Summary
我们使用机械铣削，研磨和成像分析的逐步过程来展示微塑料和纳米塑料（分别为MP和NP）的形成和尺寸表征。
Abstract
分散在农业生态系统中的微塑料（MP）和纳米塑料（NPs）可能对土壤和附近水道中的生物群构成严重威胁。此外，NPs吸附的农药等化学物质会损害土壤生物，并可能进入食物链。在这种情况下，农业上使用的塑料，如塑料地膜，对农业生态系统中的塑料污染有重大影响。然而，大多数关于命运和生态毒性的基础研究都使用理想化且代表性较差的MP材料，例如聚苯乙烯微球。
因此，如本文所述，我们开发了一种实验室规模的多步骤程序，以机械方式形成具有代表性的MP和NP进行此类研究。该塑料材料由市售的聚丁酸己二酸酯-共对苯二甲酸酯（PBAT）塑料地膜制备，该薄膜通过低温处理（CRYO）或环境风化（W）脆化，并由未经处理的PBAT颗粒制成。然后通过机械研磨处理塑料材料，形成尺寸为46-840μm的MP，模仿风和机械对塑料碎片的磨损。然后将国会议员筛分成几个尺寸部分，以便进行进一步分析。最后，对106 μm筛分进行湿法研磨，生成20-900 nm的NPs，该过程模仿了地面MP的缓慢尺寸减小过程。通过立体显微仪的图像分析确定了MP的尺寸和形状，并采用动态光散射（DLS）来评估NP的粒度，通过该过程形成的MP和NP具有不规则的形状，这与从农田中回收的MP的几何特性一致。总体而言，这种尺寸减小方法被证明对于形成由可生物降解塑料组成的MP和NP是有效的，例如聚己二酸丁二醇酯 - 共对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT），代表用于农业特种作物生产的覆盖材料。
Introduction
近几十年来，全球塑料产量迅速增加，处置不当，塑料废物缺乏回收利用，导致环境污染，影响了海洋和陆地生态系统1，2，3。塑料材料对于当代农业至关重要，特别是种植蔬菜，小水果和其他特种作物。它们用作地膜、高低隧道覆盖物、滴灌带和其他应用，旨在提高作物产量和质量，降低生产成本，并促进可持续耕作方法4，5。然而，“塑料栽培”的不断扩大引起了人们对农业环境中塑料碎片的形成，分布和保留的担忧。在使用寿命期间通过环境退化引起的脆化过程之后，较大的塑料碎片形成微塑料和纳米塑料（MNPs），这些塑料碎片在土壤中持续存在 或通过水径 流和风迁移到相邻的水道6，7，8。环境因素，如通过阳光的紫外线（UV）辐射，水的机械力和生物因素触发环境分散塑料的塑料脆化，导致较大的塑料碎片分解成宏观或中胚层塑料颗粒9，10。进一步碎片化形成微塑料（MP）和纳米塑料（NPs），反映平均尺寸（公称直径; dp）分别为1-5000μm和1-1000nm11.然而，NPs的 dp 上限（即MP的下限）并未得到普遍同意，在几篇论文中，这被列为100 nm12。
来自塑料废物的MNP对土壤健康和生态系统服务构成了新的全球威胁。与周围环境相比，国会议员从淡水中吸附重金属导致重金属浓度高出800倍13.此外，水生生态系统中的议员通过改变光渗透，导致氧气耗尽，并导致粘附在各种生物群中，包括渗透和积累在水生生物中，造成多种压力源和污染物14.
最近的研究表明，MNPs可以影响土壤地球化学和生物群系，包括微生物群落和植物15，16，17。此外，NPs威胁到食物网17，18，19，20。由于MNP很容易在土壤中经历垂直和水平运输，它们可以将吸收的污染物（如杀虫剂，增塑剂和微生物）通过土壤带入地下水或水生生态系统，如河流和溪流21，22，23，24。传统的农用塑料，如地膜，由聚乙烯制成，使用后必须从田间取出，并在垃圾填埋场中处理。然而，不完全的去除导致大量的塑料碎片在土壤中积累9，25，26。或者，土壤可生物降解的塑料覆盖物（BDM）被设计为在使用后耕种到土壤中，在那里它们会随着时间的推移而降解。然而，BDM暂时存在于土壤中，并逐渐降解并分裂成MP和NP9，27。
目前的许多环境生态毒理学和命运研究都采用了理想化和非代表性的MP和NP模型材料。最常用的替代MNP是单分散聚苯乙烯微球或纳米球，它们不反映实际驻留在环境中的MNP12，28。因此，选择不具代表性的国会议员和NP可能会导致不准确的测量和结果。由于缺乏用于陆地环境研究的适当模型ΜNPs，作者有动力用农用塑料制备此类模型。我们之前报道了通过塑料颗粒和薄膜材料的机械研磨和研磨从BDM和聚乙烯颗粒形成MNP，以及MNP29的尺寸和分子特性。目前的论文为制备MNP提供了更详细的方案，可以更广泛地应用于所有农用塑料，如地膜或其颗粒状原料（图1）。在这里，作为一个例子，我们选择了可生物降解聚合物聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）的地膜和球形颗粒来代表农用塑料。
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Protocol
1. 通过低温预处理和碾磨加工塑料颗粒中的MP
注意：该方法基于其他地方描述的程序，采用由本研究29中使用的相同材料的PBAT薄膜组成。
- 称取约1克的聚合物颗粒样品，并转移到50 mL玻璃罐中。
- 将带有20目（840μm）筛的“矩形输送”管放在旋转切割机前面的槽中，并抬起输送管，直到它碰到停止销。
- 将玻璃板放在铣削室的表面上，并用可调节的夹具固定。接下来，将50 mL玻璃罐放在磨机出口下方（图2）。
- 将磨机上的滑动侧臂支架（位于右上侧）置于前玻璃的中间，并用滚花螺栓拧紧。确保磨机的前玻璃牢固定位（图2a）。
- 将磨机顶部的料斗漏斗插入上部铣刨室的开口中。
- 将电源线插入电源插座和按线开关以开始轧机操作。
注：为防止卡住，在磨机通电并旋转后，仅进料。此外，在整个铣削过程中佩戴眼睛和耳朵保护装置。 - 将样品缓慢送入料斗（约10粒/分钟），以防止减速或卡住。在可听见的噪音降低后，加入下一批颗粒（约10片）。处理颗粒（1 g）后，按下电源线开关以停止磨机操作约20分钟以冷却。使用木制柱塞进样，防止颗粒在进料斗内喷射和结块。
注意：最佳进给速率因加工材料的类型而异。如果由于切割室中的颗粒摩擦导致加工速度下降，或者如果在玻璃板上观察到熔融聚合物的形成，请立即关闭研磨机，以防止聚合物颗粒过热和进一步熔化。 - 取出20目（840μm）输送管，并在完成第一批后将其替换为60目（250μm）输送管（图2b）。
- 将收集的材料重新引入磨料斗。对于 250 μm 铣削分数，请遵循步骤 1.1 和 1.7。
- 将收集的250μm馏分重新加热至三次。
- 回收腔室中剩余的颗粒，并将它们添加到收集的主级分中。
2. 通过低温预处理和研磨加工塑料薄膜
- 从卷筒中取出薄膜试样，并用切纸机将试样切割成~120 mm（横向）x 20 mm（机器方向）的条带。
- 将片段（~1g）在800 mL去离子（DI）水中预浸在1000 mL玻璃烧杯中10分钟。该步骤通过预浸聚合物来改善后续低温冷却过程的脆化。
注意：戴上低温手套和安全眼镜，使用安全设备处理液氮。 - 缓慢向低温容器中加入200 mL液氮（N2）。
- 用钢镊子小心地将预浸泡的薄膜颗粒转移到低温容器中。在液体N2中预浸泡3分钟。
- 将冷冻的薄膜碎片转移到200 W的14速搅拌机中。
- 以3级的速度处理冷冻材料10秒，以破坏冷冻玻璃膜结构。为了促进进一步减少尺寸，加入400 mL去离子水，并将薄膜水浆混合5分钟。
- 将浆料转移到带有过滤器（1μm网）的Büchner漏斗中，并施加真空至少1小时。
- 在30°C下真空干燥固体颗粒在铝皿中至少48小时。
- 用镊子将干燥的颗粒送入磨机中。对于铣削，请遵循步骤 1.1-1.11。
3. 通过环境老化和铣削预处理的塑料薄膜的加工
- 将从现场回收的塑料薄膜碎片铺在光滑的表面（实验室工作台）上。用软毛刷小心地去除吸收的土壤颗粒和植物残留物。
- 用剪刀将薄膜切成约4厘米2 个〜1.0 g的样品。
- 将薄膜片段加入装有 500 mL 去离子水的 1000 mL 烧杯中。用20毫米搅拌棒以300 min-1的速率搅拌1小时。
- 通过在烧杯轻微搅拌下倾析和重新引入去离子水到水槽或塑料桶中来去除溶解的土壤颗粒。重复此步骤三次。连续搅拌可使土壤颗粒分散在水中，并且更容易倾倒。
- 将样品从烧杯转移到铝制培养皿中。将塑料样品风干12小时，然后在真空烘箱中转移并在30°C下干燥24小时。 对于铣削，请遵循步骤 1.1-1.11。
4. 通过级联筛分筛进行筛分程序
- 从底部的平底锅开始堆叠筛子（直径3英寸），然后是最细的筛子（#325; 45μm），然后是越来越粗的筛子（例如#140; 106μm和#60; 250μm，其中#20; 840μm筛是最粗糙的），并将盖子放在顶部。
- 通过在摇床的开口处插入四个销钉，将所有四个筛子安装在摇床上。
- 将步骤1、2或3中收集的单个馏分转移到四个级联筛的顶部。以 300 分钟-1 摇晃 10 分钟。
- 单独回收较大的（顶部）馏分，这将进行进一步的研磨。
注：根据需要调整摇床上的摇动速度。或者，也可以用手摇筛。一次只使用一个筛子，从网状#20筛开始：用手将底部和盖子牢牢地放在筛子上，轴向和水平摇动5分钟。 - 按照步骤1.6-1.10所述，将 dp >106μm的筛分颗粒重新引入旋转切割机。
- 从锅中回收底部部分，并将颗粒重新引入下一个较小的筛子尺寸。重复该过程，直到106μm颗粒代表主要部分。
- 合并收集的106μm馏分并将颗粒储存在干燥区域（干燥器或空气密封塑料袋）中。
注意：45 μm分数是106 μm分数的一部分;然而，由于产量通常非常低，因此没有分离和单独分析前一部分。单个馏分的产量回收率和粒度分数可以通过使用高精度微量天平对每个筛分（目数#20 - 目#325）与初始进料馏分的重量测量（以重量%为单位）来确定。
5. 湿法研磨用NP水性浆料的制备
- 通过将800 mL蒸馏水加入1000 mL玻璃烧杯并插入搅拌棒（直径= 8 mm，长度= 50.8 mm）来制备分散在去离子水中的MP浆料。
- 将步骤1，2，3或4中的106μm塑料部分中的8g引入去离子水中，产生1 wt%的浆料。
- 将玻璃烧杯放在搅拌板上，以磁性方式搅拌24小时，400分钟-1 ，将颗粒浸泡在水中以促进颗粒软化。
- 将颗粒转移到1000 mL塑料容器中。
- 用去离子水填充另外两个1000 mL塑料容器，用于在研磨过程中冲洗掉研磨机料斗上的粘附颗粒。
6. NP生产湿法研磨机的准备
- 将46粒尺寸（磨石砂砾= 297-420μm）的石头放入湿摩擦研磨机中，并用17毫米扳手将中心螺母手紧固定。
- 将料斗加到顶部，并用 17 mm 扳手固定三个螺母和螺栓。
- 将一个1 L塑料收集罐放在对撞机的出口下。在出口旁边放置第二个空的1 L桶，用于在处理时进行交换。
- 将压力表间隙调整为+ 1.0，对应于从零位置开始的正0.10μm位移。
- 打开电源，小心地顺时针转动调节轮，直到听到磨石的触摸。然后，将柔性测量环调整为零，并立即逆时针转动车轮。默认情况下，速度调整为 1500 min-1。
注意：避免对宝石进行“干磨”，因为这会在磨石上产生过热。 - 顺时针转动调节轮，直到石头接触，然后轻轻地将水NP浆料填充到料斗中。将间隙连续减小到-2.0的间隙规，对应于引入浆料后从零位置的负0.20μm偏移。两个石盘之间的塑料颗粒水浆促进了从MP到NP的转化，并避免了磨石之间的直接摩擦。
- 一旦桶中的填充水平超过0.5 L，通过交换收集桶来收集浆料。
- 收集并将颗粒重新引入研磨机30-60次;更高的通过（重新引入的次数）导致更小的颗粒尺寸。
- 用制备的DI水瓶洗涤吸附在料斗上的粘附颗粒，以允许在加工时进行适当的浆料混合。
注意：通过在出口流中容纳20 mL玻璃瓶，可以在此过程中收集中间样品。各个步骤将在过程严重性（通过次数）增加时评估颗粒破碎机制。回收浆料并在25°C下以400分钟-1 搅拌4小时，以充分混合;让浆料静置48小时以使其稳定。
7. 从浆料中回收和干燥 NPs
- 如果通过将浆料缓慢倒入另外1000 mL玻璃烧杯中观察到浆料中的多层，则分离底部级分（或具有最高NP浓度的相）。
- 将馏分转移到离心小瓶（50mL）中并离心10分钟（相对离心力[RCF] = 20×102 g）。RCF（也称为g力）是产生的径向力，作为转子半径和转子速度的函数，这导致较重的颗粒和浆料的水的分离。
- 将透明顶层倒入单独的铝锅中，将其取出。
- 将剩余的底层（含有NP浆料）转移到额外的铝皿中，并将其置于30°C的真空烘箱中48小时。
- 戴着呼吸面罩，用刮刀在通风橱或手套箱下回收干燥的材料。将干燥的内容物转移到100 mL玻璃容器中并用盖子密封。
- 将NPS装在小瓶中，并将其储存在密闭，干燥和阴凉的地方（例如，干燥器）。
注：在制造过程中释放到环境中的MNP（这里，无论是在湿磨过程中还是作为干燥颗粒）都可能对水生和陆地生态系统构成严重威胁。特别是，监管措施旨在最大限度地降低其生产和使用工程纳米材料的风险30。因此，MNPs的形成需要特定的预防措施，例如在通风橱或手套箱中处理材料。此外，在NPs分离过程中形成的水性废物溶液（步骤6.7-6.9）将受到环境健康和安全部执行的报废处置程序。
8. 通过 立体显微镜进行 MP 成像
- 将〜20mg颗粒（在步骤4中收集）分散在约4厘米2的表面表面上。在深色表面上展开白色或半透明 MP，在白色背景（纸张）上展开黑色或深色 MP，以最大限度地提高背景对比度。
- 将显微镜调整到最低放大倍率以捕获最大可能的区域（粒子区域的中间）。接下来，将外部灯引导到焦点中心，以获得对感兴趣区域的照明。
- 应用放大倍率，允许在视野中间检测>50个粒子。建议使用此量以获得可靠的统计评估结果。
- 专注于没有或有轻微颗粒重叠和良好色彩对比度的区域。
- 通过聚焦外部粒子形状来捕获至少五个代表性图像。用于映像的本地计算机将高分辨率图像保存为软件中的位图。
- 将立体显微镜记录的图像保存为ImageJ识别的文件格式（位图，tiff或jpeg），以进行以下定量数据分析。
注：使用标尺或图像中记录的任何其他参考对象以精确放大倍率设置拍摄主图像时拍摄一张参考图像。此过程允许在通过ImageJ软件准备和分析时轻松校准图像。
9. 通过图像J进行图像分析
- 打开ImageJ软件31 ，通过输入（CTRL + L）打开 命令查找器来准备文件导入。接下来，在右下角输入生物格式 。此功能激活菜单路径 文件>导入>生物格式 （>是指软件中的导航步骤）。搜索存储的图像文件的目录。
注意：如果生物格式包未出现在 命令查找器中，请在 生物格式 ImageJ 下在线搜索。按照说明下载和安装 ImageJ。生物格式导入器允许在ImageJ中导入/导出图片文件和搜索命令的简单处理。 - 通过单击“文件”（文件>打开）打开图像（或者步骤 9.1 中所述的生物格式导入），>步骤 4.7 中收集的文件位置 处选择粒子图像 ，以及步骤 1.6 中描述的标尺参考图像。建议通过单击 Shift + 命令 + D 创建复制图像，以便在调整复制图像的阈值设置的同时与原始图像进行比较。
注意： 文件>打开 “命令将打开 ImageJ 本身支持的各种格式，如步骤 8.7 中所述。或者，选择计算机上的图像位置，然后将文件拖放到 ImageJ 主窗口状态栏上。图像文件将在单独的窗口中自动打开。 - 分别使用 CTRL + 和 CTRL -放大和缩小图像。
- 通过单击“ 分析”>“设置度量值”来设置度量值，然后选择“ 面积 ”和 “形状描述符 ”作为默认值。
- 定义比例尺，方法是使用标尺参考图像在比例尺的长度上绘制一条直线，如步骤 8 中所述。按 分析>设置比例“，然后在 ”已知距离“下输入条形长度的数值和相应长度的单位。
- 通过单击“ 分析”>工具“>比例尺”来可视化图像上的比例尺，并调整设置，例如在图像上显示清晰的对比度。在图像上选择一个位置，以便为比例尺设置放置比例尺。选择“ 宽度 ”以校准单位调整条形图、“条 形图的高度 （以像素为单位）”和“比例尺标签的 字体大小” 。选择“ 背景 ”以调整标签文本框的填充颜色。
注意：对于千分尺，μm的输入就足够了;程序在数据输出中自动调整μm。 - 通过将图像转换为 8 位图像 >类型> 8 位图像。
- 通过将“映像”> “类型”> 8 位，将复制的图像转换为 8 位。
- 通过选择“ 图像”>“调整>阈值”>设置 “进行调整（与原始图像的大小进行比较）。
- 通过选择“ 分析”>“设置测量值”来确定要执行的测量值。
- 选择分析粒子> 0-无穷远，单击显示结果，然后原位显示。
- 将 ROI（.zip）结果存储在“保存测量值”和“选择文件夹”下。
- 在“文件”>“ 另存为”>“选择文件夹”下保存结果（*.csv）。
10. 电子表格软件中的粒径（dp）和形状因子计算
注意：了解颗粒直径和形状因素对于颗粒在环境中的行为（命运，运输）和表面积的确定至关重要。因此，当MP用于环境研究时，几何学是必不可少的。例如，根据国会议员的大小和形状，观察到与土壤的不同相互作用机制，例如MP-MP和MP-土壤团聚，它们会影响土壤中的颗粒运动15，32。因此，建议通过以下步骤来确定 dp-粒径 分布和几何参数。
- 将从ImageJ分析（步骤9.13）中获得并保存的相应*.csv文件导入电子表格软件。
注：每列行中的数值反映了根据 等式 1 和等式 2 对每个粒子进行的独立计算。 - 通过在每列底部输入 = 平均值 （x，y），评估平均形状参数值，如圆度 （CIR） 和纵横比 （AR），其中 x 表示列的第一行和 y 的最后一行，然后按 Enter。CIR值描述了投影面积与单个粒子的CIR = 1（等式1）的完美圆之间的关系。AR表示 等式2描述的粒子长/宽比。
- 确定平均AR是否<2.5，然后使用等式3在新列中计算dp值。如果 AR ≥ 2.5，则计算反映等式 4 的 dp 值。添加一个新列以根据从 ImageJ 输出接收的面积列计算 dp。
注意：选择 AR 阈值≥ 2.5 表示更多的矩形颗粒，而 AR < 2.5 则反映更多的圆形颗粒。这种选择可以最大限度地减少从显微镜测量的面积得出的 dp 计算误差，并通过ImageJ确定。
（1）
(2)
(3)
(4)
11. 国会议员和NP的统计分析
- 使用统计软件打开*.csv数据文件 ，方法是文件>打开>选择 在步骤9.13中创建的相应文件的文件位置。
注意：或者，表格可以通过 复制粘贴 功能直接传输到统计软件中。请参阅 材料表 ，了解统计软件的品牌和版本 编辑> 粘贴 列名称。 - 通过选择分析>分布来评估 dp 数据。
- 选择反映列数据的 dp，拖放到 Y 列中，然后按 OK 按钮。此功能将创建一个直方图，其中包含统计输出，其中包括汇总统计数据、平均值和标准开发值。
- 通过选择 dp 旁边的三角形>连续拟合，评估直方图是否遵循正态分布（或 d p 的最佳拟合曲线），然后选择作为最佳拟合曲线接收的曲线（例如，拟合法线）。此步骤将直方图与正态分布拟合叠加。
- 根据圆度 （Cir）、长宽比 （AR）、圆度（圆形）和实度 （Sol） 的平均形状参数值的汇总统计输出，确定并报告平均值和标准偏差值。
注：建议的统计显著性水平为α = 0.05，并已用于所有评价。显著性水平是在比较数值结果时否定原假设的概率。
12. dp 尺寸分布和颗粒形状因子的最佳拟合
- 将数据集加载到统计软件中，并使用步骤10中计算的相同的*.csv数据集来分布 dp 。
- 选择“分析>可靠性和生存>寿命分布”。
- 将 dp 列 拖到 “Y”、“事件发生时间” 字段中，然后选择“ 确定”。此功能创建一个输出，其概率图作为 dp 的函数。
- 通过选中非参数、对数正态、Weibull、逻辑和正态，确定“比较分布”下的最佳分布。
- 通过图表下方统计模型 比较表中 的 Akaike 和贝叶斯信息标准（分别为 AIC 和 BIC）的最低数值，按最低的 BIC 数字评估模型的质量拟合。默认情况下，最佳拟合模型显示在第一行中。每个分布评估的参数化或非参数估计输出字段位于 “比较分布” 图下方。
- 通过将“将脚本保存到数据表”选择左上角的红色下拉三角形 ，将输出脚本保存到数据表>。接下来，通过选择“ 文件 ” >另存为> *.jmp，将原始数据表保存在所需的文件位置。
13. 通过动态光散射对NP进行尺寸表征
- 通过双击桌面图标启动动态光散射 （DLS） 软件。选择“文件>”新建> SOP“。在DLS软件的“样品设置”下，将样品名称并选择材料折射率，蒸馏水为1.33，聚合物33为1.59。在下拉菜单中选择材料，然后单击确定。
注：单击下拉菜单可打开 “材料管理器”，该管理器可通过更改 折射率 和 吸收来添加新样品或修改现有样品。选择 水作为分散剂。 - 在“ 单元格>单元格类型 ”下选择适当的单元格，然后选择“ 报告 ”以确定每次测量后将显示哪个输出。
- 通过合上仪器盖启动仪器，然后合上盖子（如果打开）并按 ON 按钮打开 系统。在第一声蜂鸣音后等待，等待约30分钟，以使光束稳定。
- 等到初始化例程完成，然后等待第二声蜂鸣音，表示已达到预设温度（通常为25°C）。
- 通过磁力搅拌〜1小时以〜1小时浓度在15 mL小瓶中制备NPS样品浆液（如步骤7中接收的）和DI水，使其充分混合。
- 在将~1.0 mL转入4.5 mL石英比色皿中并打开盖子之前，摇动浆料。然后，小心地将样品池插入DLS仪器的样品架中。
注意：从同一浆料批次中以步骤13.5中所述的相同浓度制备三个样品。 - 对每个样品进行三次测量（在DLS软件中选择）。在两次测量之间，取出样品池并轻轻摇动样品5秒，以允许样品混合。
- 通过DLS软件提取和导出数据，将数据集传输到电子表格软件中，并为MP和NP创建直方图，如步骤11.1-11.5中所述（图1）。通过选择“编辑-复制”从“记录视图”选项卡复制表格或图形，这可以粘贴到其他应用程序（如电子表格软件）中。
14. 使用傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱衰减全反射率 （ATR） 对 MNP 进行化学分析
注：通过傅里叶变换红外（FTIR）和核磁共振（NMR）光谱对MNP进行化学分析是评估湿法研磨对化学键合性能的影响以及主要成分和聚合物单体成分的相对量（分别为10）的合适工具。此外，MNPs聚合物成分的热性能和稳定性可以分别通过差示扫描量热法（DSC）和热重分析（TGA）来评估，29.
- 用乙醇和不起毛的布清洁检测系统（ATR晶体表面）。
- 启动软件并按命令栏中 的“背景”按钮 ，通过清除仪器光束路径在空中执行 背景扫描 。背景光谱在收集后不久显示。
- 在仪器设置工具栏中输入样品 ID 和 样品描述 。
- 在4000 cm-1 和600 cm-1 之间调整光谱波数，并在吸光度模式下选择2.0 cm-1 的分辨率。 选择每个光谱32次扫描 并开始。
- 将塑料样品（~20mg或〜1-3mm 3）的MPS（106μm）和NP（〜300nm）放在内径为〜10mm或等效物的钢垫圈内，放在晶体表面上。
注意：当样品架压缩样品时，垫圈可防止晶体上的色散，从而导致材料不均匀性和由于测量不一致而导致的数据偏差。 - 将垫圈放在ATR晶体的中心，并用刮刀将聚合物样品加入垫圈开口的中间。
- 将上方的样品杆摆动到样品中心，并通过监测力计力在50-90之间顺时针旋转旋钮。该样品显示了初步光谱。再次按“ 扫描 ”按钮以收集频谱。
- 通过单击“ 扫描 ”按钮收集8-10个光谱，并在每次测量后用刮刀仔细混合样品，以便收集代表性结果。
- 单击数据资源管理器中的“示例视图”文件夹，以显示叠加在查看区域中的所有收集的示例。首先，删除表示异常值的明显偏差光谱。接下来，在工具栏中选择“吸光度”或“透射率”模式。
- 通过选择包含光谱的“ 样品视图 ”文件夹并从文件菜单中选择 “另存为” 来保存光谱。 对话框窗口 启用所有光谱的文件名、目标目录和默认位置更改。
注意：或者，可以通过选择频谱并右键单击以显示二进制选项，将光谱另存为 *.sp 文件。选择“保存二进制文件”并浏览最终的“保存位置”。 - 通过在数据资源管理器中选择单个频谱来执行基线校正和均值归一化，方法是通过软件或在下一步中选择菜单中的“处理>规范化”。
注意：平均归一化可补偿由于样品中的厚度或材料变化而导致的光谱误差。 - 数据收集完成后，用乙醇和无绒布清洁晶体区域。
- 根据在之前的出版物10 中分配和评估的指定 FTIR 振动带解释 MP 和 NP 之间的差异。
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Representative Results
为了验证实验程序方法和分析，从颗粒和薄膜材料中形成MP和NP，并使用微观图像按尺寸和形状进行比较。 图1 中描述的方法从可生物降解的塑料颗粒和薄膜中有效地形成MP和NP;这是通过低温冷却、铣削、湿磨和表征实现的。对于环境风化的电影来说，前一步是不必要的，因为风化会引起脆化（Astner等人，未发表）。颗粒也直接进行研磨，无需低温预处理。研磨后，通过筛分将颗粒分馏成四种尺寸的馏分：840μm，250μm，106μm和45μm，如协议步骤4中所述。后三部分仅由国会议员组成。随后，通过使用ImageJ软件确定收集的立体显微镜图像的尺寸 （dp） 和形状因子（即圆度和长宽比）的分布来评估每个级分的颗粒表征，如步骤8.1-8.6所示。图中显示了PBAT颗粒的106μm筛分部分（图3a，c）和250μm筛分，以及用低温曝光处理的未风湿PBAT薄膜（图3b，d）的立体显微镜获得的图像示例。
颗粒尺寸的统计分析表明，PBAT颗粒的平均dp比标称筛尺寸（106μm）小41μm，PBAT薄膜（250μm公称尺寸）小137μm，这表明较小的筛分代表更均匀的粒度分布（表1）。与薄膜材料相比，加工颗粒的圆度值较大，长宽比较低（表明更多的圆形颗粒），这一观察结果也得到了证实，这可能归因于起始材料的不同性质（密度）。正态分布是描述两种馏分粒度分布的最佳模型。然而，为了确定圆度和纵横比，Weibull和对数正态模型是最优的（图4a-d;表 1）。对于这两种原料，对106 μm MP筛分进行湿法研磨工艺形成NPs，并通过DLS测量其粒度分布。数值分析揭示了由两种原料生产的NP的双峰粒径分布（图5）。PBAT颗粒中NP的主要颗粒群在~80 nm和531 nm， 相应的数密度频率（NDF）值分别为25%和5%。另一方面，从PBAT薄膜中提取的NP在~50 nm和106 nm处具有最大尺寸，相应的NDF值分别为11%和10%。观察结果表明，来自PBAT颗粒的NP产生比PBAT薄膜更均匀的dp值（〜50-110nm）;然而，在300nm和700nm之间的颗粒亚群，最大值在531nm处，也共存（图5）。
通过FITR光谱法评估了PBAT薄膜的化学键合性能。光谱仅显示，在1300至700 cm-1区域，由于MP的铣削和NP的湿磨，只有微小的变化。然而，观察到淀粉的C-O拉伸显着降低，反映了淀粉组分10的吸光度，对于覆盖膜。然而，在1800 cm-1和1230 cm-1之间，观察到代表PBAT的条带（例如C-H 和C-O拉伸）的微小变化，表明由于湿磨过程，聚酯的结构发生了微小变化（图6）。
图1：形成和表征微塑料和纳米塑料的流程图。 该表示显示了形成过程以及随后的几何和化学颗粒评估。通过将立体显微镜和图像分析（ImageJ）相结合，然后进行数值统计分析来确定几何性质。化学表征，如分子键合，通过使用衰减全反射（FTIR-ATR）的傅里叶变换红外光谱法进行。聚合物的分子结构可以通过核磁共振（NMR）光谱作为补充方法进行评估（本研究未描述）。对于每个步骤，以下过程中突出显示了关键点。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：旋转切割机设备。 （a）旋转磨机组件的图像，包括进料斗，前玻璃板和筛槽;（b） 将筛网尺寸为#20（840μm）和#60（250μm）的单个输送管安装到从粗筛开始的磨机筛槽中;（c）双层玻璃前板附着在研磨室的前部。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：微塑料 （MP） 的立体显微照片，包括软件处理的图像。 这些图像来自（a）PBAT颗粒（106μm筛分）和（b）PBAT薄膜（250μm筛分），通过低温暴露和机械研磨制备。选择黑色背景对白色PBAT颗粒（a）进行成像，为黑色PBAT胶片（b）选择白色背景。相应的图像分别由图像J软件31 （c）和（d）处理。dp分布的最佳拟合模型，在从（e）PBAT颗粒和（f）PBAT薄膜的立体图导出的颗粒直方图中描绘，由正态分布表示。误差线反映一个标准偏差。立体显微镜收集了带有集成摄像头的立体显微仪。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：具有叠加最佳曲线拟合的粒子形状因子分布直方图。 该图像代表MP：（a）PBAT颗粒的圆度和（c）长宽比以及（b）PBAT薄膜的圆度和（d）长宽比，基于ImageJ分析31。立体显微仪基于 PBAT 颗粒（106 μm）和 PBAT BDM MP（250 μm）的两个筛分组分颗粒。在统计软件V 15中进行数值分析。立体图和直方图表示相应的图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：NPs 的粒度 （dp） 直方图。 该图表示从PBAT薄膜和PBAT颗粒衍生的颗粒分布，这些颗粒是由106μm MP筛分的湿磨处理形成的。曲线表示使用统计软件进行的双参数 Weibull 模型拟合到尺寸分布。使用动态光散射进行数据测量。 请点击此处查看此图的大图。
图 6.不同加工步骤之间MNP的代表性FTIR光谱比较。 该图描述了 PBAT 薄膜、PBAT-MP 和 PBAT-NP 的初始条件之间的比较。PBAT薄膜在机械研磨之前经过低温处理，由干磨塑料的106μm筛分组成;NPs 是通过 干磨和筛分后对106μm筛分MP进行湿法研磨来生产的。光谱数据是使用装有金刚石衰减全反射（ATR）附件的光谱仪收集的。使用FTIR频谱分析软件进行光谱数据分析。 请点击此处查看此图的大图。
| 颗粒 | 断续器薄膜 | |
| 筛分分数，μm | 106 | 250 |
| 正常 dp， μm | 65 | 113 |
| Std Dev， μm | 24 | 58 |
| 圆 | 0.68 | 0.47 |
| 纵横比 | 1.73 | 2.33 |
| 最佳拟合度，dp | 正常 | 正常 |
| 最佳贴合度，圆度 | 威布尔 | 威布尔 |
| 最佳贴合度，宽高比 | 对数 | 对数 |
| N | 83 | 125 |
表1：代表性的粒径和形状参数。结果来自图 3 和 图4中描述的PBAT颗粒和PBAT薄膜处理的MP的统计分析。
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Discussion
该方法描述了最初在先前出版物29中描述的有效过程，以制备来自颗粒和覆盖膜的MNP用于环境研究。尺寸减小过程涉及低温冷却（仅适用于薄膜）、干磨和湿磨阶段，以制造模型MNP。我们已经应用这种方法从各种聚合物原料中制备MNP，包括低密度聚乙烯（LDPE），聚丁酸己二酸酯 - 共对苯二甲酸酯（PBAT）和聚乳酸（PLA）29 （Astner等人，手稿正在准备中）。然而，对于LDPE，只有颗粒可以作为原料;地膜不能被加工，因为在其挤出过程中掺入了增强网格到膜中，如先前的出版物29中所述。
协议中的关键步骤涉及a）低温预处理，提供一般柔性薄膜的脆化，b）碾磨以模拟通过农业实践（犁地，耕作）的机械冲击，以及c）湿磨，模仿MP-土壤碰撞之间的环境剪切事件。通过这种方法形成的MNP比聚苯乙烯微球和纳米球更有可能代表农业土壤中发生的颗粒。然而，后者经常被用作环境研究中的工程模型材料，研究对土壤微生物群落的影响34，35，36，植物37和土壤动物群落38。
各种方法已经产生了替代NP，包括使用旋转和球磨机39，40，41，42的低温研磨和研磨。此外，经常使用与液氮相结合的研磨来形成MNP40，41，42，43，44，45。相比之下，超速离心干磨程序（无低温处理）与湿球磨相结合，分别用于产生MP和NP39。相比之下，本文中描述的方法使用低温浸泡 - 混合 - 研磨 - 研磨的廉价组合从塑料薄膜中产生MNP，以模拟环境影响，例如风化和机械剪切力。因此，最近的一项研究比较了低温形成的环境风化农用塑料薄膜之间的机械和化学性质变化。结果显示，所形成的MNP的几何特征，物理化学性质和生物降解性存在统计学上的显着差异（Astner等人，未发表）。
机械低温研磨方法的局限性是，在第一次研磨后，<840μm的馏分的筛分（~10 wt%）筛分收率相对较低，这需要两次以上的步骤，与>840μm29的较大分数相比，加工时间更长。由于46μm馏分的产率在1至2重量%之间，因此106μm的颗粒级分用于湿法研磨程序以形成NP。此外，在碾磨过程中的摩擦可导致加工室过热，这导致在碾磨过程中颗粒或薄膜碎片的团聚和热降解，如其它研究29，46中所述。本文中描述的低温研磨方法的另一个限制是用于塑料的应用有限，例如具有较差热性能（即低玻璃化转变温度）的LDPE薄膜或PBS颗粒。由于LDPE薄膜的纤维结构，以前的塑料不可能粉碎。此外，后者堵塞了磨机，因为机械剪切增加了铣削室中的温度。相比之下，LDPE颗粒很容易通过研磨进行加工，而无需使用低温冷却。对MP的dps的比较显示，250μm分数与标称筛孔尺寸的偏差大于106μm dp分数。然而，两个筛分都遵循单分散正态分布（图3e，f和表1），这表明薄膜或颗粒原料的分解机制相似。相比之下，NP尺寸分析导致PBAT薄膜的双峰分布，类似于先前的出版物29，以及PBAT颗粒在50nm和107nm处具有代表性的尺寸分布峰。然而，颗粒分布数据在80 nm和531 nm左右显示出峰值，表明分解发生的频率不如薄膜均匀。先前建立的方法的意义在于低温预处理，铣削和湿法研磨等加工步骤的高效和廉价组合。本研究中PBAT薄膜NP的粒径分布与对可生物降解塑料29的NP形成进行的初步研究相似，其特征在于双峰分布，颗粒亚群在〜50nm和〜200nm处达到峰值;然而，后者导致颗粒略小（106nm），如图5所示，基于本研究中较高的通过次数（60），而Astner等人之前执行的27次通过。29. 本研究表明，PBAT薄膜产生的NP形成遵循初步研究结果。
该方法稳健性的进一步证明是，化学成分没有由于低温处理，研磨和湿法研磨而发生显着变化（图6）。此外，原料之间的差异，如颗粒与薄膜（粒度分布），平均dp或形状参数没有显着差异（图3和图4）。环境分散的MNP及其对陆生生物47，48和海洋生物群49，50的生态毒性影响已被广泛报道。然而，虽然土壤是MNP易位、退化和生物蓄积的最突出的全球环境储库，但这些材料缺乏强大而统一的分析方法，导致陆地生态系统中MP和NP的关键风险评估知识差距51.因此，该方法的未来应用可能涉及制备和表征用于农业聚合物薄膜的新开发的塑料材料的MNP（例如，PBAT与木质素的组合），以在市场引入之前评估MNP的环境命运和生态毒性。因此，该协议可以作为环境研究的标准化协议，用于通过低温研磨产生MP，通过湿法研磨产生NP，并对所得MNP进行尺寸和化学表征。此外，衍生颗粒可用于环境研究，例如陆地和海洋环境中的命运，生态毒性，运输和生物降解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由赫伯特农业学院，生物系统工程和土壤系以及田纳西大学诺克斯维尔分校的科学联盟资助。此外，作者非常感谢通过美国农业部拨款2020-67019-31167为这项研究提供的财务支持。用于制备基于PBAT的可生物降解地膜MNP的初始原料由BioBag美洲公司（美国佛罗里达州杜尼文）和莫比乌斯有限责任公司（田纳西州勒努瓦市）提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum dish, 150 mL | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 08-732-103 | Drying of collected NPs |
| Aluminum dish, 500 mL | VWR International, Radnor, PA, USA | 25433-018 | Collecting NPs after wet-grinding |
| Centrifuge | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Centrific 228 | Container for centrifugation |
| Delivery tube, #20, 840 µm | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383M30 | Sieving of the first fraction during milling |
| Delivery tube, #60, 250 µm | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383M45 | Sieving of the second fraction (3x) during milling |
| Thermomixer, 5350 Mixer | Eppendorf North America, Enfield, CT, USA | 05-400-200 | Analysis of sieving experiments |
| FT-IR Spectrum Two, spectrometer with attenuated total reflectance (ATR) | Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | L1050228 | Measuring FTIR spectra |
| Glass beaker, 1000 mL | DWK Life Sciences, Milville, NJ, USA | 02-555-113 | Stirring of MPs-water slurry before grinding |
| Glass front plate | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383N55 | Front cover plaste for Wiley Mini Mill |
| Glass jar, 50 mL | Uline, Pleasant Prairie, WI, USA | S-15846P | Collective MPs after milling |
| Glove Box, neoprene | Bel-Art-SP Scienceware, Wayne, NJ, USA | BEL-H500290000 | 22-Inch, Size 10 |
| Zetasizer Nano ZS 90 size analyzer | Malvern Panalytical, Worcestershire, UK | Zetasizer Nano ZS | Measuring nanoplastics dispersed in DI-water |
| Microscope camera | Nikon, Tokyo, 108-6290, Japan | Nikon Digital Sight 10 | Combined with Olympus microscope to receive digital images |
| Microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | Model SZ 61 | Imaging of MPs |
| Nitrogen jar, low form dewar flasks | Cole-Palmer, Vernon Hills, IL, USA | UX-03771-23 | Storage of liquid nitrogen during cryogenic cooling |
| Accurate Blend 200, 12-speed blender | Oster, Boca Raton, FL, USA | 6684 | Initiating the size reduction of cryogenically treated plastic film |
| PBAT film, - BioAgri™ (Mater-Bi®) | BioBag Americas, Inc, Dunedin, FL, USA | 0.7 mm thick | Feedstock to form MPs and NPs, agricultural mulch film |
| PBAT pellets | Mobius, LLC, Lenoir City, TN, USA | Diameter 3 mm | Feedstock to form microplastics (MPs) and nanoplastics (NPs) trough milling and grinding |
| Plastic centrifuge tubes, 50 mL | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 06-443-18 | Centrifugation of slurry after wet-grinding |
| Plastic jar, 1000 mL, pre-cleaned, straight sided | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 05-719-733 | Collection of NPs during and after wet grinding |
| Polygon stir bars, diameterø=8 mm, length=50.8 mm | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14-512-127 | Stirring of MPs slurry prior to wet-grinding |
| Scissors, titanium bonded | Westcott, Shelton, CT, USA | 13901 | Cutting of initial PBAT film feedstocks |
| Square glass cell with square aperture and cap, 12 mm O.D. | Malvern Panalytical, Worcestershire, UK | PCS1115 | Measuring of NPs particle size |
| Stainless steel bottom, 3 inch, pan | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 8401 | For sieving after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 140 (106 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1308 | For sieving after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 20 (850 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1296 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 325 (45 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1313 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 60 (250 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1303 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel top cover, 3 inch | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 8406 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel tweezers | Global Industrial, Port Washington, NY, USA | T9FB2264892 | Transferring of frozen film particles from jar into blender |
| Vacuum oven, model 281A | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 13-262-50 | Vacuum oven to dry NPs after wet-grinding |
| Friction grinding machine, Supermass Colloider | Masuko Sangyo, Tokyo, Japan | MKCA6-2J | Grinding machine to form NPs from MPs |
| Wet-grinding stone, grit size: 297 μm -420 μm | Masuko Sangyo, Tokyo, Japan | MKE6-46DD | Grinding stone to form NPs from MPs |
| Wiley Mini Mill, rotary cutting mill | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | NC1346618 | Size reduction of pellets and film into MPs and NPs |
| Software | |||
| FTIR-Spectroscopy software | Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | Spectrum 10 | Collection of spectra from the initial plastic, MPs and NPs |
| Image J, image processing program | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.53n | Analysis of digital images received from microscopy |
| Microscope software, ds-fi1 software | Malvern Panalytical , Malvern, UK | Firmware DS-U1 Ver3.10 | Recording of digital images |
| Microsoft, Windows, Excel 365, spreadsheet software | Microsoft, Redmond, WA, USA | Office 365 | Calculating the average particle size and creating FTIR spectra images |
| JMP software, statistical software | SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2021 | Version 15 | Statistical analysis of particle size and perform best fit of data set |
| Unscrambler software | Camo Analytics, Oslo, Norway | Version 9.2 | Normalizing and converting FTIR spectra into .csv fromat |
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