Summary
Den nåværende protokollen beskriver bioengineering av ytre membranvesikler for å være en "Plug-and-Display" vaksineplattform, inkludert produksjon, rensing, biokonjugering og karakterisering.
Abstract
Biomimetiske nanopartikler hentet fra bakterier eller virus har tiltrukket seg stor interesse for vaksineforskning og utvikling. Ytre membranvesikler (OMV) utskilles hovedsakelig av gramnegative bakterier under gjennomsnittlig vekst, med en nanostørrelsesdiameter og selvadjuvant aktivitet, noe som kan være ideelt for vaksinelevering. OMV-er har fungert som et mangefasettert leveringssystem for proteiner, nukleinsyrer og små molekyler. For å dra full nytte av de biologiske egenskapene til OMV-er, ble bioengineerte Escherichia coli-avledede OMV-er benyttet som bærer og SARS-CoV-2-reseptorbindende domene (RBD) som et antigen for å konstruere en "Plug-and-Display" vaksineplattform. Domenene SpyCatcher (SC) og SpyTag (ST) i Streptococcus pyogenes ble brukt på konjugerte OMVer og RBD. Cytolysin A (ClyA) -genet ble oversatt med SC-genet som et fusjonsprotein etter plasmidtransfeksjon, og etterlot et reaktivt sted på overflaten av OMVene. Etter blanding av RBD-ST i et konvensjonelt buffersystem over natten, ble det dannet kovalent binding mellom OMV-ene og RBD. Dermed ble en multivalent OMV-vaksine oppnådd. Ved å erstatte med forskjellige antigener, kan OMVs vaksineplattform effektivt vise en rekke heterogene antigener, og dermed potensielt raskt forhindre smittsomme sykdomsepidemier. Denne protokollen beskriver en presis metode for å konstruere OMV-vaksineplattformen, inkludert produksjon, rensing, biokonjugering og karakterisering.
Introduction
Som en potensiell vaksineplattform har ytre membranvesikler (OMV) tiltrukket seg mer og mer oppmerksomhet de siste årene 1,2. OMV-er, hovedsakelig utskilt naturlig av gramnegative bakterier3, er sfæriske nanoskalapartikler sammensatt av et lipid-dobbeltlag, vanligvis i størrelsen 20-300 nm4. OMV-er inneholder forskjellige foreldrebakterielle komponenter, inkludert bakterielle antigener og patogenassosierte molekylære mønstre (PAMPs), som fungerer som faste immunpotensiatorer5. Ved å dra nytte av deres unike komponenter, naturlige vesikkelstruktur og gode genteknologiske modifikasjonssteder, har OMV-er blitt utviklet for bruk i mange biomedisinske felt, inkludert bakterielle vaksiner6, adjuvanser7, kreftimmunterapimedisiner8, legemiddelleveringsvektorer9 og antibakterielle lim10.
SARS-CoV-2-pandemien, som har spredt seg over hele verden siden 2020, har gått hardt utover det globale samfunnet. Det reseptorbindende domenet (RBD) i piggprotein (S-protein) kan binde seg til humant angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE2), som deretter formidler virusets inntreden i cellen11,12,13. Dermed ser RBD ut til å være et hovedmål for vaksineoppdagelse14,15,16. Imidlertid er monomer RBD dårlig immunogen, og den lille molekylvekten gjør det vanskelig for immunsystemet å gjenkjenne, så adjuvanser er ofte nødvendig17.
For å øke immunogenisiteten til RBD ble OMV-er som viste polyvalente RBD-er konstruert. Eksisterende studier som bruker OMV for å vise RBD, smelter vanligvis RBD med OMV som skal uttrykkes i bakterier18. Imidlertid er RBD et virusavledet protein, og prokaryotisk uttrykk vil sannsynligvis påvirke aktiviteten. For å løse dette problemet ble SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) -systemet, avledet fra Streptococcus pyogenes, brukt til å danne et kovalent isopeptid med OMV og RBD i et konvensjonelt buffersystem19. SC-domenet ble uttrykt med Cytolysin A (ClyA) som et fusjonsprotein av bioengineered Escherichia coli, og ST ble uttrykt med RBD via HEK293F cellulære ekspresjonssystem. OMV-SC og RBD-ST ble blandet og inkubert over natten. Etter rensing ved ultrasentrifugering eller størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) BLE OMV-RBD oppnådd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid konstruksjon
- Sett inn DNA-koding SpyCatcher-sekvens (tilleggsfil 1) i et ampicillinresistent pThioHisA-ClyA-plasmid (se materialtabell) mellom BamH I- og Sal I-stedene for å konstruere plasmidet pThioHisA ClyA-SC etter en tidligere publisert rapport20.
- Ligate det syntetiserte SpyTag-RBD-Histag-fusjonsgenet (Supplementary File 1) til et pcDNA3.1-plasmid (se Materialtabell) mellom BamH I- og EcoR I-stedene for å konstruere plasmidet pcDNA3.1 RBD-ST etter en tidligere publisert rapport19.
2. OMV-SC forberedelse
- Utfør ClyA-SC-transformasjon ved å følge trinnene nedenfor.
- Tilsett 5 μL pThioHisA ClyA-SC plasmidoppløsning (50 ng / μL) til 50 μL BL21 kompetent belastning, blås forsiktig og la avkjøles på is i 30 minutter.
- Legg oppløsningen i 90 s i vannbadet ved 42 °C, og legg deretter den blandede oppløsningen umiddelbart på is i 3 minutter.
- Tilsett 500 μL LB-medium til bakteriesuspensjonen, og etter blanding dyrker du ved 220 o / min ved 37 ° C i 1 time.
- Plate all transformasjon på en LB agar plate som inneholder ampicillin (100 μg / ml, se Tabell over materialer) og kultur over natten ved 37 ° C.
MERK: I påfølgende eksperimenter ble ampicillinet holdt i samme konsentrasjon i mediet. Hvis ikke, kan dette føre til tap av plasmider i bakteriene.
- For OMV-SC-produksjon, utfør trinnene nedenfor.
- Isoler en enkelt koloni fra platen (trinn 2.1.4.) til 20 ml LB (ampicillinresistent) medium og kultur over natten ved 220 o / min ved 37 ° C.
- Inokuler bakterieoppløsningen (fra trinn 2.2.1.) til 2 L medium, kultur ved 220 o / min, 37 ° C i 5 timer til det logaritmiske vekststadiet (OD600nm er mellom 0,6 og 0,8).
- Når OD ved 600 nm av bakterieoppløsningen når 0,6-0,8, tilsett isopropyl beta-D-tiogalaktopyranosid (IPTG, se Materialtabell) for å gjøre den endelige konsentrasjonen av bakterieoppløsningen til 0,5 mM, og deretter kultur over natten ved 220 o / min ved 25 ° C.
- Utfør OMV-SC-rensing.
- Sentrifuge bakterieoppløsningen ved 7000 x g ved 4 °C i 30 minutter.
- Filtrer supernatanten med et 0,22 μm membranfilter, og konsentrer det deretter ved hjelp av en 100 kD ultrafiltreringsmembran eller hul fiberkolonne (se materialtabell).
- Filtrer konsentratet gjennom et 0,22 μm membranfilter, sentrifuger det deretter ved 150 000 x g ved 4 °C i 2 timer ved hjelp av en ultracentrifuge (se Materialtabell), og kast supernatanten med en pipette.
- Resuspender nedbøren med PBS og oppbevar den ved -80 °C. Løsningen kan opprettholde langsiktig stabilitet ved −80 °C.
3. RBD-ST forberedelse
- Utfør RBD-ST-transfeksjon ved å følge trinnene nedenfor.
- Velg et passende eukaryot uttrykkssystem (f.eks. HEK293F) og dyrk cellene over natten ved 130 o / min ved 37 ° C etter utvinning.
- Tilsett 20 μL HEK293F-celleoppløsning i den automatiserte celletelleren (se Materialtabell), registrer antall celler, juster konsentrasjonen til 1 x 106 celler / ml, og dyrk deretter cellene ved 130 o / min ved 37 ° C i 4 timer.
- Filtrer RBD-ST-plasmid gjennom et 0,22 μm membranfilter, og tilsett 300 μg plasmider i cellekulturmediet (se Materialtabell) til det endelige volumet er 10 ml; rist i 10 s.
- Varm PEI (1 mg / ml, se materialtabell) til 65 ° C i vannbadet, bland 0,7 ml PEI med 9,3 ml cellekulturmedium, og rist periodisk i 10 s.
MERK: Ikke rist oppløsningen kraftig. Ellers kan de resulterende boblene påvirke transfeksjonseffektiviteten. - Tilsett plasmidoppløsning til PEI-løsningen, rist blandingen periodisk i 10 s, og inkuber den ved 37 ° C i 15 minutter.
- Tilsett blandingen til 280 ml cellekulturmedium og kultur ved 130 o / min ved 37 ° C i 5 dager.
- Utfør RBD-ST-rensing.
- Sentrifuge cellene ved 6000 x g ved 25 °C i 20 minutter og bruker en pipette til å samle opp supernatanten.
- Fyll kolonnen med 2 ml Ni-NTA agarose (se Materialtabell) og vask den 3x med 3x PBS.
- Tilsett imidazol (se Materialfortegnelse) i cellesupernatanten for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 20 mM, og fyll cellesupernatanten 2x.
- Tilsett 3 kolonnevolumer (CV) av PBS som inneholder 20 mM imidazol for vask, og samle vaskefraksjonen.
- Gradient eluer med 3 CV PBS som inneholder lave til høye konsentrasjoner (f.eks. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) imidazol; Elutt 2x for hver konsentrasjon.
- Bruk SDS-PAGE21 for å identifisere RBD-ST i forskjellige konsentrasjonsgradienter.
4. OMV-RBD biokonjugering og rensing
- Bestem proteinkonsentrasjonen ved BCA-metoden (se Tabell over materialer).
- Fortynn standard BSA-proteinoppløsning serielt fra 2 mg / ml til 0,0625 mg / ml, fortynn den rensede OMV-SC og RBD-ST 10x, bland deretter BCA-arbeidsløsninger A og B (gitt i analysesettet) i forholdet 50: 1 (v / v).
- Tilsett fortynnet proteinoppløsning (25 μL/brønn) og bland med BCA arbeidsløsning (200 μL/brønn); inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- Mål absorbansen (OD) ved 562 nm av hver brønn og beregn proteinkonsentrasjonen fra standardkurven22.
- Utfør biokonjugering av OMV-SC og RBD-ST ved å følge trinnene nedenfor.
- Bland OMV-SC og RBD-ST i PBS i forholdet 40:1 (w/w).
- Roter vertikalt for å blande blandingen over natten ved 15 o/min ved 4 °C.
MERK: Ulike antigener kan reagere i forskjellige proporsjoner. Man kan prøve forskjellige reaksjonsforhold basert på antigenets egenskaper.
- Kontroller reaksjonseffektiviteten.
- Forbered 10 μL OMV-SC, RBD-ST og reaksjonsproduktet (trinn 4.2.). Tilsett 2,5 μL 5x lastebuffer (se materialfortegnelse), og varm opp prøvene ved 100 °C i 5 minutter. Legg prøvene i gelen (10 μL/brønn). Utfør elektroforese ved 60 V i 20 minutter og endre tilstanden til 120 V i 1 time.
- Overfør proteinet fra gelen til PVDF vestlige blottingmembraner (se Materialtabell) ved 100 V i 70 minutter.
- Sett membranen i 5% ikke-fett pulverisert melk / TBST og rist i 1 time. Vask deretter 3x med TBST i 5 minutter per vask med risting.
- Sett membranen i 0,1% His-Tag antistoff / TBST (se Materialtabell) og rist i 1 time, vask deretter 3x med TBST i 5 minutter per vask med risting.
- Sett membranen i 0,02% anti-mus IgG1 antistoff (HRP) / TBST (se Materialtabell) og rist i 40 min, vask deretter 3x med TBST i 5 minutter per vask med risting.
- Tilsett forbedret kjemiluminescensløsning (se materialtabell) og utsett membranen.
- Utfør rensing av OMV-RBD.
- Fortynn 1 ml reagert OMV-RBD-løsning til 10 ml, og sentrifuger fortynningen ved 150 000 x g ved 4 °C i 2 timer.
- Bruk en pipette til å kaste supernatanten og heng opp restene med 10 ml PBS. Sentrifuge suspensjonen ved 150 000 x g ved 4 °C i 2 timer.
- Kast supernatanten og suspender resten med 1 ml PBS.
MERK: Hvis antigenets oppløselighet er mye lavere, kan den samme separasjonseffekten oppnås ved størrelseseksklusjonskromatografi19.
5. Karakterisering
- Utfør dynamisk lysspredning (DLS).
- Fortynn prøvene til en konsentrasjon på 100 μg/ml og tilsett 1 ml prøve i prøvecellen.
- Velg "Størrelse" for "Måletype", "Protein" for "Prøvemateriale", "Vann" for "Dispergeringsmiddel", "25 °C" for "Temperatur", og last deretter prøver og mål automatisk23.
- Ta bilder ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM).
- Fortynn prøvene til 100 μg/ml. Ta et 200-mesh kobbergitter, tilsett 20 μL prøve til det, og la det bli absorbert i 10 minutter.
- Bruk filterpapir til å transportere av løsningen, tilsett 20 μL 3% uranylacetat til støttefilmen og flekk i 30 s.
- Veke av uranylacetatet og tørk filmen naturlig ved romtemperatur i 1 time.
- Legg prøvene til TEM-systemet (se materialfortegnelse) og ta bilder ved 80 kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flytskjemaet for denne protokollen er vist i figur 1. Denne protokollen kan være en generell tilnærming til å bruke OMV-er som vaksineplattform; Man trenger bare å velge de riktige ekspresjonssystemene basert på typen antigener.
Figur 2 gir et gjennomførbart plasmiddesignskjema. SC-genet er forbundet med ClyA-genet via en fleksibel linker, mens ST kobles til 5 'terminalen av RBD-genet med et His-tag-gen for rensing og verifisering. Western blot viste at reaksjonen gradvis avsluttes med økende OMV-SC (figur 3A). Etter ultracentrifugering forble nesten alle de uomsatte RBD-ST i supernatanten. Den andre ultracentrifugeringen ga ikke en ytterligere signifikant fordel i forhold til første gang (figur 3B).
Fordelingen av partikkelstørrelse ble bestemt av DLS (figur 4). Z-gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter på OMV-SC var 133 nm, mens den var 152,6 nm for OMV-RBD (tabell 1). Disse forskjellene kan skyldes at RBD øker OMV-partikkelstørrelsen etter intensiv visning. Resultatene av TEM (figur 5) er i samsvar med DLS-resultatene. Bildene viste at OMV-ene alltid har en standard sfærisk struktur, enten de er koblet til RBD eller ikke. Dette indikerer at ekstraksjons-, reaksjons- og rensebetingelsene bidrar til å opprettholde den biologiske aktiviteten til OMV-er.
Figur 1: Flytskjema for OMV-RBD-klargjøring. ClyA-SC-plasmidet ble transformert til E. coli, mens RBD-ST-plasmidet ble transfisert til HEK293F-celler. Etter en periode med dyrking ble OMV-SC og RBD-ST isolert og renset. Etter biokonjugering i konvensjonell buffer og ultrasentrifugering ble OMV-RBD oppnådd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Plasmidprofilene som ble brukt i denne studien . (A) pThioHisA ClyA-SC plasmid. (B) pcDNA RBD-ST plasmid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Verifikasjon av OMV-RBD ved western blot. (A) Utforskningen av reaksjonsforholdet mellom OMV-SC og RBD-ST med anti-6x HisTag. M: molekylvektmarkør 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV: RBD = 10: 1 (w / w); 4: OMV:RBD = 20:1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) Validering av effektiviteten av ultrasentrifugering med anti-6x HisTag. M: molekylvektmarkør 1: OMV-SC; 2: OMV-RBD pre-ultracentrifugation; 3: RBD-ST; 4: supernatant post første ultracentrifugation; 5: utfelling etter første ultracentrifugering; 6: supernatant post andre ultracentrifugation; 7: utfelling etter andre ultracentrifugering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Partikkelstørrelsesfordeling målt ved DLS . (A) OMV-SC. (B) OMV-RBD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Visualisering av OMV-er etter TEM. (A) OMV-SC (200 μg/ml). (B) OMV-RBD (200 μg/ml). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel på navn | Temperatur (°C) | Z-Ave (d.nm) | Pdi |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
Tabell 1: Parametere målt ved DLS.
Tilleggsfil 1: Plasmidsekvenser brukt i denne studien. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å skape en "Plug-and-Display" nanopartikkelvaksineplattform ble SC-smeltet ClyA uttrykt i BL21 (DE3) stammer, som er en av de mest brukte modellene for rekombinant proteinproduksjon på grunn av fordelene i proteinuttrykk24, slik at det ville være nok SC-fragment som vises på overflaten av OMVene under prosessen med bakterieproliferasjon. Samtidig ble det fremstilt et ST-smeltet målantigen for den kjemiske koblingen mellom antigenene og OMV-ene. Denne eksperimentelle ordningens fordeler og fremtidige applikasjonsutsikter gjenspeiles hovedsakelig i tre aspekter. Først realiseres "Plug-and-Display" -systemet med forskjellige antigener og biologiske nanopartikler. Reaksjons- og renseprosessen kan være rask og grei, noe som har betydelige fordeler ved å utvikle vaksiner for fremvoksende smittsomme sykdommer og andre scenarier. For det andre oppnår den målet om antigenvisning med høy tetthet og gir en vaksinedesignmetode for noen antigener med lav immunogenitet. For det tredje er det individuelle uttrykket av OMV og RBD (antigenprotein) gunstig for å sikre høy antigenaktivitet fordi konvensjonelle prokaryote ekspresjonssystemer mangler funksjoner som bestemte kofaktorer, molekylære chaperoner og posttranslasjonelle modifikasjoner, noe som kan føre til proteintap og feilfolding.
I prosessen med plasmidkonstruksjon ble ClyA valgt som et mål for å koble til SC, hovedsakelig på grunn av den løse fatformede strukturen til C-terminalen til ClyA. Studier har vist at hemoglobinprotease (Hbp) autotransportør kan vise antigener fra Streptococcus lungebetennelse og Mycobacterium tuberculosis25,26. Ellers, hvis antigenet som skal vises er fra en prokaryote, er det mulig å konstruere antigenene direkte inn i C-terminalen til ClyA uten å bruke SC / ST-konjugering. Denne metoden kan resultere i OMV-er med høyere visningstetthet, men det er fortsatt en risiko for at antigenproteinene ikke brettes riktig. Det er viktig å merke seg at en fleksibel linker må utformes og brukes når SC / ST settes inn i målfragmentet, noe som bidrar til å forbedre reaksjonseffektiviteten mellom SC og ST. Linkersekvensen som ble brukt her var GSGGSGGSGTG, og andre fleksible linkere kan også velges.
I tillegg til SC/ST-systemet for klikkkjemisk konjugering, brukes også Snooptag/Snoopcatcher og Sortase A-konjugering ofte til kovalent konjugering mellom proteiner27,28. Samtidig har det også blitt rapportert at innføringen av flere forskjellige koblingssystemer på samme vektor29 eller bruk av samme koblingssystem for flere antigener19 kan oppnå formålet med å vise flere heterologe antigener på samme vektor, og deretter kan polyvalente eller multifunksjonelle vaksiner fremstilles.
Høy cytotoksisitet og lavt utbytte begrenser den utbredte bruken av OMV som vaksineplattformer 4,30. Noen LPS-relaterte gener har blitt slått ut i stammen som brukes i denne protokollen, ifølge relevant litteratur31,32,33, for å redusere cytotoksisiteten til OMV. 1,18 mg OMV kan ekstraheres fra hver 1 L av bakterieoppløsningen ved metoden introdusert i denne protokollen. Utbyttet er fortsatt lavere enn for noen genmodifiserte høyvesikkelproduserende stammer34. Om nødvendig kan høytrykkshomogenisering også fremme spiring av bakteriemembranen for å produsere flere OMV-er, som kan oppnå forbedret utbytte og vise tetthet samtidig35.
Induksjonsforholdene er avgjørende for tettheten av SC som vises på overflaten av OMV-ene. Vi overvåket uttrykket av målproteinet gjennom SDS-PAGE og screenet deretter ut induksjonstilstanden, som er relativt mild og uttrykker mer protein. Ulike proteiner kan kreve forskjellige induksjonsbetingelser, og endringer i induksjonsbetingelsene kan føre til forskjeller i tettheten av SC som vises på overflaten av OMV-ene. Justering av antigen- og bærerforholdet etter at eksperimentelle forhold endres for å utforske det mest hensiktsmessige reaksjonsforholdet, foreslås. I tillegg kan rensing av OMV-RBD oppnås ved SEM eller ultracentrifugering. Begge metodene ble prøvd; ultracentrifugering er mer praktisk, og den resulterende OMV hadde en renhet som ligner SEM-protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av nøkkelprogrammet til Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) og Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 31670936, 82041045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
References
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A.
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
