Summary
我々は、メカニカルミリング、研削、およびイメージング分析の段階的なプロセスを使用して、マイクロプラスチックおよびナノプラスチック(それぞれMPおよびNP)の形成および寸法特性評価を示す。
Abstract
農業生態系に分散しているマイクロプラスチック(MPs)とナノプラスチック(NP)は、土壌や近くの水路の生物相に深刻な脅威をもたらす可能性があります。さらに、NPによって吸着された農薬などの化学物質は、土壌生物に害を及ぼし、食物連鎖に入る可能性があります。この文脈では、プラスチックマルチフィルムなどの農業利用プラスチックは、農業生態系におけるプラスチック汚染に大きく寄与する。しかし、運命と生態毒性に関するほとんどの基礎的研究は、ポリスチレンミクロスフェアなどの理想化された、あまり代表性の低いMP材料を採用している。
したがって、本明細書に記載されるように、我々は、そのような研究のために代表的なMPおよびNPを機械的に形成するためのラボ規模のマルチステップ手順を開発した。プラスチック材料は、極低温処理(CRYO)または環境風化(W)のいずれかによって脆化したポリ酪酸アジピン酸 - コテレフタレート(PBAT)の市販のプラスチックマルチフィルム、および未処理のPBATペレットから調製した。次いで、プラスチック材料をメカニカルミリングによって処理し、風力および機械機械によるプラスチック破片の摩耗を模倣して、46〜840μmのサイズのMPを形成した。その後、MPsをいくつかのサイズ画分にふるい分けて、さらなる分析を可能にしました。最後に、106μmのふるい画分を湿式粉砕に供して、陸上MPsの遅いサイズ縮小プロセスを模倣するプロセスである20〜900nmのNPを生成する。MPの寸法と形状は、実体顕微鏡写真の画像解析により決定し、動的光散乱(DLS)を用いてNPの粒径を評価した。全体として、このサイズ縮小方法は、農業特殊作物の生産に使用されるマルチ材料を表すポリブチレンアジペート - コテレフタレート(PBAT)などの生分解性プラスチックからなるMPおよびNPを形成するのに効率的であることが証明された。
Introduction
ここ数十年で、プラスチックの世界的な生産の急速な増加とプラスチック廃棄物の不適切な処分とリサイクルの欠如は、海洋および陸上生態系に影響を与えている環境汚染につながっています1,2,3。プラスチック材料は、現代の農業、特に野菜、小さな果物、その他の特殊作物を栽培するために不可欠です。マルチフィルム、トンネル被覆の高低、ドリップテープ、その他の用途としての使用は、作物の収量と品質を向上させ、生産コストを削減し、持続可能な農法を促進することを目的としています4,5。しかし、「プラスチック」の雇用拡大により、農業環境におけるプラスチック片の形成、流通、保持に関する懸念が生じています。耐用年数中の環境劣化による脆化によって引き起こされる連続的な断片化プロセスの後、より大きなプラスチック断片は、土壌中に持続するか、または水の流出および風を介して隣接する水路に移動するマイクロおよびナノプラスチック(MNP)を形成する6,7,8。太陽光による紫外線(UV)放射、水の機械的力、生物学的要因などの環境要因は、環境分散プラスチックのプラスチック脆化を引き起こし、より大きなプラスチック断片をマクロまたはメソプラスチック粒子に分解する9,10。さらなるデフラグは、マイクロプラスチック(MPs)およびナノプラスチック(NP)を形成し、平均サイズ(公称直径;dp)それぞれ1〜5000μmおよび1〜1000nmの11.しかし、NPの上限dp限界(すなわち、MPの下限)は普遍的に合意されておらず、いくつかの論文では、これは100nm12としてリストされている。
プラスチック廃棄物からのMNPは、土壌の健康と生態系サービスに対する新たな世界的な脅威となっています。MPsによる淡水からの重金属の吸着は、周囲の環境と比較して800倍の高濃度の重金属をもたらした13。さらに、水生生態系のMPは、光の浸透を変化させ、酸素枯渇を引き起こし、水生生物への浸透と蓄積を含む様々な生物相への付着を引き起こすことによって、複数のストレッサーおよび汚染物質をもたらす14。
最近の研究は、MNPsが微生物群集や植物を含む土壌地球化学と生物相に影響を与える可能性があることを示唆しています15,16,17。さらに、NPは食物網17、18、19、20を脅かしている。MNPは土壌中で垂直および水平輸送を容易に受けるため、農薬、可塑剤、微生物などの吸収された汚染物質を土壌を通って地下水や河川や小川などの水生生態系に運ぶことができます21,22,23,24。マルチフィルムなどの従来の農業用プラスチックはポリエチレン製で、使用後に畑から取り出して埋め立て処分する必要があります。しかし、不完全な除去は、土壌中の実質的なプラスチック破片の蓄積につながる9、25、26。あるいは、土壌生分解性プラスチックマルチ(BDM)は、使用後に土壌に耕され、そこで時間の経過とともに劣化するように設計されています。しかし、BDMは一時的に土壌中に持続し、徐々に分解され、MPsとNPに断片化します9,27。
現在の多くの環境生態毒性学的および運命的研究は、理想化された非代表的なMPおよびNPモデル材料を採用している。最も一般的に使用される代理MNPは、単分散ポリスチレンマイクロまたはナノスフィアであり、環境12,28に存在する実際のMNPを反映していない。その結果、代表的でない国会議員やNPを選ぶと、測定や結果が不正確になる可能性があります。陸生環境研究のための適切なモデルΜNPの欠如に基づいて、著者らは農業用プラスチックからそのようなモデルを準備することに動機づけられた。我々は以前、プラスチックペレットおよびフィルム材料の機械的粉砕および粉砕によるBDMおよびポリエチレンペレットからのMNPsの形成ならびにMNPsの寸法および分子特性について報告した29。現在の論文は、マルチフィルムやペレット化された原料など、すべての農業用プラスチックに広く適用できるMNPを調製するためのより詳細なプロトコルを提供しています(図1)。ここでは、一例として、農業用プラスチックを表すために生分解性ポリマーポリブチレンアジペートテレフタレート(PBAT)のマルチフィルムおよび球状ペレットを選択した。
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Protocol
1. 極低温前処理とフライス加工によるプラスチックペレットからのMPsの加工
注:この方法論は、この提示された研究29に使用されたのと同じ材料からなるPBATフィルムを使用して、他の場所に記載されている手順に基づいている。
- 約1gのポリマーペレットサンプルを計量し、50mLのガラス瓶に移す。
- 回転切断ミルの前のスロットに20メッシュ(840μm)のふるいを備えた「長方形の送達」チューブを置き、停止ピンに当たるまで送達チューブを持ち上げます。
- ガラス板をフライス盤の表面の上に置き、調整可能なクランプで固定します。次に、50 mLのガラス瓶をミル出口の下に置きます(図2)。
- スライド式サイドアームサポートをミル(右上側にあります)の前面ガラスの中央に置き、ローレットボルトで締め付けます。ミルの前面ガラスがしっかりと配置されていることを確認します(図2a)。
- ミル上部のホッパー漏斗を上部フライスチャンバーの開口部に挿入します。
- ラインコードを電源コンセントとプレスコードスイッチに差し込み、ミル運転を開始します。
メモ:詰まりを防ぐため、ミルの電源を入れて回転させた後に材料のみを供給してください。また、フライス加工手順全体を通して目と耳の保護具を着用してください。 - サンプルをホッパーにゆっくりと供給し(約10ペレット/分)、減速や詰まりを防ぎます。可聴ノイズが減少したら、次のバッチのペレット(〜10個)を追加します。ペレット(1g)を処理した後、コードスイッチを押してミル操作を約20分間停止して冷却します。木製のプランジャーを使用してサンプルを供給し、供給ホッパー内での粒子の排出と凝集を防ぎます。
警告: 最適な送り速度は、加工材料の種類によって異なります。切断チャンバ内の粒子摩擦により処理速度が低下した場合、またはガラス板上に溶融ポリマーの形成が観察された場合は、ポリマー粒子の過熱およびさらなる溶融を防ぐために、直ちにミルをオフにする。 - 20メッシュ(840μm)の送達管を取り外し、最初のバッチの完了時に60メッシュ(250μm)の送達管と交換します(図2b)。
- 回収した材料をミルホッパーに再導入します。ステップ 1.1 および 1.7 に従って、250 μm の粉砕分画を取得します。
- 収集した250μm画分を最大3回まで再供給する。
- チャンバー内の残りの粒子を回収し、収集したメインフラクションに追加します。
2. 極低温前処理とフライス加工によるプラスチックフィルムの加工
- ロールからフィルム試料を取り出し、ペーパーカッターで約120mm(交差方向)x 20mm(機械方向)の短冊状に切断する。
- 1000 mLのガラスビーカーに800 mLの脱イオン(DI)水に断片(〜1 g)を10分間浸します。このステップは、ポリマーを予め浸漬することによって、その後の極低温冷却手順のための脆化を改善する。
警告: 液体窒素は、極低温手袋と安全メガネを着用して、安全装置で取り扱います。 - 200mLの液体窒素(N2)を極低温容器にゆっくりと加える。
- 予め浸漬されたフィルム粒子を、スチールピンセットで極低温容器に慎重に移します。液体N2に3分間プレソークする。
- 凍結したフィルム断片を200W、14速ブレンダーに移します。
- 凍結した材料を速度レベル3で10秒間処理し、凍結ガラス膜構造を壊します。さらなる小型化を促進するために、400mLのDI水を加え、フィルム水スラリーを5分間ブレンドする。
- スラリーをフィルター(1μmメッシュ)付きのビュヒナー漏斗に移し、少なくとも1時間真空をかけます。
- 真空乾燥固体粒子を30°Cで少なくとも48時間、アルミニウム皿中で乾燥させる。
- ピンセットで乾燥粒子をミルに送ります。ミリングの場合は、ステップ 1.1 ~ 1.11 に従います。
3. 環境風化・フライス加工による前処理プラスチックフィルムの加工
- 現場から回収したプラスチックフィルムの破片を滑らかな表面(ラボベンチ)にレイアウトします。吸収された土壌粒子や植物の残骸を柔らかい毛のブラシで慎重に取り除きます。
- はさみでフィルムを〜4cm2 の〜1.0gのサンプルに切り取る。
- フィルム断片を500mLのDI水で満たされた1000mLビーカーに加える。20mmの攪拌棒で300分-1の速度で1時間攪拌する。
- ビーカーのわずかな攪拌下でDI水をシンクまたはプラスチックバケツにデカントして再導入することにより、溶解した土壌粒子を除去する。この手順を 3 回繰り返します。連続攪拌は、土壌粒子を水中に分散させ、デカンテーションを容易にすることができる。
- ビーカーからアルミ皿にサンプルを移します。プラスチックサンプルを12時間風乾した後、真空オーブンで30°Cで24時間移送して乾燥させます。 ミリングの場合は、ステップ 1.1 ~ 1.11 に従います。
4. カスケードふるいによるふるい分け手順
- ふるい(直径3インチ)を底の鍋から始めて、次に最も細かいふるい(#325;45 μm)を積み重ね、次にますます粗いふるい(#140;106 μm、#60;250 μmなど、#20;840 μmのふるいが最も粗い)を積み重ね、蓋を上に置きます。
- ふるいシェーカーの開口部に4本のピンを挿入して、4つのふるいすべてをシェーカーに取り付けます。
- ステップ1、2、または3のいずれかで収集された個々の画分を、4つのカスケードシーブの上に移します。300分-1で10分間振る。
- より大きな(上の)画分を別々に回収し、さらに粉砕に供する。
メモ: 必要に応じて、シェーカーの振とう速度を調整します。あるいは、手でふるいを振ることも可能です。メッシュ#20ふるいから始めて、一度に1つのふるいだけを使用してください:底と蓋を手でふるいにしっかりと押し付け、軸方向と水平方向に5分間振ってください。 - 工程1.6〜1.10に記載されるようにdp>106μmの篩い分け粒子を回転式カッティングミルに再導入する。
- 鍋から底部分画を回収し、粒子を次の小さなふるいサイズに再導入する。106 μmの粒子が主分率を表すまでこの手順を繰り返します。
- 収集した106μmの画分をマージし、乾燥した領域(デシケーターまたは空気密封ビニール袋)に粒子を保管します。
注: 45 μm フラクションは 106 μm フラクションの一部です。しかし、前者の画分は、収量が一般に非常に低いため、単離および別々に分析されなかった。個々のフラクションの収率回収率および粒径フラクションは、高精度マイクロバランスを使用して、初期供給フラクションに関連して、各ふるい分けフラクション(メッシュ#20〜メッシュ#325)の重量%単位の重量測定によって決定することができる。
湿式粉砕用の水性NPスラリーの調製
- 1000 mLのガラスビーカーに800 mLの蒸留水を加え、攪拌棒(直径=8 mm、長さ=50.8 mm)を挿入して、DI水に分散したMPsのスラリーを調製した。
- 工程1、2、3、又は4からの106μmプラスチック画分8gをDI水に導入し、1重量%スラリーを製造する。
- ガラスビーカーを攪拌盤の上に置き、400分-1 で24時間磁気攪拌して粒子を水に浸し、粒子軟化を促進する。
- 粒子を1000mLのプラスチック容器に移す。
- さらに2つの1000 mLプラスチック容器にDI水を充填し、粉砕プロセス中にグラインダーのホッパーに付着した粒子を洗い流すために使用されます。
NP生産のための湿式粉砕機の準備
- 46グレインサイズの石(砥石のグリット=297-420μm)を湿式摩擦グラインダーに入れ、センターナットを17mmレンチで手締めします。
- ホッパーを上に追加し、3つのナットとボルトを17mmレンチで固定します。
- 1 L のプラスチック製の収集瓶をコライダーの出口の下に置きます。2 つ目の空の 1 L バケットをコンセントの横に置き、処理中の交換に使用されます。
- ゲージクリアランスを+1.0に調整し、ゼロ位置からの正の0.10μmシフトに対応します。
- 電源を入れ、砥石が触れるまで調整ホイールを時計回りに慎重に回します。次に、フレキシブル測定リングをゼロに調整し、ホイールをすぐに反時計回りに回します。デフォルトでは、速度は1500分-1に調整されています。
注:砥石に過度の熱が発生するため、石の「乾式研削」は避けてください。 - 石が触れるまで調整ホイールを時計回りに回し、水-NPスラリーをホッパーに静かに充填します。スラリーが導入された後のゼロ位置からの負の0.20μmシフトに対応する-2.0のクリアランスゲージまでギャップを連続的に減少させる。2つの石の円盤の間のプラスチック粒子 - 水スラリーは、MPからNPへの変換を促進し、砥石間の直接摩擦を回避します。
- バケット内の充填レベルが0.5 Lを超えたら、収集バケットを交換してスラリーを収集します。
- 粒子を収集し、30〜60回粉砕機に再導入する。パス(再導入回数)が多いほど、粒子サイズが小さくなります。
- ホッパーに吸着した付着粒子を調製したDI水ボトルで洗浄し、処理中に適切なスラリー混合を可能にする。
注:プロセス中の中間サンプルの収集は、20 mLのガラスバイアルを出口ストリームに保持することによって可能です。個々のステップは、プロセスの重大度(パス数)が増加する一方で、粒子フラグメンテーションメカニズムを評価します。スラリーを回収し、良好な混合のために25°Cで400分-1 で4時間攪拌する。スラリーを48時間放置して安定させます。
7. スラリーからのNPの回収と乾燥
- スラリーを追加の1000 mLガラスビーカーにゆっくりと注ぐことによってスラリー中の複数の層が観察される場合は、底部画分(またはNP濃度が最も高い相)を分離します。
- 画分を遠心分離バイアル(50mL)に移し、10分間遠心分離する(相対遠心力[RCF]=20 x102g )。RCF(g力とも呼ばれる)は、ローター半径とローター速度の関数として生成された半径方向の力であり、スラリーのより重い粒子と水の分離を引き起こします。
- 透明な最上層を別のアルミパンにデカントして取り外します。
- 残りの最下層(NPスラリーを含む)を追加のアルミニウム皿に移し、30°Cの真空オーブンに48時間入れる。
- 呼吸マスクを着用したまま、ヒュームフードまたはグローブボックスの下にヘラで乾燥した材料を回収します。乾燥した内容物を100mLのガラス容器に移し、蓋で密封する。
- バイアルにNPを入れ、気密で乾燥した涼しい場所(デシケーターなど)に保管してください。
注:製造プロセス中(ここでは、湿式粉砕プロセス中または乾燥粒子として)に環境に放出されるMNPは、水生および陸上の生態系に深刻な脅威をもたらす可能性があります。特に、規制措置は、工学的ナノ材料30に対するそれらの製造および使用に対するリスクを最小限に抑えるように設計されている。したがって、MNPの形成には、ヒュームフードまたはグローブボックス内のマテリアルハンドリングなどの特定の予防措置が必要です。さらに、NPの単離中に形成された水性廃液(ステップ6.7-6.9)は、環境安全衛生部によって実施される使用済み廃棄手順の対象となります。
8. 実体顕微鏡 による MPイメージング
- 〜20mgの粒子(ステップ4で収集)を〜4cm2の表面上に分散させる。背景のコントラストを最大にするために、暗い表面に白または半透明のMPを広げ、白い背景(紙シート)に黒または濃い色のMPを広げます。
- 顕微鏡を最低倍率に調整して、可能な限り大きな領域(粒子領域の中央)をキャプチャします。次に、外部ランプをフォーカスセンターに向け、関心領域の照明を取得します。
- 視野の中央に>50個の粒子を検出できる倍率を適用します。この量は、堅牢な統計的評価結果を得るために推奨されます。
- パーティクルの重なりがない、または小さな粒子があり、色のコントラストが良い領域に焦点を当てます。
- 外側の粒子形状に焦点を合わせることによって、少なくとも5つの代表的な画像をキャプチャする。イメージングに使用されるローカルコンピュータは、高解像度の画像をビットマップとしてソフトウェアに保存します。
- 実体顕微鏡で記録した画像をImageJで認識されるファイル形式(ビットマップ、tiff、jpeg)で保存し、以下の定量データ解析を行います。
メモ:メイン画像が定規または画像に記録された他の参照オブジェクトを使用して撮影された正確な倍率設定で1つの参照画像を撮影します。この手順により、ImageJソフトウェアを使用して準備および分析するときに、画像を簡単にキャリブレーションできます。
9. ImageJによる画像解析
- ImageJソフトウェア31を開き、コマンドファインダーを開くために(CTRL+L)と入力してファイルインポートを準備します。次に、右下隅にバイオフォーマットを入力します。この機能は、メニューパスのファイル>インポート>バイオフォーマットをアクティブにします(>はソフトウェア内のナビゲーションステップを参照します)。保存されているイメージファイルのディレクトリを検索します。
メモ: Bio-Formats パッケージが コマンドファインダーに表示されない場合は、 Bio-Formats ImageJ でオンラインで検索してください。ImageJ のダウンロードとインストールの指示に従ってください。Bio-Formatインポーターを使用すると、ImageJ内の画像ファイルのインポート/エクスポートとコマンドの検索を簡単に処理できます。 - [ファイル] > [開く] をクリックしてイメージを開き (手順 9.1 で説明したように Bio-Formats のインポートも行います)、手順 4.7 で収集したファイルの場所にあるパーティクル イメージと、手順 1.6 で説明した定規参照 イメージ>選択します 。複製イメージを作成するには、 Shift + Command + D をクリックして、コピーイメージのしきい値設定を調整しながら元のイメージと比較することをお勧めします。
メモ: ファイル> 開くコマンドは、手順 8.7 で説明したように、ImageJ でネイティブにサポートされているさまざまな形式を開きます。または、コンピュータ上のイメージの場所を選択し、メインのImageJウィンドウのステータスバーにファイルをドラッグアンドドロップします。画像ファイルは別のウィンドウで自動的に開きます。 - 画像にズームインおよびズームアウトするには、それぞれ Ctrl + と CTRL - を使用します。
- 測定値を設定するには、「分析」>「測定値を設定」をクリックし、デフォルト値として「面積記述子」と「形状記述子」を選択します。
- 手順 8 で説明したように、定規参照画像を使用してスケール バーの長さに直線の線を描画して、スケール バーを定義します。 [分析]>[スケールの設定]を押し、 既知の距離の下にバーの長さの数値と対応する長さの単位を入力します。
- [ >ツールの分析] > [スケール バー] をクリックして画像上のスケール バーを視覚化し、画像に鮮明なコントラストを表示するなどの設定を調整します。スケールバーの設定でスケールバーを配置する画像上の位置を選択します。「 幅 」を選択して、バーをキャリブレーションされた単位で、「バー の高さを ピクセル単位で」、および「スケールバーラベルの フォントサイズ」 を調整します。 背景 を選択して、ラベルテキストボックスの塗りつぶし色を調整します。
メモ: マイクロメータの場合は、μm の入力で十分です。プログラムは、μmをデータ出力に自動的に適応させます。 - 「イメージ」 >「タイプ」を選択して、イメージを 8 ビット・イメージ>変換します。
- コピーしたイメージを 8 ビットに変換する には、[イメージ > タイプ] > 8 ビットを選択します。
- 「 画像」または「しきい値>>設定 」(元の画像とサイズを比較)>選択して調整します。
- [分析] または [測定値 の設定] を選択して、実行する測定>決定します。
- [パーティクルを 0-無限大>解析] を選択し、[結果の表示] をクリックして、その場で表示します。
- ROI (.zip) 結果を [ 測定値の保存] と [フォルダーの選択] に保存します。
- [ファイル] の [ファイル] の下の [結果の保存 (*.csv) > [フォルダ>選択] として保存します。
10. 表計算ソフトでの粒子径(dp)と形状係数計算
注:粒子径と形状要因の知識は、環境中の粒子の挙動(運命、輸送)と表面積の決定に不可欠です。したがって、MPが環境研究に使用される場合、幾何学は不可欠です。例えば、土壌中の粒子移動に影響を与えるMP-MPやMP土壌凝集など、MPのサイズや形状によって土壌との相互作用メカニズムが異なることが観察された15,32。したがって、以下のステップは、dp−粒径分布および幾何学的パラメータを決定するために推奨される。
- ImageJ解析(ステップ9.13)で取得・保存した*.csvファイルを表計算ソフトにインポートします。
注: 各列行の数値は、式 1 および式 2 に従って各粒子の個別の計算を反映しています。 - 円形度 (CIR) や縦横比 (AR) などの平均形状パラメーター値を評価するには、各列の下部に = 平均 (x,y) と入力します (x は列の最初の行、y は列の最後の行を表します) 次に Enter キーを押します。CIR 値は、投影面積と個々のパーティクルの CIR = 1 (式 1) を持つ真円の関係を表します。ARは、 式2によって記述される粒子の長さ/幅比を表す。
- 平均ARが2.5<かどうかを判断し、式3を使用して新しい列のdp値を計算します。AR ≥ 2.5 の場合、式 4 を反映して dp 値を計算します。新しい列を追加して、ImageJ 出力から受信した面積列に基づいて dp を計算します。
メモ: AR しきい値を 2.5 ≥選択すると、より長方形のパーティクルを表し、AR < 2.5 はより丸い形状のパーティクルを反映します。この選択により、顕微鏡によって測定され、ImageJを介して決定された領域から導出 されるdp 計算誤差を最小限に抑えることができる。
(1)
(2)
(3)
(4)
11. 国会議員とNPの統計分析
- *.csvデータファイルを統計ソフトウェアでファイル>開き、手順9.13で作成した対応する ファイルのファイル>場所を選択します 。
メモ: または、コピー&ペースト機能を使用してテーブルを統計ソフトウェアに直接転送することもできます。統計ソフトウェア「Edit > Past」のブランドとバージョンについては、資料表を参照してください。 - dpデータを評価するには、分布の分析>選択します。
- 列のデータを反映する dp を選択し、Y 列にドラッグ アンド ドロップして OK ボタンを押します。この機能は、要約統計量、平均値、および標準偏差値を含む統計出力を含むヒストグラムを別のウィンドウに作成します。
- ヒストグラムが、D p > 連続適合 (連続適合) の横の三角形を選択して、最適適合曲線を持つ正規分布 (または dp に最適) に従っているかどうかを評価し、最適として受け取った曲線 (たとえば、適合正規) を選択します。このステップでは、ヒストグラムを正規分布の適合度で重ね合わせます。
- 円形度(Cir)、アスペクト比(AR)、真円度(円形)、および固体度(Sol)の平均形状パラメータ値の要約統計出力から平均値と標準偏差値を決定し、報告します。
注: 統計的有意水準 α = 0.05 が推奨され、すべての評価に採用されました。有意水準は、数値結果を比較するときに帰無仮説が真である場合に帰無仮説を棄却する確率です。
12. dpサイズ分布と粒子形状係数の最適適合
- データ・セットを統計ソフトウェアにロードし、ステップ 10 で計算 した dp の分布に同じ *.csv データ・セットを使用します。
- [>の信頼性と生存期間の分析 > 寿命分布] を選択します。
- dp 列を Y、イベントまでの時間フィールドまでドラッグし、「OK」を選択します。この機能は、dp の関数として確率プロットを持つ出力を作成します。
- 分布の比較で、ノンパラメトリック、対数正規、ワイブル、対数ロジスティック、正規をチェックして、最適な分布を決定します。
- グラフの下の 統計モデル比較表 の赤池情報基準とベイズ情報基準 (それぞれ AIC と BIC) の最小数値でモデル適合の品質を、最も低い BIC 数値で評価します。デフォルトで、最適モデルは最初の行に表示されます。各分布評価のパラメトリックまたはノンパラメトリック推定値の出力フィールドは、 分布の比較 グラフの下にあります。
- [スクリプトをデータテーブルに保存]で左上隅にある赤いプルダウン三角形を選択して、出力スクリプトをデータテーブルに保存>ます。次に、[ファイル] を選択して目的のファイルの場所に元のデータ テーブル>保存し、[名前を付けて保存] *.jmp >選択します。
13. 動的光散乱によるNPの次元特性評価
- デスクトップアイコンをダブルクリックして、動的光散乱(DLS)ソフトウェアを起動します。[ファイル>新規> SOP] を選択します。サンプル名を追加し、サンプルセットアップの下のDLSソフトウェアで、蒸留水の場合は1.33、ポリマーの場合は1.59に材料屈折率を選択します。プルダウンメニューで材料を選択し、「OK」をクリックします。
メモ: プルダウン メニューをクリックすると、 材料マネージャが開き、 屈折率 と 吸収を変更して新しいサンプルを追加したり、既存のサンプルを変更したりできます。分散剤として 水を選択します。 - [セル タイプ] で適切なセル>選択し、[レポート] を選択して、各測定後に表示する出力を決定します。
- 計測器のふたを閉め、ふたを閉めて(開いている場合)、 ON ボタンを押してシステムの電源を入れて、計測器を起動します。最初のビープ音が鳴った後、ビームを安定させるために約30分待ちます。
- 初期化ルーチンが完了するまで待ってから、あらかじめ設定された温度(通常は25°C)に達したことを示す2回目のビープ音が鳴るのを待ちます。
- NPs(ステップ7で受け取ったように)とDI水のサンプルスラリーを約0.1重量%濃度の15mLバイアルに調製し、磁気的に〜1時間攪拌してよく混合できるようにします。
- スラリーを振ってから、約1.0 mLを4.5 mLの石英キュベットに移し、蓋を開けます。次に、サンプルセルをDLS装置のサンプルホルダーに慎重に挿入します。
注: ステップ 13.5 で説明したのと同じ濃度で、同じスラリーバッチから 3 つのサンプルを調製します。 - 各サンプルについて3つの測定(DLSソフトウェアでの選択)を実行します。測定の合間には、サンプルセルを取り出し、サンプルを5秒間静かに振ってサンプルを混合できるようにします。
- DLS ソフトウェアを使用してデータを抽出およびエクスポートし、データセットをスプレッドシート ソフトウェアに転送し、手順 11.1 ~ 11.5 (図 1) の説明に従って MP と NP のヒストグラムを作成します。「レコードの表示」タブから「編集/コピー」を選択して表またはグラフをコピーします。このコピーは、スプレッドシート・ソフトウェアなどの別のアプリケーションに貼り付けることができます。
14. フーリエ変換赤外(FTIR)分光減衰全反射率(ATR)を用いたMNPの化学分析
注:フーリエ変換赤外(FTIR)および核磁気共鳴(NMR)分光法によるMNPの化学分析は、湿式粉砕が化学結合特性に及ぼす影響、ならびに主要成分およびポリマーのモノマー成分の相対量を評価するのに適したツールです10。さらに、MNPsのポリマー成分の熱特性および安定性は、それぞれ示差走査熱量測定(DSC)および熱重量分析(TGA)によって評価することができる29。
- 検出システム(ATR結晶表面)をエタノールと糸くずの出ない布で拭きます。
- ソフトウェアを起動し、コマンドバー の背景ボタンを押し て、計器ビームパスをクリアして空中で バックグラウンドスキャン を実行します。背景スペクトルは、収集後すぐに表示されます。
- 計測器設定ツールバーにサンプル ID と サンプル説明 を入力します。
- スペクトル波数を4000 cm-1~600 cm-1の範囲で調整し、吸光度モードでは2.0 cm-1の分解能を選択します。スペクトルごとに32スキャンを選択して開始します。
- MPs(106 μm)とNP(~300 nm)のプラスチックサンプル(~20 mgまたは~1-3 mm 3)を、内径が約10 mm(または同等)のスチールワッシャーの内側に結晶表面に置きます。
注:ワッシャーは、サンプルホルダーがサンプルを圧縮するときに結晶上の分散を防ぎ、一貫性のない測定による材料の不均一性とデータバイアスをもたらします。 - ワッシャーをATRクリスタルの中央に置き、ヘラでワッシャー開口部の中央にポリマーサンプルを追加します。
- 上記のサンプルレバーをサンプルの中央に回し、50〜90の間のフォースゲージ力を監視してノブを時計回りに回します。サンプルは予備スペクトルを示す。 [スキャン ]ボタンをもう一度押して、スペクトルを収集します。
- 「 スキャン 」ボタンをクリックして8~10個のスペクトルを収集し、各測定後にサンプルをヘラで慎重に混合して、代表的な結果を収集できるようにします。
- データエクスプローラーの「サンプルビュー」フォルダーをクリックして、収集されたすべてのサンプルを表示領域に重ねて表示します。まず、外れ値を表す大きく外れたスペクトルを削除します。次に、ツールバーの「吸光度」モードまたは「透過率」モードを選択します。
- スペクトルを保存するには、スペクトルを含む サンプルビュー フォルダを選択し、ファイルメニューから [名前を付けて保存] を選択します。 ダイアログウィンドウ では、ファイル名、宛先ディレクトリ、およびすべてのスペクトルのデフォルトの場所の変更が有効になります。
メモ: または、スペクトルを選択して右クリックしてバイナリオプションを表示することで、スペクトルを*.spファイルとして保存することもできます。[バイナリの保存] を選択し、最終的な保存場所を参照します。 - ベースライン補正と平均正規化を実行するには、ソフトウェアまたは次の手順でメニューの [プロセス>正規化] を選択して、データ エクスプローラーで 1 つのスペクトルを選択します。
注: 平均正規化は、サンプルの厚さまたは材料の変動によるスペクトル誤差を補正します。 - データ収集が完了したら、エタノールと糸くずの出ない布で結晶領域を清掃します。
- 以前の出版物10で割り当てられ、評価された割り当てられたFTIR振動バンドに従って、MPとNPの違いを解釈する。
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Representative Results
実験手順の方法と分析を検証するために、ペレットとフィルム材料からMPsとNPを形成し、顕微鏡画像を使用してサイズと形状で比較しました。図1に記載の方法は、生分解性プラスチックペレットおよびフィルムからMPsおよびNPを効率的に形成した。これは、極低温冷却、粉砕、湿式粉砕および特性評価によって達成された。前者のステップは、風化が脆化を誘発したため、環境風化した映画には不要であった(Astnerら、未発表)。ペレットはまた、極低温前処理なしで直接粉砕に供した。粉砕後、粒子を、プロトコルステップ4に記載されているように、4つのサイズ画分(840μm、250μm、106μm、および45μm)に篩い分けることによって分画した。後者の3つの分派は国会議員のみで構成されていた。続いて、各フラクションの粒子特性評価は、ステップ8.1〜8.6に与えられたImageJソフトウェアを用いて、収集された立体顕微鏡画像のサイズ(dp)および形状因子(すなわち、円形度およびアスペクト比)の分布を決定することによって評価された。実体顕微鏡によって得られた画像の例は、PBATペレットの106μmふるい分け画分(図3a、c)および250μmのふるい画分、および極低温暴露で処理された無風化PBATフィルム(図3b、d)について示されている。
粒子寸法の統計解析では、PBATペレットの公称ふるいサイズ(106 μm)よりも41 μm小さく、PBATフィルム(公称サイズ250 μm)よりも137 μm小さい平均dpが示され、ふるい分率が小さいほどより均質な粒度分布を表すことが示唆されました(表1)。この観察はまた、フィルム材料と比較して処理されたペレットの円形度および低いアスペクト比(より丸い形状の粒子を示唆する)のより大きな値によって確認されたが、これは出発材料の異なる特性(密度)に起因する可能性がある。正規分布は、両方のフラクションの粒度分布を記述するのに最適なモデルでした。しかし、円形度とアスペクト比を決定するには、ワイブルモデルと対数正規モデルが最適でした(図4a-d;表1)。両方の原料について、106μmのMPふるい画分に湿式粉砕プロセスを適用してNPを形成し、それらの粒度分布をDLSを介して測定した。数値解析により、両方の原料から製造されたNPの二峰性粒度分布が明らかになりました(図5)。PBATペレットからのNPsの主要粒子集団は〜80nmおよび531nmであり、対応する数密度頻度(NDF)値はそれぞれ25%および5%であった。一方、PBATフィルムに由来するNPは、〜50nmおよび106nmに最大サイズを有し、対応するNDF値はそれぞれ11%および10%であった。この観察結果は、PBATペレットからのNPがPBATフィルムよりも均一なdp値(〜50〜110nm)をもたらしたことを示唆している。しかし、300 nm~700 nmの間にあり、最大が531 nmの粒子亜集団も共存していた(図5)。
PBATフィルムの化学結合特性をFITR分光法により評価した。スペクトルは、1300〜700cm-1の領域におけるMPのミリングおよびNPの湿式粉砕によるわずかな変化しか示さなかった。しかしながら、澱粉のC−O伸縮の有意な減少は、澱粉成分10の吸光度を反映して、マルチフィルムについて観察された。しかし、C-HおよびC-O延伸などのPBATを表すバンドについては、1800 cm-1と1230 cm-1の間でわずかな変化が見られ、湿式粉砕プロセスに起因するポリエステルの構造のわずかな変化が示唆された(図6)。
図1:マイクロプラスチックおよびナノプラスチックを形成し、特性評価するためのフロー図。この表現は、形成プロセスとその後の幾何学的および化学的粒子評価を示す。幾何学的特性は、立体顕微鏡法と画像解析(ImageJ)を組み合わせて決定し、続いて数値統計解析を行った。分子結合などの化学的特性評価は、減衰全反射率(FTIR-ATR)を用いたフーリエ変換赤外分光法によって行った。ポリマーの分子構造は、相補的な方法として核磁気共鳴(NMR)分光法によって評価することができる(この研究では記載されていない)。次の手順では、ステップごとに重要なポイントが強調表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:回転式切削ミル装置。 (a)供給ホッパー、前面ガラス板、およびふるいスロットを含む回転ミルアセンブリの画像。(b)ふるいサイズ#20(840μm)および#60(250μm)の個々の送達管が、粗いものから始めてミルふるいスロットに取り付けられる。(c)二層ガラス前面板が粉砕チャンバの前面に取り付けられる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ソフトウェア処理画像を含むマイクロプラスチック(MPs)の実体顕微鏡写真。画像は、(a)PBATペレット(106μmふるい画分)および(b)PBATフィルム(250μmふるい画分)に由来するMPsを極低温暴露とメカニカルミリングによって調製した。白色PBAT粒子(a)の撮像には黒の背景を選択し、黒色のPBATフィルム(b)には白色の背景を選択した。対応する画像は、ImageJソフトウェア31(c)および(d)によってそれぞれ処理された。(e)PBATペレットおよび(f)PBATフィルムのステレオグラフに由来する粒子のヒストグラムに描かれるdpの分布のベストフィットモデルは、正規分布によって表される。エラーバーは1つの標準偏差を反映しています。実体顕微鏡は、統合されたカメラヘッドで実体顕微鏡写真を収集しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:最良のカーブフィッティングを重ね合わせた粒子形状係数分布ヒストグラム。画像は、ImageJ分析31に基づいて、PBATペレットの(a)円形度および(c)アスペクト比、ならびにPBATフィルムの(b)円形度および(d)アスペクト比のMPsを表す。実体顕微鏡写真は、PBATペレット(106μm)およびPBAT BDM MPs(250μm)の2つのふるい画分粒子に基づく。数値解析は、統計ソフトV15で行った。ステレオグラフとヒストグラムは、対応する画像を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:NPの粒径(DP)のヒストグラム。 同図は、106μmのMPふるい画分の湿式粉砕処理から形成されたPBATフィルム及びPBATペレットに由来する粒子分布を表す。曲線は、統計ソフトウェアを使用して実施されたサイズ分布に適合する2パラメータワイブルモデルを表します。データ測定は、動的光散乱を用いて行った。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6.異なる処理ステップ間のMNP比較の代表的なFTIRスペクトル。 この図は、PBATフィルム、PBAT-MPs、およびPBAT-NPの初期条件の比較を示しています。PBATフィルムを、乾燥粉砕されたプラスチックの106μmふるい画分からなるMPsの機械的粉砕の前に低温処理した。NPsは、乾式粉砕および篩い分け後の106μm篩画分MPsの湿式粉砕 を介して 製造した。スペクトルデータは、ダイヤモンド減衰全反射率(ATR)アタッチメントを取り付けた分光器を用いて収集した。スペクトルデータ解析は、FTIRスペクトル解析ソフトウェアを用いて行った。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| PBATペレット | PBATフィルム | |
| ふるい分率、μm | 106 | 250 |
| 通常のdp、μm | 65 | 113 |
| Std Dev, μm | 24 | 58 |
| 循環 | 0.68 | 0.47 |
| 縦横比 | 1.73 | 2.33 |
| ベストフィット、dp | 正常 | 正常 |
| ベストフィット、円形度 | ワイブル | ワイブル |
| ベストフィット、アスペクト比 | 対数 正規 | 対数 正規 |
| N | 83 | 125 |
表1:代表的な粒径および形状パラメータ。結果は、図3および図4に描かれたPBATペレットおよびPBATフィルムから処理されたMPsについての統計分析から得られた。
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Discussion
この方法は、環境研究のためにペレットおよびマルチフィルムから供給されたMNPsを調製するための、以前の刊行物29に最初に記載された有効なプロセスを記載している。サイズ縮小プロセスには、モデルMNPを製造するために、極低温冷却(フィルムのみ)、乾式粉砕、および湿式粉砕段階が含まれていました。我々は、低密度ポリエチレン(LDPE)、ポリ酪酸アジピン酸コテレフタレート(PBAT)、およびポリ乳酸(PLA)29 を含む幅広いポリマー原料からMNPsを調製するためにこの方法を適用した(Astnerら、準備中の原稿)。しかし、LDPEの場合、ペレットのみが原料として役立つことができました。マルチフィルムは、以前の刊行物29に記載されているように、その押出中にフィルムに組み込まれた補強グリッドのために処理することができなかった。
プロトコル内の重要なステップには、a)一般的に柔軟なフィルムの脆化を提供する極低温前処理、b)農業慣行(耕作、耕作)による機械的影響をシミュレートするためのフライス加工、およびc)MPと土壌の衝突の間の環境せん断事象を模倣する湿式粉砕が含まれる。この方法によって形成されたMNPは、ポリスチレンのマイクロスフィアおよびナノスフィアよりも農業土壌で発生する粒子を表す可能性が高い。しかしながら、後者は、土壌微生物群集34、35、36、植物37、および土壌動物群集38への影響を調査する環境研究において、工学的モデル材料として頻繁に使用されている。
様々な方法が、回転式およびボールミル39、40、41、42を用いた極低温粉砕および粉砕を含む代理NPを生成している。さらに、液体窒素と組み合わせた粉砕は、MNPs40、41、42、43、44、45を形成するために頻繁に採用された。対照的に、湿式ボール粉砕と組み合わせた超遠心乾式粉砕手順(極低温処理なし)を使用して、それぞれMPsおよびNPs39を生成した。対照的に、この論文で説明した方法は、極低温浸漬 - ブレンド - フライス加工 - 粉砕の安価な組み合わせを使用してプラスチックフィルムからMNPを生成し、風化や機械的せん断力などの環境への影響を模倣する。そこで、最近の研究では、極低温で形成された環境風化した農業用プラスチックフィルム間の機械的および化学的特性変化を比較した。結果は、形成されたMNPsの幾何学的特徴、物理化学的特性、および生分解性において統計的に有意な差を示した(Astnerら、未発表)。
機械的 - 極低温粉砕法の限界は、フラクション<840μm)の最初のミリングパス(〜10重量%)後のふるい分け収率が比較的低いことであり、これはさらに2回のパスを必要とし、その結果、>840μmのより大きなフラクションと比較して処理時間が長くなる29。46 μm画分の収率は1〜2重量%の間であるため、106 μmの粒子画分を湿式粉砕手順に使用してNPsを形成しました。加えて、粉砕プロセス中の摩擦は、他の研究29,46に記載されているように、粉砕プロセス中の粒子またはフィルム断片の凝集および熱劣化をもたらす処理チャンバの過熱をもたらし得る。この論文に記載されている極低温粉砕方法のさらなる制限は、熱特性が悪い(すなわち、低いガラス転移温度)LDPEフィルムまたはPBSペレットなどのプラスチックの限られた用途である。前者のプラスチックは、LDPEフィルムの繊維構造のために粉砕することは不可能であった。さらに、後者は、機械的剪断が粉砕チャンバ内の温度を上昇させたため、ミルを詰まらせた。対照的に、LDPEペレットは、極低温冷却の採用なしに粉砕を通して処理することが容易であった。MPsのdpsの比較は、公称ふるいサイズからの250μm画分の方が106μmのdp画分よりも大きな偏差を示す。しかしながら、両方のふるい分け画分は単分散正規分布をたどり(図3e、fおよび表1)、フィルムまたはペレット原料について同様の破壊メカニズムを示唆している。対照的に、NPサイズ分析は、以前の出版物29と同様に、PBATフィルムおよび50nmおよび107nmに代表的なサイズ分布ピークを有するPBATペレットについて二峰性分布をもたらした。しかし、ペレット分布データは、約80nmおよび531nmにピークを示し、破壊がフィルムの場合よりも均一に起こらないことを示唆している。以前に確立された方法の重要性は、極低温前処理、粉砕、湿式粉砕などの処理ステップの効率的かつ安価な組み合わせにある。この研究におけるPBATフィルムからのNPの粒度分布は、生分解性プラスチック29のNP形成に関して実施された予備的研究に類似しており、これは、粒子サブポピュレーションが〜50nmおよび〜200nmでピークとする二峰性分布によって特徴付けられる。しかし、後者は、本研究におけるパス数(60回)の増加に基づいて、図5に描かれているように、わずかに小さい粒子(106nm)をもたらしたが、Astnerらによって以前に実施された27回のパスと比較して。29. この研究は、PBATフィルムに由来するNP形成が予備的研究結果に従うことを示唆する。
この方法の堅牢性のさらなる証拠は、化学組成が極低温処理、粉砕、および湿式粉砕のために大きく変化しなかったことです(図6)。さらに、ペレット対フィルム(粒度分布)、平均dp、または形状パラメータなどの原料油間の差異は有意に異ならなかった(図3および図4)。環境中に分散したMNPsと、陸生生物47,48および海洋生物対生物49,50に対するそれらの生態毒性の影響が広く報告されている。しかし、土壌はMNPの転座、分解、および生物蓄積のための最も顕著な地球環境貯留層を提示する一方で、これらの材料に対する堅牢で均一な分析方法の欠如は、陸上生態系におけるMPsおよびNPの重大なリスク評価知識ギャップをもたらす51。したがって、この方法の将来の用途には、市場導入前にMNPの環境運命および生態毒性を評価するために、農業ポリマーフィルム用の新しく開発されたプラスチック材料(例えば、リグニンと組み合わせたPBAT)のMNPsを調製および特性評価することが含まれる可能性がある。したがって、このプロトコルは、極低温粉砕によるMPsおよび湿式粉砕によるNPsの生成、および得られたMNPの寸法および化学的特性評価のための標準化されたプロトコルとして、環境研究に役立つ可能性がある。さらに、誘導粒子は、陸上および海洋環境における運命、生態毒性、輸送、および生分解などの環境研究において使用され得る。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ハーバート農業大学、バイオシステム工学・土壌学部、テネシー大学ノックスビル校のサイエンスアライアンスから資金提供を受けた。さらに、著者らは、この研究のためにUSDA助成金2020-67019-31167を通じて提供された財政的支援に感謝しています。PBATベースの生分解性マルチフィルムのMNPsを調製するための初期原料は、BioBag Americas, Inc.(米国フロリダ州Dunevin)によって親切に提供され、PBATペレットはMobius, LLC(テネシー州レノアシティ)によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum dish, 150 mL | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 08-732-103 | Drying of collected NPs |
| Aluminum dish, 500 mL | VWR International, Radnor, PA, USA | 25433-018 | Collecting NPs after wet-grinding |
| Centrifuge | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Centrific 228 | Container for centrifugation |
| Delivery tube, #20, 840 µm | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383M30 | Sieving of the first fraction during milling |
| Delivery tube, #60, 250 µm | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383M45 | Sieving of the second fraction (3x) during milling |
| Thermomixer, 5350 Mixer | Eppendorf North America, Enfield, CT, USA | 05-400-200 | Analysis of sieving experiments |
| FT-IR Spectrum Two, spectrometer with attenuated total reflectance (ATR) | Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | L1050228 | Measuring FTIR spectra |
| Glass beaker, 1000 mL | DWK Life Sciences, Milville, NJ, USA | 02-555-113 | Stirring of MPs-water slurry before grinding |
| Glass front plate | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383N55 | Front cover plaste for Wiley Mini Mill |
| Glass jar, 50 mL | Uline, Pleasant Prairie, WI, USA | S-15846P | Collective MPs after milling |
| Glove Box, neoprene | Bel-Art-SP Scienceware, Wayne, NJ, USA | BEL-H500290000 | 22-Inch, Size 10 |
| Zetasizer Nano ZS 90 size analyzer | Malvern Panalytical, Worcestershire, UK | Zetasizer Nano ZS | Measuring nanoplastics dispersed in DI-water |
| Microscope camera | Nikon, Tokyo, 108-6290, Japan | Nikon Digital Sight 10 | Combined with Olympus microscope to receive digital images |
| Microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | Model SZ 61 | Imaging of MPs |
| Nitrogen jar, low form dewar flasks | Cole-Palmer, Vernon Hills, IL, USA | UX-03771-23 | Storage of liquid nitrogen during cryogenic cooling |
| Accurate Blend 200, 12-speed blender | Oster, Boca Raton, FL, USA | 6684 | Initiating the size reduction of cryogenically treated plastic film |
| PBAT film, - BioAgri™ (Mater-Bi®) | BioBag Americas, Inc, Dunedin, FL, USA | 0.7 mm thick | Feedstock to form MPs and NPs, agricultural mulch film |
| PBAT pellets | Mobius, LLC, Lenoir City, TN, USA | Diameter 3 mm | Feedstock to form microplastics (MPs) and nanoplastics (NPs) trough milling and grinding |
| Plastic centrifuge tubes, 50 mL | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 06-443-18 | Centrifugation of slurry after wet-grinding |
| Plastic jar, 1000 mL, pre-cleaned, straight sided | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 05-719-733 | Collection of NPs during and after wet grinding |
| Polygon stir bars, diameterø=8 mm, length=50.8 mm | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14-512-127 | Stirring of MPs slurry prior to wet-grinding |
| Scissors, titanium bonded | Westcott, Shelton, CT, USA | 13901 | Cutting of initial PBAT film feedstocks |
| Square glass cell with square aperture and cap, 12 mm O.D. | Malvern Panalytical, Worcestershire, UK | PCS1115 | Measuring of NPs particle size |
| Stainless steel bottom, 3 inch, pan | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 8401 | For sieving after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 140 (106 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1308 | For sieving after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 20 (850 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1296 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 325 (45 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1313 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 60 (250 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1303 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel top cover, 3 inch | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 8406 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel tweezers | Global Industrial, Port Washington, NY, USA | T9FB2264892 | Transferring of frozen film particles from jar into blender |
| Vacuum oven, model 281A | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 13-262-50 | Vacuum oven to dry NPs after wet-grinding |
| Friction grinding machine, Supermass Colloider | Masuko Sangyo, Tokyo, Japan | MKCA6-2J | Grinding machine to form NPs from MPs |
| Wet-grinding stone, grit size: 297 μm -420 μm | Masuko Sangyo, Tokyo, Japan | MKE6-46DD | Grinding stone to form NPs from MPs |
| Wiley Mini Mill, rotary cutting mill | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | NC1346618 | Size reduction of pellets and film into MPs and NPs |
| Software | |||
| FTIR-Spectroscopy software | Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | Spectrum 10 | Collection of spectra from the initial plastic, MPs and NPs |
| Image J, image processing program | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.53n | Analysis of digital images received from microscopy |
| Microscope software, ds-fi1 software | Malvern Panalytical , Malvern, UK | Firmware DS-U1 Ver3.10 | Recording of digital images |
| Microsoft, Windows, Excel 365, spreadsheet software | Microsoft, Redmond, WA, USA | Office 365 | Calculating the average particle size and creating FTIR spectra images |
| JMP software, statistical software | SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2021 | Version 15 | Statistical analysis of particle size and perform best fit of data set |
| Unscrambler software | Camo Analytics, Oslo, Norway | Version 9.2 | Normalizing and converting FTIR spectra into .csv fromat |
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