Summary
Schädelfenster sind zu einer allgegenwärtig eingesetzten Operationstechnik geworden, um eine intravitale Bildgebung bei transgenen Mäusen zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines chirurgischen Roboters, der halbautomatische Knochenbohrungen von Schädelfenstern durchführt und dazu beitragen kann, die Variabilität von Chirurg zu Chirurg zu verringern und die Schädigung der thermischen Blut-Hirn-Schranke teilweise zu mildern.
Abstract
Die Schädelfensterchirurgie ermöglicht die Bildgebung von Hirngewebe bei lebenden Mäusen unter Verwendung von Multiphotonen oder anderen intravitalen Bildgebungsverfahren. Bei der Durchführung einer Kraniotomie von Hand kommt es jedoch häufig zu einer thermischen Schädigung des Hirngewebes, die von Natur aus von Chirurgie zu Operation variiert und von der Technik des einzelnen Chirurgen abhängen kann. Die Implementierung eines chirurgischen Roboters kann die Chirurgie standardisieren und zu einer Verringerung der mit der Operation verbundenen thermischen Schäden führen. In dieser Studie wurden drei Methoden des Roboterbohrens getestet, um thermische Schäden zu bewerten: horizontal, Punkt für Punkt und gepulst Punkt für Punkt. Beim Horizontalbohren wird ein kontinuierliches Bohrschema verwendet, während bei Punkt-für-Punkt-Bohrungen mehrere Löcher gebohrt werden, die das Schädelfenster umfassen. Die gepulste Punkt-für-Punkt-Bohrung fügt ein Bohrschema "2 s an, 2 s aus" hinzu, um eine Abkühlung zwischen den Bohrungen zu ermöglichen. Die Fluoreszenzbildgebung des intravenös injizierten Farbstoffs Evans Blue (EB) misst die Schädigung des Hirngewebes, während ein Thermoelement, das unter der Bohrstelle platziert ist, die thermische Schädigung misst. Die Thermoelementergebnisse deuten auf eine signifikante Abnahme der Temperaturänderung in der gepulsten Punkt-für-Punkt-Gruppe (6,90 °C ± 1,35 °C) im Vergleich zu den horizontalen (16,66 °C ± 2,08 °C) und Punkt-für-Punkt-Gruppen (18,69 °C ± 1,75 °C) hin. In ähnlicher Weise zeigte auch die gepulste Punkt-für-Punkt-Gruppe nach der kranialen Fensterbohrung im Vergleich zur horizontalen Methode eine signifikant geringere EB-Präsenz, was auf eine geringere Schädigung der Blutgefäße im Gehirn hinweist. Daher scheint ein gepulstes Punkt-für-Punkt-Bohrverfahren das optimale Schema zur Reduzierung thermischer Schäden zu sein. Ein Roboterbohrer ist ein nützliches Werkzeug, um das Training und die Variabilität zu minimieren und thermische Schäden zu reduzieren. Mit dem zunehmenden Einsatz von Multiphotonen-Bildgebung in Forschungslaboren ist es wichtig, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu verbessern. Die hier angesprochenen Methoden werden dazu beitragen, andere darüber zu informieren, wie diese chirurgischen Roboter besser eingesetzt werden können, um das Feld weiter voranzubringen.
Introduction
Schädelfenster sind in den Neurowissenschaften, der Neurotechnik und der Biologie allgegenwärtig geworden, um eine direkte Visualisierung und Bildgebung des Kortex bei lebenden Tieren zu ermöglichen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Die leistungsstarke Kombination aus transgenen Mäusen und Multiphotonen-Bildgebung hat äußerst wertvolle Einblicke in die Schaltkreisaktivität und andere biologische Erkenntnisse im In-vivo-Gehirn geliefert 12,13,14,15,16,17,18. Miniaturmikroskope, die am Schädel montiert sind, haben diese Möglichkeiten weiter erweitert, um Aufnahmen bei wachen, sich frei bewegenden Tieren zu ermöglichen19. Der Prozess der Herstellung eines Schädelfensters erfordert ein Power-Drilling, um den Schädelknochen zu verdünnen oder vollständig zu entfernen, um Kraniotomien zu erzeugen, die groß genug sind, um ein transparentes Stück Glas über dem Kortex zu befestigen20. Polydimethylsiloxan (PDMS) und andere Polymere wurden ebenfalls als Schädelfenstermaterialien getestet 9,21. Letztendlich ist das ideale kraniale Fenster eines, das die normale endogene Aktivität darunter nicht verändert oder stört. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass das Bohren von Schädelfenstern das darunter liegende Gewebe verschlimmert, was zu einer Schädigung des Gehirns, einer Störung der Umgebung und einer Beeinträchtigung der Hirnhäute bis zu dem Punkt führt, an dem die Abbildungstiefe von Multiphotonen verdecktwird 22. Die daraus resultierende Neuroinflammation hat ein breites Spektrum an Auswirkungen, die von der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) bis hin zur Aktivierung und Rekrutierung von Gliazellen um die Implantatstelle reichen23. Daher ist die Charakterisierung sichererer und reproduzierbarerer Schädelfensterbohrmethoden von entscheidender Bedeutung für eine gleichbleibende Bildqualität und die Reduzierung von Störfaktoren.
Während darauf geachtet wird, das Trauma des darunter liegenden Gewebes zu minimieren, hat das Bohren des Knochens das Potenzial, sowohl thermische als auch mechanische Störungen des Gehirns zu verursachen24,25. Ein mechanisches Trauma durch versehentliches Eindringen des Bohrers in die Dura kann darüber hinaus zu unterschiedlich starken kortikalen Verletzungen führen24. In einer Studie von Shoffstall et al.25 führte die Hitze des Knochenbohrens zu einer erhöhten BHS-Permeabilität, was durch das Vorhandensein des Farbstoffs Evans Blue (EB) im Hirnparenchymangezeigt wurde 25. Intravenös injizierter EB-Farbstoff bindet an zirkulierendes Albumin im Blutkreislauf und überquert daher normalerweise nicht in nennenswerten Konzentrationen eine gesunde BHS. Aus diesem Grund wird der EB-Farbstoff häufig als empfindlicher Marker für die BBB-Permeabilitätverwendet 26,27. Während ihre Studie den Einfluss der BHS-Permeabilität auf nachfolgende biologische Folgeerkrankungen nicht direkt gemessen hat, haben frühere Studien die BHS-Permeabilität mit einer erhöhten neuroinflammatorischen Reaktion auf chronisch implantierte Mikroelektroden und Veränderungen der motorischen Funktion korreliert28.
Abhängig von den Zielen der Studie kann das Ausmaß der thermischen und mechanischen Schädigung eine Quelle für experimentelle Fehler darstellen, die sich negativ auf die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Studie auswirken. Es gibt Dutzende von zitierten Methoden zur Herstellung von Schädelfenstern, die jeweils unterschiedliche Bohrgeräte, Geschwindigkeiten, Techniken und Benutzer verwenden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 berichteten, dass die beobachtete Variation der Erwärmungsergebnisse auf die Variabilität der vom Bohrer ausgeübten Kraft, der Vorschubgeschwindigkeit und des Anwendungswinkels zurückgeführt wurde, neben anderen Aspekten, die beim Bohren von Hand nicht kontrolliert werden können 25. Es wird angenommen, dass automatisierte Bohrsysteme und andere stereotaktische Geräte die Reproduzierbarkeit und die Konsistenz der Ergebnisse verbessern können, aber veröffentlichte Methodenstudien haben die Temperatur oder die BHS-Permeabilität als eines der Ergebnisse nicht rigoros bewertet. Daher besteht ein Bedarf an reproduzierbareren und konsequent angewandten Methoden zur Herstellung von Schädelfenstern sowie an Methoden, die rigoros angewendet werden, um die Auswirkungen von Schädelfensterbohrungen auf das darunter liegende Nervengewebe zu bewerten.
Der Fokus dieser Studie liegt auf der Ermittlung und Entwicklung konsistenter und sicherer Bohrmethoden für Schädelfenster. Die Größe der Kraniotomie bei der Installation von Schädelfenstern ist deutlich größer als bei Standard-Kraniotomien für mikroelektroden, die dem Gehirn implantiert werden. Solche Kraniotomien können nicht mit einem einzigen Bohrloch durchgeführt werden, wenn Standardgeräte verwendet werden, was zu einer größeren Variabilität der Technik zwischen den Chirurgen führt, wenn sie von Hand durchgeführt werden20. Chirurgische Bohrroboter wurden in der Praxis eingeführt, aber nicht weit verbreitet 1,6,29. Die Automatisierung des Bohrens bietet Kontrolle über Variablen, die zur beobachteten Variation von Versuch zu Versuch beitragen, was darauf hindeutet, dass der Einsatz der Geräte inter- und intrachirurgische Effekte reduzieren kann. Dies ist von besonderem Interesse, wenn man bedenkt, dass die größere Kraniotomie, die für die Platzierung des Schädelfensters erforderlich ist, zusätzlich schwierig ist. Während man davon ausgehen könnte, dass die Steuerung durch die Automatisierung des Bohrens klare Vorteile mit sich bringt, wurde die Implementierung dieser Geräte bisher kaum bewertet. Obwohl keine sichtbaren Läsionen beobachtet wurden5, ist der Test mit höherer Sensitivität mit EB erwünscht.
Hier wird die BHS-Permeabilität mit einem handelsüblichen chirurgischen Bohrroboter mit entsprechender Software gemessen, die die Programmierung stereotaktischer Koordinaten, die Kraniotomieplanung/-kartierung und eine Auswahl von Bohrstilen ("Punkt-für-Punkt" vs. "horizontal") in Bezug auf den gerouteten Weg des Bohrmeißels ermöglicht. Zunächst werden acht "Seed"-Punkte gebohrt (Abbildung 1A), die das Schädelfenster umreißen. Von hier aus wird der Raum zwischen den Samen entweder mit der "Punkt-für-Punkt"- oder "horizontalen" Drillmethode ausgeschnitten. "Punkt-für-Punkt" führt vertikale Pilotlochschnitte durch (ähnlich wie bei einer CNC-Bohrmaschine), während "horizontal" horizontale Schnitte entlang des Umfangs des Schädelfensters ausführt, die das Loch umreißen (ähnlich wie bei einem CNC-Fräser). Das Ergebnis für beide Methoden ist ein Stück Schädel, das entfernt werden kann, um das Schädelfenster freizulegen. Um Schäden durch Bohrungen zu vermeiden, wird das Schädelfenster nicht physisch entfernt, um zusätzliche Schäden zu vermeiden. Eine Kombination aus EB-Farbstoff in Verbindung mit Fluoreszenzbildgebung wird verwendet, um die BHS-Permeabilität nach der Durchführung von Kraniotomien bei Mäusen zu messen, und ein eingesetztes Thermoelement wird verwendet, um die Temperatur der Gehirnoberfläche während des Bohrens direkt zu messen (Abbildung 1B, C). Frühere Beobachtungen deuteten darauf hin, dass das gepulste Ein- und Ausschalten des Bohrens mit Intervallen von 2 s ausreicht, um die Erwärmung des Bohrers25 zu verringern, und daher in den experimentellen Ansatz für den Operationsroboter einbezogen wird.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Methoden zur Beurteilung thermischer Schäden durch Kraniotomiebohrungen zu demonstrieren. Während die Methoden im Kontext des automatisierten Bohrens vorgestellt werden, können solche Methoden auch auf manuelle Bohrschemata angewendet werden. Diese Methoden können verwendet werden, um die Verwendung von Geräten und/oder Bohrschemata zu validieren, bevor sie als Standardverfahren übernommen werden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der experimentellen Pipeline. Schematische Darstellung des Prozesses, dem die Tiere nach dem kranialen Fensterverfahren zur EB-Quantifizierung unterzogen wurden. (A) Schematischer Aufbau der Maus mit dem stereotaktischen Rahmen und dem chirurgischen Roboterbohrer. Ein Beispiel für ein kraniales Fenster ist über dem motorischen Kortex mit Startpunkten (grün) und Kantenpunkten (blau) dargestellt. (B) Der Perfusionsaufbau umfasst die Injektion von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in das gesamte Tier, um Blut zu entfernen, gefolgt von der Extraktion des Gehirns. (C) Das Gehirn wird dann in die Kammer des EB-Fluoreszenzbildgebungssystems gegeben, um eine Fluoreszenzbildgebung mit dem Farbstoff Evans Blue durchzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Protocol
Alle Verfahren und Tierpflegepraktiken wurden vom Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee überprüft, genehmigt und durchgeführt.
1. Einrichtung der Hardware des Operationsroboters
- Befolgen Sie vor der Operation das Handbuch und die Anleitung des Operationsroboters (siehe Materialtabelle), um die Hardware und Software einzurichten. Führen Sie die Rahmenkalibrierung wie im Handbuch beschrieben durch. Wenn der Bohrer oder der Rahmen verschoben wird, wird empfohlen, den Bohrer neu zu kalibrieren, um die Genauigkeit zu gewährleisten.
2. Vorbereitung der Software
- Navigieren Sie zur chirurgischen Software (siehe Materialtabelle) und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie Mit einem sauberen Projekt beginnen auswählen. Legen Sie das Motiv oben als Maus fest, um die zu verwendenden Bohrkoordinaten festzulegen.
- Wählen Sie Neues Projekt starten aus.
- Klicken Sie von hier aus in der unteren linken Ecke auf Planung , um zum Bildschirm für die Bohrkoordinatenplanung zu navigieren. Erstellen Sie das Bohrschema für die durchzuführende Schädelfenstertechnik.
- Klicken Sie dazu auf eine beliebige Stelle im stereotaktischen Atlas. Verwenden Sie Bregma als Referenz und geben Sie die folgenden Koordinaten für den motorischen Kortex ein: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um die ausgewählten Koordinaten zu aktualisieren.
HINWEIS: Die dorsal-ventralen (DV) Koordinaten geben die Bohrtiefe an und benötigen daher hier keine Eingabe. - Klicken Sie auf Ziel speichern, um diese Koordinaten zu speichern und einen geeigneten Namen einzugeben. Klicken Sie von hier aus auf die Schaltfläche Verschieben unten links, um zurück zum Hauptbohrbildschirm zu navigieren.
- Klicken Sie dazu auf eine beliebige Stelle im stereotaktischen Atlas. Verwenden Sie Bregma als Referenz und geben Sie die folgenden Koordinaten für den motorischen Kortex ein: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um die ausgewählten Koordinaten zu aktualisieren.
- Klicken Sie auf Extras > Projekt > Speichern unter , um dieses Vorlagenprojekt für spätere Projekte wiederzuverwenden. Dadurch werden die Bohrkoordinaten automatisch für die spätere Verwendung gespeichert.
3. Vorbereitung auf die Operation
- PrismPlus-Mäuse30,31 (siehe Materialtabelle) werden in einer Isoflurankammer anästhesiert (3,5 % in 1,5 l/minO2). Tragen Sie Augengleitmittel auf, um das Austrocknen der Augen zu verhindern, rasieren Sie den Kopf mit einer Haarschneidemaschine und schneiden Sie die Nägel, um zu verhindern, dass die Mäuse die Nähte herauskratzen.
HINWEIS: PrismPlus-Mäuse sind eine Art transgener fluoreszierender Spezies, die in der Multiphotonen-Bildgebung verwendet wird. Den heterozygoten PrismPlus-Mäusen fehlen die fluoreszierenden Gene und sie wurden daher hier verwendet, um tierische Ausscheidungen aus anderen laufenden Studien zu reduzieren, da es in dieser Studie keine Multiphotonen-Bildgebung gibt. Es wird erwartet, dass Wildtyp-Mäuse ähnliche Ergebnisse zeigen. - Verabreichen Sie den anästhesierten Mäusen subkutane Injektionen mit dem Antibiotikum Cefazolin (24 mg/kg), dem Analgetikum Carprofen (5 mg/kg) und Buprenorphin (0,05-0,10 mg/kg). Verabreichen Sie vor jedem Schnitt eine einzelne subkutane Injektion von Marcaine (0,25 %, 100 μl) unterhalb der Einschnittstelle (1 Zoll entlang der Mittellinie des Schädels, beginnend hinter den Augen).
HINWEIS: Die hier verwendeten Medikamente folgen den zuvor festgelegten IACUC-Protokollen. Es wird jedoch empfohlen, EMLA-Creme als topisches Anästhetikum für eine multimodale Wirkung vor der Operation und der Schwanzveneninjektion sowie Meloxicam SR anstelle von Carprofen in Betracht zu ziehen. EMLA und Meloxicam SR können vor der Isofluran-Anästhesie verabreicht werden. - Montieren Sie das Tier mit den mitgelieferten Ohrbügeln auf dem stereotaktischen Rahmen des Operationsroboters und halten Sie die Anästhesie mit 0,5%-2%igem Isofluran durch Inhalation durch einen Nasenkegel aufrecht.
- Stellen Sie sicher, dass die Anästhesietiefe von einem geschulten Tiertechniker oder -personal genau überwacht wird, basierend auf der Reaktionsfähigkeit der Maus, der Atmung (~55-65 Atemzüge/min), der Herzfrequenz (300-450 Schläge pro Minute) und der Farbe (rosa). Schnurrbart und regelmäßiges Zehenkneifen können auch als Maß verwendet werden, um die Narkosetiefe zu bestimmen. Die Werte der Vitalwerte werden durch die institutionellen Vorschriften der IACUC bestimmt.
- Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres auf einem zirkulierenden Wasserkissen aufrecht und überwachen Sie die Vitalwerte mit einem Blutsauerstoff- und Herzfrequenzmesssystem.
- Schrubben Sie den Operationsbereich zur Sterilisation mit Chlorhexidingluconat (CHG) und 70% Isopropanol. Um die Sterilität während der Operation zu erhalten, legen Sie eine sterile Plastikfolie über die Maus und den stereotaktischen Rahmen.
HINWEIS: Obwohl diese Protokolle für Überlebensoperationen entwickelt wurden, spiegeln die präsentierten Daten die Verwendung von Nicht-Überlebenstieren wider, da der Schwerpunkt darauf lag, die geeigneten Bohrprotokollmethoden zu testen und zu bestimmen.
4. Schädelpräparation
- Führen Sie mit einer Skalpellklinge einen 1-Zoll-Schnitt an der Mittellinie des Schädels durch, beginnend im hinteren Teil der Augen.
- Ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen, und verwenden Sie (optional) Retraktoren, um das Operationsfenster zu erhalten. Entfernen Sie alle Gewebe- und Membranreste mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze.
- Trocknen und reinigen Sie den Schädel mit 3%igem Wasserstoffperoxid mit Applikatoren mit Wattespitze.
HINWEIS: Dadurch werden die Nähte des Schädels sichtbar. Bregma und Lambda sollten leicht zu erkennen sein. Wenn nicht, tragen Sie mehr Wasserstoffperoxid auf oder vergrößern Sie den Einschnitt. - Ermöglichen Sie die "Auto-Stopp"-Funktion, indem Sie das Krokodilklemmenkabel vom Bohraufbau des Operationsroboters gemäß den Empfehlungen des Herstellers an die Maus anschließen. "Auto-Stop" funktioniert, indem es eine Impedanzänderung erkennt, d. h. sobald der Bohrer mit Liquor cerebrospinalis (CSF) anstelle von Knochen in Kontakt kommt, stoppt der Bohrer das Bohren und verhindert so Schäden am Gehirn.
5. Injektion der Evans Blue Schwanzvene
ACHTUNG: EB ist möglicherweise krebserregend. Verwenden Sie bei der Handhabung Handschuhe.
- Um den Schwanz für eine einfache Injektion vorzubereiten, wischen Sie ihn mit einem Alkoholtuch ab. Optional kann Wintergrünöl topisch aufgetragen werden, um die Venezu erweitern 35.
- Fassen Sie den Schwanz mit einer Hand, während Sie mit der anderen Hand die Spritze mit EB handhaben. Beugen Sie mit Daumen und Zeigefinger den Schwanz, um die Schwanzvene über der Schwanzbiegung freizulegen. Führen Sie die Spritze (1 oder 2 ml, 30 g Insulinspritze) parallel zur Vene ein und injizieren Sie langsam das Volumen EB. EB (4 Gew.-%) wird in einer Konzentration von 2 ml/kg Körpergewicht über eine Schwanzveneninjektion verabreicht.
Anmerkungen: Wenn die Nadel richtig eingeführt ist, ist ein minimaler bis gar kein Widerstand beim Fließen von der Spritze in den Schwanz zu spüren. Wenn es einen Widerstand gibt oder EB-Farbstoff im Schwanz erscheint, bewegen Sie sich auf dem Schwanz nach unten und versuchen Sie es erneut. - Warten Sie nach der Injektion 5 Minuten, damit EB in der Maus zirkulieren kann, bevor Sie mit dem Bohren beginnen. Die erfolgreiche Injektion wird sofort bestätigt, wenn sich die Extremitäten und das Operationsfenster der Maus blau färben.
6. Chirurgisches Roboterbohrverfahren
- Sobald der Schädel für das Bohren vorbereitet ist, navigieren Sie zurück zur chirurgischen Software. Öffnen Sie das in Schritt 2.4 definierte Vorlagenprojekt, in dem die Koordinaten für die Bohrung festgelegt wurden.
- Folgen Sie Tools > Projekt > neuer > Wählen Sie ein Vorlagenprojekt aus, und wählen Sie das Vorlagenprojekt aus, das in Schritt 2 (Softwarevorbereitung) festgelegt wurde.
- Wählen Sie Gleiche Protokollelemente > Planung (Zielpunkte) > Bohrparameter aus, um sie auf dieses neue Projekt zu übertragen.
- Klicken Sie auf Neues Projekt starten.
- Korrigieren Sie als Nächstes die Übung und den Rahmen, um die Neigung und Skalierung des Mausschädels des aktuellen Tieres zu berücksichtigen. Klicken Sie auf Extras und wählen Sie Korrigieren für Neigung und Skalierung... , um den Korrekturbildschirm zu öffnen. Stellen Sie am oberen Bildschirmrand sicher, dass der Bohrer aktiv ist (nicht die Spritze), indem Sie auf die hellrote Schaltfläche Bohren klicken.
HINWEIS: Nach der Aktivierung wird die Drill-Taste dunkel-/hellrot. Der Spritzenknopf kann ignoriert werden, da dieser in diesem Protokoll nicht verwendet wird.- Korrigieren Sie zunächst die Skala, die Tonhöhe und das Gieren, indem Sie festlegen, wo sich Bregma und Lambda auf dem aktuellen Tier befinden. Verwenden Sie entweder die Tastatursteuerung oder die Steuerelemente auf dem Bildschirm, um den Bohrer zu bewegen. Sobald sich der Bohrer über Bremma befindet, senken Sie ihn ab, bis er gerade den Schädel berührt, und klicken Sie auf Bregma einstellen. Wiederholen Sie dies für Lambda.
- Passen Sie als Nächstes die spezifische Rolle des Schädels an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zum Mittelpunkt gehen , um den Bohrer automatisch an die Mitte des Schädels anzupassen. Klicken Sie 2 mm nach links und senken Sie dann den Bohrer langsam ab, bis Sie den Schädel berühren. Klicken Sie auf Linkspunkt setzen.
- Wiederholen Sie Schritt 6.2.2 für die rechte Gehirnhälfte. Jetzt ist das System für diesen speziellen Schädel eingerichtet.
HINWEIS: Die Korrektur ist hier von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Bohrkoordinaten und die Bohrtiefe korrekt sind. Die Maus muss so gerade wie möglich montiert werden, um die Notwendigkeit einer Korrektur so weit wie möglich zu reduzieren. Wenn große Korrekturen erforderlich sind, kann dies zu einer schlechten Bohrgenauigkeit führen.
- Nachdem die Korrektur durchgeführt wurde, verlassen Sie das Korrekturfenster, indem Sie auf Schließen in der unteren Mitte des Bildschirms. Navigieren Sie zum Bohrbildschirm, indem Sie auf Werkzeuge und wählen Sie dann Bohrer... , um den Bohrvorgang zu starten.
- Stellen Sie sicher, dass Kraniotomie-Form aus dem Dropdown-Menü Bohren am oberen Bildschirmrand ausgewählt ist. Klicken Sie dann auf Bohrmittelpunkt und -form auswählen und wählen Sie das vordefinierte Ziel aus, das in Schritt 2.3.1 benannt wurde. Wählen Sie auf diesem Bildschirm Kreis als Form für das Ziel aus und geben Sie 2,60 mm als Durchmesser2 des Kreises ein. Klicken Sie auf Anzeigen.
Anmerkungen: Der Durchmesser des kranialen Fensters wird mit der Mitte des Bohrers als Mittelpunkt der Ausgangspunkte erstellt. Ein kleiner Bohrer (Durchmesser = 0,6 mm oder die vom Hersteller empfohlene Bitgröße) wird verwendet, um den zusätzlichen Durchmesser zu minimieren, der durch die Verwendung eines größeren Bohrers entsteht. Speziell für den Operationsroboter kommen spezielle Bohrer zum Einsatz. Die acht Startpunkte und Kantenpunkte werden nun auf dem Schädel als grüne bzw. blaue Punkte angezeigt. - Klicken Sie auf das Hauptfenster und verwenden Sie die Tastenkombination Strg + Umschalt + D , um das Menü " Bohrpunkte" auf der rechten Seite des Bildschirms aufzurufen. Dies ermöglicht die Anzeige bestimmter Bohrpunkttiefen und -status.
- Bevor Sie mit der Bohrung beginnen, passen Sie bei Bedarf die Auto-Stopp-Funktion an, indem Sie auf die Schaltfläche neben dem Kontrollkästchen Auto-Stop klicken. Diese Schaltfläche ist standardmäßig auf Mittel eingestellt, was der Empfindlichkeit für die Auto-Stopp-Funktion entspricht.
HINWEIS: Dies kann vorher getestet werden, um die richtige Empfindlichkeit für die Tiere zu finden. Bei diesem Protokoll wurde die höchste Empfindlichkeit verwendet, um ein minimales Bohren durch das Gehirn zu gewährleisten. - Sobald die Auto-Stop-Funktion aktiviert und angepasst ist, beginnen Sie mit dem Bohren des Startpunkts. Klicken Sie auf Automatischer Scan , damit die Bohrung automatisch bei Seed 1 beginnt. Sobald der Bohrer den Liquor berührt, erkennt die Auto-Stop-Funktion eine Impedanzänderung, was zu einem Stopp des Bohrens und einem Zurückziehen des Bohrers aus dem Schädel führt.
- Behalten Sie die Bohrung genau im Auge, falls der automatische Stopp keine Veränderungen erkennt. Die Escape-Taste kann gedrückt werden, um das Bohren manuell abzubrechen. Der rosafarbene Kreis am unteren Rand des Drill-Menüs und rechts neben den Impedanzwerten kann ebenfalls angeklickt werden, um das Drillen zu starten oder zu stoppen.
HINWEIS: Der Bohrer bohrt automatisch bis zu einer Tiefe, die der geschätzten Schädeldicke entspricht (oder bis die Auto-Stop-Funktion aktiviert ist). - Wenn der automatische Stopp nicht aktiviert ist, bevor die geschätzte Tiefe erreicht ist, wird ein Bildschirm angezeigt, in dem der Benutzer aufgefordert wird: 1) weiter zu bohren und # mm weiter abzusenken, 2) in der aktuellen Tiefe zu markieren und fortzufahren, 3) den aktuellen Punkt zu überspringen und fortzufahren oder 4) den Vorgang zu stoppen (kann später fortgesetzt werden). Wählen Sie eine der unten beschriebenen Optionen aus.
- Geben Sie für Weiter bohren und absenken # mm weiter einen Abstand ein, in dem der Bohrer vorrücken soll. Standardmäßig wird 0,1 mm verwendet. Ein kleinerer Abstand kann vorgeschlagen werden, um ein versehentliches Eindringen in das Gehirn zu verhindern.
- Wenn angenommen wird, dass die Dura auf diesem Bildschirm erreicht wurde, wählen Sie die Option In aktueller Tiefe markieren und fortfahren , damit das System die Dura in dieser Tiefe markiert und mit dem nächsten Startwert fortfährt.
- Verwenden Sie den aktuellen Punkt überspringen und fortfahren und den Vorgang stoppen (kann später fortgesetzt werden), um Fehler zu beheben oder den Bohrer zu reinigen und zurückzukehren, sobald der automatische Stopp wieder funktioniert.
- Wenn alle Saatpunkte gebohrt wurden und einige nicht mit der Auto-Stop-Funktion fertiggestellt wurden, überprüfen Sie die Tiefe des Lochs manuell mit einem Dura-Pick. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bohrtiefe durch den Schädel gedrungen ist.
- Bevor Sie mit dem Kantenpunktbohren beginnen, entscheiden Sie, welche Art von "Kantenschnitt" gewünscht wird, indem Sie das Dropdown-Menü neben dem Text " Kantenschnitt " im Menü "Bohren" auswählen. Die beiden Optionen sind Punkt für Punkt und Horizontal.
- Wählen Sie Punkt für Punkt aus, um jeden Kantenpunkt einzeln und bis zu einer Tiefe zu bohren, die durch die Tiefe der benachbarten Startpunkte bestimmt wird. Passen Sie die Skalierung bei Bedarf über die Schaltfläche Kantenskalierung... unten an, obwohl die Standardeinstellung Keine Skalierung in der Regel ausreicht.
- Wählen Sie Horizontal, um mit dem Bohren an Kantenpunkt 1 zu beginnen, und verwenden Sie eine kontinuierliche Bohrbewegung , um den gesamten Umfang des Bohrkreises zu umrunden. Standardmäßig schneidet der horizontale Schnitt in 100-μm-Intervallen, wobei er den gesamten Umfang des Fensters umrundet, bevor er weitere 100 μm tiefer vorrückt. Ändern Sie bei Bedarf die Intervalltiefe und die Bohrgeschwindigkeit unter der Schaltfläche Schnittoptionen... unten.
- Verwenden Sie den automatischen Schnittversatz (unter dem Feld Kantenschnitt ), um die Tiefe des automatischen Schnitts anzupassen, indem Sie einen vordefinierten Versatz von den benachbarten Startpunkten nehmen. In diesem Protokoll wurde ein Auto-Cut-Offset von 20 μm verwendet. Weitere Tests können durchgeführt werden, um einen optimalen Ausgleich pro Tier zu bestimmen.
- Nachdem Sie die Einstellungen für den Kantenschnitt festgelegt haben, beginnen Sie mit dem Bohren von Kantenpunkten, indem Sie auf die Schaltfläche Automatischer Schnitt in der Mitte des Bohrmenüs klicken. Beim Punkt-für-Punkt-Bohren ist der Bohrvorgang beendet, sobald die letzte Kante gebohrt wurde. Fahren Sie beim horizontalen Bohren fort, bis genügend Schädel gebohrt wurde, um das Schädelfenster freizugeben.
Anmerkungen: Obwohl so lange gebohrt wird, bis das Fenster gelöst werden kann, wird das Fenster hier nicht physisch freigegeben, um Schäden am darunter liegenden Gewebe zu vermeiden. Es ist wichtig, den Schaden, der nur durch das Bohren entsteht, zu isolieren, um verschiedene Bohrschemata zu bewerten.- Sobald die horizontale Bohrung die Tiefe eines Startpunkts erreicht hat, klicken Sie im Menü Bohrpunkte mit der rechten Maustaste auf diesen Startpunkt (oder wählen Sie zuerst mehrere Punkte aus), und klicken Sie auf Tiefe sperren. Auf diese Weise kann der horizontale Schnitt fortgesetzt werden, ohne dass dieser Bereich tiefer geschnitten wird (wodurch ein Eindringen in das Gehirn vermieden wird).
HINWEIS: Wenn es Saatpunkte mit unterschiedlichen Dura-Tiefen gibt, kann dies zu Unterschieden in der Tiefe führen, die für das horizontale Bohrverfahren benötigt wird.
- Sobald die horizontale Bohrung die Tiefe eines Startpunkts erreicht hat, klicken Sie im Menü Bohrpunkte mit der rechten Maustaste auf diesen Startpunkt (oder wählen Sie zuerst mehrere Punkte aus), und klicken Sie auf Tiefe sperren. Auf diese Weise kann der horizontale Schnitt fortgesetzt werden, ohne dass dieser Bereich tiefer geschnitten wird (wodurch ein Eindringen in das Gehirn vermieden wird).
- Wenn die Auto-Stop-Funktion nicht richtig funktioniert, stellen Sie sicher, dass der Bohrer vollständig frei von Schmutz oder potenziellem Blut, Kochsalzlösung usw. ist, da diese die Grundimpedanz des Bohrers beeinträchtigen können. Wählen Sie außerdem eine der unten beschriebenen manuellen Bohroptionen für den Fall, dass der automatische Stopp nicht konsistent funktioniert.
- Navigieren Sie im Menü "Drill" manuell zu den einzelnen Ausgangswerten, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Startwert oder die Kante klicken und Gehe zu Eintrag auswählen. Es gibt auch Optionen zum Löschen der markierten Tiefen, zum Zurücksetzen des Lochs und andere Optionen, die den Bohrvorgang unterstützen können.
- Steuern Sie den Vorschub der Bohrtiefe manuell, indem Sie eine Tiefe aus der Dropdown-Liste auswählen, die sich neben dem Text Vortrieb: oben im Menü Bohren befindet. Klicken Sie direkt darunter auf die Schaltfläche Vorwärts, um die Übung um den eingestellten Abstand vorzurücken.
HINWEIS: Diese Funktion kann in Verbindung mit den Schaltflächen "Dura einstellen" und "Oberfläche festlegen" unter der Schaltfläche "Advance" verwendet werden, um dem System manuell mitzuteilen, wo sich sowohl die Oberfläche des Schädels als auch die Oberfläche der Dura befinden. Verwenden Sie nach Möglichkeit die Auto-Stopp-Funktion, aber bei Bedarf reichen auch diese manuellen Optionen aus. - Wenn Sie manuell bohren, seien Sie zwischen den einzelnen Bohrtiefenintervallen vorsichtiger, um sicherzustellen, dass der Bohrer die Dura nicht überschreitet. Überprüfen Sie das Bohrloch zwischen den Tiefenintervallen mit einem Dura-Pick, um zu bestätigen, ob die Dura erreicht wurde. Sobald alle manuellen Aussaaten abgeschlossen sind, setzen Sie den Kantenschnitt wie oben beschrieben normal fort.
- Pulse-Methode
- Um manuelles Impulsbohren durchzuführen, deaktivieren Sie die Auto-Stopp-Funktion, indem Sie das Kontrollkästchen neben der Option Auto-Stopp im Menü Bohren deaktivieren. Dies muss ausgeschaltet sein, um steuern zu können, wann der Bohrer für das Pulsieren ausgeschaltet ist.
Anmerkungen: Das Impulsbohren folgt einem Muster von 2 s Bohren, gefolgt von 2 s ohne Bohren, damit der Schädel abkühlen kann. - Wählen Sie im Menü Bohren 100 μm als Bohrtiefenvorschub aus, dies entspricht ~2 s Bohren nach unten.
- Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Advance , um mit der Bohrung zu beginnen.
Anmerkungen: Seien Sie bereit, den Bohrer schnell zu stoppen, sobald er um 100 μm vorgerückt ist, da sich der Bohrer in der Tiefe weiter dreht, bis der Austritt gedrückt wird (wodurch unnötige Wärme erzeugt wird). - Sobald der Bohrer 100 μm vorgerückt ist, drücken Sie zweimal die Esc-Taste , um den Bohrer zu stoppen. Wiederholen Sie diesen Zyklus nach 2 s für die Tiefe des Schädels.
HINWEIS: Aufgrund von Software- und mechanischen Einschränkungen kann nur die Punkt-für-Punkt-Methode mit der gepulsten Methode durchgeführt werden. Kontinuierliches Horizontalbohren kann auf diese Weise nicht durchgeführt werden. - Bohren Sie alle Ausgangs- und Kantenpunkte mit der oben beschriebenen Methode. Stellen Sie sicher, dass Sie Dura über die Schaltfläche im Bohrer-Menü einstellen, sobald die Dura erreicht ist.
- Um manuelles Impulsbohren durchzuführen, deaktivieren Sie die Auto-Stopp-Funktion, indem Sie das Kontrollkästchen neben der Option Auto-Stopp im Menü Bohren deaktivieren. Dies muss ausgeschaltet sein, um steuern zu können, wann der Bohrer für das Pulsieren ausgeschaltet ist.
- Stellen Sie sicher, dass Kraniotomie-Form aus dem Dropdown-Menü Bohren am oberen Bildschirmrand ausgewählt ist. Klicken Sie dann auf Bohrmittelpunkt und -form auswählen und wählen Sie das vordefinierte Ziel aus, das in Schritt 2.3.1 benannt wurde. Wählen Sie auf diesem Bildschirm Kreis als Form für das Ziel aus und geben Sie 2,60 mm als Durchmesser2 des Kreises ein. Klicken Sie auf Anzeigen.
7. Perfusion und Gehirnextraktion
- Sobald das Bohren der Saat- und Kantenpunkte abgeschlossen ist, halten Sie das Tier für weitere 1 Stunde unter Isofluran-Narkose, damit der EB-Farbstoff zirkulieren und durch die beschädigte BHS extravasieren kann. Führen Sie eine kardiale Perfusion durch, um Blut oder Flüssigkeiten aus den Gefäßen zu entfernen, und entfernen Sie dann das Gehirn für die Bildgebung und Analyse, wie unten beschrieben.
- Nach der 1-stündigen EB-Zirkulationsperiode nach der Bildung des Schädelfensters wird dem Tier intraperitoneal ein Cocktail aus Ketamin (160 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg) injiziert. Wenn Sie nicht mehr ansprechen, führen Sie eine Herzperfusion durch.
- Schneiden Sie den Bauch der Maus mit einer Schere auf und legen Sie das Herz frei, indem Sie vertikal durch den Brustkorb und horizontal über das Zwerchfell schneiden. Ziehen Sie den Brustkorb zurück, um das Herz klar zu sehen. Führen Sie eine Schmetterlingsnadel in die linke Herzkammer ein und beginnen Sie, 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den ganzen Körper zu infundieren. Schneiden Sie einen kleinen Teil des rechten Vorhofs des Herzens ab, um den Druckaufbau zu lösen.
- Nachdem 25 ml 1x PBS im ganzen Körper durchblutet wurden, stoppen Sie die Perfusion und enthaupten Sie die Maus als sekundäres Mittel der Euthanasie.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die institutionell anerkannte Methode der Euthanasie und/oder Endpunktperfusion durchführen, damit das Tier das Gehirn isolieren kann. - Von hier aus entfernst du das Gehirn aus dem Schädel, indem du den Knochen und das Gewebe mit Rongeuren entfernst.
- Stellen Sie das extrahierte Gehirn mit einem fluoreszierenden Bildgebungssystem dar, um die Menge an EB zu beobachten, die sich im Gehirn um die Bohrstellen herum befindet.
HINWEIS: EB bindet an zirkulierendes Albumin. Wenn eine Gefäßschädigung im Gehirn auftritt, tritt EB aus und bindet sich an das Hirngewebe, was zu einem klaren visuellen Indikator für Schäden führt.
8. Bildgebung und Analyse von Evans Blue
- Hardware-Initialisierung
- Schalten Sie den Computer ein, der an das EB-Fluoreszenzbildgebungssystem angeschlossen ist, und starten Sie die Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle), während andere Elemente vorbereitet werden. Schalten Sie die Lichtquelle, die Plattform und die Kamera in dieser Reihenfolge ein.
- Navigieren Sie zur Bildbearbeitungssoftware und klicken Sie in der Systemsteuerung für die Erfassung auf Initialisieren. Das System und die Kammer signalisieren von Rot auf Grün, sobald die Initialisierung abgeschlossen ist.
Anmerkungen: Initialisieren Sie das EB-Fluoreszenz-Bildgebungssystem 30 Minuten vor jeder Bildgebung, damit die Temperatur der Lichtquelle optimale Werte erreicht.
- Bildgebung des Gehirns
- Legen Sie das explantierte Gehirn zur Bildgebung in eine durchsichtige Schale in der Mitte des Tisches.
- Passen Sie in der Systemsteuerung für die Aufnahme die Einstellungen für das Bild an. Wählen Sie die Belichtungszeit: 1 s; Binning: Mittel; Blende: F1; Anregung: 535 bis 675 nm; Emission: Cy 5,5; Lampenstand: Hoch; und Sichtfeld: 5 cm. Lassen Sie den Filter gesperrt und die Überlagerung von Fotografie und Fluoreszenz aktiviert. Diese Einstellungen basieren auf früheren Laborerfahrungen und anderen veröffentlichten Methoden zur Bildgebung von EB36.
- Laden Sie Bilder des EB-Fluoreszenzbildgebungssystems in eine frei zugängliche Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle) und generieren Sie drei freihändige Regions of Interest (ROIs), um die Fluoreszenzintensität von EB zu ermitteln, indem Sie die mittlere Strahldichte über den Hintergrund, das gesamte Gehirn und das Schädelfenster messen.
- Normalisieren Sie die Messungen des Schädelfensters und des gesamten Gehirns im Vergleich zum entsprechenden Hintergrund-ROI.
- Jedes Gehirn wird unter verschiedenen Anregungsfiltern (535-675 nm) abgebildet, um die Wellenlänge mit dem höchsten Signal-Rausch-Verhältnis (605 nm wurde gewählt) zwischen den Versuchsgruppen und der Kochsalzkontrolle zu finden.
- Isolieren Sie die mittlere Strahldichte unter der entsprechenden Wellenlänge und den Mittelwert, um die durchschnittliche mittlere Strahldichte oder Fluoreszenzintensität für die ROIs des gesamten Gehirns und des Schädelfensters zu erhalten.
- Ermitteln und normalisieren Sie die durchschnittliche mittlere Strahldichte über die kraniale Fensterfläche für jede Gruppe im Vergleich zur Kochsalzkontrolle.
9. Bewertung des Thermoelements
- Messen Sie die Temperaturänderungen von Schädel und Gehirn mit einem Thermoelement (siehe Materialtabelle) in Kombination mit den drei verschiedenen Bohrschemata. Das Thermoelement ist mit einem Datenerfassungssystem (DAQ) verbunden, mit dem die Messung in MATLAB eingelesen werden kann.
- Montieren Sie eine Kadavermaus auf dem stereotaktischen Rahmen und dem Roboterbohrer-Setup. Bohren Sie manuell ein kleines Loch (gleiche Größe wie der Saatpunkt) ~2 mm von der Stelle entfernt, an der das Schädelfenster in die Seite des Schädelsgemacht wird 25. Dieses Loch ermöglicht es, das Thermoelement in die Position zu schieben, unter der das Schädelfenster gebohrt wird (Abbildung 2D).
Anmerkungen: Kadavermäuse werden verwendet, da die Seite des Schädels aufgebohrt werden muss, um das Thermoelement über den Bohrbereich des Schädelfensters zu schieben. Bei dieser Kadavermaus handelt es sich um ein anderes Tier als dasjenige, das zuvor für die Evans-Blue-Analyse verwendet wurde. - Beginnen Sie den Bohrvorgang für jedes der drei Schemata wie zuvor ausgeführt (Schritt 6). Wenn der Bohrer durch den Schädel geht, kommt es zu Temperaturspitzen, die auf eine Erwärmung in der Nähe des Gehirns hindeuten.
- Zeichnen Sie die Ergebnisse in MATLAB auf und zeichnen Sie sie auf, um die maximale Temperaturdifferenz zu berechnen. Dies sollte getrennt für die Saatsaat und die Kantenbohrung erfolgen, um die horizontale vs. Punkt-für-Punkt-Aussaat zusammen mit der gepulsten manuellen Bohrmethode zu bewerten.
10. Statistik
- Führen Sie statistische Analysen für Thermoelement- und EB-Fluoreszenzbildgebung in R unter Verwendung eines Kruskal-Wallis-Rangsummentests mit Benjamini-Hochberg-Korrektur durch, gefolgt von paarweisen Vergleichen mit dem Wilcoxon-Rangsummen-Exakttest25.
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Representative Results
Thermische Auswertung
Das Potenzial für thermische Schäden wurde bewertet, indem die Temperaturänderung gegenüber der Basislinie aufgrund von Bohrungen mit horizontalen (Abbildung 2A), Punkt-für-Punkt- (Abbildung 2B) und gepulsten Punkt-für-Punkt-Methoden (Abbildung 2C) gemessen wurde. Abbildung 2D zeigt den Versuchsaufbau zur Gewinnung thermischer Daten. Für die thermische Auswertung wurde eine Stichprobengröße von N = 4 Schädelfenstern verwendet. Horizontal und Punkt für Punkt verwenden das gleiche Schema für die Aussaat, unterscheiden sich jedoch in der Art und Weise, wie die Kantenpunkte geschnitten werden. Beim Punkt-für-Punkt-Pulsieren wird ein gepulstes Verfahren sowohl für die Saatgut- als auch für die Kantenaussaat verwendet. Bei der horizontalen Aussaat zeigte sich eine maximale Temperaturänderung von 16,66 °C ± 2,08 °C, während die Randbohrung 9,08 °C ± 0,37 °C zeigte. Bei der Punkt-für-Punkt-Methode zeigte die Aussaat eine maximale Temperaturänderung von 18,69 °C ± 1,75 °C, während die Randaussaat 8,53 °C ± 0,36 °C zeigte. Bei der gepulsten Punkt-für-Punkt-Methode zeigte die Saatsaat eine maximale Temperaturänderung von 6,90 °C ± 1,35 °C, während die Randsaat 4,10 °C ± 0,51 °C zeigte. Sowohl die horizontalen als auch die Punkt-für-Punkt-Bohrschemata zeigen nicht signifikante Unterschiede bei thermischen Änderungen. Die Umstellung auf eine gepulste Punkt-für-Punkt-Methode führte jedoch zu einer signifikant geringeren Erwärmung (p < 0,05) des Gehirns als sowohl horizontales als auch Punkt-für-Punkt-Bohren (Abbildung 2E, F). Die Dauer der Operation wurde ebenfalls aufgezeichnet, da dies einen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Tiere bei Lebendoperationen haben kann. Bei beiden automatisierten Verfahren dauerte die Aussaat durchschnittlich 360 s. Das horizontale Kantenbohren dauerte 300 s, das Punkt-für-Punkt-Kantenbohren 200 s. Das gepulste Verfahren dauerte am längsten, wobei Saat- und Kantensaat jeweils etwa 500 s dauerten. Diese Unterschiede sind jedoch nicht groß genug, um eine Berücksichtigung zu rechtfertigen, da Operationen in der Regel länger als 2-3 Stunden dauern können.
Abbildung 2: Thermische Auswertung. Das Potenzial für thermische Schäden wurde anhand der maximalen Temperaturänderungen im Gehirn als Folge von Bohrmethoden bewertet. (A) Horizontales Bohren und (B) Punkt-für-Punkt-Bohren erzeugten ähnliche Wärmemengen, während (C) eine gepulste Punkt-für-Punkt-Methode mit 2 s an und 2 s aus Punkt für Punkt eine minimale Erwärmung aufwies. (E) Die Aussaat und die Randaussaat (F) führten zu einer signifikant geringeren thermischen Änderung in der gepulsten Punkt-für-Punkt-Aussaat (p < 0,05, N = 4 pro Bedingung). (D) Das Thermoelement wird unter dem Schädel des Mäusekadavers platziert, wo das Bohren durchgeführt wird. Die Daten werden über eine Datenerfassung erfasst und zur Analyse in einen Computer eingespeist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Gefäßschäden
Abbildung 3 zeigt den Zusammenhang zwischen Bohrschema und Gefäßschädigung. Tabelle 1 zeigt den p-Wert für jedes Bohrschema nach der statistischen Analyse, wie in Schritt 10 angegeben. Für die EB-Farbstoffauswertung wurde eine Stichprobengröße von N = 4 pro Gruppe verwendet. Das Vorhandensein einer höheren EB-Menge ist ein direkter Indikator für eine Schädigung der BBB, von der die Punkt-für-Punkt-, Horizontal- und gepulsten Bohrmethoden deutlich größer sind als die der Kontrolle (alle mit p = 0,043; Tabelle 1). Die Punkt-für-Punkt-Methode zeigt keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die EB-Präsenz im Vergleich zur Horizontalbohrung (p = 0,411). Beide Schemata nutzten die Auto-Stop-Funktion, um ein Bohren in das Gehirn zu verhindern. Diese Auto-Stopp-Funktion konnte jedoch oft keine Schäden verhindern. Dieses Versagen des automatischen Stopps in der gemeinsam genutzten Aussaat hätte zu unbekannten übermäßigen Schäden führen können, was die Unterscheidung zwischen den Techniken erschwert hätte. Daher wurde ein paarweiser Vergleich mit einer gepulsten Punkt-für-Punkt-Methode ohne Auto-Stopp durchgeführt, um die beiden anderen Methoden ohne Auto-Stopp zu evaluieren. Es gab keinen signifikanten Unterschied, wenn gepulste Punkt-für-Punkt-Methode mit Punkt-für-Punkt verglichen wurde (p = 0,486), während die gepulste Punkt-für-Punkt-Methode signifikant weniger EB-Präsenz aufwies als die horizontale Methode (p = 0,043). Die mangelnde Signifikanz zwischen gepulsten Punkt-für-Punkt- und Punkt-für-Punkt-Methoden kann auf die große Variation bei Punkt-für-Punkt-Bohrungen zurückgeführt werden (Abbildung 4).
Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder von horizontalen (Abbildung 3C) und Punkt-für-Punkt-Bohrungen (Abbildung 3D) mit korrekten Auto-Stopp-Funktionen. Visuell und durch EB-Fluoreszenzbildgebung wurde festgestellt, dass das Bohren durch Punkt-für-Punkt- und horizontales Schneiden im Vergleich zu Kontrollgruppen die Gefäße im Gehirn schädigt (Abbildung 3A,B). Die gepulste Punkt-für-Punkt-Methode (Abbildung 3E) wies eine geringere lokale Schädigung am Seed- und Randpunkt auf, wies aber immer noch eine sichtbare EB-Präsenz innerhalb des kranialen Fensters auf.
Abbildung 3: Gefäßschädigung. EB-Fluoreszenzbilder von explantierten Gehirnen (1) und entsprechende ROIs (2) zur Bestimmung der mittleren Strahldichte des von der Kraniotomie betroffenen Bereichs verwendet. (A) Der Maus wurde EB injiziert, ohne dass ein Schädelfenster operiert wurde, um eine EB-Hintergrundpräsenz im Gehirnsystem zu erhalten. (B) Der Maus wurde nur Kochsalzlösung injiziert und eine kraniale Fensterkraniotomie durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die gemessene mittlere Strahldichte auf die EB-Akkumulation aufgrund undichter Blutgefäße und vaskulärer Traumata in der Nähe des Schädelfensters zurückzuführen war. (C) Der Maus wurde EB injiziert und das Schädelfenster wurde durch die horizontale Methode des automatischen Bohrens erzeugt. (D) Der Maus wurde EB injiziert und das Schädelfenster wurde durch die Punkt-für-Punkt-Methode des automatischen Bohrens erstellt. (E) Zwei repräsentative Bilder von Schädelfenstern, die mit der Punkt-für-Punkt-Pulsbohrmethode des Bohrens erstellt wurden, nachdem den Mäusen (n = 2) EB injiziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Sichtprüfung von Beschädigungen
Die visuelle Inspektion des Gehirns zeigt physische Schäden an der Oberfläche des Gehirns (Abbildung 4). Die Paneele A-D zeigen das EB-Vorhandensein der horizontalen Bohrung, die Paneele E-H die Punkt-für-Punkt-Methode und die Paneele I-L die gepulste Punkt-für-Punkt-Methode. "Punkt-für-Punkt" führt vertikale Pilotlochschnitte aus, während "horizontal" horizontale Schnitte entlang des Umfangs des Schädelfensters ausführt, die das Loch umreißen. Das "gepulste Punkt-für-Punkt-Verfahren" verwendet die gleichen Methoden wie das Punkt-für-Punkt-Verfahren ohne die Verwendung der Auto-Stopp-Funktion und hängt davon ab, dass der Benutzer die Bohrung in festgelegten Tiefenschritten stoppt. Obwohl eine Methode gefunden wurde, die das Ausmaß der thermischen Schädigung des Gehirns minimiert, gibt es immer noch das Problem der mechanischen Schäden durch den Bohrer. Im Idealfall würde hier eine Auto-Stopp-Funktion funktionieren, die den Liquor erkennt und das Bohren stoppt, bevor das Hirngewebe beschädigt wird, aber nicht konsistent zu funktionieren schien. Selbst bei äußerster Sorgfalt beim gepulsten manuellen Bohren gab es immer noch visuelle Schäden am Gehirn. Dies könnte das Ergebnis von zwei Faktoren sein: 1) dem Mangel an Kontrolle und Gefühl, der mit dem Bohren von Hand einhergeht, und 2) der Trenntiefe zwischen Schädel und Gehirn für ein kleines Tier wie eine Maus. Handbohren kann mit genügend Übung und Fachwissen eine kontrolliertere Methode bieten, um durch den Schädel zu gelangen, ohne das Gehirn zu schädigen. Im Vergleich zu einem Plug-and-Play-Roboter, der es mehreren "Chirurgen" ermöglichen würde, an derselben Studie teilzunehmen, sind jedoch viel höhere Fähigkeiten und Schulungen erforderlich - was im Bereich der intrakortikalen Mikroelektroden nicht üblich ist. Bei Mäusen ist der Abstand zwischen Gehirn und Schädel extrem gering, so dass schon die geringste Überbohrung von 10 μm zu einer mechanischen Schädigung des Gehirns führen kann.
Abbildung 4: Sichtprüfung des Schadens. Digitale Bilder aller Gehirne, die zur visuellen Inspektion und Darstellung für jede der drei Bohrmethoden aufgenommen wurden. (A-D) Die Horizontale zeigte durchweg Schäden um das Schädelfenster herum, sei es durch mechanische oder thermische Schäden. (E-H) Punkt für Punkt zeigten sich erhebliche Abweichungen in den Ergebnissen, was auf eine weniger zuverlässige Bohrmethode hindeutet. (I-L) Die Punkt-für-Punkt-Messung war konsistenter und zeigte weniger visuelle Schäden als die anderen Methoden, was den Unterschieden in der EB-Fluoreszenzanalyse und den Thermoelementergebnissen entsprach. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Horizontal | Punkt | Gepulst | Steuerung | |
| Horizontal | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| Punkt | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| Gepulst | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
Tabelle 1: Statistische Analyse der Ergebnisse der EB-Fluoreszenzbildgebung. Die Ergebnisse des EB-Fluoreszenz-Bildgebungssystems für verschiedene Bohrtechniken wurden mit einem Kruskal-Wallis-Rangsummentest mit Benjamin-Hochberg-Korrektur analysiert, gefolgt von paarweisen Vergleichen mit dem Wilcoxon-Rangsummen-exakten Test (N = 4 pro Gruppe). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen sind mit einem Sternchen * gekennzeichnet.
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Discussion
Die Verwendung von EB-Farbstoff und Bildgebung ist einfach, schnell und nützlich, um Gefäßschäden im Gehirn für neue Methoden und Techniken zu bewerten. Unabhängig davon, ob ein chirurgischer Roboter verwendet wird oder um die Bestätigung von Methoden, die derzeit im Labor durchgeführt werden, ist es wichtig, chirurgische Methoden zu validieren, um die Auswirkungen experimenteller Behandlungen im Vergleich zu chirurgischen Auswirkungen zu isolieren und das Tierwohl zu verbessern. Ein Thermoelement-Setup ist auch nützlich, um Bohrmethoden zu bewerten, um sicherzustellen, dass keine Erwärmung auftritt. Es ist bekannt, dass Temperaturerhöhungen aufgrund von Knochenbohrungen Gewebeschäden verursachen, und selbst ein Anstieg von 5 °C reicht aus, um große Gefäßschäden im Gehirn zu verursachen 32,33,34,35,36. Es wird empfohlen, die hier beschriebenen Methoden zur Verbesserung der Labor- und Operationstechniken anzuwenden.
Die Auswertung von Thermoelementen ist zwar für die Auswertung nützlich, weist jedoch einige Einschränkungen auf. Thermoelementdaten werden mit Leichenmäusen erfasst, da ein Loch in die Seite des Schädels gebohrt werden muss, um das Thermoelement in das Gehirn einzupassen, und dadurch das Gehirn geschädigt werden kann. Infolgedessen wird die Temperaturdifferenz über die Aussaat hinweg gemessen und nicht die physiologische Temperatur des Tieres. Darüber hinaus kann es physiologische Temperaturregelungsfunktionen geben, die nicht in die Analyse einbezogen werden.
Mehrere Schritte während des Protokolls sind entscheidend, um eine ordnungsgemäße Bohrung zu gewährleisten. Erstens führt die Schädelausrichtung, wenn sie falsch durchgeführt wird, zu einer schlechten Bohrgenauigkeit und zu einer Schädigung des Gehirns (wenn der automatische Stopp nicht funktioniert). Stellen Sie sicher, dass das Tier vor der Neigungskorrektur so gerade wie möglich montiert ist, um dieses Problem zu vermeiden. Korrigieren Sie alle Neigungsversätze, indem Sie den Neigungskorrekturprozess langsam und sicher befolgen. In einigen Fällen während dieser Studie war die Neigung nicht korrekt, was dazu führte, dass das Bohrsystem glaubte, in den Schädel zu bohren, obwohl der Bohrer den Schädel nicht einmal berührt hatte. Dies ist im Großen und Ganzen ein Problem für die genaue Erfassung der Schädeldicke und kann, wenn es ungeheuerlich genug ist, zu Ungenauigkeiten in den Bohrkoordinaten führen. Darüber hinaus war die Auto-Stopp-Funktion inkonsistent und muss mit Vorsicht verwendet werden. Verlassen Sie sich nicht nur auf die Auto-Stopp-Funktion, um Schäden am Gehirn zu vermeiden. Überprüfen Sie immer das Bohrloch, um sicherzustellen, dass kein Überbohren auftritt.
Unabhängig vom Auto-Stopp gibt es einige Optimierungen, die für die Punkt-für-Punkt- und Horizontalbohrverfahren durchgeführt werden können. Um sicherzustellen, dass das Gehirn nicht zufällig geschädigt wird, wird beim Kantenschneiden Punkt für Punkt ein Bohrversatz verwendet, der jedoch vom Benutzer zuvor durch Tests festgelegt werden muss. Eine lineare Interpolationsmethode könnte mit dem flachsten Seed-Punkt als Grundlage verwendet werden, so dass bei dickeren Seeds um den Schädel herum keine Schäden im Gehirn auftreten. Bei Bedarf kann der Benutzer jederzeit zu einem dickeren Bereich des Schädels zurückkehren und tiefer bohren. Der horizontale Schnittschritt verwendet ein Tiefenschnittintervall (standardmäßig 100 μm) für jede Drehung um die Kantenpunkte. Dies kann auch anhand der Schädeldicke bestimmt werden, um zu vermeiden, dass zu tief gebohrt wird und das Gehirn geschädigt wird.
Transgene Mäuse sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell für die intravitale Multiphotonen-Bildgebung. Während in dieser Studie die Verwendung eines Operationsroboters für Schädelfenster bei transgenen Mäusen hervorgehoben wird, ist es wichtig, die Verwendung eines Operationsroboters in anderen Schädeloperationen zu beachten. Die Möglichkeit, Bohrungen zu kontrollieren und zu standardisieren, bietet Vorteile für Kraniotomien in größeren Tierstudien im gesamten Feld. Auch wenn einige mechanische Schäden visuell beobachtet wurden, ist dies höchstwahrscheinlich auf den extrem geringen Abstand zwischen Gehirn und Schädel bei Mäusen zurückzuführen. Größere Tiere, wie z. B. Ratten, haben mehr Platz für Subarachnoidea und eine dickere Dura, was zu einem geringeren Risiko mechanischer Schäden durch Roboterbohren führt25. In Kombination mit der hier gezeigten Reduzierung der thermischen Schädigung durch das gepulste Verfahren hat der Operationsroboter das Potenzial, Schäden durch Bohrungen in verschiedenen Tiermodellen deutlich zu reduzieren.
Insgesamt zeigte die gepulste Punkt-für-Punkt-Methode die geringste Schädigung, sei es durch weniger Erwärmung oder weniger mechanische Schädigung des Gehirns. Das Bohren von Hand kann eine kontrolliertere Methode zur Vermeidung von Schäden bieten, aber es ist wichtig, die Vorteile eines Operationsroboters hervorzuheben. Ein Roboter benötigt weniger Training, kann dazu beitragen, die Variabilität von Chirurg zu Chirurg zu reduzieren, und kann, sobald er vollständig optimiert ist, ein standardisierteres Verfahren in allen Laboren ermöglichen. Darüber hinaus ist die Lernkurve für einen Operationsroboter viel geringer als die einer Operation von Hand. Dies reduziert nicht nur die Zeit, die zum Erlernen der Technik benötigt wird, sondern auch die Anzahl der Tiere, die zu Trainingszwecken eingesetzt werden. Die Prävalenz des kranialen Fensterbohrens hat mit der Innovation der Multiphotonen-Bildgebung durch das Gehirn zugenommen, wie in veröffentlichten Arbeiten20,37 zu sehen ist. Der Einsatz von charakterisierenden Methoden wie Thermoelementen und EB-Farbstoffbildgebung wird dazu beitragen, die Bohrtechnik zu optimieren, während der Einsatz von Robotern schwierige Operationen zugänglicher und breiter machen wird.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu melden. Die Inhalte repräsentieren nicht die Ansichten des US-Ministeriums für Veteranenangelegenheiten, der National Institutes of Health oder der Regierung der Vereinigten Staaten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde zum Teil durch die Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) und GRANTI01RX003420 (Shoffstall/Capadona) sowie den Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) des United States (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit teilweise auch vom National Institute of Health, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) und dem National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona/Kirsch) unterstützt. Dieses Material basiert auf Arbeiten, die durch das Graduiertenforschungsstipendium der National Science Foundation unter der Fördernummer GRANT12635723 unterstützt wurden. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material geäußert werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
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