相关函数互相关度最高的线性指数，然后使用 ind2sub 函数从注册图像的原始图像计算其移动位置。
- 使用imwarp函数将R-CaMP图像转换为步骤4.3.3.3计算的位置，然后使用imwrite函数保存R-CaMP的注册图像。
- 生成微量钙
- 使用 MATLAB 执行以下处理。使用 imread 函数读取在步骤 4.3.3.4 中生成的所有已注册的 R-CaMP tiff 图像。如果已注册的映像已作为变量加载到工作区中，请省略此步骤。
- 使用均值函数生成时间投影图像。使用 imshow 函数将平均图像显示为图形;使用 ROIPOLY 函数生成目标结构（此数据中的树突棘）的二进制 ROI 掩码。
- 将二进制掩模与每帧的图像相乘作为输入变量而获得的图像使用平均函数，计算每帧ROI内的平均荧光强度。
- 如前所述17，对在步骤4.4.3中获得的变量，在截止=1.6秒处应用黄油值频率滤波器，用于切割高频噪声，然后在时间窗口= 200秒处应用滑动中值滤波器，用于切割低频噪声。
Representative Results
如本协议所述，我们在8周龄CX3XR1-EGFP转基因小鼠的V1中进行了AAV注射和颅窗植入。手术后四周，我们在V1的第2/3层同时对基于R-CaMP的神经活动和小胶质细胞动力学进行了 体内双光 子成像（图4 和 视频1）。在成像过程中，将鼠标放在跑步机上并允许自由运行。使用25倍、1.1 NA物镜和GaAsP PMT以30 Hz的帧速率和0.25 μm/像素的空间分辨率采集图像。EGFP和R-CaMP均在1，000 nm波长下激发，同时采集EGFP荧光（525/50 nm发射滤光片）和R-CaMP荧光（593/46 nm发射滤光片）。在配准采集的数据以尽量减少运动伪像后，每四帧平均为一帧以减少背景噪声。将光栅视觉刺激呈现给小鼠，并分析神经元和单个树突棘的视觉反应（图4D）。小胶质细胞过程显示出快速动力学并在10秒内改变其形态（图4E和 视频1）。如讨论部分所述，当AAV注入失败时，无法检测到R-CaMP的表达。如果手术不成功，则无法观察到EGFP和R-CaMP的信号。
图1：AAV注射 。 （A）使用硅管将玻璃移液器连接到26 G汉密尔顿注射器。（B）AAV注射的设置。（C） AAV溶液通过 玻璃移液管从垂直轴向前倾斜60°注入。（D）开放颅骨程序示意图（在步骤3.3中描述）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：颅窗和顶板 。 （A）颅窗植入示意图。（B） 使用定制的顶板。对于右半球的成像，应在右侧使用较短的臂。（C）带有颅窗和植入头板的小鼠背视图。（D）颅窗的高放大倍率视图，如图 2C所示。（E）用定制的立体定位仪器固定的小鼠的背视图。 请点击此处查看此图的大图。
图 3： 体内 双光子成像的设置。 （一）遮阳装置背视图。（二）遮阳装置侧视图。（C） 物镜下方顶板上带有遮光装置的鼠标视图。鼠标放在跑步机上。（D）在双光子激发显微镜下观察。呈现视觉刺激的监视器放置在图形的右侧。物镜上覆盖有遮光装置和黑色铝箔，以避免光线从监视器照射到物镜。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：树突棘中的小胶质细胞动力学和视觉反应。 （A-C） 12 周龄 CX3XR1-EGFP 转基因小鼠 V1 第 2/3 层中 EGFP（+） 小胶质细胞和 R-CaMP（+） 神经元的时间平均图像。每个通道中的信号强度是独立归一化的。（D）树突棘的视觉反应。带有黑色箭头的条纹图以灰色列指示的时间表示光栅刺激的方向。在钙迹线中，灰线表示个体反应，黑线表示其平均值。在右插图中，黄色箭头表示树突棘，其中生成感兴趣区域（ROI）以获取钙迹线。（E）小胶质细胞过程（青色箭头）在10 s内显示快速回缩。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：神经元活动和小胶质细胞动力学的双光子成像。 12周龄CX3XR1-EGFP转基因小鼠V1层2/3中EGFP（+）小胶质细胞和R-CaMP（+）神经元的成像数据。在电影的左侧，洋红色表示神经元中的R-CaMP，绿色表示小胶质细胞中的EGFP。影片的中心对应EGFP信号，右侧对应R-CaMP信号。每个通道中的信号强度是独立归一化的。电影的帧速率比实际速率快 40 倍。比例尺 = 10 μm 请点击这里下载此视频。
Discussion
我们描述了AAV注射和开颅术的方案，用于同时对清醒小鼠的小胶质细胞动力学和神经元活动进行成像以及数据处理。该技术可以在亚秒到几十秒的时间尺度上揭示小胶质细胞动力学与神经元活动之间的协调。
手术方案涉及几个技术要求苛刻的步骤。AAV注射是关键步骤之一。不成功的AAV注射可能导致R-CaMP表达的显着降低。主要有两个原因：玻璃移液器堵塞和组织损伤。玻璃移液器的堵塞可减少或完全阻止AAV溶液的喷射。这种情况可以通过用诸如快绿之类的染料对AAV溶液进行着色并目视确认注射成功来避免。AAV注射引起的组织损伤会阻止注射部位中心附近的外源性基因表达。AAV注射引起的损伤很可能是由于移液器内部压力积聚后玻璃移液器尖端的外排量突然增加引起的。因此，AAV溶液从玻璃移液管流出在注射过程中应该是恒定的。选择尖端直径稍宽的玻璃移液器可以解决这个问题。在颅窗植入术中，手术速度至关重要。如果手术时间过长，脑组织可能会严重受损。因此，需要反复练习以确保手术的速度和顺利。此外，在从手术到成像的4周内，通过常规方法17，颅窗和脑组织之间的组织再生可能会降低成像质量。这里的方法通过在颅窗的内玻璃盘上应用厚玻璃来克服这个问题，以抑制组织再生并保持窗户清洁。在这里描述的系统中，通过使用厚度为0.525±0.075μm的内玻璃盘，这种效果很明显。
该方法可以成功地应用于4周以上的小鼠，但应用于年轻小鼠可能有问题。在幼年小鼠中，头骨显示出快速而突出的生长，这导致颅骨和玻璃窗之间的不匹配。
在一些前沿研究中，体内双光子成像用于研究小胶质细胞-神经元相互作用12，21，23。特别是在Merlini等人的开创性工作中，他们同时对细胞体内的小胶质细胞动力学和神经活动进行了体内成像21。在这种方法中，通过使用较厚的内玻璃作为颅窗，我们可以抑制深度方向上的运动伪影，并实现对微结构（如树突棘）中神经元活动的稳定测量。该方法将有助于研究清醒小鼠的突触 - 小胶质细胞过程相互作用。
最近， 体外 研究表明，薄丝足样小胶质细胞突比厚突具有更快的运动性，这表明它们在监测中更快运动的重要性19。这里的系统可以跟踪薄小胶质细胞过程的运动性，时间分辨率从亚秒到几十秒不等。该特性有助于阐明其运动性对 体内监测的功能意义。
将来，将这种成像技术与应用于局部神经回路或区域间神经连接的干预措施（例如光遗传学24 或化学遗传学25）相结合，将揭示突触发育和可塑性中的新型小胶质细胞功能，从而塑造神经回路的特征。此外，成像、干预和行为任务的进一步整合将有助于揭示小胶质细胞和特定行为神经元的协调。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Masashi Kondo博士和Masanori Matsuzaki博士提供病毒载体。这项工作得到了科学研究补助金（20H00481，20A301，20H05894，20H05895至S.O.），日本医学研究与发展机构（JP19gm1310003和JP17gm5010003至S.O.和JP19dm0207082至H.M.），东京大学人类行为综合科学中心（CiSHuB），日本科学技术振兴机构登月研发（JPMJMS2024至H.M.）的支持， 脑科学基金会（致H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| 27G needle | Terumo | NN-2719S | |
| AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
| Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
| Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
| CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
| DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
| Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
| Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
| Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
| Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
| Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
| ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
| Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
| MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
| Microinjector | KD Scientific | KDS-100 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
| Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
| Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
| Shading device | Customized | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
| Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
| Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Treadmill | Customized | N/A | |
| UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
| Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |
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