Summary
展示了一种新型样品制备方法,用于通过基质辅助激光解吸/电离成像质谱 分析 琼脂基细菌大菌落。
Abstract
了解感染期间发生的微生物相互作用的代谢后果对生物医学成像领域提出了独特的挑战。基质辅助激光解吸/电离(MALDI)成像质谱代表了一种无标记的 原位 成像模式,能够生成各种代谢物的空间图。虽然现在通过该技术 常规 分析薄切片组织样品,但由于这些样品的高含水量和不均匀的地形,非传统底物(例如微生物学研究中通常在琼脂上生长的细菌菌落)的成像质谱分析仍然具有挑战性。本文演示了一种样品制备工作流程,以便对这些样品类型进行成像质谱分析。该过程使用两种胃肠道病原体的细菌共培养大菌落来举例说明: 艰难梭菌 和 粪肠球菌。研究这种明确定义的琼脂环境中的微生物相互作用也被证明可以补充组织研究,旨在了解小鼠感染模型中这两种致病生物之间的微生物代谢合作。氨基酸代谢物精氨酸和鸟氨酸的成像质谱分析作为代表性数据呈现。该方法广泛适用于其他分析物、微生物病原体或疾病以及需要细胞或组织生物化学空间测量的组织类型。
Introduction
人类微生物组是一个高度动态的生态系统,涉及细菌、病毒、古细菌和其他微生物真核生物的分子相互作用。虽然近年来对微生物关系进行了深入研究,但在化学水平上对微生物过程仍有许多了解1,2。这部分是由于没有能够准确测量复杂微生物环境的工具。过去十年来,成像质谱(IMS)领域的进展使生物底物中的许多代谢物,脂质和蛋白质的原位和无标记空间映射成为可能3,4。基质辅助激光解吸/电离(MALDI)已成为成像质谱中最常用的电离技术,涉及使用紫外激光从薄组织切片表面烧蚀材料,以通过质谱法4进行测量。通过将化学基质均匀地应用于样品表面,可以在整个样品表面上以光栅模式进行连续测量,从而促进了这一过程。然后在数据采集后生成分析物离子强度的热图。电离源和采样技术的最新进展使得能够分析非传统底物,例如在营养琼脂上生长的细菌5和哺乳动物6,7,8细胞标本。IMS提供的分子空间信息可以为感染过程中微生物-微生物和宿主-微生物相互作用的生化通讯提供独特的见解9,10,11,12,13,14。
艰难梭菌感染 (CDI) 后,艰难梭菌暴露于胃肠道中快速变化的微生物环境中,其中多种微生物相互作用可能会影响感染结果15,16。令人惊讶的是,人们对感染期间艰难梭菌和常驻微生物群之间相互作用的分子机制知之甚少。例如,肠球菌是肠道微生物组中的一类机会性共生病原体,与 CDI17、18、19、20 的易感性和严重程度增加有关。然而,对这些病原体之间相互作用的分子机制知之甚少。为了可视化肠道微生物组这些成员之间的小分子通讯,本文在琼脂上生长细菌大菌落以模拟受控环境中的微生物-微生物相互作用和细菌生物膜形成。然而,由于细菌培养标本的高含水量和不均匀的表面形貌,通过MALDI成像质谱分析获得具有代表性的代谢分布具有挑战性。这主要是由琼脂的高度亲水性和去除水分过程中琼脂表面反应不均匀引起的。
琼脂的高含水量也使得获得均匀的MALDI基质包衣变得具有挑战性,并可能干扰随后在真空中进行的MALDI分析21。例如,许多MALDI源在0.1-10托的压力下运行,这是一个足够的真空,可以从琼脂中去除水分,并可能导致样品变形。真空环境引起的琼脂中的这些形态变化导致干燥琼脂材料起泡和开裂。这些伪影会降低琼脂对载玻片的粘附,并可能导致样品拆卸或剥落到仪器真空系统中。琼脂样品的厚度可能与载玻片相距5 mm,这会导致仪器内部离子光学元件的间隙不足,从而导致仪器离子光学元件受到污染和/或损坏。这些累积效应可以导致反映表面形貌的离子信号减少,而不是潜在的微生物生化相互作用。琼脂样品必须均匀干燥,并在真空分析之前牢固地粘附在显微镜载玻片上。
本文展示了一种用于控制在琼脂培养基上生长的细菌培养物大菌落干燥的样品制备工作流程。这种多步骤、较慢的干燥过程(相对于先前报道的过程)可确保琼脂均匀脱水,同时最大限度地减少安装在显微镜载玻片上的琼脂样品冒泡或开裂的影响。通过使用这种逐渐干燥的方法,样品牢固地粘附在显微镜载玻片上,并适合随后的基质应用和MALDI分析。这使用在琼脂和鼠组织模型上生长的 艰难梭菌 模型来举例说明,这些模型具有和不存在共生和机会性病原体粪肠球菌。细菌和组织模型的MALDI成像质谱分析允许氨基酸代谢物谱的空间映射,为生物能量微生物代谢和通讯提供新的见解。
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Protocol
注意:动物实验已获得费城儿童医院和宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院动物护理和使用委员会的批准(协议IAC 18-001316和806279)。
注意:艰难梭菌(艰难梭菌)和粪肠球菌( 粪肠球菌)是BSLII病原体,应格外小心处理。必要时使用适当的净化方案。
1. 细菌培养大菌落的生长和隔夜运输的准备
- 制备 艰难梭菌 和 粪肠杆菌 过夜培养物,并在37°C的厌氧室(85%氮,10%氢气,5%二氧化碳)中在补充有0.5%酵母提取物和0.1%l-半胱氨酸(BHIS)的脑 - 心脏输液中单独培养。对所有铺板样品使用1.5%琼脂。
- 将细菌培养基标准化为600nm(OD600)的光密度。将每个大菌落的5μL板到BHIS + l-半胱氨酸琼脂平板上,并在37°C下厌氧生长7天。 对于混合物种大菌落,在铺板前以1:1的比例混合细菌培养基。
- 使用欧姆表用导电涂层识别载玻片的侧面,制备氧化铟锡(ITO)涂层的显微镜载玻片。使用金刚石尖端的划线蚀刻并标记显微镜载玻片的ITO涂层侧。
- 从琼脂生长平板上切除整个培养物,然后安装到ITO包被的显微镜载玻片上,同时确保气泡不会被困在琼脂和载玻片之间。
注意:琼脂培养基中的水含量应使培养物自然粘附在显微镜载玻片表面上。在Yang等人的补充文档中提供了一段视频来举例说明这一过程22。 - 将菌落放在显微镜载玻片盒中进行保护。将载玻片盒存放在 8 英寸 x 8 英寸的生物危害标本运输袋中,并带有少量干燥剂颗粒,并密封过夜运输以进行进一步处理和分析。
注意:在室温条件下运输细菌培养物时,保持细菌培养物的干燥环境以减缓细菌生长和代谢并保持细菌标本的固定直到分析,这一点很重要。这种运输方法已通过大量实验进行了优化,并且优于运输在干冰中冷冻的菌落。干燥前的主要温度变化往往会导致安装的琼脂样品下方的拆卸和鼓泡。
2. 艰难梭菌+粪肠杆菌大菌落的常温干燥
- 从包装材料中取出安装在ITO涂层显微镜载玻片上的琼脂糖细菌菌落。将样品放入带有干燥剂的干燥盒中,在室温下48-72小时。
注意:这是一个温和而缓慢的干燥过程,可最大限度地减少琼脂培养基从显微镜载玻片表面的鼓泡、开裂或分离。 - 妥善处理所有受污染的包装材料,并使用适当的杀菌/杀孢子消毒剂对工作空间进行净化。
- 目视检查菌落在琼脂表面的变形(例如,鼓泡、开裂、脱落)。
注意:琼脂糖表面的高度应明显降低并平放在载玻片上。
3. 艰难梭 菌+ 粪肠杆菌 大菌落的真空和热介导干燥
注意:构建了定制的真空干燥设备(图1),以促进从琼脂样品中去除多余的水分。该设备利用连接到HEPA生物过滤器,冷阱和不锈钢室的旋片真空泵,用于放置细菌样品。可变电压变压器连接到绝缘线丝,允许用户加热腔室以加快干燥过程。
- 关闭样品室的真空管路,打开 旋片 泵的电源开关,使真空泵预热并达到适当的真空压力。
- 打开 可变电压变压器 以加热缠绕在腔室周围的电线丝。调整 可变电源 ,直到真空室的内部温度达到~50°C。当泵预热时,将干冰和100%乙醇的浆液放入冷阱的冷凝器中。
注意: 冷阱可冷凝样品中的任何蒸汽或孢子,并避免污染旋片泵系统和真空泵油。 - 使用扳手松开 16 mm 双爪法兰夹打开真空室。将琼脂糖样品插入腔室,并用 16 mm 双爪法兰夹紧密封腔室。
- 打开泵阀以排空腔室。让样品干燥60-120分钟(例如,在~150 mTorr)。
注意:此干燥时间足以去除小琼脂切片中的大部分水分。根据个体设置和样品的不同,可能需要根据经验确定去除水分和降低琼脂高度的最佳干燥时间。干燥时间的延长会导致干燥的琼脂变脆并容易开裂。 - 完成后,通过关闭旋片泵上的阀门并将外部阀门打开环境空气,将真空室缓慢排放到环境压力。使用前面提到的方案打开腔室,并从腔室中取出干燥的琼脂糖样品。
- 将样品储存在带有干燥剂的干燥盒中,直到基质应用。
注意: 图2 显示了干燥前后琼脂表面的图像。
4. 通过机器人喷涂应用 MALDI基质
注意:在琼脂糖样品彻底干燥并且培养部分的高度明显降低后,使用机器人基质喷雾器均匀地涂覆化学MALDI基质化合物的薄涂层。此过程应在化学通风橱中进行,并配有适当的个人防护设备,包括手套、实验室眼镜和实验室外套。
- 选择适当的 MALDI 矩阵。要遵循此协议,请使用1,5-二氨基萘(DAN)MALDI基质,因为它在负离子模式下有利于氨基酸的解吸和电离。
- 在 90/10 (v/v) 乙腈/水中制备 10 mL 的 10 mg/mL DAN MALDI 基质溶液。使用HPLC级溶剂,超声处理30分钟,并在引入机器人喷雾器注射泵之前通过0.2μm尼龙注射器过滤器过滤溶液。此外,准备洗涤溶液,以确保每次使用之间的喷雾器管路清洁。
注意:选择清洗溶液是为了增加喷雾器管路中基质和其他污染物的溶解度,并便于将其从系统中去除。此处使用的洗涤溶液为90/10(v/v)乙腈/水、50/50(v/v)水/甲醇、99/1(v/v)乙腈/乙酸和95/5(v/v)水/氢氧化铵。 - 将样品连接到喷雾器托盘,并将制备的溶液装入喷雾器管路(图3)。使用计算机软件指定必要的参数,以使基质化合物的均匀涂层: 30°C喷嘴温度,八次通过,0.1 mL / min流速,CC模式,0 s干燥时间,10 psi。
注意:人们普遍认为,大多数病原体将通过应用MALDI基质而失活,该基质通常是小的有机酸或碱。 - 喷洒顺序完成后,从喷雾器托盘中取出样品并储存在干燥柜中直至分析。
5. 制备用于MALDI成像质谱数据采集的细菌大菌落
注意:所有成像质谱分析均使用傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱仪进行。该仪器配备了Nd:YAG MALDI激光系统(2 kHz,355 nm)。
- 将基质包被的样品插入MALDI靶板显微镜载玻片适配器中,并使用永久性标记划线至少三个基准标记,这些基准标记包含样品区域(图4)。使用平板扫描仪获取显微镜载玻片的光学图像,包括基准标记。
注意:基准标记将允许将光学图像配准到仪器中观察到的MALDI相机视图。 - 定义针对所需质量范围、灵敏度和分辨率进行优化的 MS 仪器方法,包括质量校准、MALDI 激光设置、离子光学参数和 ICR 池条件。对于该方法,选择从m / z 100到200的100 Da质量窗口,使用连续累积选定离子(CASI)方法在负离子模式下富集气相信号,23该方法包含目标代谢物的m / z值。
- 打开仪器的图像采集软件,使用 设置向导 定义 文件名 和 位置、 MS采集方法、要采样 的感兴趣区域 以及图像的空间 分辨率 。
注意:100-300μm的空间分辨率通常用于细菌大菌落成像。 - 定义所有参数后,开始采集序列以连续采集定义感兴趣区域每个像素的质谱。
注意:图像采集时间取决于仪器设置,但对于包含5,000-10,000像素的图像,通常范围为2至6小时。
6. 成像质谱数据分析与化合物鉴定
- 图像采集后,使用“.mis”文件扩展名保存数据,这是用于成像质谱平台的供应商特定文件格式。在flexImaging 或 SCiLS 软件包中打开数据文件,或导出为非专有数据格式(如 .mzml),并使用供应商中立的软件(例如 Cardinal24 或 MSIreader25,26)进行可视化。
注意:在flexImaging中打开成像数据时显示平均质谱,它表示在采样区域中检测到的所有离子的平均强度。可以根据准确的质量测量暂时确定感兴趣的峰。通常,质量精度优于百万分之5(ppm)足以在FTICR质谱仪上鉴定代谢物。 - 使用参考的软件,定义目标峰的质量窗口,以生成采样区域中离子分布的假彩色热图。
- 在 平均质谱 显示上,放大到感兴趣的峰并选择包含峰图面积的适当质量数窗口。
- 右键单击突出显示的质量窗口,然后选择 添加质量过滤器...。使用高分辨率精确质量数测量确定的可疑代谢物的暂定鉴定标记所选m / z 值。
- 选择 强度阈值 以调整假色热图显示的分析物图像的动态范围。进一步调整质量数 过滤参数 ,使质量数窗口包含峰分布的面积,然后添加 质量数过滤器。
注意:可以根据需要执行强度归一化,以改善测量区域的相对定量。本文的实验利用了CASI数据采集(vide infra),这可能使总离子计数(TIC)和均方根(RMS)归一化方法不准确。因此,此处显示的所有离子图像均未归一化。
7.未感染对照和 艰难梭菌 感染小鼠盲肠组织的制备和运输
- 将4-8周龄C57BL / 6雄性小鼠在饮用水中随意接种抗生素(0.5mg / mL头孢哌酮或0.5mg / mL头孢哌酮+ 1mg / mL万古霉素)5天,然后2天恢复期和随后的感染。
- 通过CO2 窒息对动物实施安乐死,并立即收获小鼠盲肠器官。嵌入蒸馏水中 20% 的最佳切割温度 (OCT) 化合物混合物中。
- 将样品放在干冰上,然后包装并运输进行分析;储存在-80°C直至分析。
8.未感染对照品艰难梭菌 感染小鼠盲肠组织的冷冻切片
- 用100%乙醇冲洗清洁所有冷冻切割设备,并在将样品放入低温恒温器室之前使其干燥。使用欧姆表准备ITO涂层的显微镜载玻片,以识别带有导电涂层的载玻片的侧面。使用金刚石尖端的划线蚀刻并标记显微镜载玻片的ITO涂层侧。
注意:应穿戴适当的个人防护设备,包括手套、实验室眼镜、实验室外套和低温恒温器套筒。 - 对研究冷冻切片机进行冷冻切片。将OCT包埋的小鼠ceca组织从-80°C冰箱转移到干冰上的冷冻切片机室(30°C室温度,-28°C物体温度)。将要使用成像质谱法比较的组织样品(例如,未感染的对照与 艰难梭菌感染的对照)安装在同一显微镜载玻片上,以确保两种组织类型的样品制备相同,并能够进行准确的代谢物比较。
- 在冷冻切片机室内,使用额外的OCT溶液将OCT包埋的组织安装在样品卡盘上。OCT溶液凝固后,将卡盘固定在试样头上。以10-50μm的增量开始冷冻切片,以达到器官的所需组织深度/平面。
- 一旦达到组织的最佳横截面,就开始收集12μm厚度的切片。使用艺术家画笔轻轻操作切片,然后将其放在特氟龙涂层的显微镜载玻片上。
- 将ITO涂层的显微镜载玻片滚动到组织切片的顶部,以从特氟龙涂层的载玻片中拾取组织。通过将手掌压在ITO涂层载玻片的背面,将组织切片安装到显微镜载玻片上。继续解冻安装,直到组织切片从半透明过渡到不透明/哑光纹理。
- 将干冰上的组织安装显微镜载玻片转移到带有干燥剂的干燥盒中,以便储存在同一天进行分析,或储存在-80°C以进行长期储存。
9. 非感染对照与 艰难梭菌 感染小鼠盲肠组织的制备,用于基质应用和MALDI成像质谱
- 使用 步骤4 中描述的相同方案(30°C喷嘴温度,八次通过,0.1mL / min流速,CC模式,0 s干燥时间,10 psi)执行MALDI基质应用。
- 使用 步骤 5 和 6 中描述的相同协议执行 MALDI 成像质谱分析。
- 分析来自多个生物学重复的离子图像,并使用上面引用的SCiLS统计软件通过强度箱图比较 来 比较结果的显着性。
注意:适当的统计测试和比较将取决于应用,并且可以包括空间分割、分类模型和比较分析,以确定判别性和相关的光谱特征。比较分析可以包括为显著特征分配 p 值、生成用于组织比较的主成分分析以及可视化箱形图以识别变化。在成像质谱法之后,使用通过苏木精和伊红(H&E) 染色 的组织切片的明场显微镜可视化组织也是有用的。这样可以清楚地识别组织中的形态特征,并且可以与训练有素的病理学家协商进行分析。
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Representative Results
我们对模型细菌菌落和与 粪肠杆菌 和 艰难梭菌 共定植的小鼠进行了代谢物MALDI成像质谱分析,以研究氨基酸在微生物 - 微生物相互作用中的作用。在琼脂上生长的细菌大菌落可作为分析细菌生物膜形成中不同生化变化的明确定义模型。重要的是要确保在琼脂培养基上生长的细菌培养大菌落的受控干燥过程,以最大限度地减少琼脂表面的变形和开裂。这是通过两步过程 实现 的,包括在环境温度和压力下使用干燥剂进行初步干燥,然后在高温下进行更快速的真空辅助干燥步骤。使用定制的干燥设备促进琼脂脱水,同时捕获样品中释放的任何细菌污染物或孢子(图1)。额外的真空干燥步骤是必要的,以确保样品完全脱水,并且在暴露于MS真空时不会发生变形。
琼脂切片的样品高度最初为2-4毫米(图2A),并在干燥方案后降低至~0.5毫米的高度(图2B)。在此样品制备方案中,确保整个样品表面的均匀干燥非常重要。样品高度的巨大变化将导致样品表面出现散焦的MALDI激光束,这会对电离效率和产生的分析物离子强度产生不利影响。 图2D显示了干燥过程失败的示例,其中琼脂表面起泡并破裂,使样品无法用于进一步分析。一旦细菌样品彻底干燥,使用机器人喷雾器施加DAN MALDI基质层(图3)。该仪器可以精确控制喷涂参数,从而能够应用均匀的基质涂层(图2C)。
基质应用后,将包含样品的显微镜载玻片插入载玻片适配器中,以便在FTICR MS上进行分析(图4)。首先在载玻片上围绕待测区域绘制基准标记( 图4中用“+”符号表示),在成像质谱采集软件和仪器相机之间记录载玻片上的坐标。然后使用平板扫描仪对载玻片进行数字扫描以记录光学图像,然后用于在flexImaging软件中定义采集序列。我们优化了代谢物阴离子传输和检测的质谱仪设置。使用CASI气相离子富集,定义了离子分离窗口以选择性地积累m / z 150± 50 Da的离子(图5A),其中包含从组织表面观察到的一系列化合物。特别是对于 艰难梭菌 感染,我们发现氨基酸途径在细菌分解代谢过程中表现出有趣和不断变化的作用。基于精确的质量数测量,在 m/ z 131.083和 m/z 173.104处的离子信号被鉴定为鸟氨酸(0.34 ppm质量误差; 图5B)和精氨酸(0.43 ppm质量误差; 图5C),分别。
对艰难梭菌单培养和艰难梭菌+粪埃克菌共培养菌落进行细菌大菌落的成像质谱分析(图6)。MALDI基质应用后样品的光学图像突出显示了感兴趣的采集区域,这些区域延伸到菌落生物膜的外部区域(图6A,C)。这些样品的成像质谱允许鸟氨酸和精氨酸氨基酸代谢物的空间映射,发现它们在粪肠杆菌存在下被改变和差异定位(图6B,D)。例如,与艰难梭菌+粪肠杆菌共培养相比,艰难梭菌单一栽培中的精氨酸含量明显更高(图6D)。我们还使用8周龄无菌C57BL / 6雌性小鼠将成像质谱分析扩展到小鼠感染模型,这些雌性小鼠感染了艰难梭菌孢子,艰难梭菌孢子+粪肠杆菌细胞(wt)(5 ×10 8 / mL),或含有艰难梭菌孢子+粪肠杆菌(ArcD突变)细胞(5 × 108 / mL)(图7)27.收获小鼠盲肠并在25%OCT化合物中冷冻以保持器官形状和保真度。OCT化合物还有助于在冷冻切片过程中支持薄组织切片。与上述方案类似,组织切片涂有DAN MALDI基质层,使用平板光学扫描仪扫描(图7B),并通过MALDI成像质谱分析(图7C)。在成像质谱分析后对组织切片进行组织学染色,并采用高分辨率明场光学扫描评估组织形态(图7A)。与对照组织相比,上皮细胞层在感染期间明显发炎。
图1:自制真空干燥设备。 定制的真空干燥设备用于加快琼脂样品中的水分去除。将样品放入真空室中,真空室使用旋片泵密封并抽真空,然后使用可变电压变压器加热。样品中的任何污染物蒸气/孢子都被捕获在冷阱和HEPA在线过滤器中。通常采用 100-150 mTorr 的压力。 请点击此处查看此图的大图。
图2:细菌大菌落的干燥和制备。使用干燥和真空辅助干燥去除水分之前和(B)之前琼脂样品(A)的光学图像。(C)使用机器人喷雾器干燥后将1,5-二氨基萘MALDI基质施加到细菌共培养物中。(D)不成功的干燥通常会导致琼脂内部开裂和起泡,使其无法用于进一步分析。缩写:DAN = 1,5-二氨基萘;MALDI = 基质辅助激光解吸/电离。请点击此处查看此图的大图。
图 3:在琼脂糖样品上机器人喷洒 MALDI 基质。 (A)HTX M5 TM喷雾器和(B)琼脂糖样品加载到机器人基质喷雾器中用于MALDI基质应用的图像。缩写:MALDI = 基质辅助激光解吸/电离。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:质谱仪适配器,带有用于分析的加载样品。 将基质包被的琼脂糖样品加载到 MTP 玻片适配器中,用于 MALDI 分析。基准标记显示为黑色加号 (“+”)。缩写:MALDI = 基质辅助激光解吸/电离。 请点击此处查看此图的大图。
图5:鉴定的代谢物离子峰的代表性质谱。 (A)细菌培养样品的负离子模式MALDI分析允许检测数十种代谢物。高分辨率精确质量数测量允许在m/z 131.083(0.34 ppm质量误差)和(C)精氨酸(m/z 173.104(0.43 ppm质量误差)下初步鉴定(B)鸟氨酸。质谱是在m/z 150下使用75,000的质量分辨能力(FWHM)获取的。缩写:MALDI = 基质辅助激光解吸/电离;FWHM = 全宽,最大一半。请点击此处查看此图的大图。
图6:细菌大菌落的成像质谱分析。 (A,C)琼脂糖样品的光学图像显示了成像质谱分析的测量区域,这些区域以白色虚线突出显示。(乙,四)鸟氨酸(m/z 131.083,0.038 ppm)和精氨酸(m/z 173.104,0.60 ppm)的MALDI离子图像在细菌培养物中显示出独特的空间分布。请注意,图B和D中显示的共培养离子图像的绝对强度标度不同。例如,相对于图C和D中的共培养,艰难梭菌单一栽培中的精氨酸明显更丰富,这意味着该强度尺度相对于单一栽培中的精氨酸丰度,并且似乎该共培养中不存在精氨酸。相反,A和B中的共培养将精氨酸的强度投射到较低的绝对强度尺度上,因为这是图像中唯一的样品。缩写:MALDI = 基质辅助激光解吸/电离;CASI = 选定离子的连续积累。请点击此处查看此图的大图。
图7:感染小鼠盲肠组织的成像质谱分析。 (A)来自感染小鼠ceca的苏木精和伊红染色组织的明场显微镜图像允许组织形态的可视化。(B)小鼠盲肠组织的光学图像显示了应用DAN MALDI基质层后的样品。(C) 鸟氨酸(m/z 131.083,0.88 ppm)和精氨酸(m/z 173.104,0.15 ppm)的 MALDI 离子图像在组织样品中显示出独特的空间分布。缩写:MALDI = 基质辅助激光解吸/电离;DAN = 1,5-二氨基萘。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在MALDI成像质谱分析过程中,重要的是具有平坦的样品表面,以使样品基板上入射MALDI激光的焦距一致。样品高度的偏差会导致 MALDI 激光束移出焦点,从而导致光束直径和强度的变化,从而影响 MALDI 电离效率。电离效率的这些变化可能导致整个组织表面的分析物强度差异,这些差异不反映底层组织生物化学,而是反映表面形貌。此外,大多数MALDI电离源在低于大气压下运行,水合琼脂样品在 真空 条件下是易碎样品。这些来源的真空会导致琼脂糖样品脱水,从而在干燥过程中改变样品表面。含有气穴或大量水的样品极易受到这些变化的影响。在对琼脂上生长的细菌标本进行MALDI成像质谱分析时,经常会遇到此问题。营养琼脂含水量高,促进细菌生长;然而,在涂覆MALDI基质涂层并将样品引入质谱仪的真空之前,必须尽可能多地去除水分。
因此,水合琼脂样品不利于 真空 分析。除了 真空条件下引起的 形态变化外,样品高度离MALDI靶板载玻片适配器太远也存在潜在问题,该转载台用于固定显微镜载玻片安装的样品并将其带到MALDI激光焦点的正确位置。MALDI载物台机构与载物台的其他机械部件紧密相连,就位时,样品靶板表面与离子源光学器件前端之间的间隙仅为几毫米。这可能会导致样品刮擦,从而移动或完全卸下要分析的样品。此外,虽然水合琼脂标本自然粘附在显微镜载玻片表面,但这往往比完全干燥的琼脂标本的粘附力弱得多。因此,水合琼脂样品进一步突出样品靶板表面并且粘附性较弱,这导致样品拆卸并剥落到下游仪器离子光学器件中的风险更大。
MALDI矩阵的身份和应用方法的选择也是成像质谱实验中需要考虑的重要变量。有机MALDI基质的选择在很大程度上取决于样品底物和目标化合物。例如,许多低分子量代谢物(MW<300Da)由许多有机酸,磷酸盐和其他部分组成,它们在负极性中更容易电离28。对于负模式分析,首选碱性基质,使得它们的化学结构更容易接受质子(例如,9-氨基吖啶,1,5-二氨基萘),因此在许多感兴趣的小代谢物离子上留下负电荷。我们对目标分析物进行了基质筛选,发现1,5-二氨基萘(DAN)基质对对照组织样品的目标氨基酸代谢物产生最高的信号。在MALDI基质应用过程中,从样品底物中提取目标分析物并与MALDI基质共结晶。在某些情况下,“润湿”基质应用条件将促进更高的提取和共结晶,从而改善MALDI分析时的分析物检测。但是,如果基质施用过程使用过多的溶剂,分析物可能会在组织内离域。在选择基质应用条件时,在有效提取分析物和保持组织中分析物的空间保真度之间取得平衡非常重要。例如,定制的升华装置可用于将均匀的基质层施加到样品表面并产生极小的基质晶体尺寸29,30。然而,该过程非常干燥,可能不是分析物提取的最佳选择31。这里使用的机器人喷雾器可对喷雾压力、流速、喷嘴温度和其他参数进行可重复和精确的控制,从而优化分析物提取和基质共结晶的方法32。
此处使用的FTICR MS上的仪器参数已经过优化,可在负离子模式下传输和检测代谢物离子。这包括调整离子转移区域中的RF和DC元件,以优先传输低分子量(<m/z 200)的离子。对离子传输影响较大的参数包括漏斗射频振幅(65 V)、四极杆质谱过滤离子分离的Q1质量设置(m/z 150)以及六极累积池和ICR池之间的飞行时间延迟(0.400 ms)。这些选定的参数值可以更有效地传输低m/z值的离子,但会牺牲较大m/z值的离子的传输效率。此外,我们利用了选定离子的连续积累(CASI)方法,该方法允许在确定的目标质量窗口中选择性富集离子。在这种方法中,四极杆质谱过滤器用于选择性地将小范围的m / z值从电离源传输到仪器中的六极积累池,而在此质量窗口之外具有m / z值的离子具有不稳定的离子轨迹,并且不通过四极杆质量过滤器传输。这允许选择性富集低丰度的目标分析物,通过消除化学噪声将检测限和动态范围提高多达三个数量级。FTICR仪器平台的高质量分离能力和质量精度允许轻松分离同量异位(即相同标称质量数)化合物并初步鉴定代谢物。
对样品制备、MALDI 基质应用和成像质谱分析进行仔细且可重现的控制,可以对菌落和组织样品中的细菌生物化学进行可重现的观察。细菌大菌落作为简化模型来表征微生物感染期间病原体的代谢交叉通讯,然后可以将其与更复杂的系统(如动物组织)进行比较。例如,与单独的艰难梭菌培养物相比,艰难梭菌+粪肠杆菌共培养样品中的精氨酸丰度较低(图6),这得到了粪棘杆菌消耗精氨酸作为能量来源并通过ArcD反转运体从细胞输出鸟氨酸的能力的支持33。 大菌落结果导致了对动物模型中氨基酸的这种调节的研究。感染艰难梭菌+粪肠杆菌(wt)的小鼠比单独感染艰难梭菌的小鼠表现出显着少的精氨酸(图7C),概括了集落图像结果。
为了测试精氨酸代谢的假设和ArcD反转运体的参与,我们使用了一种转座子突变体,该突变体通过粪肠杆菌的ArcD反转运蛋白敲除代谢物转运。感染艰难梭菌+粪肠杆菌(arcD::Tn)的小鼠相对于野生型混合感染模型(图7C)显示出精氨酸检测的增加和鸟氨酸检测的减少,并且通常挽救在仅艰难梭菌感染模型中观察到的原始氨基酸水平(图7A)。代谢物调控的这种反比关系证实了粪肠杆菌交叉喂养艰难梭菌产生的氨基酸营养素的发现。此外,组织学分析显示感染艰难梭菌和粪埃克氏杆菌的小鼠的广泛细胞损伤,这主要在与ArcD转座子突变体相反的粪肠杆菌野生型菌株中观察到。这些结果支持我们最近的发现,即精氨酸和鸟氨酸是艰难梭菌毒力、行为和
健身27.总体而言,该工作流程展示了一种制备用于MALDI成像质谱的琼脂细菌大菌落的有效方法,并表明这些系统可以作为检查感染期间微生物合作的有用模型。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)国家普通医学科学研究所(NIGMS)的支持,授予GM138660。J.T.S.得到了佛罗里达大学的查尔斯和莫妮卡·伯克特家庭暑期奖学金的支持。JPZ得到了NIH拨款K22AI7220(NIAID)和R35GM138369(NIGMS)的支持。A.B.S.得到了宾夕法尼亚大学细胞和分子生物学培训基金(T32GM07229)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
Variable voltage transformer | Powerstat | ||
Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
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