Summary
Mevcut protokol, farelerde atriyal fibrilasyon duyarlılığını değerlendirmek için transözofageal atriyal pacing kullanıldığında deneysel parametrelerin optimizasyonunu açıklamaktadır.
Abstract
Atriyal fibrilasyon (AF) için genetik ve edinilmiş risk faktörlerinin fare modelleri, AF'nin moleküler belirleyicilerinin araştırılmasında değerli olduğunu kanıtlamıştır. Programlanmış elektriksel stimülasyon, hayatta kalma prosedürü olarak transözofageal atriyal pacing kullanılarak gerçekleştirilebilir, böylece aynı hayvanda seri test yapılabilir. Bununla birlikte, tekrarlanabilirliği zorlaştıran çok sayıda pacing protokolü vardır. Mevcut protokol, çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği artırmak için modele özgü deneysel parametreler geliştirmek için standartlaştırılmış bir strateji sağlamayı amaçlamaktadır. Çalışma sırasındaki yaş, cinsiyet ve pacing protokolünün parametreleri (örneğin, pacing modu ve AF duyarlılığının tanımı) dahil olmak üzere, incelenen spesifik model için deneysel yöntemleri optimize etmek için ön çalışmalar yapılır. Önemli olarak, yüksek uyaran enerjilerinden kaçınmak için özen gösterilir, çünkü bu, gangliyonik pleksi'nin yanlışlıkla parasempatik aktivasyonla uyarılmasına neden olabilir, pacing sırasında abartılı atriyoventriküler (AV) blok ile kendini gösterir ve genellikle yapay AF indüksiyonu ile ilişkilidir. Bu komplikasyonu gösteren hayvanlar analizin dışında tutulmalıdır.
Introduction
Atriyal fibrilasyon (AF), çoklu edinsel ve genetik risk faktörleri için son ortak yolu temsil eder. AF substratının patofizyolojik mekanizmalarını araştıran çalışmalar için, fare modelleri, genetik manipülasyonun kolaylığı ve genel olarak, farklı klinik fenotipler 1,2,3 için insanlarda gözlenen AF duyarlılığını yeniden ürettikleri gerçeği göz önüne alındığında avantajlıdır. Bununla birlikte, fareler nadiren spontan AF4 geliştirir ve bu da provokatif atriyal pacing çalışmalarının kullanılmasını gerektirir.
Programlanmış elektriksel stimülasyon (PES), intrakardiyak5 veya transözofageal6 pacing kullanılarak murin atriyal elektrofizyolojisini ve AF duyarlılığını değerlendirmek için yapılabilir. Transözofageal yaklaşım bir sağkalım prosedürü olarak özellikle avantajlı olsa da, kullanımı çok sayıda yayınlanmış deneysel protokol 7,8 ve tekrarlanabilirliği engelleyebilecek değişkenlik kaynakları9 ile karmaşıktır. Ayrıca, sınırlı rapor edilen protokol karşılaştırmaları, uygun bir pacing protokolünün seçilmesini zorlaştırmaktadır.
Mevcut protokol, tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla murin AF duyarlılığını değerlendirmek için modele özgü transözofageal PES yöntemleri geliştirmek için sistematik bir strateji kullanmayı amaçlamaktadır. Daha da önemlisi, yaş, cinsiyet ve pacing modu değişkenliğini hesaba katarak pacing protokolünü optimize etmek için ilk pilot çalışmalar yapılır ve sonuçları karıştırabilecek yanlışlıkla parasempatik stimülasyonu en aza indirmek için tasarlanmış pacing9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedür Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile tutarlıdır. Protokol hem genetik9 kullanılarak geliştirildi hem de AF duyarlılığının10 (örneğin hipertansiyon) fare modelini edindi. Operatör, incelenen farenin fenotipine kör edildi.
1. Hayvan seçimi
- Genetik modeller için, optimal AF duyarlılığı dönemini belirlemek için fareleri aşağıda açıklandığı gibi iki haftada bir (yani her iki haftada bir) atriyal pacing'e maruz bırakın (bkz. adım 6.).
- 8 haftalıkken iki haftada bir tempoya başlayın. Değişkenliği azaltmak için vahşi tip çöp arkadaşlarını kontrol olarak kullanın. Her iki cinsiyeti de inceleyin, çünkü AF fenotip9 gelişmeyebilir.
- Edinilmiş modeller için, fareler fiziksel olgunluğa ulaştıktan sonra (~ 12 haftalık) pacing yapın10. Yukarıda belirtildiği gibi, her iki cinsiyeti de inceleyin.
- Bu ön çalışmalar sırasında, optimum pacing modunu belirlemek için hem patlama hızı8 (sabit bir pacing döngü uzunluğu [CL] kullanarak) hem de azalan pacing7 (giderek daha kısa bir pacing CL ile) gerçekleştirin. Her prosedürü en az 24 saat ayırın.
NOT: Artan sayıda fare incelendikçe, AF'ye duyarlı farelerde AF'yi destekleyen ancak kontrolleri destekleyen optimal yaş, cinsiyet ve pacing modunu belirlemek için biriken verileri gözden geçirin.- AF duyarlılığının birden fazla tanımını kullanarak verileri analiz edin (örneğin, AF ataklarının sayısı8, toplam AF süresi 9, AF insidansı4 ve yaygın olarak 10s 11 veya 15 s 12 olarak tanımlanan sürekli AF insidansı ve hatta 5 dakika13,14'e kadar) çünkü bazı modeller biri için bir AF fenotipi gösterebilir, ancak tüm tanımlar9 için değil.
NOT: AF atağının tanımı ve AF duyarlılığı yayınlanmış çalışmalar arasında farklılık göstermektedir 4,7. AF atak8 genellikle en az 1 saniye boyunca meydana gelen düzensiz düzensiz ventrikül yanıtı ile hızlı atriyal aktivite olarak tanımlanır (Şekil 1). AF'ye ek olarak, atriyal pacing ayrıca düzenli veya düzensiz bir ventrikül yanıtı ile atriyal flutter'ı da indükleyebilir.
- AF duyarlılığının birden fazla tanımını kullanarak verileri analiz edin (örneğin, AF ataklarının sayısı8, toplam AF süresi 9, AF insidansı4 ve yaygın olarak 10s 11 veya 15 s 12 olarak tanımlanan sürekli AF insidansı ve hatta 5 dakika13,14'e kadar) çünkü bazı modeller biri için bir AF fenotipi gösterebilir, ancak tüm tanımlar9 için değil.
- Ek fareler üzerinde sonraki çalışmalar için optimize edilmiş modele özgü parametreleri ve AF duyarlılığının tanımını kullanın.
2. Hayvan hazırlığı
- Fareyi bir indüksiyon odasında, 1 L/dak %100 oksijende %3 izofluran kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu) anestezi altına alın.
NOT: İzofluran zararlıdır. Cildi veya gözü tahriş edebilir ve diğer merkezi sinir sistemi toksisitelerinin yanı sıra baş dönmesine, yorgunluğa ve baş ağrısına neden olabilir. İyi havalandırılan bir alanda uygun bir süpürme yöntemiyle (örneğin, aktif karbon bidonu) kullanın. - Pedal refleksinin kaybedilmesinden sonra, fareyi, arka bacakları ped yüzeyine bantlanmış olarak vücut ısısını yaklaşık 37 ° C'de tutmak için tasarlanmış bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü bir konuma getirin.
- Kurumayı önlemek için gözlere yağlayıcı göz merhemi uygulayın.
- Farenin burnunun üzerine güvenli bir şekilde anestezik bir maske yerleştirin. 1 L/dk %100 oksijende %1 izofluran kullanarak anestezi idaresine başlayın. Burun deliklerinin tıkanıklıktan arındırıldığından emin olun, çünkü fareler zorunlu burun soluyanlardır.
- Bir biyolojik amplifikatöre bağlı 27 G EKG iğne elektrotlarının deri altına yerleştirilmesiyle bir yüzey elektrokardiyogramı (EKG, kurşun I) ve ön ayaklara veri toplama donanımı elde edin. Sol arka bacağa bir iğne elektrodu yerleştirerek sinyali topraklayın.
3. Kateter yerleştirme
- İzofluran maskesini fareden kısaca çıkarın.
- Yemek borusuna bir uyarıcı ve uyaran izolatörü (bkz. Malzeme Tablosu) bağlı 2-F oktapolar elektrot kateteri ( elektrot genişliği ve aralığı = 0,5 mm) yerleştirin (Şekil 2).
- Ağızdan (boyun uzatılmış) kifoid kıkırdağın hemen üstüne kadar olan mesafeye yaklaşan bir derinliğe yerleştirin.
- İzofluran maskesini farenin burun deliklerinin üzerine yeniden yerleştirin.
- Analiz yazılımı kullanarak EKG derivasyonunun sürekli kaydedilmesiyle veri toplamaya başlayın (bkz.
- Uyaran izolatör modunu bipolar olarak ayarlayın. Stimülasyon sırasında en çok kullanılan elektrot çiftini kullanın.
- Yakalamayı sağlamak için kateteri yemek borusu içinde uygun şekilde konumlandırın. Bunu yapmak için, sinüs CL'sinden biraz daha kısa bir CL'de darbe genişliği 2 ms olan 1,5 mA'lık bir uyaran uygulayın (örneğin; sinüs CL 120 ms ise 100 ms'lik bir CL kullanın). Tutarlı atriyal yakalama elde edilene kadar kateteri dikkatlice konumlandırın.
4. Eşik belirleme
- Atriyal diyastolik yakalama eşiğini (TH) belirlemek için, atriyal yakalama için kullanılan CL'de 2 ms'lik bir darbe genişliği ile 1.5 mA'da pacing başlatın. Atriyal yakalama kaybına kadar uyaran genliğini 0,05 mA artışlarla azaltın, ardından yakalamaya kadar artırın.
NOT: Tutarlı atriyal yakalamanın elde edildiği en düşük genlik atriyal TH'dir. Yüksek uyaran genliklerinde parasempatik stimülasyon endişesi nedeniyle, yapay AF indüksiyonu9 ile pacing sırasında aşırı AV bloğu tarafından yansıtılan maksimum kabul edilebilir TH, 0.75 mA'dır. Gerekirse, TH ≤0.75 mA'ya ulaşmak için kateteri yeniden konumlandırın. - Uyaran genliğini TH'nin iki katına ayarlayın.
5. Elektrofizyolojik özelliklerin belirlenmesi
- AF indüksiyonu15 için hızlı atriyal pacing öncesinde sinüs düğümü iyileşme süresi (SNRT), Wenckebach döngü uzunluğu (WCL) ve atriyoventriküler etkili refrakter dönem (AVERP) dahil olmak üzere elektrofizyolojik parametreleri ölçün.
6. Atriyal aritmi duyarlılığı
- Farklı CL'lerde patlama hızı veya ilk çalışmalardan belirlenen düşük tempoyu kullanarak 2 ms'lik bir darbe genişliğine sahip iki TH'de pacing gerçekleştirin (adım 1.1.-1.4.).
- Patlama hızı için, 15 s için 50 ms'lik bir başlangıç CL'sinde hızlayın ve sonraki trenler 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms ve 15 ms 8,10'luk CL'lerde gerçekleşir. Devam etmeden önce iyileşmeye izin vermek için her tempolu trenden sonra tempoyu 30 sn duraklatın. Bir tempolu trenden sonra AF oluşursa, sonraki tempoya geçmeden önce sonlandırmadan sonra 30 s bekleyin.
- Azaltılmış tempo için, 40 ms'lik bir CL'de hız yapın ve CL'yi 20 ms7'de sona erene kadar her 2 saniyede bir 2 ms azaltın. Her treni takiben iyileşme için 30 saniyelik bir duraklama ile üçlü16 veya beşli17'de tempolu trenler gerçekleştirin. Yukarıdaki gibi, AF gelişirse, devam etmeden önce sonlandırmadan sonra 30 s bekleyin.
NOT: Ön deneyler sırasında protokol parametrelerini optimize ederken (yani, adım 1.1.-1.5.), beş trenle azaltılmış tempo gerçekleştirin. Üç veya beş trenin en yüksek hassasiyeti sağlayıp sağlamadığını belirlemek için post hoc bir analiz yapın. - Son tempo trenini takiben 30 sn sinüs ritmi üzerine veya 10 dakikalık bir AF atağından sonra, hangisi önce gelirse, prosedürü sonlandırın.
7. İşlem sonrası
- Veri alımını durdurun.
- Kateter ve EKG elektrotlarını nazikçe çıkarın.
- Anesteziyi durdurun.
- Anestezi uygulanan fareyi bir kafese yerleştirin ve iyileşmeyi sağlamak için 10 dakika boyunca gözlemleyin.
- Veri dosyasını kaydedin. Seri test durumunda, pacing prosedürünü tekrarlamadan önce en az 24 saat bekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transözofageal atriyal pacing çalışmaları, SNRT ve AVERP'nin yanı sıra AF duyarlılığını 6'yı belirleyerek SA ve AV düğümlerinin elektrofizyolojik özelliklerinideğerlendirir (Şekil 1). EKG kaydı, P dalga süresi, PR aralığı, QRS süresi ve QT / QTc aralıklarının ölçülmesini sağlar. Hızlı atriyal pacing sırasında EKG'nin sürekli kaydedilmesi, AF kırılganlığının aşağıdaki ölçümlerini sağlayabilir: çalışma sırasında indüklenen bölüm sayısı, bölümlerin kümülatif ve ortalama süresi ve sürekli AF ataklarının sayısı. Pacing sırasında aşırı AV bloğu atakları, pacing kaynaklı parasempatik stimülasyon dönemlerini gösterebilir (Şekil 3), ilişkili AF'nin modelin kendisinin patofizyolojisinden ziyade bu fenomenin bir eseri olduğunu gösterir9.
Şekil 1: Atriyal pacing'in temsili sonuçları. Hızlı atriyal pacing sonrası (A) sinüs ritmini ve (B) atriyal fibrilasyonu gösteren yüzey EKG kayıtları. Pacing hızı Wenckebach CL'yi aşıyor ve bu da pacing sırasında 1:1 AV düğüm iletiminin kaybolmasına neden oluyor. Temel yapıt, fare solunumu ile ilgilidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Transözofageal kateterin görsel gösterimi ve gangliyonik pleksiye yakınlığı. (A) 2-F oktapolar kateteri gösteren bir fotoğraf. (B) Kateterin posterior sol atriyal gangliyonik pleksiye yakınlığının tasviri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hızlı atriyal pacing sırasında aşırı AV bloğunun temsili sonuçları. Atriyal tempo sırasında, özellikle daha yüksek uyaran yoğunluğuna sahip tempo sırasında ve kısa CL'lerde ortaya çıkabilecek (A) ve (B) aşırı AV bloğu olmadan atriyal tempolu ritmi gösteren yüzey EKG kayıtları. Kırmızı oklar QRS komplekslerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transözofageal atriyal pacing sadece aynı hayvanda seri çalışmalara izin vermekle kalmaz, aynı zamanda süresi tipik olarak intrakardiyak çalışmalardan (~ 20 dakika) daha kısadır, böylece anestezik kullanımı ve elektrofizyolojik parametreler üzerindeki etkilerini en aza indirir.
Her bir fare modeli için yöntemleri başlangıçta optimize etmek çok önemlidir. Yaşlanma, normal farelerde AF indüklenebilirliğiniarttırır 18,19 ve bireysel genetik modeller sınırlı bir süre içinde AF indüklenebilirliğini gösterebilir. Her iki haftada bir pilot çalışmalar yapmak, AF fenotip faresinin indüklenebildiği, ancak kontrol farelerinin indüklenemediği bir yaş penceresini belirleyebilir. Cinsiyet, belirleyici bir faktör olabilir, çünkü cinsiyetlerden biri veya her ikisi de indüklenebilir AF9 gösterebilir. Ek olarak, belirli fareler yalnızca bir tür pacing moduna yanıt olarak AF duyarlılığını gösterebilirken, diğerleri farklı bir moda veya birden fazla mod9'a AF duyarlılığı gösterir.
Hızlı atriyal pacing sırasında, fareler genellikle AF indüksiyonu ile çakışan aşırı AV bloğu yaşayabilir. Bu fenomen, arka sol atriyumda bulunan gangliyonik pleksi'nin yanlışlıkla uyarılmasından kaynaklanır ve parasempatik aktivasyon9 ile sonuçlanır. Belirgin AV blok, tek bir pacing treninin %≥10'unu süren ventriküler bradikardi olarak tanımlanır ve en sık yüksek uyaran yoğunluklarında ve kısa tempolu CL'lerde görülür. Bu tip aritmi indüksiyonu, kontrol farelerinde AF insidansını arttırır ve bir deney grubunda daha fazla aritmi değişkenliğine neden olur. Bu kirletici özellikler göz önüne alındığında, bu koşullar altında AF yaşayan hayvanlar analizin dışında tutulmalıdır.
TH ≤0.75 mA'ya rağmen pacing sırasında derin AV bloğu meydana gelirse, pacing genliğini 1.5x TH7'ye düşürmek mantıklıdır. Ayrıca, ön deneyler sırasında bir AF fenotipi gözlenmezse, en düşük tempolu CL16 olarak 10 ms kullanılarak yeniden denenmesi düşünülebilir. Edinilmiş bir model için 12 haftalıkken bir AF fenotipi gözlenmezse, artan fenotip olgunluğunun etkilerini araştırmak için iki haftada bir ön çalışmaları düşünün20.
Bu yaklaşımın bir sınırlaması, izofluran anestezisinin kullanılmasıdır. İzofluranın otonom fonksiyon21'i baskıladığı bilinmektedir ve bu etki nispeten kısa bir maruziyete rağmen göz ardı edilemez. Bu protokol, farelerde transözofageal PES yöntemleri geliştirmek için optimize edilmiş bir stratejinin ilk ayrıntılı raporunu temsil eder. Bu çalışma AF duyarlılığına odaklanırken, bu protokolün gelecekteki uygulamaları ventriküler aritmilerindeğerlendirilmesinde kullanılabilir 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Şekil 2 , BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden (HL096844 ve HL133127) gelen hibelerle desteklenmiştir; Amerikan Kalp Derneği (2160035, 18SFRN34230125 ve 903918 [MBM]); ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
References
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al.
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T.
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077 (2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896 (2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402 (2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57 (2021).
