Summary
Ett neuronalt lysosomnärhetsmärkningsproteomikprotokoll beskrivs här för att karakterisera den dynamiska lysosomala mikromiljön i humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade neuroner. Lysosomala membranproteiner och proteiner som interagerar med lysosomer (stabilt eller övergående) kan kvantifieras exakt i denna metod med utmärkt intracellulär rumslig upplösning i levande mänskliga neuroner.
Abstract
Lysosomer kommunicerar ofta med en mängd olika biomolekyler för att uppnå nedbrytningen och andra olika cellulära funktioner. Lysosomer är avgörande för människans hjärnfunktion, eftersom neuroner är postmitotiska och förlitar sig starkt på autofagi-lysosomvägen för att upprätthålla cellulär homeostas. Trots framsteg i förståelsen av olika lysosomala funktioner är det tekniskt utmanande att fånga den mycket dynamiska kommunikationen mellan lysosomer och andra cellulära komponenter, särskilt på ett sätt med hög genomströmning. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för den nyligen publicerade endogena (knock-in) lysosomnärhetsmärkningsproteomiska metoden i humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) -härledda neuroner.
Både lysosomala membranproteiner och proteiner som omger lysosomer inom en radie på 10-20 nm kan med säkerhet identifieras och kvantifieras exakt i levande mänskliga neuroner. Varje steg i protokollet beskrivs i detalj, dvs hiPSC-neuronkultur, närhetsmärkning, neuronskörd, fluorescensmikroskopi, biotinylerad proteinberikning, proteinsmältning, LC-MS-analys och dataanalys. Sammanfattningsvis ger denna unika endogena lysosomala närhetsmärkningsproteomikmetod ett högt genomströmnings- och robust analytiskt verktyg för att studera de mycket dynamiska lysosomala aktiviteterna i levande mänskliga neuroner.
Introduction
Lysosomer är katabola organeller som bryter ner makromolekyler via lysosomal-autofagivägen1. Förutom nedbrytning är lysosomer involverade i olika cellulära funktioner såsom signaltransduktion, näringsavkänning och utsöndring 2,3,4. Störningar i lysosomal funktion har varit inblandade i lysosomala lagringsstörningar, cancer, åldrande och neurodegeneration 3,5,6,7. För postmitotiska och mycket polariserade neuroner spelar lysosomer kritiska roller i neuronal cellulär homeostas, neurotransmittorfrisättning och långväga transporter längs axonerna 8,9,10,11. Att undersöka lysosomer i mänskliga nervceller har dock varit en utmanande uppgift. De senaste framstegen inom inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har gjort det möjligt för kulturen av levande mänskliga neuroner som tidigare var otillgängliga, vilket överbryggar klyftan mellan djurmodeller och mänskliga patienter för att studera den mänskliga hjärnan12,13. I synnerhet integrerar den avancerade i3Neuron-tekniken stabilt neurogenin-2-transkriptionsfaktorn i iPSC-genomet under en doxycyklininducerbar promotor, vilket driver iPSC att differentiera till rena kortikala neuroner på 2 veckor14,15.
På grund av den mycket dynamiska lysosomala aktiviteten är det tekniskt utmanande att fånga lysosomala interaktioner med andra cellulära komponenter, särskilt på ett sätt med hög genomströmning. Närhetsmärkningsteknik är väl lämpad för att studera dessa dynamiska interaktioner på grund av dess förmåga att fånga både stabila och övergående / svaga proteininteraktioner med exceptionell rumslig specificitet16,17. Konstruerat peroxidas eller biotinligas kan genetiskt smältas till betesproteinet. Vid aktivering produceras mycket reaktiva biotinradikaler för att kovalent märka angränsande proteiner, som sedan kan berikas av streptavidinbelagda pärlor för nedströms bottom-up-proteomik via vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) plattformar 17,18,19,20,21.
En endogen lysosomal närhetsmärkning proteomikmetod utvecklades nyligen för att fånga den dynamiska lysosomala mikromiljön i i3Neurons22. Konstruerat askorbatperoxidas (APEX2) slogs in på C-änden av det lysosomala associerade membranproteinet 1 (LAMP1) i iPSC, som sedan kan differentieras till kortikala neuroner. LAMP1 är ett rikligt lysosomalt membranprotein och en klassisk lysosomal markör23. LAMP1 uttrycks också i sena endosomer, som mognar till lysosomer; Dessa sena endosom-lysosomer och icke-nedbrytande lysosomer kallas alla lysosomer i detta protokoll. Denna endogena LAMP1-APEX-sond, uttryckt på fysiologisk nivå, kan minska LAMP1-fellokalisering och överuttrycksartefakter. Hundratals lysosomala membranproteiner och lysosomala interagerande kan identifieras och kvantifieras med utmärkt rumslig upplösning i levande mänskliga neuroner.
Här beskrivs ett detaljerat protokoll för lysosomnärhetsmärkning proteomik i humana iPSC-härledda neuroner med ytterligare förbättringar från den nyligen publicerade metoden22. Det övergripande arbetsflödet visas i figur 1. Protokollet inkluderar hiPSC-härledd neuronkultur, aktivering av närhetsmärkning i neuroner, validering av APEX-aktivitet genom fluorescensmikroskopi, bestämning av ett optimalt streptavidin-pärl-till-input-proteinförhållande, anrikning av biotinylerade proteiner, proteinsmältning på pärlor, peptidavsaltning och kvantifiering, LC-MS-analys och proteomikdataanalys. Felsökningsriktlinjer och experimentella optimeringar diskuteras också för att förbättra kvalitetskontroll och prestanda för närhetsmärkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av George Washington University biosäkerhets- och etikkommitté. Sammansättningarna av medier och buffertar som används i detta protokoll anges i tabell 1. Den kommersiella produktinformationen som används här finns i materialförteckningen.
1. Mänsklig iPSC-härledd neuronkultur
- Mänsklig iPSC-kultur och LAMP1-APEX-sondintegration (7 dagar)
- Tina Matrigel stamlösning i en ishink vid 4 °C över natten, alikvotera 500 μl av lösningen i kalla sterila rör och förvara alikvoterna vid −80 °C. Bered 50 ml beläggningslösning genom att tillsätta 500 μl av Matrigel-buljongen till 49,5 ml kallt DMEM/F12-medium.
OBS: Håll Matrigel kall och använd förkylda koniska rör och pipettspetsar för att förhindra polymerisation. Beläggningslösningen kan förvaras vid 4 °C i 2 veckor. - Täck en 10 cm cellodlingsskål med 4 ml beläggningslösning i 1 h i en 37 °C inkubator.
OBS: Vitronectin kan vara en alternativ beläggningslösning vid 5 μg / ml koncentration och 2 h beläggning för iPSC-odling. Vitronectin (enstaka proteinkomponent) är dyrare än Matrigel men har mindre batchvariationer och renare bakgrundssignaler än Matrigel, som extraheras från mustumör med många extracellulära matrisproteiner. Icke-behandlad vävnadsodlingsplatta behövs för vitronektinbeläggning. Matrigelbeläggning fungerar för både behandlade och icke-behandlade vävnadsodlingsplattor. - Tina och platta 1-3 miljoner hiPSC på varje belagd 10 cm skål förinstallerad med 8 ml Essential E8 komplett medium kompletterat med ROCK-hämmare (slutlig koncentration 10 μM Y-27632 eller 50 nM Chroman1).
OBS: Att lägga till ROCK-hämmare (Y-27632 eller Chroman1) till stamcellsodlingsmediet minimerar dissociationsinducerad apoptos efter splittring och kryogen konservering. Chroman1 har nyligen visat sig vara mer potent än Y-27632 för att hämma både ROCK1 och ROCK224. - Byt till 10 ml E8 komplett medium utan ROCK-hämmare efter att iPSC: erna bildar kolonier, vanligtvis efter 1-2 dagar. Behåll iPSC-kulturen i E8 komplett medium och byt ut supernatanten mot färskt medium varannan dag.
- Integrera närhetsmärkningsenzymet, konstruerat askorbatperoxidas (APEX2), i C-änden av endogen LAMP1-genen genom CRISPR-genomteknik. För detaljerade steg för att generera en konstruerad stabil cellinje, se den tidigare publicerade metoden (Frankenfield et al). 22.
- Tina Matrigel stamlösning i en ishink vid 4 °C över natten, alikvotera 500 μl av lösningen i kalla sterila rör och förvara alikvoterna vid −80 °C. Bered 50 ml beläggningslösning genom att tillsätta 500 μl av Matrigel-buljongen till 49,5 ml kallt DMEM/F12-medium.
- Mänsklig iPSC-neuron differentiering (3 dagar)
- Täck en 10 cm cellodlingsskål över natten med 4 ml Matrigel-beläggningslösning i en 37 °C-inkubator före differentiering.
- Behåll hiPSC tills ~ 70% sammanflöde. Tvätta försiktigt hiPSC med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 2x för att ta bort döda celler. Aspirera PBS och lägg till3 ml Accutase till 10 cm skålen med celler. Skaka plattan för jämn fördelning och inkubera i 8 minuter i en 37 °C inkubator.
- Tillsätt 2 ml PBS för att tvätta och lyfta cellerna från plattan och samla all celllösning i ett 15 ml koniskt rör. Pellera cellerna genom centrifugering vid 300 × g i 5 min. Platta 2-4 × 106 hiPSC på en matrigelbelagd platta förinstallerad med 8 ml varmt neuroninduktionsmedium (tabell 1). Fördela cellerna jämnt och placera i en 37 °C inkubator.
OBS: Neurondifferentiering drivs av en doxycyklininducerbar transkriptionsfaktor, neurogenin-2 (NGN2), som överuttrycktes i denna stabila hiPSC-cellinje15. - Tvätta hiPSC försiktigt med PBS på dag 1 av differentiering för att ta bort döda cellskräp. Ersätt med 10 ml varmt induktionsmedium utan ROCK-hämmare.
- Byt med varmt induktionsmedium utan ROCK-hämmare varje dag fram till dag 3 av differentiering.
OBS: Neuroner är redo att replated till neuronalt medium.
- Plätering av neuroner och upprätthållande av neuronkultur (10 dagar)
- Bered 0,1 mg/ml poly-L-ornitin(PLO)-beläggningslösning i boratbuffert (tabell 1).
- Täck en cellodlingsskål med PLO-beläggningslösningen i en 37 °C inkubator i minst 1 timme eller över natten före plätering av dag 3-neuroner. Tvätta skålen med 4 ml sterilt vatten tre gånger och låt den lufttorka helt inuti biosäkerhetsskåpet.
- Dissociera dag 3-neuroner från varje 10 cm skål med 3 ml Accutase och platta 8-10 miljoner celler på varje 10 cm PLO-belagd skål förinstallerad med varmt kortikalt neuronmedium (tabell 1).
- Utför en halvmediumförändring var 2-3: e dag med varmt neuronmedium tills i3-neuronernanår mognad i 2 veckor efter differentiering.
2. In situ närhetsmärkning och neuronlys (2 h)
- Bered 500 mM biotinfenol (BP) stamlösning i dimetylsulfoxid (DMSO) och förvara vid −20 °C. På dagen för närhetsmärkning, späd BP-stamlösningen med varmt neuronmedium och behandla neuronerna i en slutlig koncentration av 500 μM i 30 minuter i en 37 ° C inkubator.
OBS: Doxycyklin tillsätts i neuronmediet, vilket aktiverar APEX-enzymuttryck. Doxcyklin måste tillsättas minst 24 timmar före närhetsmärkningsexperimentet. - Initiera märkningsreaktionen genom att tillsättaH2O2i en slutlig koncentration av 1 mM i neuronkulturen och inkubera i exakt 1 min. Aspirera omedelbart mediet och skölj 3 gånger med släckbuffert (tabell 1).
OBS: H2O2-lösningen ska göras färsk före märkningsreaktionen. H2O2-aktiveringen måste vara exakt 1 min för att minska experimentell variation och minimera oxidativ stress orsakad av långvarigH2O2-behandling. - Luta plattan för att aspirera all kvarvarande buffert. Tillsätt iskall celllysbuffert (tabell 1) direkt på neuronplattan. Använd 100 μL celllysbuffert per 1 miljon neuroner. Virvla plattan för tillräcklig celllys och lägg på is.
- Skrapa celllysaterna i kalla 1,5 ml rör. Sonicate i ett iskallt vattenbad med en bad sonicator (>100 W) för 15 min med alternerande 40 s på, 20 s off cykler.
OBS: Tillräckligt lyserad proteinlösning bör vara klar utan pellets eller överdrivna bubblor. Tillräcklig ultraljudsbehandling av celllysat är avgörande för att skjuva nukleinsyror och minska klibbigheten hos celllysat för att minska ospecifik bindning i nedströms förfaranden. En sond sonicator kan också användas för att ge starkare och snabbare celllys, men tvättning av sonden mellan prover krävs för att minimera korskontaminering och provförlust. - Tillsätt kall aceton (−20 °C) till provet med en 4-faldig lysbuffert. Virvel kort och inkubera vid −20 °C i 3 timmar.
- Centrifugera vid 16 500 × g i 10 min vid 2 °C. Ta bort supernatanten utan att störa proteinpelleten. Tvätta pelleten med 1 ml −20 °C aceton 2x och avlägsna supernatanten efter centrifugering.
- Torka proteinpelleten med en vakuumkoncentrator i 1 min. Tillsätt celllysbuffert för att helt lösa upp pelleten. Sonicate kort om det behövs. Förvara proverna vid −80 °C.
OBS: Acetonutfällning kan avlägsna rester av biotinfenol i provet, vilket kan störa nedströms anrikning av biotinylerade proteiner.
3. Fluorescensmikroskopi för att validera APEX-lokalisering och aktivitet (1,5 dagar)
- Inkubera i3-neuronernasom uttrycker endogen LAMP1-APEX med 500 μM BP i 30 minuter vid 37 °C. Aktivera märkningen med 1 mM H 2 O2-behandlingi bara 1 s för att begränsa diffusionen av biotinmoln.
- Fixera cellerna omedelbart med 4% paraformaldehyd i släckbufferten och tvätta försiktigt 3x med PBS.
OBS: För en 10 cm skål behövs 4-6 ml för en tillräcklig tvätt. - Blockera och permeabilisera cellerna med 3% åsneserum och 0,1% saponin i PBS i 30 min vid rumstemperatur (RT).
- Inkubera cellerna med primär anti-LAMP1-antikropp (musmonoklonal H3A4, 1:1 000) över natten vid 4 °C.
- Tvätta neuronerna 3 x försiktigt med PBS. Inkubera nervcellerna med antimus AF561 sekundär antikropp (1:1 000) och Streptavidin-680 (1:1 000) i 1 timme vid RT.
- Tvätta 2x med PBS och inkubera med Hoechst eller 4',4-diamidino-2-fenylindol (DAPI) kärnmarkör i 10 min vid RT. Skölj cellerna 2x med PBS.
- Visualisera de fasta neuronerna under ett fluorescensmikroskop. Observera biotinylerade proteiner färgade med streptavidin och samlokaliserade med LAMP1-färgning utanför kärnan för att validera rätt placering av APEX-aktivitet.
4. Bestämning av streptavidin-pärlor-till-insatsproteinförhållandet (1,5 dagar)
- Utför tvättmedelskompatibel proteinanalys (DCA) för att bestämma totala proteinkoncentrationer i celllysater
- Lös upp proteinstandarden bovint serumalbumin (BSA) i celllysbufferten i en koncentration av 4 mg/ml. Bered en serie BSA-proteinstandardlösningar (0,2-2 mg/ml, 5 utspädningar) med hjälp av celllysbufferten.
- Överför 5 μL från varje proteinprov, BSA-proteinstandardlösning och blindcellslysbuffert i tre exemplar till varje brunn i en 96-brunnsplatta.
- Tillsätt 2 μl reagens S per 1 ml reagens A för att få reagens A'. Tillsätt 25 μl reagens A' till varje brunn. Tillsätt 200 μl reagens B till varje brunn. Blanda och poppa bubblor om de finns.
- Inkubera den 96-brunnsplattan vid RT i 15 minuter, läs absorbansen vid 750 nm i en mikroplattläsare och kvantifiera koncentrationerna av proteinprover baserat på BSA-standardkurvan.
- Analys av punktfläckar för pärlor (1,5 dagar)
- Överför en serie streptavidin magnetiska pärlor uppslamning (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) till PCR-remsrör. Sätt PCR-remsrören på ett magnetiskt ställ, tvätta pärlorna 3x med 100 μL 2% SDS-buffert och ta bort tvättbufferten helt på magnetstället.
- Tillsätt 50 μg proteinprov till varje rör. Tillsätt mer lysbuffert till en total volym på 80 μl. Stäng varje rör ordentligt och rotera vid 4 °C över natten.
- Centrifugera PCR-remsrören kort på en bänkmikrocentrifug. Placera PCR-remsrören på ett magnetiskt ställ i 1 min. Placera 2 μl supernatant från varje rör på ett torrt nitrocellulosamembran och låt membranet torka helt.
OBS: Om signalintensiteten är låg kan mer än 2 μL upptäckas på membranet. Volymen kan ökas genom att upptäcka flera gånger på samma plats efter att membranet lufttorkats mellan varje gång. En Bio-Dot-apparat kan också användas. - Inkubera membranet i blockerande buffert (TBS) i 1 h. Inkubera membranet i Streptavidin Alexa Fluor 680-konjugat (1:1 000 i blockerande buffert) i 1 timme. Tvätta sedan membranet med TBS-T (tabell 1) 5x.
OBS: Ett alternativ till dot blot-analysen är western blotting med hjälp av en streptavidinantikropp. - Mät den fluorescerande signalen för varje punkt på membranet under 680 nm våglängd och generera ett spridningsdiagram med fluorescerande signal över volymen av pärlor. Välj den optimala volymen pärlor som behövs för 50 μg ingående proteinprov baserat på var kurvans exponentiella sönderfall slutar .
OBS: Fluorescensintensiteten representerar överflödet av biotinylerade proteiner i supernatanten, som bör minska med ökande mängder pärlor.
5. Anrikning av biotinylerade proteiner och matsmältning på pärlor (3 dagar)
- Överför proteinlysatprover från −80 °C och sonikera proverna i 1,5 ml rör i 30 s i en badljudsmedare för att snabbt tina lösningarna. Vortex och placera provrören på is.
- Överför 250 μL streptavidin (SA) magnetiska pärlor uppslamning till varje 1,5 ml rör. Sätt rören på ett magnetiskt ställ, tvätta pärlorna 3x med 1 ml tvättbuffert A (2% SDS) och ta bort den återstående bufferten.
- Baserat på resultaten från dot blot-analysen och DC-proteinanalysen, beräkna mängden proteinprov (μg) som behövs för 250 μL av streptavidinmagnetiska pärlor uppslamning.
OBS: I denna endogent uttryckta LAMP1-APEX-sond behövs 5 μL pärlor för 50 μg ingående protein. Därför tillsätts 2,5 mg totalt protein till 250 μl pärlor. Mindre än 250 μl SA-pärlor får användas för begränsat ingående provmaterial. - Tillsätt celllysbuffert till röret som innehåller den magnetiska pärl-lysatblandningen till en total volym på 1 ml och rotera vid 4 °C över natten.
OBS: Prover från olika grupper eller replikat bör normaliseras till samma proteinkoncentration, volym och mängd pärlor för att minska experimentella variationer. - Snurra ner alla rör kort på en bänkmikrocentrifug och placera rören på ett magnetiskt ställ i 1 min. Ta bort supernatanten medan du är på magnethyllan.
OBS: Det är viktigt att vänta i 1 min efter att provrören har placerats på magnetstället varje gång. Detta kan minimera pärlförlusten på grund av den osynliga lilla mängden pärlor som fortfarande rör sig mot magneten i lösningen. - Tvätta pärlorna 2x med 1 ml tvättbuffert A vid RT (5 min rotation varje gång). Upprepa processen med varje tvättbuffert 2x sekventiellt vid 4 °C. (Buffert B, buffert C och buffert D; Tabell 1).
OBS: En hög koncentration av SDS-lösning kan fällas ut vid kalla temperaturer. Den första tvätten måste utföras vid RT. - Sätt rören på magnetstället. Tvätta pärlorna 2x med Buffer D för att helt ta bort kvarvarande tvättmedel. Återsuspendera pärlorna i 100 μl 50 mM Tris-buffert och tillsätt 5 mM TCEP (slutlig koncentration) för att inkubera i 30 minuter vid 37 °C i en temperaturkontrollerad blandare och skaka vid 1 200 rpm.
- Tillsätt 15 mM jodacetamid (IAA, slutlig koncentration) till varje rör och inkubera i 30 minuter vid 37 °C i en temperaturkontrollerad blandare och skaka vid 1 200 rpm i mörker (blandarlocket på).
OBS: IAA är ljuskänsligt och bör göras färskt 5 min innan detta steg. - Tillsätt 5 mM TCEP (slutlig koncentration) för att släcka överskott av IAA. Inkubera i 10 minuter vid 37 °C i en temperaturkontrollerad blandare med skakning vid 1 200 rpm (mixerlocket av).
- Centrifugera provrören en kort stund och ställ dem på ett magnetiskt ställ i 1 min för att avlägsna supernatanten. Tillsätt 200 μL 5 mM TCEP i 50 mM Tris-buffert för att återsuspendera pärlorna. Tillsätt 1 μg trypsin/lys-C-blandning till provet och inkubera i 14 timmar vid 37 °C i en temperaturkontrollerad blandare och skaka vid 1 200 rpm.
- Tillsätt ytterligare 0,2 μg trypsin/lys-C-blandning och smält i 3 timmar.
- Snurra ner provrören kort och sätt rören på ett magnetiskt ställ i 1 min. Överför peptidsupernatanten för att rengöra rören medan du är på ett magnetiskt ställ. Tvätta pärlorna med 50 μL 50 mM Tris-buffert (skaka i 5 min) och kombinera peptidsupernatanterna.
- Tillsätt 30 μl 10% trifluorättiksyra (TFA) till röret som innehåller peptidsupernatant för att få pH <3.
6. Avsaltning och fraktionering av peptider (2 timmar)
- Våt den omvända fasutsugningsplattan (endast brunnarna för användning) med 200 μL metanol av HPLC-kvalitet (MeOH) 3x på vakuumgrenröret. Tillsätt 200 μL 1% TFA i HPLC-vatten 3x för att balansera plattan.
- Ladda peptidproverna i plattan och slå långsamt på vakuumet för en flödeshastighet som är lägre än 3 droppar / s för att minimera provförlusten.
- Tvätta extraktionsplattan 3x med 200 μL 1% TFA. Tvätta extraktionsplattan igen med 200 μl 1% TFA innehållande 2% MeOH (v/v). Håll flödeshastigheten lägre än 3 droppar/s.
- Byt ut uppsamlingsplattan med en uppsamlingsplatta med 96 brunnar. Om ingen fraktionering behövs, eluera peptidproverna 3x med 100 μL 1% TFA innehållande 80% MeOH och kombinera i ett nytt provrör. Torka peptidproverna i ett vakuumkoncentrator utan värme.
OBS: Om fraktionering önskas kan peptidprover elueras till 4 fraktioner därefter med användning av 200 μL 1% TFA innehållande 15%, 35%, 50% respektive 90% MeOH i en annan uppsamlingsplatta.
7. Kolorimetrisk peptidkvantifieringsanalys (valfritt) (1 h)
- Återsuspendera peptidprover i 50 μL vatten av LC-MS-kvalitet och ta 20 μL alikvoter för att utföra peptidanalysen.
OBS: Detta steg förbrukar en stor mängd peptidprov men kan ge en exakt kvantifiering av peptidkoncentrationen före LC-MS-analys. Detta utförs vanligtvis endast en gång per provtyp för testning före storskalig provberedning. - Förbered seriella utspädningar av peptidstandardlösningarna (som tillhandahålls i kolorimetriska analyssatsen) i LC-MS-vatten. Förbered arbetsreagenset genom att blanda 50% reagens A, 48% reagens B och 2% reagens C.
- Överför 20 μL av varje peptidstandardlösning (tre replikat) och det okända peptidprovet till en 96-brunns mikroplatta. Tillsätt 180 μl av arbetsreagenset till varje brunn, blanda väl och inkubera plattan i 30 minuter vid RT.
- Läs av absorbansen vid 480 nm i en mikroplattläsare och kvantifiera koncentrationerna av peptidprover baserat på peptidstandardkurvan.
8. LC-MS-analys
- Återsuspendera peptidproverna i LC-buffert A (2% acetonitril och 0,1% myrsyra, LC-MS-kvalitet). Centrifugera vid 16 500 × g i 10 min vid 4 °C för att bli av med eventuella partiklar.
- Överför supernatanten till LC-MS-injektionsflaskorna. Analysera proverna med hjälp av ett nanoLC-MS-instrument.
OBS: Detaljerade LC-MS/MS-parametrar är instrumentberoende och har tidigare beskrivits22,25,26. - Generera en anpassad LC-MS-uteslutningslista med en rad retentionstider för mycket rikliga förorenande peptidtoppar som streptavidin och trypsin med 5 ppm massnoggrannhet 22 (t.ex. vanliga streptavidinpeptidtoppar är m / z 402.5435 [laddning 3], m / z 603.3117 [laddning 2], m / z 654.9733 [laddning 3], m / z 678.6812 [laddning 3], m / z 1017.5182 [laddning 2], etc.; Vanliga trypsinpeptidtoppar är M/Z 421,7584 [laddning 2], M/z 523,2855 [laddning 2] och M/Z 737,7062 [laddning 3]).
9. Proteomics dataanalys
- Analysera LC-MS-rådata med proteomics-dataanalysprogramvara som Proteome Discoverer, MaxQuant27 eller MS-Fragger28. Inkludera två FASTA-bibliotek för dataanalys: 1) en Swissprot Homo Sapiens referensdatabas; 2) ett nygenererat universellt förorenande FASTA-bibliotek (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), som visat sig förbättra proteomikidentifieringen och minska falska upptäckter29.
- Ställ in proteomikdataanalysparametrarna med en 1% falsk upptäcktshastighet (FDR) cutoff för protein- och peptidspektralmatchning (PSM) identifieringar. Välj trypsindigestion med högst tre missade klyvningar, en fast modifiering av cysteinkarbamidometylering och en variabel modifiering av metioninoxidation och protein N-terminal acetylering. Använd peptid MS1 toppintensiteter för etikettfri kvantifiering. Normalisera peptidintensiteterna till det endogent biotinylerade karboxylaset, propionyl-CoA-karboxylas (PCCA), för att minska variationer i närhetsmärkning, som beskrivits tidigare22.
OBS: PCCA-normalisering kan väljas i Proteome Discoverer-programvaran genom att inkludera en PCCA-proteinsekvens FASTA-fil. Alternativt kan PCCA-normalisering utföras i nedströms dataanalys. - Exportera proteinnivåresultat från proteomics-programvaran. Ta bort förorenande proteiner före statistisk analys29. Ta bort proteiner med endast 1 PSM eller inget kvantifieringsresultat. Genomföra proteingenontologi (GO)-termanalys med Enrichr30 och proteinnätverksanalys med STRING31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna lysosomnärhetsmärkning proteomikstudie genomfördes i humana iPSC-härledda neuroner för att fånga den dynamiska lysosomala mikromiljön in situ i levande neuroner. Cellmorfologier av hiPSC och hiPSC-härledda neuroner vid olika tidpunkter illustreras i figur 2A. Mänskliga iPSC växer i kolonier i E8-medium. Differentiering initieras genom plätering av iPSC till doxycyklininnehållande neuroninduktionsmedium. Neuritförlängningar blir mer synliga varje dag under 3-dagarsdifferentieringen. Efter att ha bytt till PLO-belagda plattor i neuronmedium bildar neuriterna ett nätverk mellan neuroner, och axonala förlängningar blir mer synliga när neuronerna når mognad på 2 veckor. Ii 3Neurons valideras lokaliseringen av APEX-sonden genom fluorescensmikroskopi efter snabb APEX-aktivering. Biotinylerade proteiner färgas med streptavidin (SA) antikropp, och lysosomer färgas med anti-LAMP1-antikropp. Den sammanslagna bilden validerar korrekt lokalisering av LAMP1-APEX till betesproteinet (figur 2B).
Pärltitreringsanalysen är avgörande för att bestämma det optimala förhållandet mellan pärlor och protein så att mängden streptavidinpärlor är tillräcklig för att berika alla biotinylerade proteiner men inte så överdriven för att orsaka allvarlig streptavidinförorening i LC-MS. Den optimala volymen pärlor som behövs för 50 μg ingående proteinprov väljs utifrån var kurvans exponentiella sönderfall slutar (figur 3A) Som visas i figur 3A minskade punktblotsignaler från pärlproteininkubationssupernatanten när fler biotinylerade proteiner fångades upp med ökade mängder av streptavidinpärlorna. För endogena LAMP1-APEX-prover var 5 μL streptavidinpärlor optimala för 50 μg insatsprotein (markerat i figur 3A). Efter anrikning är mängden protein som fångas upp av streptavidinpärlorna okänd. Överskott av proteolytiskt enzym (trypsin) kan öka enzym autodigestion, med rikliga trypsinpeptidtoppar i LC-MS. Överdriven trypsin kan också smälta mer streptavidinpeptider i proverna. Därför bör mängden proteas som behövs för matsmältning på pärlor optimeras. Jämfört med trypsin ensam resulterade matsmältningen på pärlor med trypsin / Lys-C-blandning i identifiering av fler proteiner och peptider och färre missade klyvningar (figur 3B). Dessutom var 1-1,5 μg proteas per 250 μL streptavidinmagnetiska pärlor optimalt för att erhålla det högsta antalet identifierade proteiner och den lägsta andelen missade klyvningar (figur 3C). Med ett optimalt pärl-till-protein-förhållande bör samma mängd pärlor fånga samma mängd biotinylerade proteiner. Därför kan denna optimerade proteasmängd användas för alla experiment som berikar biotinylerade proteiner med samma streptavidinmagnetiska pärlor.
Peroxidasbaserade närhetsmärkningsenzymer aktiveras genom biotin-fenolinkubation och kortH2O2-behandling(1 min). Detta steg är en viktig källa till variation i närhetsmärkning proteomik. Vi fann tidigare att normalisering till det vanligaste, endogent biotinylerade karboxylaset, PCCA, kan avsevärt minska experimentella variationer, vilket möjliggör jämförelse av närhetsmärkning proteomikdata över olika experimentella satser (figur 4)22. För endogena LAMP1-APEX-neuroner användes föräldralinjen utan LAMP1-APEX-sonduttryck som en kontrollgrupp. Kontrollneuroner behandlades också med biotin-fenol ochH2O2. Fördelningen av proteinförhållanden för LAMP1-APEX jämfört med kontrollgruppen illustreras i figur 5A. Alla endogent biotinylerade karboxylas berikades med streptavidinbelagda pärlor men förblev oförändrade. Som framgår av GO-termanalysen och proteinnätverksanalysen (figur 5B,C) berikades både stabila lysosomala membranproteiner och övergående lysosomala interactrar relaterade till endolysosomal handel och transport i LAMP1-APEX-proteomik32,33,34.
Bild 1: Övergripande arbetsflöde för lysosomnärhetsmärkning av proteomik i hiPSC-härledda nervceller. Förkortningar: hiPSC = humaninducerad pluripotent stamcell; LAMP1 = lysosomalt associerat membranprotein 1; APEX = askorbatperoxidas; dox = doxycyklin; BP = biotin-fenol; DCA = tvättmedelskompatibel proteinanalys; SA = streptavidin; LC-MS/MS = vätskekromatografi-tandemmasspektrometri; PCCA = propionyl-CoA-karboxylas, ett endogent biotinylerat protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikroskopisk avbildning av hiPSC-härledda nervceller och LAMP1-APEX-aktivitet . (A) Brightfield-mikroskopibilder av olika stadier av hiPSC och hiPSC-härledda neuroner. (B) Fluorescensavbildning av LAMP1-APEX-aktivitet i neuronen. Biotinylerade signaler färgade mot streptavidin samlokaliseras med LAMP1-färgning utanför kärnan (HOECHST). Skalstänger = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Förkortningar: hiPSC = humaninducerad pluripotent stamcell; LAMP1 = lysosomalt associerat membranprotein 1; APEX = askorbatperoxidas; SA = streptavidin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Optimering av förhållandet mellan pärlor och ingående protein och enzymatisk proteinsmältning kan förbättra proteinidentifieringar och minska störningar . (A) Exempel på analys av pärlor-titrering är resultatet av dot-blot-analys med användning av 50 μg insatsprotein och olika mängder streptavidinpärlor. (B) Trypsin/Lys-C-blandning resulterade i bättre protein/peptididentifiering och färre missade klyvningar än enbart trypsin. (C) Optimering av mängden Trypsin / Lys-C för matsmältning på pärlor. Denna siffra har modifierats från Frankenfield et al.22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Normalisering av närhetsmärkning proteomikdata till ett endogent biotinylerat karboxylas, PCCA, kan minska kvantifieringsvariationer mellan biologiska replikat. Denna siffra har modifierats från Frankenfield et al.22. Förkortning: PCCA = propionyl-CoA-karboxylas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Lysosomnärhetsmärkning proteomik berikade lysosomala membranproteiner och lysosomala interagerande proteiner i neuroner. (A) Spridningsdiagram över proteinmängdsförhållanden för LAMP1-APEX kontra ingen APEX-kontroll som visar berikade lysosomala membranproteiner och oförändrade endogent biotinylerade proteiner. (B) GO-term analys av proteomikresultat som bevisar berikad cellulär komponent vid lysosomen. (C) STRING-proteinnätverksanalys som visar att proteiner direkt interagerar med betesproteinet (LAMP1), lysosomala membranproteiner och lysosomala interagerare såsom membranhandelsproteiner. Denna siffra har modifierats från Frankenfield et al.22. Förkortningar: LAMP1 = lysosomalt associerat membranprotein 1; APEX = askorbatperoxidas; GO = genontologi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Medel/buffert | Komponent | Protokoll | ||
| Beläggningslösning för källarmembranmatris (Matrigel) | 1% källarmembranmatrislager, 99% DMEM / F12 medium | 1.1, 1.2 | ||
| Vitronektinbeläggningslösning | 5 μg/ml slutlig koncentration i PBS | 1.1 | ||
| E8 komplett medium med ROCK-hämmare | 98% E8-medium, 2% E8-tillskott, 10 μM Y-27632 eller 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Neuron induktionsmedium | 97% DMEM/F12 med HEPES, 1% N2-tillskott, 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 1% L-glutamin, 2 μg/ml doxycyklin och ROCK-hämmare (10 μM Y-27632 eller 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| Neuron PLO beläggningslösning | 0,1 mg/ml poly-L-ornitin (PLO), 100 mM borsyra, 25 mM natriumtetraborat, 75 mM natriumklorid, 1 M natriumhydroxid | 1.3 | ||
| Neuron medium | 98% kortikal neuron medium, 2% B27 tillägg, 10 ng / ml hjärn-härledd neurotrofisk faktor (BDNF), 10 ng / ml glial-härledd neurotrofisk faktor (GDNF), 10 ng / ml NT-3, 0.2 μg / ml Laminin, 2 μg / ml doxycyklin | 1.3 | ||
| Släck buffert | 10 mM natriumazid, 10 mM natriumaskorbat, 5 mM TROLOX i PBS | 2.2 | ||
| Buffert för celllys | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Triton, 1 mM Tris(2-karboxyetyl)fosfinhydroklorid (TCEP), 10 mM natriumazid, 10 mM natriumaskorbat, 5 mM TROLOX, proteashämmare cocktail | 2.3 | ||
| TBS-T | 0,05% Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Buffert A | 2% SDS-buffert | 5.2 | ||
| Buffert B | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffert C | 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffert D | 2 M Urea, 50 mM Tris-HCl | 5.6 | ||
Tabell 1: Sammansättningar av medier och buffertar som används i detta protokoll.
| Problem | Protokoll | Lösning/Förslag | ||||
| iPSC-odling som skalar av plattan | 1.1 | Öka koncentrationen eller tiden av vitronektinbeläggning. | ||||
| Vissa iPSC differentierade inte till neuroner | 1.2 | Öka behandlingstiden för cellavskiljningslösning för att helt dissociera iPSC under d0-differentiering. | ||||
| Neuronkultur som skalar av plattan | 1.3 | Tvätt och byte av medium måste vara skonsamt och från plattans sidovägg. | ||||
| Proteiner löser sig inte helt efter acetonutfällning | 2.7 | Minska torkningstiden för proteinpelleten. Öka volymen av lysbuffert och sonicate kort för att hjälpa upplösning. | ||||
| Svaga streptavidinfärgningssignaler | 3 | ÖkaH2O2behandlingstiden till 2-3 s och virvla plattan för jämn fördelning. | ||||
| Låg signal om pärlor titreringsanalys | 4.2 | Vänta tills membranet är helt torkat och tillsätt mer supernatant till samma plats (kan upprepa upp till 3x) för att förbättra signalintensiteten. | ||||
| Magnetiska pärlor som inte pelleterar mot magnetstället | 5 | Magnetisk pärlrörlighet minskar i icke-tvättmedel som innehåller buffert. Högre ureakoncentration upp till 4 M eller LC-MS-kompatibelt tvättmedel kan användas i tvättbuffert D. | ||||
| Magnetisk pärlförlust under sköljning av pärlor | 5 | Öka väntetiden när provrör placeras på magnetpärlorna (1 min eller längre) innan du tar supernatant från rören. | ||||
| Enskilt laddade föroreningstoppar i LC-MS | 6 | Peptidrensning räcker inte. Öka tvättvolymerna och tiderna under peptidavsaltning. | ||||
| Peptidanalys låg signal | 7 | Återsuspendera peptidprover i lägre volym för att öka peptidkoncentrationen. | ||||
| Överväldigande streptavidinsignaler i LC-MS | 8 | Minska mängden streptavidinpärlor. Om trypsin topp är också rikligt, minska trypsinmängden. | ||||
| För många ospecifika etiketteringsbakgrunder | 9 | Streptavidin pärlor tvätt var inte tillräckligt. Ta bort all kvarvarande vätska under varje tvättsteg. Öka tiden och volymen för sköljning av pärlor. | ||||
Tabell 2: Felsökning av problem och lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av denna LAMP1-APEX-sond biotinyleras och berikas proteiner på och nära det lysosomala membranet. Med tanke på den typiska lysosomdiametern på 100-1 200 nm ger denna metod utmärkt intracellulär upplösning med en märkningsradie på 10-20 nm. LAMP1 är ett rikligt lysosomalt membranprotein och en klassisk markör för lysosomer, som fungerar som ett utmärkt beteprotein för lysosomal APEX-märkning på endogen uttrycksnivå. Det finns dock också begränsningar när man använder LAMP1 för att rikta in sig på lysosomer, eftersom LAMP1 också finns i sena endosomer och icke-nedbrytande lysosomer35. De flesta lysosomala markörer uttrycks också i sena endosomer, som så småningom mognar till lysosomer. Alternativa betesproteiner till mållysosomer är LAMPTOR, LAMP2 och TMEM19235,36,37. Det är viktigt att notera att reaktiva biotinradikaler inte tränger in i membranet. Därför fångas inte de flesta lysosomala lumenproteiner i denna LAMP1-APEX-proteomikmetod. Lysosomala lumenproteiner kan erhållas genom lysosomal isolering via den traditionella gradientcentrifugeringsmetoden eller lysosomal immunrening 4,38. Proteiner på det lysosomala membranet kan emellertid störas under lysosomal isolering och förlora informationen för övergående och dynamiska lysosomala interaktioner. Därför kan lysosomal närhetsmärkning och lysosomal isolering kombineras för att få en fullständig ögonblicksbild av lysosomala aktiviteter både utanför och inuti lysosomer.
För att minimera variationen från iPSC-neuronkulturen måste neuronpläteringstätheten vara konsekvent över alla biologiska replikat och jämförelsegrupper. Samma nivåer av neuronal mognad och hälsa är också kritiska av denna anledning. Under APEX-aktivering måste tillsats av biotinfenol ochH2O2till cellerna utföras genom föregående blandning med varmt odlingsmedium och sedan tillsats av blandningen till cellerna, följt av omedelbar, mild skakning för att säkerställa jämn fördelning. Användningen avH2O2väcker också oro över oxidativ stress och störningar i cellens dynamiska mikromiljö. Även om inga signifikanta förändringar hittades vid proteinmängdsnivån, modifierades fler peptider med metioninoxidation iH2O2-behandladekontra kontrollneuroner22. Därför är strikt kontroll av H 2 O2-aktiveringstiden (1 min) avgörande för att minimera oxidativ stress och minska diffusionen av biotinmoln för att säkerställa en specifik märkningsradie som omger betesproteinet.
För icke-polariserade cellinjer som HEK och U2OS kan celler skördas genom pelletering efter närhetsmärkning för att avlägsna supernatanten som innehåller fritt biotin. Neuroner måste dock skördas genom att direkt tillsätta celllysbuffert till plattan och skrapa i rör för att undvika neuritskador och provförlust under pelletering. Närvaron av fritt biotin kan mätta streptavidinpärlorna. Det fullständiga avlägsnandet av fritt biotin kan uppnås genom flera tvättar och inkubation med släckbuffert i nervceller och / eller proteinutfällning efter celllys. Eftersom olika betesproteiner har olika uttrycksnivåer måste en punktfläckanalys utföras för varje ny APEX-sond. När det optimala förhållandet mellan pärlor och protein har bestämts bör mängden startprotein och pärlornas volym vara konsekvent för alla replikat för samma APEX-sond. När man jämför olika sonder, såsom LAMP1-APEX kontra cytosolisk-APEX, rekommenderas att man använder samma volym pärlor men varierar mängden startprotein för att återspegla de optimala pärlorna / proteinförhållandena för olika APEX-sonder. För att ytterligare minska experimentella variationer och öka genomströmningen kan stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling (SILAC) utföras39. Multiplexerad isobarisk märkning kan också användas för att kemiskt märka peptider efter proteinsmältning via TMT / iTraq / DiLeu-taggar 20,40,41,42.
Närhetsmärkning har använts i stor utsträckning för att fånga den cellulära och molekylära mikromiljön i olika organismer43. Närhetsmärkning står dock fortfarande inför många tekniska utmaningar, såsom kontaminering från streptavidinsignaler, användning av väteperoxid för enzymaktivering och närvaron av endogent biotinylerade mitokondriella karboxylaser. Därför kräver proteomiska experiment med närhetsmärkning noggrann planering och kvalitetskontroll. För att hjälpa forskare att felsöka sitt närhetsmärkningsexperiment ger vi en kort guide för vanliga problem och lösningar i tabell 2. Senast utvecklades en klyvbar närhetsmärkningsmetod med tiolklyvbart biotin25. Biotinylerade proteiner kan därför klyvas av pärlor med hjälp av ett reducerande reagens såsom TCEP utan behov av uppslutning på pärlor. Denna klyvbara biotinmetod kan dramatiskt minska interferenssignaler från streptavidin, endogent biotinylerade karboxylaser och ospecifik bindning. Pågående ansträngningar kommer att tillämpa denna klyvbara biotinmetod på LAMP1-APEX-proteomik för att förbättra märkningsspecificiteten och noggrannheten. Närhetsmärkningssonder kan också utformas för att rikta in sig på andra subcellulära fack44. Mängden och typen av identifierade proteiner är beroende av betesproteinets natur, dess intracellulära miljö och uttrycksnivån för närhetsmärkningssonden. Denna endogena LAMP1-APEX proteomikmetod ger ett värdefullt verktyg för att studera den dynamiska lysosomala aktiviteten i mänskliga neuroner. Den detaljerade protokoll- och metodoptimeringen är också tillämplig på andra närhetsmärkningssonder och kemisk biotinylering, som fungerar som en användbar resurs för proteomiksamhället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöds av NIH-anslaget (R01NS121608). A.M.F. erkänner ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship och Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi tackar Michael Ward-labbet vid National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) för molekylärbiologiskt stöd och i3Neuron-teknikutvecklingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R.
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P.
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M.
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
