Summary
تصف هذه الورقة بروتوكولا للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة.
Abstract
يتم الحفاظ على مثيلة السيتوزين بشكل كبير عبر أنواع الفقاريات ، وكمحرك رئيسي للبرمجة اللاجينية وحالة الكروماتين ، تلعب دورا مهما في التطور الجنيني المبكر. تؤدي التعديلات الأنزيمية إلى المثيلة النشطة وإزالة ميثيل السيتوزين إلى 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) والأكسدة اللاحقة ل 5-mC إلى 5-hydroxymethylcytosine و 5-formylcytosine و 5-carboxylcytosine. إعادة البرمجة اللاجينية هي فترة حرجة أثناء تطور الرحم ، وتعرض الأمهات للمواد الكيميائية لديه القدرة على إعادة برمجة epigenome داخل النسل. يمكن أن يتسبب هذا في نتائج سلبية مثل عواقب النمط الظاهري الفوري ، والآثار طويلة المدى على قابلية الإصابة بأمراض البالغين ، والآثار عبر الأجيال للعلامات اللاجينية الموروثة. على الرغم من أن التسلسل القائم على ثنائي الكبريتيت يمكن الباحثين من استجواب مثيلة السيتوزين بدقة زوج القاعدة ، فإن النهج القائمة على التسلسل باهظة التكلفة ، وعلى هذا النحو ، تمنع القدرة على مراقبة مثيلة السيتوزين عبر مراحل النمو ، وتركيزات متعددة لكل مادة كيميائية ، وتكرار الأجنة لكل علاج. نظرا لسهولة التصوير الآلي في الجسم الحي ، والتلاعب الجيني ، ووقت التطور السريع خارج الرحم ، والتربية أثناء التطور الجنيني ، يستمر استخدام أجنة الزرد كنموذج سليم من الناحية الفسيولوجية للكشف عن المسارات بوساطة الأجانب التي تساهم في النتائج السلبية أثناء التطور الجنيني المبكر. لذلك ، باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب 5 mC المتاحة تجاريا ، نصف استراتيجية فعالة من حيث التكلفة للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين داخل أجنة الزرد الفردية السليمة من خلال الاستفادة من الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة ، والتصوير الآلي عالي المحتوى ، ومعالجة البيانات الفعالة باستخدام لغة البرمجة قبل التحليل الإحصائي. وفقا للمعرفة الحالية ، هذه الطريقة هي الأولى التي نجحت في اكتشاف وتحديد مستويات 5 mC في الموقع داخل أجنة الزرد أثناء التطور المبكر. تتيح هذه الطريقة الكشف عن مثيلة الحمض النووي داخل كتلة الخلية ولديها أيضا القدرة على اكتشاف مثيلة السيتوزين ل mRNAs الأم الموضعية بالصفار أثناء الانتقال من الأم إلى الزيجوت. بشكل عام ، ستكون هذه الطريقة مفيدة في التعرف السريع على المواد الكيميائية التي لديها القدرة على تعطيل مثيلة السيتوزين في الموقع أثناء إعادة البرمجة اللاجينية.
Introduction
تؤدي التعديلات الأنزيمية إلى المثيلة النشطة وإزالة ميثيل السيتوزين إلى 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) والأكسدة اللاحقة ل 5-mC إلى 5-hydroxymethylcytosine و 5-formylcytosine و 5-carboxylcytosine 1,2. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCIPP) هو مثبط للهب يستخدم على نطاق واسع في الولايات المتحدة وقد ثبت سابقا أنه يغير مسار مثيلة السيتوزين بعد التعرض الجنيني المبكر من 0.75 ساعة بعد الإخصاب (HPF) من خلال المعدة المبكرة (6 HPF) 3،4،5،6،7،8 . داخل الفقاريات ، تعتبر 5-mC ومشتقاتها المعدلة ضرورية لتنظيم التطور الجنيني المبكر9. يؤدي إخصاب الجنين إلى إزالة ميثيل الحمض النووي الأبوي ، يليه تدهور mRNA الأمومي ، وتنشيط الجينوم الزيجوتي ، وإعادة مثيلة الجينومالزيجوتي 9. تشمل العمليات ذات الصلة بيولوجيا التي تستخدم مثيلة السيتوزين تعديل الهستون ، وتوظيف آلات النسخ ، ومثيلة الحمض النووي الريبي ، وإعادة البرمجة اللاجينية ، وتحديد بنية الكروماتين10,11. يتم الحفاظ على مثيلة السيتوزين أيضا بين أنواع الفقاريات ، مما يؤكد أهمية فهم والتحقيق في كيفية تأثير مثيلة السيتوزين الشاذة على مسار تطور الكائن الحي11. علاوة على ذلك ، فإن التطور في الرحم حساس لتعرض الأمهات ولديه القدرة على التسبب في نتائج سلبية مثل العواقب المظهرية الفورية ، والآثار طويلة المدى على قابلية البالغين للأمراض ، والآثار عبر الأجيال للعلامات اللاجينية الموروثة12،13،14.
كانت الامتدادات الطويلة لأزواج السيتوزين والجوانين ، أو جزر CpG ، هي البؤر الأساسية للباحثين الذين يهدفون إلى توصيف ديناميكيات مثيلة السيتوزين عبر الجينوم15،16،17. تمثل الاستراتيجيات القائمة على ثنائي الكبريتيت مثل تسلسل ثنائي كبريتيت الجينوم الكامل ، وتسلسل ثنائي الكبريتيت منخفض التمثيل ، وتسلسل أمبليكون ثنائي الكبريتيت المعيار الذهبي لاستجواب مثيلة السيتوزين بدقة زوج القاعدة. ومع ذلك ، فإن النهج القائمة على التسلسل باهظة التكلفة ، وبالتالي ، تمنع القدرة على مراقبة مثيلة السيتوزين عبر مراحل النمو ، والتركيزات المتعددة لكل مادة كيميائية ، وتكرار الأجنة لكل علاج. بالإضافة إلى ذلك ، لا توفر الأساليب القائمة على التسلسل معلومات حول التوطين المكاني ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم أنواع الخلايا والمناطق التي يحتمل أن تتأثر داخل الجنين النامي. وبالمثل ، فإن مقايسات مثيلة الحمض النووي العالمية مثل تحليل التقييد المعتمد على المثيلة ، والمقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم 5-mC (ELISAs) ، و 5-methyl-2'-deoxycytidine (5-mC) قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) تعتمد على تجانس الخلايا أو الأنسجة ، وعلى هذا النحو ، تمنع القدرة على مراقبة توطين وحجم مثيلة السيتوزين عبر المكان والزمان داخل العينات السليمة12,18.
نظرا لسهولة التصوير الآلي في الجسم الحي ، والتلاعب الجيني ، ووقت التطور السريع خارج الرحم ، والتربية أثناء التطور الجنيني ، لا تزال أجنة الزرد تستخدم على نطاق واسع كنماذج سليمة من الناحية الفسيولوجية للكشف عن المسارات بوساطة الأجانب التي تساهم في النتائج السلبية أثناء التطور الجنيني المبكر. لذلك ، باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا الخاصة ب 5-mC ، يصف البروتوكول أدناه استراتيجية فعالة من حيث التكلفة للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين داخل أجنة الزرد الفردية السليمة من خلال الاستفادة من الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة (IHC) ، والتصوير الآلي عالي المحتوى ، ومعالجة البيانات بكفاءة باستخدام لغة البرمجة قبل التحليل الإحصائي.
للمعرفة الحالية ، هذه الطريقة هي الأولى لمراقبة 5 mC داخل أجنة الزرد سليمة. تتيح هذه الطريقة الكشف عن مثيلة الحمض النووي داخل كتلة الخلية ولديها أيضا القدرة على اكتشاف مثيلة السيتوزين ل mRNAs الأم الموضعية بالصفار أثناء الانتقال من الأم إلى الزيجوت. بشكل عام ، ستكون هذه الطريقة مفيدة في التعرف السريع على المواد الكيميائية التي لديها القدرة على تعطيل مثيلة السيتوزين في الموقع أثناء إعادة البرمجة اللاجينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التعامل مع المربين البالغين ومعالجتهم وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات المعتمد من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) (# 20180063) في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد.
1. جمع أجنة الزرد والتعرض الكيميائي
- أضف مصائد تربية داخل الخزان إلى الخزانات التي تحتوي على ذكور وإناث الزرد البالغين الناضجين جنسيا والقابلة للحياة من الناحية الإنجابية. أضف ما لا يقل عن ثلاثة مصائد لكل خزان سعة 6 لتر قبل 12 ساعة على الأقل من التجميع في ~ 9:00 صباحا ، وهو الوقت التقريبي لتخصيب وتفريخ البيض داخل الخزانات.
- قم بإعداد محلول تعرض جديد في صباح يوم التجميع. يتم تحضير محلول التعرض باستخدام ماصة سعة 5 مل وإضافة 5.0 مل من ماء النظام الخالي من الجسيمات إلى طبق بتري زجاجي مقاس 60 مم.
- بعد ذلك ، استخدم ماصة زجاجية صغيرة سعة 10 ميكرولتر لنقل 10 ميكرولتر من السيارة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو DMSO) أو محلول مخزون كيميائي إلى مياه النظام في الطبق الزجاجي.
- حرك طبق بتري الزجاجي لضمان تبدد محلول المخزون. أضف 5.0 مل أخرى من ماء النظام إلى طبق بتري الزجاجي. قم بتدوير طبق بتري الزجاجي لتجانس محلول التعرض.
- كرر لكل مجموعة علاج في نسخ مكررة من أربعة للحصول على أربع نسخ مكررة لكل علاج.
- بعد تحضير محاليل التعرض ، قم بتغطية الأطباق الزجاجية بأغطية زجاجية لتقليل التبخر.
- أثناء إزالة مصائد التكاثر من كل خزان ، اترك الماء الموجود داخل كل مصيدة يصرف بعناية إلى الخزان قبل إزالته من الخزانات. تأكد من بقاء الفخاخ في الجانب الأيمن لأعلى.
- انقل مصائد التربية إلى حوض المختبر واشطفها باستخدام زجاجة رش مملوءة بماء التناضح العكسي (RO) في شبكة أسماك غارقة مسبقا في مبيض بنسبة 10٪ وشطفها بالماء. شطف الأجنة حتى يتم إزالة جميع الحطام وتبقى الأجنة النظيفة فقط.
- انقل الأجنة من شبكة السمك باستخدام زجاجة بخ مملوءة بالماء RO إلى طبق بتري بلاستيكي 100 مم. فرز عشوائي 50 جنينا حيا في 0.75 ساعة بعد الإخصاب (hpf) وإزالة الماء الزائد من التناضح العكسي.
- باستخدام ملعقة مجهرية ، ضع الأجنة المصنفة في محلول العلاج. يجب أن تكون جميع الأجنة داخل السيارة أو محلول العلاج في موعد لا يتجاوز الساعة 9:45 صباحا. حرك الأطباق الزجاجية لضمان طلاء الأجنة بالتساوي داخل محلول المعالجة.
- بعد إعداد أربعة أطباق مكررة (N = 50 لكل طبق متماثل) لكل مجموعة علاج ، ضع الغطاء الزجاجي فوق أطباق التعرض وانقل جميع الأطباق إلى حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 28 درجة مئوية حتى 2 hpf أو 4 hpf أو 6hpf أو 8 hpf أو 10 hpf.
- قم بإعداد 4٪ بارافورمالدهيد الطازج (PFA) قبل 4 ساعات على الأقل من إنهاء التعرض وخزنه في 4 درجات مئوية.
- قم بتشغيل لوح التسخين إلى 115 درجة مئوية ، وقم بعمل 20 مل من محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) (2 مل من 10x PBS + 18 مل من ماء RO) في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، ووزن 800 مجم من بارافورمالدهيد.
- داخل غطاء دخان كيميائي ، انقل محلول 1x PBS إلى قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل ، وأضف 800 مجم من بارافورمالدهيد ، ثم أضف 2 ميكرولتر من 10 N NaOH. ضع مقياس حرارة داخل القارورة ، ضع القارورة على اللوح الساخن ، وراقب درجة الحرارة مع التحريك.
- عندما تصل درجة الحرارة إلى 62-65 درجة مئوية ، قم بإزالة 4٪ PFA من اللوحة الساخنة واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتخزين 4٪ PFA في 4 درجات مئوية.
- بمجرد انتهاء مدة التعرض ، قم بإزالة الأجنة من الحاضنة ونقل جميع الأجنة الحية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. نضح محلول التعرض المتبقي باستخدام ماصة 1 مل. لا تستنشق أي أجنة.
- أضف 500 ميكرولتر من 4٪ PFA المبرد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واخلط الأجنة في 4٪ PFA عن طريق قلب عدة مرات. اسمح للأجنة بالإصلاح في 4٪ PFA بين عشية وضحاها.
ملاحظة: لا ينصح بالسماح للأجنة بالبقاء في PFA لمدة تزيد عن 12 ساعة.
2. إزالة الأجنة
- في اليوم التالي ، قم بشفط 4٪ PFA ، وأعد تعليق الأجنة في 1x PBS ، واسحب برفق لأعلى ولأسفل لمدة 30 ثانية. إذا لزم الأمر ، أوقف البروتوكول في هذه الخطوة وقم بتخزين الأجنة في 1x PBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة.
- باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، انقل الأجنة الثابتة بعناية إلى طبق زجاجي مملوء بالماء RO وقم بتدويره برفق لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- استخدم إبر المحاقن تحت تكبير 5.0x باستخدام مجهر مجسم قياسي لتفكيك جميع الأجنة يدويا. افعل ذلك باستخدام طرف الإبرة لثقب المشيم وتقشيره برفق بعيدا عن الصفار وكتلة الخلية4.
- بمجرد إزالة الأجنة ، استخدم ماصة زجاجية دقيقة لنقل ما يصل إلى 25 جنينا سليما إلى سلة واحدة للكيمياء المناعية (IHC) وضع سلة IHC في لوحة 96 بئر. استخدم ماصة سعة 1 مل لشفط مياه التناضح العكسي من كل بئر.
3. الكيمياء الهيستولوجية المناعية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب 5 mC
- أعد تعليق الأجنة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (1x PBST + 2٪ مصل الأغنام + 2 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار) لكل بئر ، ولف الطبق بالبارافيلم ورقائق الألومنيوم لحمايتها من الضوء. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات على شاكر مداري (100 دورة في الدقيقة).
- قم بإزالة غلاف البارافيلم والألمنيوم واستخدم ماصة سعة 1 مل لشفط المخزن المؤقت للحجب من كل بئر. استبدله ب 500 ميكرولتر من تخفيف 1: 100 من الجسم المضاد للفأر أحادي النسيلة المضاد ل 5-mC في المخزن المؤقت للحظر. احتضان جميع الأجنة بالأجسام المضادة الأولية باستثناء مجموعة فرعية من أجنة التحكم في المركبات التي سيتم تحضينها باستخدام المخزن المؤقت للحجب لحساب ضوضاء الخلفية. احرص على عدم تعطيل سلامة الأجنة ، ولا استنشاق الأجنة خلال هذه الخطوة.
- أعد تغليف اللوحة بالبارافيلم ورقائق الألومنيوم واترك اللوحة تحضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل على شاكر مداري (100 دورة في الدقيقة).
- في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من كل بئر واستبدله ب 1x PBS + 0.1٪ Tween-20 (1x PBST). اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام 1x PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسلة على شاكر مداري (100 دورة في الدقيقة).
- استبدل 1x PBST بتخفيف 1: 500 من الجسم المضاد IgG المضاد للفأر الماعز في منع المخزن المؤقت واحتضان جميع الأجنة بالجسم المضاد الثانوي. دع الصفيحة تحتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل على شاكر مداري (100 دورة في الدقيقة).
- في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي واغسل المحلول المتبقي ثلاث مرات باستخدام 1x PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسلة على شاكر مداري (100 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا لمدة تصل إلى 48 ساعة إذا تم تخزين سلال IHC في آبار نظيفة مملوءة ب 1x PBS. - استخدم ماصة سعة 1 مل لشفط 1x PBST من كل بئر وضع سلة IHC في طبق بتري زجاجي مملوء بماء RO. تحت المجهر المجسم القياسي ، قم بفرز الأجنة السليمة بشكل عشوائي في لوحة 96 بئرا ، مما ينتج عنه جنين واحد لكل بئر.
- باستخدام ماصة 1 مل ، قم بإزالة جميع مياه RO من الآبار الفردية واستبدلها ب 200 ميكرولتر من 1x PBS. جهاز طرد مركزي للوحة لمدة 3 دقائق في 1 × غرام.
4. التصوير الآلي للأجنة داخل 96 لوحة بئر
- تصوير الأجنة بهدف 2x تحت الضوء المرسل و FITC باستخدام نظام فحص عالي المحتوى (جدول المواد).
ملاحظة: تم التقاط صورة فلورية لكل جنين تلقائيا باستخدام التكبير المذكور أعلاه ومرشح FITC19.- حدد التركيز البؤري التلقائي للتأكد من أن تركيز الكاميرا على الجزء السفلي من اللوحة ويقابله سمك الجزء السفلي.
- حدد طولا موجيا ل FITC مع مدة تعريض تبلغ 100 مللي ثانية ، واضبط التركيز البؤري التلقائي على الليزر باستخدام إزاحة Z. مراقبة وتأكيد الحصول على الصورة المناسبة في العديد من الآبار قبل البدء في الحصول على اللوحة.
ملاحظة: يلتقط الجهاز تلقائيا صورا من جميع الآبار المختارة التي تحتوي على أجنة. تتطلب لوحة 96 بئرا حوالي 30 دقيقة للحصول على الصور وتخزين البيانات. طوال فترة الاستحواذ ، تم الحفاظ على درجة الحرارة الداخلية داخل نظام التصوير في RT.
- بعد الحصول على الصور ، قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام نظام فحص المحتوى العالي وإجراء تحليل الصور الآلي المخصص. حدد كل جنين على لوحة 96 بئرا ليتم تحليلها للمساحة الكلية والكثافة المتكاملة للتألق.
ملاحظة: تضمن التحليل توفير صور تحتوي على تراكبات لنقاط البيانات من التحليل. - بعد ذلك ، قم بجدولة نقاط البيانات وتصديرها من نظام فحص المحتوى العالي بالانتقال إلى قياس وتحديد سجل البيانات المفتوح إلى جدول بيانات. يتم تصوير أجزاء الحصول على اللوحة وتحليل البيانات في الشكل 1.
5. تحليل البيانات
- قم بتحميل جدول البيانات الذي تم تصديره إلى برنامج كمبيوتر حيث يتم استخدام حزمة الموزع (dplyr) لفرز البيانات وتلخيصها لكل بئر والتصفية حسب رقم البئر. ثم يتم استخدام حزمة writexl لتصدير البيانات المجمعة إلى جدول بيانات. يظهر رمز برنامج 5mC في الملف التكميلي 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد ما إذا كان العلاج يؤثر على الوفرة النسبية ل 5 مللي مئوية من خلال تقييم المساحة الإجمالية والكثافة النسبية للتألق داخل أجنة الزرد الثابتة والموسمة. بعد الانتهاء من البروتوكول ، يمكن استخدام المجهر المجسم الفلوري لتحديد ما إذا كان IHC بالكامل ناجحا أم لا. عندما تتم ملاحظة الأجنة الموسومة تحت مرشح FITC أو GFP ، تتم الإشارة إلى النتيجة الإيجابية من خلال إشارة FITC الإيجابية داخل الجنين ، في حين يشار إلى النتيجة السلبية من خلال عدم وجود مضان داخل الأجنة الضابطة. باستخدام نظام فحص عالي المحتوى ، يمكن أيضا تأكيد هذه النتائج أثناء الحصول على الصورة باستخدام مرشح FITC. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء تحليل البيانات ، ستقوم الوحدة المخصصة بتحديد وقياس المساحة الإجمالية والكثافة المتكاملة للتألق. يتم عرض الصور التمثيلية للنتائج الناجحة في الشكل 1 ، حيث تم قياس الصور المكتسبة بنجاح بواسطة الوحدة المخصصة ، وتم الحصول على نقاط البيانات الفردية (الموضحة على شكل تراكب أزرق) لكل من المساحة الإجمالية والكثافة المتكاملة.
أثناء استخراج البيانات ، تعد صرامة العتبة داخل الوحدة المخصصة متغيرا إضافيا يحتاج إلى تحسين لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وزيادة احتمالية اكتشاف اختلاف كبير خاص بالعلاج في وفرة 5 مللي سي. أثناء التحسين ، قدمت هذه العتبة النهائية الفصل الأكثر أهمية بين متوسطات مجموعات التحكم والعلاج (على سبيل المثال ، أكبر نسبة إشارة إلى ضوضاء). يتم عرض النتائج التمثيلية عند عتبات الوحدة المخصصة المختلفة التي تؤثر على نسب الإشارة إلى الضوضاء في الشكل 2.
الشكل 1: مخطط تدفق يوفر تمثيلا بيانيا لبروتوكول التعرض والكشف في الموقع عن 5-methylcytosine لأجنة الزرد 6 hpf. يتم توفير اتجاه مخطط التدفق بأسهم سوداء. حدث التعرض في نسخ متماثلة من أربعة أطباق مكررة لكل علاج و 50 جنينا لكل طبق مكرر. الاختصارات: سم = كتلة الخلية ؛ YS = كيس صفار البيض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تحسين الوحدة المخصصة. تظهر اللوحات A-D تحسين الوحدة المخصصة من خلال تقييم متوسط وتوزيع المساحة الإجمالية الخاصة ب 5 mC والكثافة المتكاملة داخل أجنة الزرد عند 6 hpf. (أ، ب) يتم سرد العتبات المختلفة التي تم اختبارها في وسيلة الإيضاح إلى اليمين (فرق 100 بين كل عتبة) ويتم ترتيبها حسب الصرامة ، حيث يمثل 1500 و 2500 العتبات الأقل والأكثر صرامة التي تم اختبارها ، على التوالي. (ج، د) يتم سرد العتبات المختلفة التي تم اختبارها في وسيلة الإيضاح إلى اليمين (فرق 250 بين كل عتبة) ومرتبة حسب الصرامة ، حيث يمثل 1500 و 2500 العتبات الأقل والأكثر صرامة التي تم اختبارها ، على التوالي. يشير (*) في C ، D إلى عتبات تختلف اختلافا كبيرا عن الأجنة المعالجة بالمركبات (p < 0.05). بالنسبة ل A ، B ، كانت جميع العتبات التي تم اختبارها مهمة من التحكم في السيارة. يشير المحور السيني إلى التعرض لأي مركبة (0.1٪ DMSO) أو 0.78 ميكرومتر TDCIPP (تحكم إيجابي). يشير المحور ص إلى التألق النسبي. تعرض اللوحة A المساحة الإجمالية البالغة 5 مللي مئوية المكتشفة داخل الأجنة كدالة للعلاج ، بينما تعرض اللوحة B الكثافة المتكاملة ل 5 مللي C داخل نفس المنطقة. يتم تمثيل جنين واحد بنقطة بيانات واحدة لما مجموعه N = 96 لكل مجموعة علاج. تم إجراء جميع حالات التعرض في نسخ طبق من أربعة أطباق لكل معاملة مع 50 جنينا لكل طبق زجاجي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: رمز برنامج 5mC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلال هذا البروتوكول ، هناك بعض الخطوات الحاسمة. أولا ، عند إزالة الأجنة ، من المهم توجيه الإبرة بعيدا عن أنسجة كيس الجنين / كيس الصفار / كتلة الخلية ، لأن هذه الأجزاء من الجنين النامي هشة للغاية ويسهل ثقبها. ثانيا ، عند نقل الأجنة المصنفة إلى آبار فردية ، استخدم ماصة زجاجية لنقل الأجنة لأنها ستلتصق بماصة بلاستيكية. ثالثا ، عند إجراء IHC بالكامل ، تأكد من حماية اللوحة من الضوء. أخيرا ، بعد الانتهاء من بروتوكول IHC بالكامل ، اسمح للوحة بالحضانة في 1x PBS عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل التصوير ، لأن هذا سيقلل من التألق الذاتي الذي قد يتداخل مع التصوير.
إذا كانت هناك أجنة تم قطعها أثناء الاستئصال أو IHC ، فقم باستبعاد هذه الأجنة من بقية البروتوكول. إذا لم يتم الكشف عن مضان ، يمكن حل ذلك عن طريق الحضانة لفترة أطول (حتى 16 ساعة). نظرا لأن هذا جسم مضاد خاص ب 5 mC ، فقد يتم تسمية كل من DNA و RNA. من المهم فهم عام للتوطين المكاني.
هناك بعض القيود في هذه الطريقة. أولا ، إنها تقنية غير مستهدفة ، مما يعني أنها لن توفر الكمية الدقيقة البالغة 5 مللي سم مكعب ، بل الوفرة النسبية بناء على المساحة الإجمالية والكثافة المتكاملة للتألق. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار هذا البروتوكول فقط على الأجنة قبل التجزئة ، لذلك إذا تم اختبار مراحل لاحقة من التطور ، فقد تكون هناك حاجة إلى بعض التحسين الإضافي. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الطريقة تستند إلى IHC ، فقد تكون عرضة للربط غير المحدد ؛ لذلك ، ليس من المؤكد أن يكون تلطيخ 5-mC موضعيا في الحمض النووي فقط ، ولكن قد يكون أيضا تلطيخ 5-mC موضعيا في الحمض النووي الريبي أيضا. أخيرا ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين عتبة تحليل البيانات اعتمادا على المادة الكيميائية وصرامة الظروف المفضلة.
بشكل عام ، توفر هذه الطريقة كشفا سريعا وفعالا من حيث التكلفة ل 5 مللي C عبر مراحل متعددة من التطوير والتركيزات الكيميائية3. ولذلك فإنه يوفر بديلا للنهج القائمة على تسلسل ثنائي الكبريتيت الباهظة التكلفة. من خلال تقديم هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة لفحص المواد الكيميائية بسرعة وتقييم كيفية تأثر وفرة 5-mC أثناء التطور الجنيني المبكر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة كأداة فحص مسبق لتحديد نطاق التركيز و / أو فترة التطور و / أو نافذة الحساسية التي تؤثر فيها المادة الكيميائية ذات الأهمية على وفرة 5 مللي جيم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة نفسها لعلامة حيوية وجسم مضاد مختلف ، وإن كانت هناك حاجة إلى مزيد من التحسين. من خلال استخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحث فحص وتحديد مادة كيميائية بسرعة وكفاءة وفعالية من حيث التكلفة تغير الوفرة النسبية ل 5 مللي C داخل أجنة الزرد قبل الاستثمار في الأساليب القائمة على تسلسل ثنائي الكبريتيت كثيفة العمالة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة خاصة بأسماك الزرد ، وهناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد ما إذا كان يمكن اكتشاف 5-mC في الموقع داخل الأجنة المبكرة للكائنات النموذجية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.
Acknowledgments
تم تقديم الدعم البحثي من خلال زمالة قسم الدراسات العليا في UCR إلى SAB ، وزمالة برنامج تدريب NRSA T32 (T32ES018827) إلى SAB ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (R01ES027576) ومشروع هاتش المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية (1009609) إلى DCV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K.
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F.
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
