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Engineering

Bildung von Mikro- und Nanoplastik aus Agrarkunststofffolien für den Einsatz in Grundlagenforschung

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64112
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 2, 4
1Department of Biosystems Engineering and Soil Science, University of Tennessee, 2Neutron Scattering, Oak Ridge National Laboratory, 3Chemical Sciences Divisions, Oak Ridge National Laboratory, 4Center for Renewable Carbon, The University of Tennessee

Summary

Wir zeigen die Bildung und dimensionale Charakterisierung von Mikro- und Nanoplastik (MPs bzw. NPs) mittels eines schrittweisen Prozesses aus mechanischem Fräsen, Schleifen und bildgebender Analyse.

Abstract

Mikroplastik (MP) und Nanoplastik (NP), die in landwirtschaftlichen Ökosystemen verteilt sind, können eine ernsthafte Bedrohung für Biota im Boden und in nahe gelegenen Wasserstraßen darstellen. Darüber hinaus können Chemikalien wie Pestizide, die von NPs adsorbiert werden, Bodenorganismen schädigen und möglicherweise in die Nahrungskette gelangen. In diesem Zusammenhang tragen landwirtschaftlich genutzte Kunststoffe wie Kunststoffmulchfolien wesentlich zur Plastikverschmutzung in landwirtschaftlichen Ökosystemen bei. Die meisten grundlegenden Studien über Verbleib und Ökotoxizität verwenden jedoch idealisierte und schlecht repräsentative MP-Materialien wie Polystyrol-Mikrosphären.

Daher haben wir, wie hier beschrieben, ein mehrstufiges Verfahren im Labormaßstab entwickelt, um repräsentative MPs und NPs für solche Studien mechanisch zu bilden. Das Kunststoffmaterial wurde aus handelsüblichen Kunststoffmulchfolien aus Polybutyratadipat-Co-terephthalat (PBAT), die entweder durch kryogene Behandlung (CRYO) oder Umweltverwitterung (W) versprödet wurden, sowie aus unbehandelten PBAT-Pellets hergestellt. Die Kunststoffmaterialien wurden dann durch mechanisches Fräsen zu MPs mit einer Größe von 46-840 μm behandelt, die den Abrieb von Kunststofffragmenten durch Wind und mechanische Maschinen nachahmen. Die Abgeordneten wurden dann in mehrere Größenfraktionen gesiebt, um weitere Analysen zu ermöglichen. Schließlich wurde die 106 μm Siebfraktion einer Nassvermahlung unterzogen, um NPs von 20-900 nm zu erzeugen, ein Prozess, der den langsamen Zerkleinerungsprozess für terrestrische MPs nachahmt. Die Abmessungen und die Form für MPs wurden durch Bildanalyse von Stereomikroaufnahmen bestimmt, und dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde verwendet, um die Partikelgröße für NPs zu bestimmen. MPs und NPs, die durch diesen Prozess gebildet wurden, besaßen unregelmäßige Formen, was den geometrischen Eigenschaften von MPs entspricht, die von landwirtschaftlichen Feldern gewonnen wurden. Insgesamt erwies sich diese Zerkleinerungsmethode als effizient für die Bildung von MPs und NPs, die aus biologisch abbaubaren Kunststoffen wie Polybutylenadipat-Co-Terephthalat (PBAT) bestehen, die Mulchmaterialien darstellen, die für die landwirtschaftliche Sonderpflanzenproduktion verwendet werden.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten haben die weltweit rasant steigende Produktion von Kunststoffen und die unsachgemäße Entsorgung und das fehlende Recycling von Kunststoffabfällen zu einer Umweltverschmutzung geführt, die sich auf marine und terrestrische Ökosysteme ausgewirkt hat 1,2,3. Kunststoffmaterialien sind für die moderne Landwirtschaft unerlässlich, insbesondere für den Anbau von Gemüse, Kleinobst und anderen Sonderkulturen. Ihre Verwendung als Mulchfolien, hohe und niedrige Tunnelabdeckungen, Tropfband und andere Anwendungen zielen darauf ab, den Ernteertrag und die Qualität zu verbessern, die Produktionskosten zu senken und nachhaltige Anbaumethoden zu fördern 4,5. Der zunehmende Einsatz von "Plastikultur" hat jedoch Bedenken hinsichtlich der Bildung, Verteilung und Aufbewahrung von Kunststoffteilen in landwirtschaftlichen Umgebungen aufgeworfen. Nach einem kontinuierlichen Fragmentierungsprozess durch Versprödung durch Umweltzerstörung während der Lebensdauer bilden größere Kunststofffragmente Mikro- und Nanoplastik (MNPs), die im Boden persistieren oder über Wasserabfluss und Wind in benachbarte Gewässer wandern 6,7,8. Umweltfaktoren wie ultraviolette (UV) Strahlung durch Sonnenlicht, mechanische Kräfte von Wasser und biologische Faktoren lösen die plastische Versprödung von umweltverteilten Kunststoffen aus, was zum Zerfall größerer Kunststofffragmente in makro- oder mesoplastische Partikel führt 9,10. Durch die weitere Defragmentierung entstehen Mikroplastik (MPs) und Nanoplastik (NP), die Partikel mittlerer Größe (Nenndurchmesser; dp) von 1-5000 μm bzw. 1-1000 nm bzw.11. Die obere dp-Grenze für NPs (dh eine untere Grenze für MPs) ist jedoch nicht allgemein vereinbart und in mehreren Papieren wird dies als 100 nm12 aufgeführt.

MNPs aus Kunststoffabfällen stellen eine zunehmende globale Bedrohung für die Bodengesundheit und die Ökosystemdienstleistungen dar. Die Adsorption von Schwermetallen aus Süßwasser durch MPs führte zu einer 800-fach höheren Konzentration von Schwermetallen im Vergleich zur Umgebung13. Darüber hinaus stellen MPs in aquatischen Ökosystemen mehrere Stressoren und Schadstoffe dar, indem sie die Lichtdurchdringung verändern, Sauerstoffmangel verursachen und eine Adhäsion an verschiedenen Biota verursachen, einschließlich Penetration und Akkumulation in aquatischen Organismen14.

Neuere Studien deuten darauf hin, dass MNPs die Bodengeochemie und Biota beeinflussen können, einschließlich mikrobieller Gemeinschaften und Pflanzen15,16,17. Darüber hinaus bedrohen NPs das Nahrungsnetz17,18,19,20. Da MNPs im Boden leicht vertikal und horizontal transportiert werden, können sie absorbierte Schadstoffe wie Pestizide, Weichmacher und Mikroorganismen durch den Boden in das Grundwasser oder aquatische Ökosysteme wie Flüsse und Bächetransportieren 21,22,23,24. Herkömmliche Agrarkunststoffe wie Mulchfolien werden aus Polyethylen hergestellt, das nach Gebrauch vom Feld entfernt und auf Deponien entsorgt werden muss. Eine unvollständige Entfernung führt jedoch zu einer erheblichen Ansammlung von Kunststoffabfällen in Böden 9,25,26. Alternativ sind bodenbiologisch abbaubare Kunststoffmulche (BDMs) so konzipiert, dass sie nach Gebrauch in den Boden gepflügt werden, wo sie im Laufe der Zeit abgebaut werden. BDMs verbleiben jedoch vorübergehend im Boden und zerfallen allmählich und fragmentieren sich in MPs und NPs 9,27.

Viele aktuelle umweltökotoxikologische und Schicksalsstudien verwenden idealisierte und nicht repräsentative MP- und NP-Modellmaterialien. Die am häufigsten verwendeten Ersatz-MNPs sind monodisperse Polystyrol-Mikro- oder Nanokugeln, die nicht die tatsächlichen MNPs widerspiegeln, die sich in der Umwelt befinden 12,28. Folglich kann die Auswahl von nicht repräsentativen Abgeordneten und NPs zu ungenauen Messungen und Ergebnissen führen. Aufgrund des Mangels geeigneter Modell-ΜNPs für terrestrische Umweltstudien waren die Autoren motiviert, solche Modelle aus landwirtschaftlichen Kunststoffen herzustellen. Wir berichteten bereits über die Bildung von MNPs aus BDMs und Polyethylenpellets durch mechanisches Mahlen und Mahlen von Kunststoffpellets und Folienmaterialien sowie über die dimensionalen und molekularen Eigenschaften vonMNPs 29. Das vorliegende Papier bietet ein detaillierteres Protokoll für die Herstellung von MNPs, das breiter auf alle landwirtschaftlichen Kunststoffe wie Mulchfolien oder deren pelletierte Rohstoffe angewendet werden kann (Abbildung 1). Hier haben wir beispielhaft eine Mulchfolie und kugelförmige Pellets des biologisch abbaubaren Polymers Polybutylenterephthalat (PBAT) gewählt, um landwirtschaftliche Kunststoffe darzustellen.

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Protocol

1. Verarbeitung von MPs aus Kunststoffpellets durch kryogene Vorbehandlung und Mahlung

ANMERKUNG: Diese Methodik basiert auf einem an anderer Stelle beschriebenen Verfahren, bei dem ein PBAT-Film verwendet wird, der aus demselben Material besteht, das für diese vorgestellte Studie verwendetwurde 29.

  1. Polymerpelletproben von ~ 1 g wiegen und in ein 50 ml Glasgefäß geben.
  2. Legen Sie das "rechteckige Förderrohr" mit einem Sieb mit 20 Maschen (840 μm) in den Schlitz vor der Rotationsschneidmühle und heben Sie das Förderrohr an, bis es auf den Anschlagstift trifft.
  3. Positionieren Sie die Glasplatte über der Oberfläche der Fräskammer und sichern Sie sie mit der verstellbaren Klemme. Stellen Sie anschließend ein 50-ml-Glas unter den Mühlenauslass (Abbildung 2).
  4. Positionieren Sie die verschiebbare Seitenarmstütze auf der Mühle (rechts oben) in der Mitte der Frontscheibe und ziehen Sie sie mit dem Rändelbolzen fest. Stellen Sie sicher, dass das Frontglas der Mühle sicher positioniert ist (Abbildung 2a).
  5. Führen Sie den Trichtertrichter oben auf der Mühle in die Öffnung der oberen Mahlkammer ein.
  6. Stecken Sie ein Leitungskabel in eine Steckdose und den Presskabelschalter, um den Mühlenbetrieb zu starten.
    HINWEIS: Um ein Verklemmen zu vermeiden, führen Sie nur Material zu, nachdem die Mühle eingeschaltet und gedreht wurde. Tragen Sie auch Augen- und Gehörschutz während des gesamten Fräsvorgangs.
  7. Geben Sie die Probe langsam in den Trichter (ca. 10 Pellets/min), um ein Verlangsamen oder Verklemmen zu vermeiden. Nachdem das hörbare Geräusch nachgelassen hat, fügen Sie die nächste Charge Pellets (~ 10 Stück) hinzu. Drücken Sie nach der Verarbeitung der Pellets (1 g) den Kabelschalter, um den Mühlenbetrieb für ~20 min zum Abkühlen zu stoppen. Verwenden Sie einen Holzkolben, um die Probe zuzuführen und das Auswerfen und Agglomerieren von Partikeln im Einfülltrichter zu verhindern.
    ACHTUNG: Die optimale Vorschubgeschwindigkeit variiert je nach Art des Verarbeitungsmaterials. Schalten Sie die Mühle sofort aus, wenn die Verarbeitungsgeschwindigkeit aufgrund von Partikelreibung in der Schneidkammer abnimmt oder wenn die Bildung von geschmolzenem Polymer auf der Glasplatte beobachtet wird, um eine Überhitzung und ein weiteres Schmelzen der Polymerpartikel zu verhindern.
  8. Entfernen Sie das 20-mesh-Abgaberöhrchen (840 μm), und ersetzen Sie es nach Abschluss der ersten Charge durch das Verabreichungsröhrchen mit 60 Mesh (250 μm) (Abbildung 2b).
  9. Geben Sie das gesammelte Material wieder in den Mühlentrichter. Befolgen Sie die Schritte 1.1 und 1.7 für die 250 μm Mahlfraktion.
  10. Führen Sie die gesammelten 250 μm-Fraktionen bis zu dreimal wieder ein.
  11. Gewinnen Sie die verbleibenden Partikel in der Kammer zurück und fügen Sie sie der gesammelten Hauptfraktion hinzu.

2. Verarbeitung von Kunststofffolien durch kryogene Vorbehandlung und Mahlen

  1. Entnehmen Sie eine Folienprobe von der Rolle und schneiden Sie die Probe mit einem Papierschneider in Streifen von ~120 mm (Querrichtung) x 20 mm (Maschinenrichtung).
  2. Fragmente (~1 g) in 800 mL entionisiertem (DI) Wasser für 10 min in einem 1000 ml Glasbecher voreinweichen. Dieser Schritt verbessert die Versprödung für den anschließenden kryogenen Kühlprozess durch Vortränken des Polymers.
    ACHTUNG: Behandeln Sie flüssigen Stickstoff mit Sicherheitsausrüstung mit kryogenen Handschuhen und Schutzbrillen.
  3. Geben Sie langsam 200 ml flüssigen Stickstoff (N2) in einen kryogenen Behälter.
  4. Die vorgetränkten Filmpartikel werden vorsichtig mit einer Stahlpinzette in den kryogenen Behälter überführt. 3 min in FlüssigkeitN2 voreinweichen.
  5. Die gefrorenen Filmfragmente werden in einen 200-W-Mischer mit 14 Gängen überführt.
  6. Verarbeiten Sie das gefrorene Material auf Geschwindigkeitsstufe 3 für 10 s, um die gefrorene Glasfilmstruktur zu brechen. Um eine weitere Zerkleinerung zu fördern, fügen Sie 400 mL DI-Wasser hinzu und mischen Sie die Film-Wasser-Aufschlämmung für 5 min.
  7. Die Gülle in einen Büchner-Trichter mit Filter (1 μm Maschenweite) geben und mindestens 1 h Vakuum anlegen.
  8. Vakuumtrockene Feststoffpartikel bei 30 °C für mindestens 48 h in einer Aluminiumschale.
  9. Trockene Partikel mit einer Pinzette in die Mühle geben. Führen Sie zum Fräsen die Schritte 1.1-1.11 aus.

3. Verarbeitung von Kunststofffolien, die durch Umweltverwitterung und Fräsen vorbehandelt wurden

  1. Legen Sie Kunststofffolienfragmente, die vom Feld geborgen wurden, auf einer glatten Oberfläche (Labortisch) aus. Absorbierte Bodenpartikel und Pflanzenreste vorsichtig mit der Weichborstenbürste entfernen.
  2. Schneiden Sie den Film mit einer Schere in ~4 cm2 Proben von ~1,0 g.
  3. Filmfragmente in ein 1000-ml-Becherglas geben, das mit 500 mL DI-Wasser gefüllt ist. Mit einer Geschwindigkeit von 300 min-1 mit 20 mm Rührstab 1 h rühren.
  4. Entfernen Sie gelöste Bodenpartikel durch Dekantieren und erneutes Einbringen von DI-Wasser unter leichtem Rühren des Becherglases in eine Spüle oder einen Plastikeimer. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Kontinuierliches Rühren hält Bodenpartikel im Wasser verteilt und kann leichter dekantiert werden.
  5. Proben aus dem Becherglas in eine Aluminiumschale geben. Die Kunststoffproben werden 12 h an der Luft getrocknet und anschließend 24 h in einem Vakuumofen bei 30 °C umgefüllt und getrocknet. Führen Sie zum Fräsen die Schritte 1.1-1.11 aus.

4. Siebvorgang durch kaskadierte Siebe

  1. Stapeln Sie die Siebe (3 Zoll im Durchmesser), beginnend mit der Pfanne am Boden, gefolgt vom feinsten Sieb (# 325; 45 μm) und dann von immer gröberen Sieben (wie # 140; 106 μm und # 60; 250 μm, wobei das # 20; 840 μm Sieb das gröbste ist) und legen Sie den Deckel darauf.
  2. Montieren Sie alle vier Siebe auf dem Shaker, indem Sie vier Stifte in die Öffnungen des Siebschüttlers einführen.
  3. Übertragen Sie einzelne Fraktionen, die in Schritt 1, 2 oder 3 gesammelt wurden, auf die vier kaskadierten Siebe. 10 min bei 300 min-1 schütteln.
  4. Gewinnen Sie die größere (obere) Fraktion separat zurück, die einem weiteren Mahlen unterzogen wird.
    HINWEIS: Stellen Sie die Schüttelgeschwindigkeit am Shaker nach Bedarf ein. Alternativ ist ein Schütteln von Sieben von Hand möglich. Verwenden Sie jeweils nur ein Sieb, beginnend mit dem Sieb Maschen #20: Halten Sie den Boden und den Deckel von Hand fest gegen das Sieb und schütteln Sie axial und horizontal für 5 Minuten.
  5. Siebpartikel von dp > 106 μm werden wie in den Schritten 1.6-1.10 beschrieben wieder in die Rotationsschneidmühle eingebracht.
  6. Gewinnen Sie die unteren Fraktionen aus der Pfanne zurück und führen Sie die Partikel wieder in die nächstkleinere Siebgröße ein. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 106 μm Partikel die Hauptfraktion darstellen.
  7. Die gesammelten 106 μm Fraktionen zusammenführen und die Partikel an einem trockenen Ort (Exsikkator oder luftversiegelter Plastikbeutel) aufbewahren.
    HINWEIS: Die 45 μm Fraktion ist Teil der 106 μm Fraktion; Die erste Fraktion wurde jedoch nicht isoliert und separat analysiert, da die Ausbeute im Allgemeinen sehr gering ist. Ausbeutegewinnungsraten und Partikelgrößenanteile einzelner Fraktionen können durch gravimetrische Messungen in Gew.-% für jede Siebfraktion (Mesh #20 - Mesh #325) in Bezug auf die anfängliche Fütterungsfraktion unter Verwendung einer hochpräzisen Mikrowaage bestimmt werden.

5. Vorbereitung einer wässrigen NP-Aufschlämmung für die Nassvermahlung

  1. Bereiten Sie eine Aufschlämmung aus in DI-Wasser dispergierten MPs vor, indem Sie 800 mL destilliertes Wasser in das 1000-ml-Glasbecherglas geben und einen Rührstab einführen (Durchmesser = 8 mm, Länge = 50,8 mm).
  2. 8 g der 106 μm Kunststofffraktion aus den Schritten 1, 2, 3 oder 4 werden in DI-Wasser eingebracht, wodurch eine Aufschlämmung von 1 Gew.-% entsteht.
  3. Stellen Sie das Glasbecherglas auf eine Rührplatte und rühren Sie 24 h bei 400 min-1 magnetisch um, um die Partikel in Wasser einzuweichen und die Partikelenthärtung zu fördern.
  4. Die Partikel in einen 1000 ml Kunststoffbehälter geben.
  5. Füllen Sie zwei weitere 1000-ml-Kunststoffbehälter mit DI-Wasser, mit dem während des Mahlvorgangs anhaftende Partikel auf dem Trichter des Mahlwerks abgespült werden.

6. Vorbereitung der Nassschleifmaschine für die NP-Produktion

  1. Legen Sie Steine mit einer Korngröße von 46 (Körnung eines Schleifsteins = 297-420 μm) in die nasse Friktionsschleifmaschine und befestigen Sie die Mittelmuttern handfest mit einem 17 mm Schraubenschlüssel.
  2. Fügen Sie den Trichter oben hinzu und befestigen Sie die drei Muttern und Schrauben mit dem 17-mm-Schlüssel.
  3. Stellen Sie ein 1 L Plastiksammelgefäß unter den Auslass des Colliders. Stellen Sie einen zweiten leeren 1-L-Eimer neben den Auslass, der während der Verarbeitung zum Austausch verwendet wird.
  4. Stellen Sie das Messspiel auf + 1,0 ein, was einer positiven Verschiebung von 0,10 μm von der Nullstellung entspricht.
  5. Schalten Sie das Gerät ein und drehen Sie das Einstellrad vorsichtig im Uhrzeigersinn, bis sich die Schleifsteine berühren. Stellen Sie dann den flexiblen Messring auf Null und drehen Sie das Rad sofort gegen den Uhrzeigersinn. Standardmäßig ist die Drehzahl auf 1500 min-1 eingestellt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie das "Trockenschleifen" der Steine, da dies zu viel Hitze auf den Schleifsteinen erzeugt.
  6. Drehen Sie das Einstellrad im Uhrzeigersinn, bis sich die Steine berühren und füllen Sie vorsichtig die Wasser-NP-Aufschlämmung in den Trichter. Verringern Sie den Spalt kontinuierlich auf ein Lichtraumprofil von -2,0, was einer negativen Verschiebung von 0,20 μm von der Nullposition nach dem Einbringen der Gülle entspricht. Kunststoffpartikel-Wasser-Schlämme zwischen den beiden Steinscheiben fördern die Umwandlung von MPs in NPs und vermeiden direkte Reibung zwischen den Schleifsteinen.
  7. Sammeln Sie die Gülle, indem Sie die Auffangeimer austauschen, sobald der Füllstand im Eimer 0,5 l überschreitet.
  8. Sammeln Sie die Partikel und führen Sie sie zwischen 30-60 Mal wieder in die Mühle ein; Höhere Durchgänge (Anzahl der Wiedereinführungen) führen zu kleineren Partikelgrößen.
  9. An den Trichter adsorbierte Partikel mit der vorbereiteten DI-Wasserflasche waschen, um eine geeignete Güllemischung während der Verarbeitung zu ermöglichen.
    HINWEIS: Die Entnahme von Zwischenproben während des Prozesses ist möglich, indem 20-ml-Glasfläschchen in den Auslassstrom gehalten werden. In den einzelnen Schritten werden die Partikelfragmentierungsmechanismen bewertet, während der Schweregrad des Prozesses (Anzahl der Durchgänge) zunimmt. Die Aufschlämmung zurückgewinnen und 4 h bei 400 min-1 bei 25 °C für eine gute Mischung rühren; Lassen Sie die Gülle 48 h stehen, um sich zu stabilisieren.

7. Rückgewinnung und Trocknung von NP aus der Gülle

  1. Isolieren Sie die untere Fraktion (oder Phase mit der höchsten NP-Konzentration), wenn mehrere Schichten in der Aufschlämmung beobachtet werden, indem Sie die Aufschlämmung langsam in ein zusätzliches 1000-ml-Glasbecherglas gießen.
  2. Die Fraktionen in Zentrifugationsfläschchen (50 ml) geben und 10 min zentrifugieren (relative Zentrifugalkraft [RCF] = 20 x 102 g). Die RCF (auch g-Kraft genannt) ist die erzeugte Radialkraft in Abhängigkeit vom Rotorradius und der Rotordrehzahl, die eine Trennung der schwereren Partikel und des Wassers der Gülle bewirkt.
  3. Entfernen Sie die transparente Deckschicht, indem Sie sie in eine separate Aluminiumpfanne dekantieren.
  4. Die restliche untere Schicht (mit NP-Aufschlämmung) in eine zusätzliche Aluminiumschale geben und für 48 h in einen Vakuumofen bei 30 °C legen.
  5. Erholen Sie getrocknetes Material mit einem Spatel unter einem Abzug oder Handschuhfach, während Sie eine Atemschutzmaske tragen. Den getrockneten Inhalt in einen 100 ml Glasbehälter geben und mit einem Deckel verschließen.
  6. NPs in einer Durchstechflasche enthalten und an einem luftdichten, trockenen und kühlen Ort (z. B. einem Exsikkator) aufbewahren.
    HINWEIS: MNPs, die während des Herstellungsprozesses (hier entweder während des Nassmahlprozesses oder als getrocknete Partikel) in die Umwelt freigesetzt werden, können eine ernsthafte Bedrohung für aquatische und terrestrische Ökosysteme darstellen. Insbesondere sollen regulatorische Maßnahmen das Risiko für ihre Herstellung und Verwendung für technisch hergestellte Nanomaterialien minimieren30. Daher erfordert die Bildung von MNPs spezifische Vorsichtsmaßnahmen wie die Materialhandhabung in einem Abzug oder Handschuhfach. Darüber hinaus werden wässrige Abfalllösungen, die bei der Isolierung von NPs entstehen (Schritte 6.7-6.9), einem End-of-Life-Entsorgungsverfahren unterzogen, das von der Abteilung für Umweltgesundheit und -sicherheit durchgeführt wird.

8. MP-Bildgebung mittels Stereomikroskopie

  1. Dispergieren Sie ~ 20 mg Partikel (gesammelt in Schritt 4) auf einer Oberfläche von ~ 4 cm2. Verteilen Sie weiße oder durchscheinende Abgeordnete auf einer dunklen Oberfläche und verteilen Sie schwarze oder dunkle Abgeordnete auf einem weißen Hintergrund (Papierblatt), um den Hintergrundkontrast zu maximieren.
  2. Stellen Sie das Mikroskop auf die niedrigste Vergrößerung ein, um den größtmöglichen Bereich (Mitte des Partikelbereichs) zu erfassen. Als nächstes richten Sie die externe Lampe auf das Fokuszentrum, um die Beleuchtung der interessierenden Bereiche zu erreichen.
  3. Wenden Sie eine Vergrößerung an, die die Detektion von >50 Partikeln in der Mitte des Sichtfeldes ermöglicht. Dieser Betrag wird empfohlen, um belastbare statistische Auswertungsergebnisse zu erhalten.
  4. Konzentrieren Sie sich auf Bereiche ohne oder mit geringer Partikelüberlappung und gutem Farbkontrast.
  5. Nehmen Sie mindestens fünf repräsentative Bilder auf, indem Sie sich auf die äußeren Partikelformen konzentrieren. Der lokale Computer, der für das Imaging verwendet wird, speichert hochauflösende Bilder als Bitmap in der Software.
  6. Speichern Sie die vom Stereomikroskop aufgenommenen Bilder in einem von ImageJ erkannten Dateiformat (Bitmap, tiff oder jpeg) für die folgende quantitative Datenanalyse.
    HINWEIS: Nehmen Sie ein Referenzbild mit den genauen Vergrößerungseinstellungen auf, für die das Hauptbild mit einem Lineal oder einem anderen im Bild aufgezeichneten Referenzobjekt aufgenommen wurde. Dieses Verfahren ermöglicht eine einfache Kalibrierung der Bilder bei der Vorbereitung und Analyse durch die ImageJ-Software.

9. Bildanalyse durch ImageJ

  1. Öffnen Sie die ImageJ-Software31 und bereiten Sie den Dateiimport vor, indem Sie (STRG + L) eingeben, um den Befehlsfinder zu öffnen. Als nächstes geben Sie Bio-Formate in der rechten unteren Ecke ein. Diese Funktion aktiviert den Menüpfad Datei > Import > Bioformate (> bezieht sich auf Navigationsschritte innerhalb der Software). Suchen Sie nach dem Verzeichnis der gespeicherten Bilddateien.
    HINWEIS: Wenn das Paket Bio-Formate nicht im Befehlsfinder angezeigt wird, suchen Sie online unter Bio-Formats ImageJ. Folgen Sie den Anweisungen zum Herunterladen und Installieren von ImageJ. Der Bio-Formate-Importer ermöglicht die einfache Handhabung des Importierens/Exportierens von Bilddateien in ImageJ und die Suche nach Befehlen.
  2. Öffnen Sie das Bild (alternativ Import von Bioformaten wie in Schritt 9.1 beschrieben), indem Sie auf Datei > Öffnen klicken > Partikelbild an dem in Schritt 4.7 gesammelten Dateispeicherort und das in Schritt 1.6 beschriebene Linealreferenzbild auswählen. Es wird empfohlen, ein dupliziertes Bild zu erstellen, indem Sie Umschalt + Befehl + D drücken, um es mit dem Originalbild zu vergleichen, während Sie die Schwellenwerteinstellungen des Kopierbilds anpassen.
    Hinweis: Der Befehl Datei > Öffnen öffnet verschiedene Formate, die von ImageJ nativ unterstützt werden, wie in Schritt 8.7 beschrieben. Alternativ können Sie den Bildspeicherort auf dem Computer auswählen und die Datei per Drag & Drop in die Statusleiste des ImageJ-Hauptfensters ziehen. Die Bilddatei wird automatisch in einem separaten Fenster geöffnet.
  3. Vergrößern und verkleinern Sie das Bild mit STRG+ bzw. STRG -.
  4. Legen Sie die Maße fest, indem Sie auf Analysieren > Maße festlegen klicken und dann Flächen- und Formdeskriptoren als Standardwerte auswählen.
  5. Definieren Sie die Maßstabsleiste, indem Sie eine Linie gerade über die Länge der Maßstabsleiste zeichnen, indem Sie das Lineal-Referenzbild verwenden, wie in Schritt 8 beschrieben. Drücken Sie Analysieren > Skala festlegen und geben Sie unter Bekannter Abstand den numerischen Wert der Balkenlänge und die Einheit der entsprechenden Länge ein.
  6. Visualisieren Sie die Maßstabsleiste auf dem Bild, indem Sie auf > Tools analysieren > Maßstabsleiste klicken, und passen Sie Einstellungen an, z. B. die Anzeige eines gestochen scharfen Kontrasts im Bild. Wählen Sie eine Position im Bild aus, an der die Maßstabsleiste für die Einstellungen der Maßstabsleiste platziert werden soll. Wählen Sie Breite , um den Balken in kalibrierten Einheiten anzupassen, Höhe des Balkens in Pixel und Schriftgrad der Maßstabsleistenbeschriftung. Wählen Sie Hintergrund aus, um die Füllfarbe des Beschriftungstextfelds anzupassen.
    HINWEIS: Für Mikrometer ist die Eingabe von μm ausreichend; Das Programm passt μm automatisch in der Datenausgabe an.
  7. Wandeln Sie das Bild in ein 8-Bit-Bild um, indem Sie Bild > Typ > 8-Bit auswählen.
  8. Konvertieren Sie das kopierte Bild in 8-Bit, indem Sie Bild auswählen > Geben Sie > 8-Bit ein.
  9. Anpassen durch Auswahl von Bild > Anpassen > Schwellenwert > Festlegen (Größe mit dem Originalbild vergleichen).
  10. Bestimmen Sie, welche Messungen durchgeführt werden sollen, indem Sie Analysieren > Messungen festlegen auswählen.
  11. Wählen Sie Partikel analysieren > 0-unendlich aus, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen, und zeigen Sie sie vor Ort an.
  12. Speichern Sie die ROI-Ergebnisse (.zip) unter Messungen speichern und Ordner auswählen.
  13. Speichern Sie die Ergebnisse (*.csv) unter Datei > Speichern unter > Ordner auswählen.

10. Partikeldurchmesser (dp) und Formfaktorberechnung in Tabellenkalkulationssoftware

HINWEIS: Die Kenntnis des Partikeldurchmessers und der Formfaktoren ist für das Partikelverhalten (Verbleib, Transport) in der Umwelt und die Bestimmung der Oberfläche unerlässlich. Daher ist die Geometrie unerlässlich, wenn MPs für Umweltstudien verwendet werden. Zum Beispiel wurden unterschiedliche Wechselwirkungsmechanismen mit dem Boden in Abhängigkeit von den Größen und Formen der MPs beobachtet, wie MP-MP und MP-Bodenagglomerationen, die die Partikelbewegung im Boden beeinflussen15,32. Daher werden die folgenden Schritte vorgeschlagen, um die d p-Partikelgrößenverteilung und den geometrischen Parameter zu bestimmen.

  1. Importieren Sie die entsprechende *.csv-Datei, die Sie aus der ImageJ-Analyse (Schritt 9.13) erhalten und gespeichert haben, in die Tabellenkalkulationssoftware.
    HINWEIS: Die numerischen Werte in jeder Spaltenzeile spiegeln individuelle Berechnungen für jedes Teilchen gemäß Gleichung 1 und Gleichung 2 wider.
  2. Werten Sie die durchschnittlichen Formparameterwerte wie Zirkularität (CIR) und Seitenverhältnis (AR) aus, indem Sie = Durchschnitt (x,y) am unteren Rand jeder Spalte eingeben, wobei x die erste Zeile und y letzte Zeile der Spalte darstellt, und drücken Sie dann die EINGABETASTE. Die CIR-Werte beschreiben die Beziehung zwischen der projizierten Fläche und dem perfekten Kreis mit dem CIR = 1 eines einzelnen Teilchens (Gleichung 1). Der AR stellt das in Gleichung 2 beschriebene Verhältnis von Partikellänge zu Breite dar.
  3. Bestimmen Sie, ob der durchschnittliche AR 2,5 <, und berechnen Sie dann dp-Werte in einer neuen Spalte mithilfe von Gleichung 3. Wenn AR 2,5 ≥, berechnen Sie dp-Werte , die Gleichung 4 widerspiegeln. Fügen Sie eine neue Spalte hinzu, um dp basierend auf der von der ImageJ-Ausgabe empfangenen Flächenspalte zu berechnen.
    HINWEIS: Die Auswahl der AR-Schwellenwerte ≥ 2,5 steht für mehr rechteckige Partikel, während AR < 2,5 mehr runde Partikel widerspiegelt. Diese Auswahl ermöglicht es, den dp-Berechnungsfehler zu minimieren, der sich aus der mikroskopisch gemessenen und durch ImageJ ermittelten Fläche ergibt.
    (1) Equation 1
    (2) Equation 2
    (3) Equation 3
    (4) Equation 4

11. Statistische Auswertung für Abgeordnete und NPs

  1. Öffnen Sie die *.csv Datendatei mit der Statistiksoftware über Datei > Öffnen > Wählen Sie den Dateispeicherort der entsprechenden Datei aus, wie in Schritt 9.13 erstellt.
    HINWEIS: Alternativ kann die Tabelle auch direkt über die Copy-Paste-Funktion in die Statistiksoftware übertragen werden. Im Materialverzeichnis finden Sie die Marke und die Version der Statistiksoftware Edit > Paste with column names.
  2. Werten Sie die dp-Daten aus, indem Sie Analyze > Distribution auswählen.
  3. Wählen Sie dp aus , das die Daten der Spalte widerspiegelt, ziehen Sie es per Drag & Drop in Y-Spalten und drücken Sie die Taste OK . Diese Funktion erstellt ein Histogramm mit einer statistischen Ausgabe, einschließlich Zusammenfassungsstatistiken, Mittelwert und Std Dev-Werte in einem separaten Fenster.
  4. Bewerten Sie, ob das Histogramm einer Normalverteilung (oder der besten Anpassung für d p) mit der besten Anpassungskurve folgt, indem Sie das Dreieck neben d p > Kontinuierliche Anpassung auswählen und dann die erhaltene Kurve als beste Anpassung auswählen (z. B. An Normal anpassen). Dieser Schritt überlagert das Histogramm mit einer normalverteilten Anpassung.
  5. Bestimmen und melden Sie die Mittelwert- und Standardabweichungswerte aus der Zusammenfassungsstatistikausgabe der durchschnittlichen Formparameterwerte für Zirkularität (Cir), Seitenverhältnis (AR), Rundheit (Rund) und Festigkeit (Sol).
    HINWEIS: Ein statistisches Signifikanzniveau von α = 0,05 wird empfohlen und wurde für alle Auswertungen verwendet. Das Signifikanzniveau ist die Wahrscheinlichkeit, die Nullhypothese abzulehnen, wenn sie beim Vergleich numerischer Ergebnisse wahr ist.

12. Beste Anpassung der dp Größenverteilung und Partikelformfaktoren

  1. Laden Sie den Datensatz in eine Statistiksoftware und verwenden Sie den gleichen *.csv Datensatz für die Verteilung von dp , wie in Schritt 10 berechnet.
  2. Wählen Sie Analyze > Reliability and Survival > Life Distribution aus.
  3. Ziehen Sie die Spalte dp in das Feld Y, Time to Event, und wählen Sie OK aus. Dieses Feature erzeugt eine Ausgabe mit einem Wahrscheinlichkeitsdiagramm als Funktion von dp.
  4. Bestimmen Sie die optimale Verteilung unter Verteilungen vergleichen , indem Sie Nichtparametrisch, Lognormal, Weibull, Loglogistic und Normal aktivieren.
  5. Bewerten Sie die Qualität der Modellanpassungen anhand der niedrigsten numerischen Werte für die Akaike- und Bayes'schen Informationskriterien (AIC bzw. BIC) in der Vergleichstabelle des Statistikmodells unterhalb der Grafik anhand der niedrigsten BIC-Zahlen . Das Modell mit der besten Passform wird standardmäßig in der ersten Zeile angezeigt. Parametrische oder nicht parametrische Schätzungsausgabefelder für jede Verteilungsauswertung befinden sich unterhalb des Diagramms Verteilungen vergleichen .
  6. Speichern Sie das Ausgabeskript in der Datentabelle, indem Sie das rote Pulldown-Dreieck in der oberen linken Ecke unter Skript speichern > In Datentabelle auswählen. Speichern Sie anschließend die ursprüngliche Datentabelle am gewünschten Dateispeicherort, indem Sie Datei > Speichern unter > *.jmp auswählen.

13. Dimensionale Charakterisierung von NPs durch dynamische Lichtstreuung

  1. Starten Sie die Software zur dynamischen Lichtstreuung (DLS), indem Sie auf das Desktop-Symbol doppelklicken. Wählen Sie Datei > Neu > SOP aus. Fügen Sie den Probennamen hinzu und wählen Sie den Materialbrechungsindex auf 1,33 für destilliertes Wasser und 1,59 für Polymere33 in der DLS-Software unter Probeneinrichtung aus. Wählen Sie im Pulldown-Menü Material aus, und klicken Sie dann auf OK.
    HINWEIS: Durch Klicken auf das Pulldown-Menü wird der Materialmanager geöffnet, in dem Sie neue Proben hinzufügen oder vorhandene Proben durch Ändern des Brechungsindex und der Absorption ändern können. Wählen Sie als Dispergiermittel Wasser.
  2. Wählen Sie die richtige Zelle unter Zelle > Zelltyp aus, und wählen Sie Berichte aus, um festzulegen, welche Ausgabe nach jeder Messung angezeigt wird.
  3. Starten Sie das Gerät, indem Sie den Instrumentendeckel schließen und das System einschalten, indem Sie den Deckel schließen (falls geöffnet) und die ON-Taste drücken. Warten Sie nach dem ersten Signalton und warten Sie etwa 30 Minuten, um die Stabilisierung des Strahls zu ermöglichen.
  4. Warten Sie, bis die Initialisierungsroutine abgeschlossen ist, und warten Sie auf einen zweiten Signalton, der anzeigt, dass die voreingestellte Temperatur (in der Regel 25 °C) erreicht wurde.
  5. Bereiten Sie eine Probenaufschlämmung aus NPs (wie in Schritt 7 erhalten) und DI-Wasser in einer 15-ml-Durchstechflasche bei einer Konzentration von ~ 0,1 Gew.-% durch magnetisches Rühren für ~ 1 h vor, damit sich gut mischen kann.
  6. Schütteln Sie die Aufschlämmung, bevor Sie ~ 1,0 ml in die 4,5 ml Quarzküvette geben und den Deckel öffnen. Führen Sie dann die Probenzelle vorsichtig in den Probenhalter des DLS-Instruments ein.
    ANMERKUNG: Bereiten Sie drei Proben derselben Güllecharge in derselben Konzentration vor, wie in Schritt 13.5 beschrieben.
  7. Führen Sie für jede Probe drei Messungen (Auswahl in der DLS-Software) durch. Entfernen Sie zwischen den Messungen die Probenzelle und schütteln Sie die Proben vorsichtig für 5 s, um das Mischen der Probe zu ermöglichen.
  8. Extrahieren und exportieren Sie Daten über die DLS-Software, übertragen Sie das Dataset in die Tabellenkalkulationssoftware, und erstellen Sie Histogramme für MPs und NPs, wie in den Schritten 11.1-11.5 beschrieben (Abbildung 1). Kopieren Sie von der Registerkarte Datensatzansicht entweder eine Tabelle oder ein Diagramm , indem Sie Bearbeiten-Kopie auswählen, die in eine andere Anwendung wie die Tabellenkalkulationssoftware eingefügt werden kann.

14. Chemische Analyse von MNPs mittels Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Spektrometrie-attenuated total reflectance (ATR)

HINWEIS: Chemische Analysen von MNPs mittels Fourier-Transformations-Infrarot- (FTIR) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) sind gut geeignete Werkzeuge, um den Einfluss des Nassmahlens auf die chemischen Bindungseigenschaften sowie die relativen Mengen der Hauptkomponenten und der monomeren Bestandteile der Polymere zu beurteilen10. Darüber hinaus können die thermischen Eigenschaften und die Stabilität der polymeren Bestandteile von MNPs durch dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) bzw. thermogravimetrische Analyse (TGA) beurteilt werden29.

  1. Reinigen Sie das Detektionssystem (ATR-Kristalloberfläche) mit Ethanol und einem fusselfreien Tuch.
  2. Starten Sie die Software und drücken Sie die Hintergrundtaste in der Befehlsleiste, um einen Hintergrundscan in der Luft durchzuführen, indem Sie den Instrumentenstrahlpfad löschen. Das Hintergrundspektrum wird kurz nach der Erfassung angezeigt.
  3. Geben Sie Sample-ID und Sample Description ( Proben-ID ) und Sample Description (Proben-ID ) in der Symbolleiste der Geräteeinstellungen ein.
  4. Stellen Sie die Spektralwellenzahl zwischen 4000 cm-1 und 600 cm-1 ein und wählen Sie eine Auflösung von 2,0 cm-1 im Absorptionsmodus. Wählen Sie 32 Scans pro Spektrum aus und starten Sie.
  5. Legen Sie eine Kunststoffprobe (~20 mg oder ~ 1-3 mm3) von MPs (106 μm) und NPs (~300 nm) in eine Stahlscheibe mit einem Innendurchmesser von ~10 mm oder gleichwertig auf die Kristalloberfläche.
    HINWEIS: Die Unterlegscheibe verhindert die Dispergierung auf Kristall, wenn der Probenhalter die Probe komprimiert, was zu Materialinhomogenitäten und Datenverzerrungen aufgrund inkonsistenter Messungen führt.
  6. Platzieren Sie die Unterlegscheibe in der Mitte des ATR-Kristalls und geben Sie die Polymerprobe mit einem Spatel in die Mitte der Unterlegscheibenöffnung.
  7. Schwenken Sie den Probenhebel oben in die Mitte der Probe und drehen Sie den Knopf im Uhrzeigersinn, indem Sie die Kraftmesskraft zwischen 50-90 überwachen. Das Beispiel zeigt die vorläufigen Spektren. Drücken Sie die Scan-Taste ein zweites Mal, um das Spektrum zu erfassen.
  8. Sammeln Sie zwischen 8-10 Spektren, indem Sie auf die Schaltfläche Scannen klicken, und mischen Sie die Proben nach jeder Messung sorgfältig mit einem Spatel, um die Sammlung repräsentativer Ergebnisse zu ermöglichen.
  9. Klicken Sie im Daten-Explorer auf den Ordner Beispielansicht, um alle gesammelten Samples im Anzeigebereich anzuzeigen. Entfernen Sie zunächst deutlich abweichende Spektren, die Ausreißer darstellen. Wählen Sie anschließend entweder Absorptions- oder Transmissionsmodus in der Symbolleiste aus.
  10. Speichern Sie Spektren, indem Sie den Ordner Beispielansicht auswählen, der die Spektren enthält, und im Menü Datei die Option Speichern unter auswählen . Das Dialogfenster aktiviert den Dateinamen, das Zielverzeichnis und die Standardspeicherortänderung für alle Spektren.
    HINWEIS: Alternativ können die Spektren als *.sp-Datei gespeichert werden, indem Sie ein Spektrum auswählen und mit der rechten Maustaste klicken, um die Option Binary anzuzeigen. Wählen Sie Binärdatei speichern aus, und durchsuchen Sie den endgültigen Speicherort.
  11. Führen Sie die Baseline-Korrektur und die mittlere Normalisierung durch, indem Sie ein einzelnes Spektrum im Daten-Explorer auswählen, indem Sie im Menü entweder über die Software oder im nächsten Schritt Process > Normalization auswählen.
    HINWEIS: Die mittlere Normalisierung kompensiert spektrale Fehler aufgrund der Dicke oder Materialvariation in der Probe.
  12. Reinigen Sie den Kristallbereich nach Abschluss der Datenerfassung mit Ethanol und fusselfreiem Tuch.
  13. Interpretieren Sie Unterschiede zwischen MPs und NPs gemäß den zugewiesenen FTIR-Vibrationsbändern, die in einer früheren Publikation zugewiesen und bewertetwurden 10.

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Representative Results

Zur Validierung der experimentellen Verfahrensmethode und Analyse wurden MPs und NPs aus Pellets und Folienmaterialien gebildet und anhand mikroskopischer Bilder nach Größe und Form verglichen. Das in Abbildung 1 beschriebene Verfahren formte effizient MPs und NPs aus biologisch abbaubaren Kunststoffpellets und -folien; Dies wurde durch kryogene Kühlung, Mahlen und Nassmahlen und Charakterisierung erreicht. Der erste Schritt war für umweltverwitterte Folien unnötig, da die Verwitterung zu Versprödung führte (Astner et al., unveröffentlicht). Die Pellets wurden auch direkt ohne kryogene Vorbehandlung gemahlen. Nach dem Mahlen wurden die Partikel durch Sieben in vier Größenfraktionen fraktioniert: 840 μm, 250 μm, 106 μm und 45 μm, wie in Protokollschritt 4 beschrieben. Die letzten drei Fraktionen bestanden ausschließlich aus Abgeordneten. Anschließend wurde die Partikelcharakterisierung für jede Fraktion bewertet, indem die Verteilung der Größe (dp) und der Formfaktoren (d. h. Zirkularität und Aspektverhältnis) der gesammelten stereomikroskopischen Bilder unter Verwendung der ImageJ-Software bestimmt wurde, wie in den Schritten 8.1-8.6 angegeben. Beispiele für Bilder, die mit einem Stereomikroskop aufgenommen wurden, sind für die 106 μm Siebfraktion für PBAT-Pellets (Abbildung 3a,c) und die 250 μm Siebfraktion sowie für unverwitterte PBAT-Folien gezeigt, die mit kryogener Exposition behandelt wurden (Abbildung 3b,d).

Die statistische Analyse der Partikelabmessungen ergab einen durchschnittlichen dp, der 41 μm kleiner war als die nominale Siebgröße (106 μm) für das PBAT-Pellet und 137 μm kleiner für die PBAT-Folie (250 μm Nenngröße), was darauf hindeutet, dass die kleinere Siebfraktion eine homogenere Partikelgrößenverteilung darstellt (Tabelle 1). Diese Beobachtung wurde auch durch einen höheren Wert in der Zirkularität und niedrigere Aspektverhältnisse (was auf mehr runde Partikel hindeutet) für die verarbeiteten Pellets im Vergleich zum Folienmaterial bestätigt, was auf die unterschiedlichen Eigenschaften (Dichte) der Ausgangsmaterialien zurückzuführen ist. Eine Normalverteilung war das beste Modell, um die Partikelgrößenverteilung für beide Fraktionen zu beschreiben. Für die Bestimmung der Zirkularität und des Seitenverhältnisses waren jedoch die Modelle Weibull und Lognormal optimal (Abbildung 4a-d; Tabelle 1). Für beide Rohstoffe bildete ein Nassmahlprozess, der auf die 106 μm MP-Siebfraktionen angewendet wurde, NPs, deren Partikelgrößenverteilung über DLS gemessen wurde. Die numerische Analyse ergab eine bimodale Partikelgrößenverteilung für NPs, die aus beiden Rohstoffen hergestellt werden (Abbildung 5). Die Hauptpartikelpopulationen für NPs aus PBAT-Pellets lagen bei ~80 nm und 531 nm, und die entsprechenden NDF-Werte (Number Density Frequency) lagen bei 25% bzw. 5%. Auf der anderen Seite besaßen NPs, die von PBAT-Filmen abgeleitet wurden, Größenmaxima bei ~50 nm und 106 nm, mit entsprechenden NDF-Werten von 11% bzw. 10%. Die Beobachtungen deuten darauf hin, dass NPs aus PBAT-Pellets einheitlichere dp-Werte (~50-110 nm) lieferten als PBAT-Filme; Es existierte jedoch auch eine Partikelsubpopulation zwischen 300 nm und 700 nm mit einem Maximum bei 531 nm (Abbildung 5).

Die chemischen Bindungseigenschaften der PBAT-Folie wurden mittels FITR-Spektroskopie bewertet. Die Spektren zeigten nur geringfügige Veränderungen durch Fräsen für MPs und Nassmahlen für NPs in den Bereichen zwischen 1300 und 700 cm-1. Für die Mulchfolie wurde jedoch eine signifikante Abnahme der C-O-Dehnung von Stärken beobachtet, die die Absorption der Stärkekomponente10 widerspiegelt. Für die Banden, die PBAT repräsentieren, wie C-H- und C-O-Dehnung, wurden jedoch geringfügige Veränderungen zwischen 1800 cm-1 und 1230 cm-1 beobachtet, was auf unbedeutende Strukturänderungen des Polyesters hindeutet, die auf den Nassmahlprozess zurückzuführen sind (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm zur Bildung und Charakterisierung von Mikro- und Nanoplastik. Die Darstellung zeigt den Entstehungsprozess und die anschließende geometrische und chemische Partikelbewertung. Die geometrischen Eigenschaften wurden durch die Kombination von Stereomikroskopie und Bildanalyse (ImageJ) bestimmt, gefolgt von einer numerisch-statistischen Analyse. Die chemische Charakterisierung wie die molekulare Bindung wurde mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie unter Verwendung der abgeschwächten Gesamtreflexion (FTIR-ATR) durchgeführt. Die molekulare Struktur von Polymeren kann durch Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) als ergänzende Methode beurteilt werden (in dieser Studie nicht beschrieben). Für jeden Schritt werden die wichtigsten Punkte im folgenden Verfahren hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Bild 2: Rotationsschneidwerksapparatur. Bilder von (a) der Drehmühlenbaugruppe einschließlich des Aufgabetrichters, der vorderen Glasplatte und des Siebschlitzes; b) einzelne Förderrohre mit den Siebgrößen #20 (840 μm) und #60 (250 μm) werden beginnend mit dem gröberen Sieb in den Siebschlitz der Mühle eingesetzt; und (c) eine zweilagige Glasfrontplatte an der Vorderseite der Mahlkammer angebracht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Stereomikroskopische Aufnahmen von Mikroplastik (MPs), einschließlich softwareverarbeiteter Bilder. Die Bilder waren von MPs, die aus (a) PBAT-Pellets (106 μm Siebfraktion) und (b) PBAT-Folie (250 μm Siebfraktion) gewonnen wurden, die durch kryogene Exposition und anschließendes mechanisches Mahlen hergestellt wurden. Ein schwarzer Hintergrund wurde für die Abbildung weißer PBAT-Partikel (a) und ein weißer Hintergrund für einen schwarzen PBAT-Film (b) ausgewählt. Entsprechende Bilder wurden von der ImageJ-Software31 (c) bzw. (d) verarbeitet. Ein Best-Fit-Modell der Verteilung von dp, dargestellt in Histogrammen von Partikeln, die aus Stereographen von (e) PBAT-Pellets und (f) PBAT-Folie stammen, wird durch eine Normalverteilung dargestellt. Fehlerindikatoren spiegeln eine Standardabweichung wider. Ein Stereomikroskop sammelte stereomikroskopische Aufnahmen mit integriertem Kamerakopf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Partikelformfaktor-Verteilungshistogramme mit überlagerter bester Kurvenanpassung. Das Bild stellt MPs dar: (a) Zirkularität und (c) Seitenverhältnis für PBAT-Pellets und (b) Zirkularität und (d) Seitenverhältnis für PBAT-Film, basierend auf ImageJ-Analyse31. Stereomikroskopische Aufnahmen basieren auf zwei Siebfraktionen von PBAT-Pellets (106 μm) und PBAT BDM MPs (250 μm). Die numerische Auswertung erfolgte in der Statistiksoftware V 15. Stereographen und Histogramme stellen die entsprechenden Bilder dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Histogramme der Partikelgröße (dp) für NPs. Die Abbildung zeigt Partikelverteilungen aus PBAT-Folie und PBAT-Pellets, die bei der Nassmahlbehandlung der 106 μm MP-Siebfraktion entstanden sind. Kurven stellen das Weibull-Modell mit zwei Parametern dar, das an die Größenverteilung angepasst ist und mit der statistischen Software durchgeführt wird. Die Datenmessungen wurden mittels dynamischer Lichtstreuung durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6. Repräsentative FTIR-Spektren des MNP-Vergleichs zwischen verschiedenen Verarbeitungsschritten. Die Abbildung zeigt den Vergleich zwischen den Ausgangsbedingungen des PBAT-Films, PBAT-MPs und PBAT-NPs. Die PBAT-Folie wurde vor dem mechanischen Fräsen von MPs, bestehend aus der 106 μm Siebfraktion trocken gemahlener Kunststoffe, kryogen behandelt; NPs wurden durch Nassmahlen der 106 μm Siebfraktion MPs nach Trockenmahlen und Sieben hergestellt. Die Spektraldaten wurden mit einem Spektrometer gesammelt, das mit einem diamantgedämpften Gesamtreflexionsaufsatz (ATR) ausgestattet war. Die spektrale Datenanalyse wurde mit Hilfe der FTIR-Spektrumanalysesoftware durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

PBAT-Pellets PBAT-Film
Siebfraktion, μm 106 250
Normal dp, μm 65 113
Std Dev, μm 24 58
Zirkularität 0.68 0.47
Seitenverhältnis 1.73 2.33
Beste Passform, dp Normal Normal
Beste Passform, Zirkularität Weibull Weibull
Beste Passform, Seitenverhältnis Lognormal Lognormal
N 83 125

Tabelle 1: Repräsentative Partikelgrößen- und Formparameter. Die Ergebnisse wurden aus statistischen Analysen für MPs abgeleitet, die aus PBAT-Pellets und PBAT-Folien verarbeitet wurden, die in Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellt sind.

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Discussion

Diese Methode beschreibt ein effektives Verfahren, das erstmals in einer früheren Veröffentlichung29 beschrieben wurde, um MNPs aus Pellets und Mulchfolien für Umweltstudien herzustellen. Der Zerkleinerungsprozess umfasste kryogene Kühlung (nur für Folien), Trockenmahlen und Nassmahlstufen, um Modell-MNPs herzustellen. Wir haben diese Methode angewendet, um MNPs aus einer Vielzahl von polymeren Rohstoffen herzustellen, darunter Polyethylen niedriger Dichte (LDPE), Polybutyratadipat-Co-Terephthalat (PBAT) und Polymilchsäure (PLA)29 (Astner et al., Manuskript in Vorbereitung). Für LDPE konnten jedoch nur Pellets als Ausgangsmaterial dienen; Mulchfolien konnten aufgrund eines Verstärkungsgitters, das während der Extrusion in die Folie eingearbeitet wurde, nicht verarbeitet werden, wie in einer früheren Veröffentlichungbeschrieben 29.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls umfassen a) kryogene Vorbehandlung, Versprödung der im Allgemeinen flexiblen Folie, b) Fräsen zur Simulation der mechanischen Auswirkungen durch landwirtschaftliche Praktiken (Pflügen, Bodenbearbeitung) und c) Nassmahlen, das die Umweltscherereignisse zwischen MP-Bodenkollisionen nachahmt. MNPs, die durch diese Methode gebildet werden, stellen eher Partikel dar, die in landwirtschaftlichen Böden vorkommen, als Polystyrol-Mikro- und Nanokugeln. Letztere werden jedoch häufig als technische Modellmaterialien in Umweltstudien verwendet, die die Auswirkungen auf mikrobielle Bodengemeinschaften 34,35,36, Pflanzen 37 und Bodenfauna 38 untersuchen.

Verschiedene Methoden haben Ersatz-NPs erzeugt, einschließlich kryogenes Mahlen und Mahlen mit Rotations- und Kugelmühlen 39,40,41,42. Darüber hinaus wurde häufig das Mahlen in Kombination mit flüssigem Stickstoff verwendet, um MNPs 40,41,42,43,44,45 zu bilden. Im Gegensatz dazu wurde ein ultrazentrifugal trockenes Mahlverfahren (ohne kryogene Behandlung) in Kombination mit Nasskugelmahlen verwendet, um MPs bzw. NPs39 zu erzeugen. Im Gegensatz dazu verwendet das in diesem Artikel beschriebene Verfahren eine kostengünstige Kombination aus kryogenem Einweichen-Mischen-Mahlen-Mahlen, um MNPs aus Kunststofffolien zu erzeugen, um Umwelteinflüsse wie Witterungseinflüsse und mechanische Scherkräfte nachzuahmen. Daher verglich eine aktuelle Studie die mechanischen und chemischen Eigenschaftsänderungen zwischen kryogen geformten, umweltverwitterten landwirtschaftlichen Kunststofffolien. Die Ergebnisse zeigten statistisch signifikante Unterschiede in geometrischen Merkmalen, physikalisch-chemischen Eigenschaften und biologischer Abbaubarkeit der gebildeten MNPs (Astner et al., unveröffentlicht).

Eine Einschränkung des mechanisch-kryogenen Mahlverfahrens ist die relativ geringe Siebausbeute nach dem ersten Mahldurchgang (~10 Gew.%) von Fraktionen <840 μm, was zwei weitere Durchgänge erfordert, was zu einer längeren Verarbeitungszeit im Vergleich zu den größeren Fraktionen von >840 μm29 führt. Da die 46 μm Fraktionsausbeute zwischen 1 und 2 Gew.-% liegt, wurde die 106 μm Partikelfraktion für das Nassmahlverfahren zur Bildung von NPs verwendet. Darüber hinaus kann Reibung während des Mahlprozesses zu einer Überhitzung der Verarbeitungskammer führen, was zur Agglomeration und thermischen Zersetzung von Partikeln oder Filmfragmenten während des Mahlprozesses führt, wie in anderen Studienbeschrieben 29,46. Eine weitere Einschränkung des in diesem Beitrag beschriebenen kryogenen Mahlverfahrens ist die begrenzte Anwendung für Kunststoffe wie LDPE-Folien oder PBS-Pellets mit schlechten thermischen Eigenschaften (d.h. niedrige Glasübergangstemperaturen). Die ehemaligen Kunststoffe waren aufgrund der faserigen Struktur von LDPE-Folien nicht zerkleinerbar. Zudem verstopfte letzterer die Mühle, da mechanische Scherung die Temperatur in der Fräskammer erhöhte. Im Gegensatz dazu waren LDPE-Pellets leicht durch Mahlen ohne den Einsatz von kryogener Kühlung zu verarbeiten. Der Vergleich der d p s für MPs zeigt eine größere Abweichung für die 250 μm Fraktion von der Nennsiebgröße als die 106 μm dp-Fraktion. Beide Siebfraktionen folgten jedoch einer monodispersen Normalverteilung (Abbildung 3e,f und Tabelle 1), was auf ähnliche Abbaumechanismen für Film- oder Pelletrohstoffe hindeutet. Im Gegensatz dazu ergab die NP-Größenanalyse eine bimodale Verteilung für PBAT-Folien, ähnlich einer früheren Publikation29, und PBAT-Pellets mit repräsentativen Größenverteilungsspitzen bei 50 nm und 107 nm. Die Pelletverteilungsdaten wiesen jedoch Spitzen bei etwa 80 nm und 531 nm auf, was darauf hindeutet, dass der Abbau weniger gleichmäßig abläuft als in Filmen. Die Bedeutung des bisher etablierten Verfahrens liegt in der effizienten und kostengünstigen Kombination von Verarbeitungsschritten wie kryogene Vorbehandlung, Mahlen und Nassmahlen. Die Partikelgrößenverteilungen für NPs aus PBAT-Folien in dieser Studie ähneln einer Vorstudie zur NP-Bildung von biologisch abbaubaren Kunststoffen29, die durch eine bimodale Verteilung mit Partikelsubpopulationen von ~50 nm und ~200 nm gekennzeichnet ist; Letzteres führte jedoch zu etwas kleineren Partikeln (106 nm), wie in Abbildung 5 dargestellt, basierend auf der höheren Anzahl von Durchgängen (60) in dieser vorliegenden Studie, verglichen mit 27 Durchgängen, wie sie zuvor von Astner et al. durchgeführt wurden. 29. Diese Studie legt nahe, dass die NP-Bildung aus PBAT-Filmen den vorläufigen Studienergebnissen folgt.

Ein weiterer Beweis für die Robustheit dieser Methode ist, dass sich die chemische Zusammensetzung durch kryogene Behandlung, Mahlen und Nassmahlen nicht signifikant verändert hat (Abbildung 6). Darüber hinaus unterschieden sich die Unterschiede zwischen Rohstoffen wie Pellets vs. Folie (Partikelgrößenverteilung), durchschnittliche dp oder Formparameter nicht signifikant (Abbildung 3 und Abbildung 4). Über umweltverstreute MNPs und ihre ökotoxischen Auswirkungen auf terrestrische Organismen47,48 und marine Biota 49,50 wurde ausführlich berichtet. Während Böden jedoch das prominenteste globale Umweltreservoir für MNP-Translokation, -Abbau und -Bioakkumulation darstellen, führt das Fehlen robuster und einheitlicher Analysemethoden für diese Materialien zu entscheidenden Wissenslücken bei der Risikobewertung von MPs und NPs in terrestrischen Ökosystemen51. Folglich könnten zukünftige Anwendungen dieses Verfahrens die Herstellung und Charakterisierung von MNPs neu entwickelter Kunststoffmaterialien für landwirtschaftliche Polymerfolien (z. B. PBAT in Kombination mit Lignin) umfassen, um den ökologischen Verbleib und die Ökotoxizität von MNPs vor der Markteinführung zu bewerten. Daher kann dieses Protokoll als standardisiertes Protokoll zur Erzeugung von MPs durch kryogene Mahlung und NPs durch Nassmahlen sowie zur dimensionalen und chemischen Charakterisierung der resultierenden MNPs dienen. Darüber hinaus können abgeleitete Partikel in Umweltstudien wie Verbleib, Ökotoxizität, Transport und biologischem Abbau in terrestrischen und marinen Umgebungen verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde vom Herbert College of Agriculture, dem Biosystems Engineering and Soil Department und der Science Alliance an der University of Tennessee, Knoxville, finanziert. Darüber hinaus danken die Autoren für die finanzielle Unterstützung durch den USDA Grant 2020-67019-31167 für diese Forschung. Die ersten Rohstoffe für die Herstellung von MNPs aus PBAT-basierter biologisch abbaubarer Mulchfolie wurden freundlicherweise von BioBag Americas, Inc. (Dunevin, FL, USA) und PBAT-Pellets von Mobius, LLC (Lenoir City, TN) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum dish, 150 mL  Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 08-732-103 Drying of collected NPs
Aluminum dish, 500 mL VWR International, Radnor, PA, USA 25433-018 Collecting NPs after wet-grinding
Centrifuge Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Centrific 228 Container for centrifugation
Delivery tube, #20, 840 µm Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3383M30 Sieving of the first fraction during milling
Delivery tube, #60, 250 µm Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3383M45 Sieving of the second fraction (3x)  during milling
Thermomixer,  5350 Mixer Eppendorf North America, Enfield, CT, USA 05-400-200 Analysis of sieving experiments
FT-IR Spectrum Two, spectrometer with attenuated total reflectance (ATR) Perkin Elmer, Waltham, MA, USA L1050228  Measuring FTIR spectra
Glass beaker, 1000 mL DWK Life Sciences, Milville, NJ, USA 02-555-113 Stirring of MPs-water slurry before grinding
Glass front plate Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3383N55  Front cover plaste for Wiley Mini Mill
Glass jar, 50 mL Uline, Pleasant Prairie, WI, USA S-15846P Collective MPs after milling
Glove Box, neoprene Bel-Art-SP Scienceware, Wayne, NJ, USA BEL-H500290000 22-Inch, Size 10
Zetasizer Nano ZS 90 size analyzer Malvern Panalytical, Worcestershire, UK  Zetasizer Nano ZS Measuring nanoplastics dispersed in DI-water
Microscope camera Nikon, Tokyo, 108-6290, Japan Nikon Digital Sight 10 Combined with Olympus microscope to receive digital images
Microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan Model SZ 61 Imaging of MPs
Nitrogen jar, low form dewar flasks Cole-Palmer, Vernon Hills, IL, USA UX-03771-23 Storage of liquid nitrogen during cryogenic cooling
Accurate Blend 200, 12-speed blender Oster, Boca Raton, FL, USA 6684 Initiating the size reduction of cryogenically treated plastic film
PBAT film, - BioAgri™ (Mater-Bi®) BioBag Americas, Inc, Dunedin, FL, USA 0.7 mm thick Feedstock to form MPs and NPs, agricultural mulch film
PBAT pellets Mobius, LLC, Lenoir City, TN, USA Diameter 3 mm Feedstock to form microplastics (MPs) and nanoplastics (NPs) trough milling and grinding
Plastic centrifuge tubes, 50 mL Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 06-443-18 Centrifugation of slurry after wet-grinding
Plastic jar, 1000 mL, pre-cleaned, straight sided Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 05-719-733 Collection of NPs during and after wet grinding
Polygon stir bars, diameterø=8 mm, length=50.8 mm   Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 14-512-127 Stirring of MPs slurry prior to wet-grinding
Scissors, titanium bonded Westcott, Shelton, CT, USA 13901 Cutting of initial PBAT film feedstocks
Square glass cell with square aperture and cap, 12 mm O.D. Malvern Panalytical, Worcestershire, UK  PCS1115 Measuring of NPs particle size
Stainless steel bottom, 3 inch, pan Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA 8401 For sieving after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 140 (106 µm) Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA 1308 For sieving after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 20 (850 µm) Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA 1296 Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 325 (45 µm) Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA 1313 Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 60 (250 µm) Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA 1303 Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel top cover, 3 inch Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA 8406 Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel tweezers Global Industrial, Port Washington, NY, USA T9FB2264892 Transferring of  frozen film particles from jar into blender
Vacuum oven, model 281A Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 13-262-50 Vacuum oven to dry NPs after wet-grinding
Friction grinding machine, Supermass Colloider Masuko Sangyo, Tokyo, Japan MKCA6-2J Grinding machine to form NPs from MPs
Wet-grinding stone, grit size: 297 μm -420 μm Masuko Sangyo, Tokyo, Japan MKE6-46DD Grinding stone to form NPs from MPs
Wiley Mini Mill, rotary cutting mill Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA NC1346618 Size reduction of pellets and film into MPs and NPs
Software
FTIR-Spectroscopy software Perkin Elmer, Waltham, MA, USA Spectrum 10  Collection of spectra from the initial plastic, MPs and NPs
Image J, image processing program National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Version 1.53n Analysis of digital images received from microscopy 
Microscope software, ds-fi1 software Malvern Panalytical , Malvern, UK Firmware DS-U1 Ver3.10 Recording of digital images
Microsoft, Windows,  Excel 365, spreadsheet software Microsoft, Redmond, WA, USA Office 365 Calculating the average particle size and creating FTIR spectra images
JMP software, statistical software SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2021 Version 15 Statistical analysis of particle size and perform best fit of data set
Unscrambler software Camo Analytics, Oslo, Norway Version 9.2 Normalizing and converting FTIR spectra into .csv fromat

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References

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Engineering Ausgabe 185 Terrestrisch mechanische Formation Umweltstudien Mikroplastik Nanopartikel
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Astner, A. F., Hayes, D. G., O'Neill, H. M., Evans, B. R., Pingali, S. V., Urban, V. S., Young, T. M. Forming Micro-and Nano-Plastics from Agricultural Plastic Films for Employment in Fundamental Research Studies. J. Vis. Exp. (185), e64112, doi:10.3791/64112 (2022).

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