Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

قياس انضغاط الخلية والنواة على أساس المجهر الصوتي

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/64225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sino-French Institute of Nuclear Engineering and Technology, Sun Yat-sen University

Summary

هنا يتم تقديم بروتوكول لبناء نظام سريع وغير مدمر لقياس انضغاط الخلية أو النواة على أساس microdevice المائع الصوتي. تم التحقيق في التغيرات في الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية بعد الانتقال الظهاري الوسيط أو الإشعاع المؤين ، مما يدل على احتمال تطبيق هذه الطريقة في البحث العلمي والممارسة السريرية.

Abstract

تلعب ميكانيكا الخلايا دورا مهما في ورم خبيث في ورم خبيث للخلايا والحساسية الإشعاعية. خلال هذه العمليات ، غالبا ما تكون دراسة الخواص الميكانيكية للخلايا صعبة. طرق القياس التقليدية القائمة على التلامس مثل الضغط أو التمدد عرضة للتسبب في تلف الخلايا ، مما يؤثر على دقة القياس وزراعة الخلايا اللاحقة. يمكن أن تؤثر القياسات في حالة الالتصاق أيضا على الدقة ، خاصة بعد التشعيع لأن الإشعاع المؤين سوف يسطيح الخلايا ويعزز الالتصاق. هنا ، تم تطوير نظام قياس ميكانيكا الخلايا على أساس طريقة الموائع الصوتية. يمكن الحصول على انضغاط الخلية عن طريق تسجيل مسار حركة الخلية تحت تأثير القوة الصوتية ، والتي يمكنها تحقيق قياس سريع وغير مدمر في الحالة المعلقة. تقدم هذه الورقة تقريرا مفصلا عن بروتوكولات تصميم الرقاقة وإعداد العينات وتسجيل المسار واستخراج المعلمات وتحليلها. تم قياس انضغاط أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية بناء على هذه الطريقة. كما تم قياس انضغاط النواة عن طريق ضبط تردد الرنين للسيراميك الكهرضغطي وعرض القناة الدقيقة. جنبا إلى جنب مع التحقق من المستوى الجزيئي لتجارب التألق المناعي ، تمت مقارنة انضغاط الخلايا قبل وبعد الانتقال الظهاري الناجم عن الدواء إلى الانتقال الوسيط (EMT). علاوة على ذلك ، تم الكشف عن تغيير انضغاط الخلايا بعد تشعيع الأشعة السينية بجرعات مختلفة. طريقة قياس ميكانيكا الخلايا المقترحة في هذه الورقة عالمية ومرنة ولها آفاق تطبيق واسعة في البحث العلمي والممارسة السريرية.

Introduction

تلعب الخواص الميكانيكية للخلايا دورا مهما في ورم خبيث في ورم خبيث للخلايا والحساسية الإشعاعية 1,2. للحصول على فهم متعمق لدور الخواص الميكانيكية للخلية في العملية المذكورة أعلاه ، يعد القياس الدقيق للميكانيكا الخلوية أمرا بالغ الأهمية ، ويجب ألا يتسبب القياس في تلف الخلايا للزراعة والتحليل اللاحقين. يجب أن تكون عملية القياس في أسرع وقت ممكن ، وإلا فقد تتأثر صلاحية الخلية إذا تمت إزالة الخلايا من بيئة الزراعة لفترة طويلة.

تواجه طرق قياس ميكانيكا الخلايا الحالية بعض القيود. بعض الطرق ، مثل قياس الخلايا الملتوية المغناطيسي ، والملقط المغناطيسي ، وعلم الميكروريولوجيا لتتبع الجسيمات ، تسبب تلف الخلايا بسبب إدخال الجسيمات في الخلايا3،4،5. الطرق التي تقيس عن طريق الاتصال بالخلايا ، مثل مجهر القوة الذرية (AFM) ، وشفط الماصة الدقيقة ، والانقباض الدقيق ، وتقنية اللوحة المتوازية ، هي أيضا عرضة لتلف الخلايا ومن الصعب زيادة الإنتاجية6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإشعاع المؤين سوف يسطيح الخلايا ويزيد من التصاقها9 ؛ لذلك من الضروري قياس ميكانيكا الخلايا بأكملها في التعليق.

استجابة للتحديات المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام قياس ميكانيكا الخلايا على أساس طريقة الموائع الصوتية10،11،12،13،14. يتطابق عرض القناة مع نصف الطول الموجي الصوتي ، مما يخلق عقدة موجة دائمة عند خط الوسط للقناة الدقيقة. تحت تأثير قوة الإشعاع الصوتي ، يمكن للخلايا أو الخرز القياسي الانتقال إلى عقدة الضغط الصوتي. نظرا لأن الخصائص الفيزيائية للخرز القياسي (الحجم والكثافة وقابلية الانضغاط) معروفة ، يمكن تحديد كثافة الطاقة الصوتية. بعد ذلك ، يمكن الحصول على انضغاط الخلايا عن طريق تسجيل مسارات حركة الخلايا في المجال الصوتي. يمكن تحقيق قياس عالي الإنتاجية غير مدمر للخلايا في حالة التعليق. ستقدم هذه الورقة تصميم رقاقة الموائع الدقيقة وإنشاء النظام وخطوات القياس. تم إجراء قياس أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية للتحقق من دقة الطريقة. تم توسيع نطاق تطبيق هذه الطريقة ليشمل الهياكل دون الخلوية (مثل النواة) عن طريق ضبط تردد الرنين للسيراميك الكهرضغطي وعرض القناة الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقيق في التغيرات في انضغاط الخلايا بعد EMT الناجم عن الدواء أو تشعيع الأشعة السينية بجرعات مختلفة. تظهر النتائج قابلية التطبيق الواسعة لهذه الطريقة كأداة قوية لدراسة العلاقة بين التغيرات الكيميائية الحيوية والخواص الميكانيكية الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع وتجميع الجهاز المجهري الصوتي

  1. تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة.
    1. صمم شريحة أحادية القناة مع مدخل ومخرج واحد فقط كما هو موضح في الشكل 1. لقياس الخلايا ، حافظ على المقطع العرضي المستطيل للقناة الدقيقة بعرض 740 ميكرومتر وعمق 100 ميكرومتر. لقياس نواة الخلية ، قم بتغيير عرض وعمق القناة الدقيقة إلى 250 ميكرومتر و 100 ميكرومتر ، على التوالي.
    2. تحضير القناة الدقيقة على رقاقة السيليكون عن طريق النقش الأيوني التفاعلي. أغلق الجزء العلوي من القناة الدقيقة بقطعة من الزجاج الشفاف المقاوم للحرارة عن طريق الترابط الأنودي15. اغسل الرقائق بمنظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق. جففها في فرن تجفيف على درجة حرارة 50 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. تصنيع كتل بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS).
    1. أضف 30 مل من البوليمر المسبق إلى طبق زجاجي قطره 100 مم (قطره). أضف 3 مل من عامل المعالجة إلى البوليمر المسبق باستخدام حقنة.
      ملاحظة: نسبة حجم عامل المعالجة وما قبل البوليمر هي 1:10.
    2. امزج بقوة PDMS قبل البوليمر وعامل المعالجة بقضيب زجاجي لمدة 10 دقائق. ابحث عن فقاعات الهواء الصغيرة والمنفصلة بشكل موحد في المحلول ، والتي تشير إلى أن PDMS قبل البوليمر وعامل المعالجة مختلطان جيدا.
    3. ضع الطبق الزجاجي في مجفف فراغ وقم بالإخلاء لمدة 15-25 ثانية. كرر هذه العملية حتى لا تكون هناك فقاعات هواء في الخليط.
    4. ضع الطبق الزجاجي في فرن تجفيف على درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح للخليط بالشفاء. بعد الحضانة ، استخدم مشرطا لقطع PDMS إلى كتل ذات حجم مناسب يبلغ طولها حوالي 1.2 سم وعرضها 1 سم.
      ملاحظة: يتوافق طول كتلة PDMS مع عرض الرقاقة ، ويتم تحديد العرض لضمان وجود مساحة كافية في الوسط للسيراميك الكهرضغطي عند الالتزام بكتلتين PDMS على الشريحة.
  3. ربط كتلة PDMS إلى الشريحة.
    1. ثقوب مثقوبة في كتلة PDMS لمنافذ المدخل والمخرج بإبرة مجوفة قطرها 1 مم. ضع كتل PDMS ورقاقة (الجانب الخلفي لأعلى) في منظف البلازما لمدة 1 دقيقة.
    2. قم بمحاذاة الثقوب الموجودة على كتل PDMS مع مدخل ومخرج الشريحة. اضغط برفق على كتل PDMS على الشريحة لمدة 15 ثانية. يجب أن يتسبب ذلك في حدوث الترابط بين كتل PDMS وسطح الشريحة.
  4. قم بتوصيل قسطرة البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) بالشريحة (الشكل 2B).
    1. قطع قطعتين من قسطرة PTFE بقطر داخلي يبلغ 0.8 مم وطول 10 سم. ثني إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر داخلي يبلغ 0.7 مم وطول 1.5 سم × 90 درجة في شكل L. قم بتوصيله بأحد طرفي القسطرة. إعداد اثنين من هذه القسطرة مع الإبر.
    2. أدخل الإبر المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في ثقوب كتل PDMS. بالنسبة للمدخل ، قم بتوصيل إبرة توزيع 19 G بالطرف الآخر من القسطرة كموصل لمحقنة.
    3. بعد الانتهاء من الخطوات المذكورة أعلاه ، حقن الماء منزوع الأيونات لاختبار ضيق القناة الكلية. منيع للماء يعني ختم جيد.
  5. تجميع السيراميك الكهرضغطي (الشكل 2C)
    1. استخدم قاطع الأسلاك الماسية لقطع صفائح السيراميك الكهرضغطية التي يبلغ قطرها 2 سم إلى أربعة شرائط بعرض 5 مم.
    2. تأكد من أن التردد الرنانة للسيراميك الكهرضغطي يتطابق مع عرض القناة الدقيقة للرقاقة. بالنسبة للقناة الدقيقة العريضة 740 ميكرومتر و 250 ميكرومتر ، استخدم السيراميك الكهرضغطي بترددات رنين تبلغ 1 ميجاهرتز و 3 ميجاهرتز ، على التوالي.
    3. أسلاك اللحام على جانبي السيراميك الكهرضغطي في نهاية واحدة.
    4. الغراء السيراميك الكهرضغطي إلى منتصف الجزء الخلفي من رقاقة مع الغراء سيانوأكريلات.
    5. لنشر الغراء بالتساوي ، ضع قطرة من الغراء على السيراميك الكهرضغطي ، وقم بتنعيم الغراء باستخدام مسواك وإزالة الغراء الزائد. ثم اضغط عليه بسرعة على الشريحة واستمر في الضغط لمدة 1 دقيقة تقريبا. تأكد من أن السيراميك الكهرضغطي والرقاقة مرتبطان بإحكام ومتصلان بالتساوي.
  6. قم بتركيب الجهاز الصغير (الشكل 2D).
    1. قطع قطعة من PDMS (حوالي 1.5 سم طويلة وعرض 1 سم) كقاعدة للجهاز الصغير. باستخدام شريط على الوجهين ، قم بلصق جانب واحد من القاعدة بكتل PDMS للمدخل والمخرج ، والجانب الآخر بشريحة زجاجية شفافة. قم بإصلاح الجهاز الصغير بأكمله في مرحلة المجهر للحفاظ على الشريحة في مستوى بؤري واحد.

2. إعداد العينات

  1. إعداد حلول جسيمات البوليسترين القياسية.
    1. أضف 0.05 مل من محلول جسيمات البوليسترين (قطره 6 ميكرومتر) (2.1 × 108 جسيمات / مل) إلى 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واخلطه جيدا.
      ملاحظة: من أجل تقليل خطأ القياس الناجم عن تغير كثافة الطاقة الصوتية، تم خلط محلول جسيمات البوليسترين مع محلول العينة في كل تجربة كمعايرة.
  2. إعداد تعليق الخلايا.
    1. اغسل الخلايا الملتصقة (على سبيل المثال ، MCF7 ، MDA-MB-231 ، HCT116) عند التقاء 90٪ (~ 5 × 105 خلايا) باستخدام PBS. أضف 500 ميكرولتر 0.25٪ تريبسين (1x) لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). قم بإزالة التربسين ، وأضف 1 مل وسط كامل وشكل تعليق خلية عن طريق السحب.
    2. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 100 × g لمدة 5 دقائق. قم بإزالة supernatant وإعادة التعليق في 0.5-1 مل من PBS من أجل الحصول على تعليق الخلية. تم حساب الخلايا باستخدام مقياس الدم وكان التركيز حوالي 3-5 × 105 خلايا / مل.
  3. تحضير تعليق نواة الخلية
    1. نفذ الخطوة 2.2. ثم ، قم بإزالة supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من كاشف استخراج البروتين السيتوبلازمي A (مكمل بنسبة 1٪ PMSF) لكل 20 ميكرولتر من بيليه الخلية (حوالي 5 ملايين خلية) واخلطه جيدا.
    2. دوامة الخليط أعلاه في 220 × غرام لمدة 5 ثانية ، ثم وضعها على حمام الجليد لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من كاشف استخراج البروتين السيتوبلازمي B إلى المحلول.
    3. دوامة في 220 × غرام لمدة 5 ثانية. ضعيه على حمام ثلجي لمدة 1 دقيقة ودوامة مرة أخرى عند 220 × جم لمدة 5 ثوان. ثم ، أخيرا ، جهاز طرد مركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: نسبة حجم كواشف استخراج البروتين السيتوبلازمي A و B هي 20: 1.
    4. إزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات في 1 مل من PBS. ثم ، جهاز طرد مركزي عند 1000 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق. قم بإزالة supernatant وإعادة التعليق في 100 ميكرولتر من PBS كتعليق نواة الخلية.
    5. أضف التربان الأزرق إلى تعليق نواة الخلية أعلاه وصبغ في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 4 دقائق. نسبة حجم محلول تريبان الأزرق إلى تعليق النواة هي 1: 1. احسب عدد النوى تحت المجهر المقلوب بهدف 10x.
      ملاحظة: لتحديد نوى الخلية بوضوح تحت المجهر ، يلزم تلطيخ التربان الأزرق. يجب أن يكون محلول التربان الأزرق في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام لتلطيخ فعال.
    6. قم بتخفيف تعليق نواة الخلية أعلاه باستخدام مخزن PBS المؤقت إلى تركيز 2-3 × 105 نواة / مل. قم بتصفية تعليق نواة الخلية من خلال غربال 70 ميكرومتر.

3. قياس انضغاط الخلية والنواة

  1. إعداد نظام القياس (الشكل 3)
    1. قم بتشغيل مصدر الضوء للمجهر وافتح برنامج الكاميرا. استخدم هدف 4x لإيجاد الموضع الأوسط للقناة الدقيقة ، أي موضع السيراميك الكهرضغطي.
    2. قم بتوصيل الأسلاك ولحامها بالمحطات الموجبة والسلبية لخرج مولد الإشارة على السيراميك الكهرضغطي ، على التوالي.
    3. ضع المحقنة على مضخة الحقن المجهري وقم بتوصيلها بقسطرة المدخل. ضع حاوية صغيرة في نهاية قسطرة المخرج لإبقاء السائل يتدفق من القناة الدقيقة.
  2. تحديد معلمات القياس
    1. شفط محلول جسيمات البوليسترين باستخدام المحقنة وحقنه في القناة الدقيقة للرقاقة. تجنب فقاعات الهواء في القناة الدقيقة للرقاقة لضمان القياس الدقيق. تأكد من توزيع الجسيمات بالتساوي في القناة الدقيقة للرقاقة.
      ملاحظة: يمكن إجراء القياس بدون تدفق أو مضخة حقنة. إذا لزم الأمر ، يجب ضبط معدل تدفق مضخة الحقن المجهري على قيمة مناسبة. هنا ، نطاق معدل التدفق هو 0-20 ميكرولتر / ساعة.
    2. اضبط خرج مولد الإشارة على إشارة جيبية بتردد 1 ميجاهرتز (3 ميجاهرتز لقياس نواة الخلية) وجهد من الذروة إلى الذروة (Vpp) يبلغ 10 فولت.
    3. اضبط تردد الإشارة بدقة حتى يلاحظ أن الجسيمات تتحرك نحو خط الوسط للقناة الدقيقة وتظل في حركة أمامية على طول خط الوسط بعد الوصول إلى خط الوسط (الشكل 4).
      ملاحظة: يتم تحديد سرعة الجسيمات التي تتحرك نحو خط الوسط من خلال سعة الجهد ، والتي يمكن تعديلها بين 5 فولت لكل بوصة و 20 فولت لكل بوصة.
  3. قياس الخلايا والنوى
    1. امزج خلية 1 مل أو تعليق النواة مع محلول الجسيمات القياسي بنسبة 1: 1 وحقنه في القناة الدقيقة باستخدام حقنة.
    2. ابدأ التسجيل باستخدام كاميرا CCD عندما تدخل الخلايا أو النوى مجال الرؤية. ثم قم بتشغيل مولد الإشارة. توقف عن التسجيل عندما تصل الخلايا أو النوى إلى خط الوسط.
    3. شطف القناة الدقيقة بالماء منزوع الأيونات ، والكحول بنسبة 75٪ ، والماء منزوع الأيونات بالتسلسل للاستخدام لاحقا.

4. معالجة البيانات

  1. تعيين مسارات الجسيمات أو الخلايا.
    1. استيراد الفيديو الذي تم التقاطه إلى برنامج ImageJ: ملف > فتح> تحديد مجلد. انقر على شكل القطع الناقص في شريط أدوات برنامج ImageJ لاختيار خلية ذات أهمية وجسيم مجاور لها (الشكل 5).
    2. كما هو موضح في الشكل 5 ، معلمات القياس المحددة مسبقا في برنامج ImageJ كتحليل → تعيين القياس → المنطقة ، المركز ، تسمية العرض.
    3. أخذ الإطار الذي تخضع فيه الخلية المستهدفة أو الجسيم للإزاحة الطولية كإطار بداية ؛ سجل موضع البكسل وحجم الخلية أو الجسيم في كل إطار حتى يصل إلى خط الوسط للقناة الدقيقة. تصدير البيانات كملف جدول بيانات وكرر الخطوة حتى يتم الحصول على مسارات لجميع الخلايا ذات الاهتمام.
  2. تنسيق التحول والتصحيح.
    1. سجل إحداثيات البيكسل للزوايا الأربع للقناة الدقيقة في مجال الرؤية هذا على النحو التالي (0، y1)، (0، y2)، (x3، y3)، (x4، y4). هنا x3 = x4.
    2. لكل نقطة قياس (xi، yi)، احسب الإحداثي الجديد (xi', yi') بعد تصحيح الدوران باستخدام الصيغ التالية:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
    3. تحويل إحداثيات البكسل إلى إحداثيات بالحجم الحقيقي. يمكن الحصول على الإحداثيات الفعلية عن طريق ضرب إحداثيات البكسل في النسبة. كانت النسبة هي العرض الفعلي للقناة الدقيقة مقسوما على عرض البكسل (H) للقناة المصغرة.
    4. قم بتحويل وتصحيح إحداثيات البكسل للخلايا والجسيمات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1 إلى بيانات مسار الحركة النهائية. جميع الإحداثيات مطروحا منها إحداثيات الزاوية السفلية اليسرى ، أي (0 ، y2). معدل إطارات الفيديو هو 40 إطارا في الثانية ، لذا اضرب عدد الإطارات المقابلة لكل إحداثي في 0.025 s للحصول على وقت حركة الجسيمات ، وبالتالي الحصول على تغيير الموضع في اتجاه y مع مرور الوقت.
  3. احسب كثافة الطاقة الصوتية (الشكل 6A,B).
    1. حركة الخلية أو الجسيم في اتجاه Y مدفوعة بالقوة الصوتية F ac والقوة الهيدروديناميكية FD. احسب مسار الحركة باستخدام الصيغ التالية:
      Equation 4(1)
      Equation 5(2)
      Equation 6(3)
      حيث r و D هما نصف قطر وقطر الخلية أو الجسيم ، ρ و β هما الكثافة والانضغاط ، ν هو متجه السرعة. يشير الحرفان المنخفضان c و f إلى الخلية والسائل ، على التوالي. d هي المسافة من أقرب عقدة ضغط صوتي ، μ هي اللزوجة الديناميكية للسائل ، k هي رقم الموجة ، و E هي كثافة الطاقة الصوتية.
      ملاحظة: كانت كثافة MCF7 و HCT116 و A549 ونوى الخلايا 1068 كجم / م 3 و 1077 كجم / م 3 و 1073 كجم / م 3 و 1155 كجم / م 3 ، على التوالي 12،16،17.
    2. وفقا للصيغ الموضحة في الخطوة 4.3.1 ، استخدم برنامج MATLAB للحصول على الحل العددي لمسار الجسيمات القياسي تحت المجال الصوتي بطريقة الفرق المحدود.
    3. ضمن نطاق المجال الصوتي المحدد مسبقا، قم بتغيير كثافة الطاقة الصوتية وتناسب الحل العددي (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.3.2) ومسار الحركة المقاسة (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.2) للجسيم القياسي. حدد أفضل نتيجة تركيب وفقا لخطأ مربع متوسط التركيب. يتم استخدام كثافة الطاقة الصوتية التي تم الحصول عليها هنا كمعلمة للحساب اللاحق لقابلية انضغاط الخلية.
  4. احسب انضغاط الخلية (الشكل 6C,D).
    1. اضبط كثافة الطاقة الصوتية على القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.3.3.
    2. وفقا للصيغ الموضحة في الخطوة 4.3.1 ، استخدم برنامج MATLAB للحصول على الحل العددي لمسار الخلية تحت المجال الصوتي بطريقة الفرق المحدود.
    3. على غرار الخطوة 4.3.3 ، ضمن نطاق الانضغاط المحدد مسبقا ، قم بتغيير قابلية الانضغاط وتناسب الحل العددي (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.4.2) ومسار الحركة المقاسة للخلية (تم الحصول عليه في الخطوة 4.2). استخدم معامل الانضغاط المقابل لأفضل نتيجة مناسبة كقابلية انضغاط الخلية المقاسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، قدم العمل بروتوكولا لبناء نظام قياس انضغاط الخلايا السريع وغير المدمر على أساس microdevice المائع الصوتي وأظهر مزاياه لقياس الخلية والنواة في ظل مواقف مختلفة. يوضح الشكل 1 مخطط قناة الموائع الدقيقة. يتم عرض مكونات وتجميع الجهاز المجهري المائع بالأوسيتيك في الشكل 2. يوضح الشكل 3 إعداد نظام القياس. تحت تأثير قوة المجال الصوتي، ستتحرك الخلايا والجسيمات نحو خط الوسط للقناة الدقيقة، كما هو موضح في الشكل 4A. يوضح الشكل 5 قياس حجم وموضع الخلايا أو الجسيمات. يوضح الشكل 6 حساب كثافة الطاقة وقابلية انضغاط الخلايا عن طريق التركيب. من أجل توسيع نطاق تطبيق هذا الجهاز على العضيات الخلوية ، وخاصة النواة ، تم عزل النوى عالية النقاء والسليمة من الخلايا (الشكل 7A). من خلال ضبط تردد الرنين للسيراميك الكهرضغطي وعرض القناة الدقيقة وفقا لذلك ، تم الحصول على مسار حركة النواة (الشكل 4B) وتم تحقيق قياس انضغاط النواة (الشكل 7B).

واستنادا إلى هذا النظام، تم قياس ومقارنة انضغاط أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية (الشكل 8 ألف). بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقيق في التغيرات في انضغاط الخلايا بعد EMT الناجم عن الدواء أو تشعيع الأشعة السينية بجرعات مختلفة (الشكل 8B ، C). بالنسبة لتحريض EMT ، تم استخدام عامل النمو مثل تحويل عامل النمو بيتا (TGFβ) ، وعامل نمو البشرة (EGF) ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF). بالنسبة للإشعاع ، كان معدل الجرعة 153 mU / min ، وكانت الجرعات المستخدمة 1 و 2 و 4 و 8 Gy. تظهر هذه النتائج قابلية التطبيق الواسعة لهذه الطريقة كأداة قوية لدراسة العلاقة بين التغيرات الكيميائية الحيوية والخواص الميكانيكية الخلوية. الأهم من ذلك ، كانت هذه الطريقة قياسا غير مدمر. تم جمع الخلايا المقاسة وبذورها في طبق زراعة الخلايا، ووجد أنه لم يكن هناك فرق كبير في تكاثر الخلايا وقابليتها للبقاء مقارنة بالمجموعة غير المعالجة بعد 48 ساعة من الزرع، كما هو موضح في الشكل 9، مما يشير إلى أن القياس ليس له أي تأثير على تكاثر الخلايا وبقائها.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للقناة الدقيقة للرقاقة. توضح هذه الصورة بنية وأبعاد القناة الدقيقة للرقاقة مع مدخل ومخرج واحد. الوحدة مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صورة تجميع للجهاز المجهري الأكوستومليك. (A) الصور الأمامية والخلفية للرقاقة. (ب) تظهر هذه الصورة قسطرة PTFE المدخل مع إبرة توزيع 19 G المرفقة وإبرة الفولاذ المقاوم للصدأ. (ج) تظهر هذه الصورة السيراميك الكهرضغطي مع أسلاك ملحومة. (D) توضح هذه الصورة تجميع الجهاز المجهري الصوتي مع قاعدة للتثبيت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إعداد نظام قياس انضغاط الخلايا. توضح هذه الصورة إعداد نظام القياس الذي يتكون من مولد الإشارة ومضخة المحاقن والجهاز المجهري المائع الصوتي والمجهر وكاميرا CCD. تم تعديل هذا الرقم من10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: حركة الخلايا والنواة. يوضح هذا الشكل حركة الخلايا (A) ونوى الخلايا (B) إلى خط الوسط للقناة الدقيقة تحت تأثير قوة المجال الصوتي. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: قياس حجم وموضع خلية أو جسيم باستخدام برنامج ImageJ. يوضح هذا الشكل نقرة الزر للحصول على معلمات مثل المساحة والمركز في برنامج ImageJ. تم تسجيل إحداثيات البكسل للزوايا الأربع للقناة الدقيقة على النحو التالي (0، y1)، (0، y2)، (x3، y3)، (x4، y4). تم تمثيل عرض البكسل على أنه H. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: حساب كثافة الطاقة وقابلية انضغاط الخلايا عن طريق التركيب. (أ) قيم متوسط الخطأ التربيعي (LS) عند كثافات طاقة مختلفة. تم الحصول على كثافة الطاقة الصوتية من أفضل نتيجة مناسبة. وحدة كثافة الطاقة هي J/m3. (ب) يوضح هذا الشكل ملاءمة الحل العددي ومسار الحركة المقاسة للجسيم. (C) متوسط قيم الخطأ التربيعي (LS) عند انضغاط الخلايا المختلفة. تم الحصول على انضغاط الخلية من أفضل نتيجة مناسبة. (د) يوضح هذا الشكل ملاءمة الحل العددي ومسار الحركة المقاسة للخلية. وحدة انضغاط الخلايا هي 10-10 Pa-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: استخراج النوى وقياس الانضغاط. (أ) توضح هذه الصورة نوى الخلية المستخرجة من خلايا A549 التي ينظر إليها بهدف 40x. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (B) توضح هذه الصورة مقارنة الانضغاط المقاسة لخلايا A549 (N = 38) ونواتها (N = 45). وحدة انضغاط الخلايا هي 10-10 Pa-1. يمثل طول الصندوق الانحراف المعياري. تم استخدام اختبار t للطالب وتحليل chi-square لتقييم الأهمية. ** P < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: انضغاط أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية والخلايا بعد EMT الناجم عن الدواء أو تشعيع الأشعة السينية. (أ) انضغاط الخلايا لأنواع مختلفة من الخلايا السرطانية. HCT116 (N = 36) ، A549 (N = 68) ، و MDA-MB-231 (N = 32) كانت الخطوط الخلوية لسرطان القولون والمستقيم ، والسرطان الغدي الرئوي ، وسرطان الثدي الغدي ، على التوالي. (ب) انضغاط الخلايا ل MCF7 و A549 قبل وبعد تحريض EMT. (ج) قابلية انضغاط الخلايا عند 3 ساعات بعد التشعيع بجرعات مختلفة. وحدة انضغاط الخلايا هي 10-10 Pa-1. تمثل أشرطة النهاية في مخطط الصندوق قيمتي 10٪ و 90٪ ، على التوالي. يمثل طول الصندوق الانحراف المعياري. يمثل الخط الأفقي الأوسط القيمة الوسيطة. ns يعني عدم وجود دلالة إحصائية. تم استخدام اختبار t للطالب وتحليل chi-square لتقييم الأهمية. * P < 0.05 ، ** P < 0.01. تم تعديل جزء من هذا الرقم من18,19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تكاثر الخلايا وقابليتها للبقاء بعد قياس الانضغاط. يوضح هذا الشكل تكاثر الخلايا A549 (A) والجدوى (B) بعد قياس الانضغاط. المجموعات الضابطة هي خلايا غير معالجة. مجموعات الاختبار هي الخلايا التي تنمو لمدة 48 ساعة بعد قياس الانضغاط. تحتوي كل تجربة على ثلاث نسخ متماثلة على الأقل. من أجل بقاء الخلايا ، تم حساب 300 خلية على الأقل. تم استخدام اختبار t للطالب وتحليل chi-square لتقييم الأهمية. يشير ns إلى عدم وجود دلالة إحصائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طرق قياس ميكانيكا الخلايا شائعة الاستخدام هي AFM ، وشفط الماصة الدقيقة ، وطرق الموائع الدقيقة ، وتقنية اللوحة المتوازية ، والملقط البصري ، والنقالة البصرية ، والطرق الصوتية20. يمكن أن تعمل طرق الموائع الدقيقة مع ثلاثة طرق: الانقباض الجزئي ، والتدفق الممتد ، وتدفق القص. من بينها ، نقالة بصرية ، ملاقط بصرية ، طرق صوتية ، تدفق امتدائي ، ونهج تدفق القص هي قياسات غير تلامسية. على النقيض من قياسات الاتصال ، يمكن للقياسات غير التلامسية تجنب مشكلة تلف الخلايا الناجمة عن التلامس أو التشوه المحلي بشكل فعال. الملقط البصري حساس جدا لبيئة القياس21. يمكن أن تسبب الاضطرابات في الظروف البصرية اختلافات كبيرة في نتائج القياس، وقد تتسبب طاقة الليزر العالية أثناء القياس أيضا في تلف الخلايا. إلى جانب ذلك ، فإن النقالات البصرية والملقط البصري عموما ذات إنتاجية منخفضة20,22. لا يمكن لطرق الموائع الدقيقة مثل التدفق الممتد وتدفق القص قياس الميكانيكا الدقيقة للخلايا السرطانية مباشرة23. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، تتمتع الطرق الصوتية بمزايا غير مدمرة وعالية الإنتاجية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع في قياس ميكانيكا الخلايا.

تستخدم طريقة القياس القائمة على الأجهزة الدقيقة المائعة الصوتية المصممة في هذه الورقة قوة الإشعاع الصوتي غير الملامسة ، وأكبر فائدة هي أنها لا تتلف الخلايا ، وهو ما أكدته النتائج التجريبية الموضحة هنا (الشكل 9). ميزة أخرى لهذه الطريقة هي الإنتاجية العالية ، والتي يمكن تعديلها عن طريق تغيير تركيز الخلية. حاليا ، يمكن تحقيق سرعة قياس تبلغ حوالي 50-70 خلية / دقيقة على فرضية ضمان دقة تحليل البيانات اللاحق. نظرا لأن الخلايا تقاس في تعليق ، يمكن أيضا تحقيق قياس الخلايا غير الملتصقة ، مما يوسع نطاق تطبيقها. علاوة على ذلك ، تم تحقيق قياس انضغاط الخلايا بعد التشعيع في هذه الورقة ، وتم الكشف عن العلاقة بين انضغاط الخلايا وجرعة التشعيع (الشكل 8). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تكييف قياس الخلايا أو النواة ذات الصلابة المختلفة عن طريق ضبط تردد الرنين للسيراميك الكهرضغطي وعرض القناة الدقيقة. كما هو موضح في الشكل 7 ، تم تحقيق قياس قابلية انضغاط النواة.

هنا ، تم النظر فقط في حركة الخلايا على طول وعرض قناة الموائع الدقيقة. واعتبرت الخلايا معلقة لأن كثافة الخلايا قريبة من كثافة السائل. إذا كان هناك استيطان للخلية أو احتكاك مع القاع ، العثور عليه في عملية تركيب المسار اللاحقة. سيتم القضاء على هذه البيانات. من أجل التحقق من صحة الطريقة المقترحة ، تم اختبار نوعين من حبات البوليسترين بقطر مختلف (6 ميكرومتر و 10 ميكرومتر). تم استخدام الخرز الذي يبلغ قطره 6 ميكرومتر كنترول. تم الحصول على انضغاط الخرز بقطر 10 ميكرومتر على أنه 2.37 ± 0.11 × 10-10 Pa-1 ، بما يتفق مع القيمة (2.1-2.4 × 10-10 Pa-1) المبلغ عنها في بحث آخر 15,24.

بناء على هذه الطريقة ، تم قياس انضغاط الخلايا والنواة. وبما أن النواة تلعب دورا هاما في الاستشعار الميكانيكي والنقل الميكانيكي، فإن قياس الخواص الميكانيكية للنواة يمكن أن يساعد على فهم أفضل لكيفية استجابتها للمحفزات الخارجية مثل تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع المؤين (الشكل 8). علاوة على ذلك ، أظهرت التجارب أن انضغاط الخلايا يمكن أن يكون بمثابة مؤشر جديد لمراقبة عملية EMT (الشكل 8) ، مما يدل على آفاق تطبيقها في تشخيص السرطان. نظرا لأن قوة الإشعاع الصوتي مرتبطة بحجم الخلية وكثافة الخلية وقابليتها للانضغاط ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لعزل الخلايا مثل فصل الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) أو مجموعاتها من عينة الدم. تلعب CTCs ومجموعاتها دورا مهما في الكشف المبكر عن الأورام النقيلية ومراقبة فعالية العلاج الإشعاعي25,26. لذلك ، فإن هذه الطريقة لديها آفاق تطبيق سريرية كبيرة في الفحص المبكر للسرطان وتقييم الفعالية.

تجدر الإشارة إلى أن العامل الرئيسي الذي يؤثر على قياس هذه الطريقة هو مطابقة تردد الرنين مع عرض القناة الدقيقة ، مما يؤدي إلى ظهور عقدة موجة دائمة عند خط منتصف القناة الدقيقة. في الوقت نفسه ، ينبغي إيلاء الاهتمام للصق السيراميك الكهرضغطي. إلى جانب ذلك ، من أجل تحديد وتتبع مسار الخلايا أو الجسيمات بدقة وتجنب مشكلة تراكم الخلايا بسبب الالتصاق ، يجب ألا تكون الإنتاجية عالية جدا. كيف تؤثر التغيرات في المعلمات الأخرى (مثل حجم الخلية ، وكثافة الخلية ، وما إلى ذلك) على قياس قابلية الانضغاط وقد تمت دراستها في العمل السابق18. علاوة على ذلك ، عند قياس نوى الخلايا ، نظرا لنعومتها ، هناك حاجة إلى قوة دافعة كبيرة للإشعاع الصوتي لجعلها تتحرك بسلاسة إلى خط الوسط للقناة الدقيقة ، مما يتطلب كاميرا سريعة لالتقاط المسارات بدقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 12075330 و U1932165) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، الصين (رقم المنحة 2020A1515010270).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  2. Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
  3. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
  4. Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
  5. Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
  6. Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
  7. Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  8. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  9. Jung, J. -W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
  10. Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
  11. Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
  12. Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
  13. Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
  14. Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
  15. Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
  16. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  17. Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
  18. Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
  19. Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
  20. Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
  21. Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
  22. Wei, M. -T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
  23. Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
  24. Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
  25. Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
  26. Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 185،
قياس انضغاط الخلية والنواة على أساس المجهر الصوتي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu,… More

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter