Summary
Hier wordt een gedetailleerd immunohistochemisch protocol gepresenteerd om functioneel relevante caspasen in complexe weefsels te identificeren, valideren en targeten.
Abstract
Van de familie van caspasen is bekend dat ze vele cellulaire routes bemiddelen voorbij celdood, waaronder celdifferentiatie, axonale pathfinding en proliferatie. Sinds de identificatie van de familie van celdoodproteasen is er gezocht naar hulpmiddelen om de functie van specifieke familieleden in ontwikkelings-, gezondheids- en ziektetoestanden te identificeren en uit te breiden. Veel van de momenteel in de handel verkrijgbare caspase-tools die veel worden gebruikt, zijn echter niet specifiek voor de beoogde caspase. In dit rapport schetsen we de aanpak die we hebben gebruikt om caspase-9 in het zenuwstelsel te identificeren, valideren en targeten met behulp van een nieuwe remmer en genetische benaderingen met immunohistochemische uitlezingen. Specifiek gebruikten we het retinale neuronale weefsel als een model om de aanwezigheid en functie van caspasen te identificeren en te valideren. Deze benadering maakt het mogelijk om celtypespecifieke apoptotische en niet-apoptotische caspase-9-functies te ondervragen en kan worden toegepast op andere complexe weefsels en caspasen van belang. Het begrijpen van de functies van caspasen kan helpen om de huidige kennis in celbiologie uit te breiden, en kan ook voordelig zijn om potentiële therapeutische doelen te identificeren vanwege hun betrokkenheid bij ziekte.
Introduction
De caspasen zijn een familie van proteasen die ontwikkelingsceldood, immuunresponsen en afwijkende celdood bij ziekte 1,2 reguleren. Hoewel het bekend is dat leden van de caspase-familie worden geïnduceerd in een verscheidenheid aan neurodegeneratieve ziekten, is het moeilijker om te begrijpen welke caspase de ziektepathologie aandrijft3. Dergelijke studies vereisen hulpmiddelen om de functie van individuele caspase-familieleden te identificeren, te karakteriseren en te valideren. Het ontleden van de relevante individuele caspasen is belangrijk, zowel vanuit een mechanistisch als een therapeutisch standpunt, omdat de literatuur meerdere studies bevat die bewijs leveren voor de verschillende rollen van caspasen 4,5. Dus als het doel is om een caspase in een ziekte te richten voor een therapeutisch voordeel, is het van cruciaal belang om specifieke targeting van het relevante familielid (en) te hebben. Traditionele technieken om caspaseniveaus in weefsel te detecteren omvatten western blotting en enzymatische en fluorometrische benaderingen 3,6. Geen van deze maatregelen maakt echter celspecifieke detectie van caspaseniveaus mogelijk en in sommige scenario's kunnen gesplitste caspasen vaak niet worden gedetecteerd door traditionele eiwitanalysemaatregelen. Het is bekend dat caspasen verschillende apoptotische en niet-apoptotische rollen kunnen spelen in hetzelfde weefsel7, daarom is een zorgvuldige karakterisering van celspecifieke caspaseniveaus nodig voor een nauwkeurig begrip van ontwikkelings- en ziekteroutes.
Deze studie toont caspase activatie en functie in een model van neurovasculaire hypoxie-ischemie - retinale ader occlusie (RVO)7,8. In een complex weefsel zoals het netvlies zijn er meerdere celtypen die kunnen worden beïnvloed door de hypoxie-ischemie geïnduceerd in RVO, waaronder gliacellen, neuronen en vasculatuur7. In het netvlies van de volwassen muis is er zeer weinig expressie van caspasen zichtbaar in gezond weefsel, zoals gemeten door immunohistochemie (IHC)7, maar dat is niet het geval tijdens ontwikkeling9 of in modellen van retinale ziekte10,11. IHC is een techniek die goed is ingeburgerd in biomedisch onderzoek en heeft validatie van ziekte en pathologische doelen, identificatie van nieuwe rollen door ruimtelijke lokalisatie en kwantificering van eiwitten mogelijk gemaakt. In gevallen waarin gesplitste caspaseproducten niet kunnen worden gedetecteerd door western blot of fluorometrische analyse, noch de specifieke cellocatie van verschillende caspasen of ondervraging van caspase-signaleringsroutes door lokalisatie, moet IHC worden gebruikt.
Om de caspase(s) functioneel relevant in RVO te bepalen, werd IHC gebruikt met gevalideerde antilichamen voor caspasen en cellulaire markers. De eerdere studies uitgevoerd in het laboratorium toonden aan dat caspase-9 snel werd geactiveerd in een model van ischemische beroerte en remming van caspase-9 met een zeer specifieke remmer beschermd tegen neuronale disfunctie en overlijden12. Omdat het netvlies deel uitmaakt van het centrale zenuwstelsel (CZS), dient het als een modelsysteem om de rol van caspase-9 bij neurovasculaire verwondingen te onderzoeken en verder te onderzoeken13. Hiertoe werd het muismodel van RVO gebruikt om de celspecifieke locatie en distributie van caspase-9 en de implicatie ervan in neurovasculair letsel te bestuderen. RVO is een veel voorkomende oorzaak van blindheid bij werkende volwassenen die het gevolg is van vaatletsel14. Het bleek dat caspase-9 op een niet-apoptotische manier tot expressie kwam in endotheelcellen, maar niet in neuronen.
Als weefsel heeft het netvlies het voordeel dat het wordt gevisualiseerd als een flatmount, die waardering van de vasculaire netwerken mogelijk maakt, of als doorsneden, die de neuronale retinale lagen benadrukken. Kwantificering van caspase-eiwitexpressie in doorsneden biedt context, met betrekking tot welke caspase potentieel kritisch is in retinale neuronale connectiviteit en visiefunctie door de lokalisatie van de caspase (s) in het netvlies te identificeren. Na identificatie en validatie wordt targeting van de caspase van belang bereikt met behulp van induceerbare celspecifieke deletie van de geïdentificeerde caspase. Voor mogelijke therapeutische onderzoeken werd de relevantie van de caspasen van belang getest met behulp van specifieke hulpmiddelen om de geactiveerde caspase te remmen. Voor caspase-9 werd een celpermeant zeer selectieve remmer 7,15, Pen1-XBIR3 gebruikt. Voor dit rapport werden 2 maanden oude, mannelijke C57BL/6J stam en tamoxifen-induceerbare endotheel caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stam met een C57BL/6J achtergrond gebruikt. Deze dieren werden blootgesteld aan het muismodel van RVO en C57BL/6J werden behandeld met de caspase-9 selectieve remmer, Pen1-XBir3. De beschreven methodologie kan worden toegepast op andere ziektemodellen in het centrale en perifere systeem 7,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Knaagdierexperimenten werden goedgekeurd en gecontroleerd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Columbia University.
1. Voorbereiding van netvliesweefsel en cryosectie
- Euthanaseer de dieren door toediening van intraperitoneale anesthesie (ketamine (ketamine (80-100 mg / kg) en xylazine (5-10 mg / kg)) en perfuseer de muizen onderworpen aan RVO (zie8 voor details) met 4% paraformaldehyde (PFA) met behulp van een peristaltische pomp.
OPMERKING: Knijp het dier toe om de diepte van de anesthesie te bevestigen voordat u doorgaat met euthanasie en perfusie. Details over perfusie zijn te vinden in16. - Oogst de ogen door zorgvuldige enucleatie met behulp van een tang en plaats de bol in 1 ml van 4% PFA. Laat de ogen een nacht bij 4 °C. Was de ogen drie keer gedurende 10 minuten, voeg 1 ml 1x PBS toe en plaats ze in de shaker.
- Dompel de ogen gedurende 3 dagen onder in 1 ml 30% sucrose, totdat ze op de bodem van de buis bezinken, wat wijst op absorptie van de sucrose.
- Vul de ogen met een optimale snijtemperatuurverbinding met behulp van een spuit van 30 G, totdat het oog een afgerond uiterlijk heeft (ongeveer 50 μL).
- Integreer de ogen in een cryomold met optimale snijtemperatuurverbinding totdat de ogen bedekt zijn en vries in bij -80 °C totdat ze klaar zijn voor cryosectie.
- Sectie ingebed de ogen op 20 μm op glazen dia's met behulp van een cryostaat.
- Verwijder het optimale snijtemperatuur compound blok uit de cryomold.
- Plaats het op de cryostat-klauwplaat door een optimale snijtemperatuurverbinding toe te voegen en het blok op de klauwplaat te plaatsen. Laat het in de cryostaat totdat het bevriest.
- Ga verder met het snijden van het blok op 20 μm totdat het netvliesweefsel wordt gezien.
OPMERKING: Dit kan worden bevestigd met een lichtmicroscoop bij 30x vergroting (3x objectief, 10x oculairs). Weefsels kunnen worden onderscheiden van de OCT-media door kleur en vorm. - Verzamel het netvliesweefsel in microscoopglaasjes in een reeks van vier secties per dia.
OPMERKING: Zie figuur 1A voor voorgestelde plaatsing van retinale secties.
- Label de dia's met een ID die de behandeling en het genotype de-identificeert.
- Bewaar de dia's bij -20 °C tot ze vlekken hebben.
2. Immunohistochemie
OPMERKING: Gebruik vast gecryopreserveerd weefsel voor immunohistochemie om de celmorfologie te behouden. Kies secties die zich op het niveau bevinden van de optische coherentietomografie (OCT) beelden verkregen in vivo7. Gebruik de eerste twee reeks dia's verzameld uit de cryostaat of secties van 150 μm in het netvliesweefsel.
- Plaats de dia's in een donkere en vochtige schuifkamer.
- Permeabilisatie en blokkering: Was de retinale doorsneden met 300 μL 1x PBS gedurende 5 minuten om de OCT te verwijderen en daarna weg te gooien.
- Permeabiliseer het weefsel door 300 μL 1x PBS toe te voegen met 0,1% Triton X-100 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) en daarna weg te gooien.
- Blokkeer het weefsel door toevoeging van 300 μL blokkeringsbuffer (10% Normal Goat Serum (NGS), 1% Bovine Serum Albumin (BSA) in 1x PBS, gefilterd) en laat een nacht bij 4 °C.
- Primaire antilichamen: Verdun primaire antilichamen in blokkerende buffer. Primaire antilichamen die worden gebruikt, zijn anti-cl-caspase-9 om 1:800, anti-CD31 om 1:50 en anti-caspase-7-488 (direct gelabeld antilichaam) om 1:150.
OPMERKING: Volg de aanbeveling van de fabrikant voor de juiste verdunning van primaire antilichamen.- Giet de blokkerende buffer van de secties en breng 100 μL van de primaire antilichaamcocktail aan op de retinale dia's.
- Incubeer de doorsneden 's nachts bij 4 °C.
- Was de secties vier keer gedurende 5 minuten met 300 μL 1x PBS.
OPMERKING: Als de weefselsecties erg kwetsbaar zijn, moeten wasbeurten worden verwijderd met behulp van capillaire werking door een weefsel op de hoek van de dia aan te brengen om te voorkomen dat de retinale secties worden verplaatst. - Om kruisetikettering van primaire antilichamen die bij dezelfde gastheersoort zijn opgebracht te voorkomen, voltooit u de kleuring met secundaire antilichamen voordat u de direct gelabelde antilichamen aanbrengt.
- Secundaire antilichamen: Verdun de secundaire antilichamen in blokkerende buffer in een concentratie van 0,1%. Om bijvoorbeeld anti-cl-caspase-9 te detecteren, een antilichaam dat bij konijnen is grootgebracht, gebruikt u geit-anti-konijn-568 secundair.
- Breng 200 μL van de secundaire antilichaamcocktail aan op het netvlies.
- Incubeer het weefsel gedurende 2 uur bij RT.
- Was de secties vier keer gedurende 5 minuten met 300 μL 1x PBS.
- Kleur de kernen gedurende 5 minuten met 300 μL DAPI bij een verdunning van 0,02%.
- Was eenmaal gedurende 5 min met 300 μL 1x PBS.
- Plaats een coverslip op de retinale secties met behulp van 500 μL fluoromount-G-media, die het fluorescerende signaal behouden, en plaats de coverslip voorzichtig op de bovenkant van de dia, waardoor bellen worden vermeden.
3. Confocale beeldvorming
- Verkrijg afbeeldingen van de gekleurde secties met confocale microscopie.
- Zet de confocale microscoop aan.
- Plaats de dia op het podium.
- Pas de focus aan om het retinale gedeelte duidelijk te zien.
OPMERKING: Maak ten minste vier afbeeldingen per sectie en afbeelding vier secties per netvlies. Zie het Retinale beeldvormingsschema voor voorgestelde beeldvormende gebieden (figuur 1B, C).
- Beeld caspase, vasculaire en nucleaire kleuring met behulp van een confocale microscoop met Z-stack acquisitie, met behulp van een 20x of 40x objectief.
OPMERKING: De beeldparameters en software-instellingen moeten constant zijn voor alle beeldvorming in een experiment. Het 20x-objectief geeft een overzicht van de retinale lagen, die goed worden gedefinieerd door de nucleaire kleuring. Het 40x-objectief biedt meer cellulaire details.- Stel de juiste belichtings- en laserintensiteitstijden per kanaal in door op instellingen voor verkrijgen te klikken.
- Stel de Z-stack in om de hele sectie te visualiseren door op Z-serie te klikken en stel parameters in om de diepte van het weefsel te bedekken.
- Sla de afbeeldingen op na de gemaskeerde ID die is toegewezen tijdens cryosectie.
4. Kwantificering van caspasegehalten
- Sleep afbeeldingsbestanden van 405, 470, 555 en 640 kanalen naar de fiji-console.
- Klik op Afbeelding > Kleur > kanalen samenvoegen.
- Wijs als volgt kleuren toe aan de bestanden: rood tot 555, groen tot 470, grijs tot 405, cyaan tot 640.
- Comprimeer de Z-stack door op Afbeelding > Stack > Z Project te klikken.
- Klik op Projectietype: Maximale intensiteit.
- Open de kanaleninterface door te klikken op Afbeelding > gereedschap Kleurkanalen.
- Open de interface Helderheid en contrast .
- Selecteer parameters per kanaal.
- Ga naar Kanalen en selecteer één kanaal.
- Plaats de cursor op de top van de caspase-expressiecel en annoteer de pixelwaarde.
- Plaats de cursor op de achtergrond en annoteer de pixelwaarde.
- Testparameters
- Ga naar de interface Helderheid en contrast.
- Klik op Selecteren.
- Sluit de minimaal weergegeven waarde (geannoteerde pixelwaarde van de caspase-tot expressie gebrachte cel) aan.
- Sluit de maximale weergegeven waarde (geannoteerde pixelwaarde van de achtergrond) aan.
- Klik op OK.
- Herhaal stap 4.8-4.9 voor alle kanalen.
- Test de parameters door willekeurige afbeeldingen te kiezen uit geblindeerd weefsel.
OPMERKING: Bewerk helderheids- en contrastparameters alleen als de achtergrondwaarde niet geschikt is voor andere afbeeldingen. - Zodra de parameters zijn ingesteld, opent u de afbeeldingsbestanden en comprimeert u de Z-stack.
- Voeg de helderheids- en contrastparameters toe voor het caspasekanaal en het isolectine, vasculaire markerkanaal.
- Gebruik het puntgereedschap om het aantal vasculaire positieve gebieden te kwantificeren met behulp van colocalisatie van de vasculaire marker met caspase-expressie als de uitlezing van positieve gebieden.
- Herhaal stap 4.14, maar gebruik Hoechst als marker van neuronale positieve gebieden.
- Annoteer de waarden in een spreadsheet per afbeelding.
- Gemiddelde van de waarden per sectie.
- Gemiddelde van de sectiewaarden - dit is de uitlezing per oog.
5. Genetische bevestiging van de relevantie van de endotheelcel caspase-9
- Gebruik netvliezen verkregen van de Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 muizen die werden onderworpen aan RVO7.
- Immunostain de netvliezen voor caspase-9 (de verwijderde caspase), caspase-7 (een down-stream effector caspase), vasculaire markers en DAPI zoals hierboven beschreven in rubriek 2.
- Afbeelding en kwantificering zoals hierboven beschreven in secties 3 en 4.
6. Caspase-9 aanpakken in RVO
- Verkrijg ogen van de muizen die aan RVO zijn onderworpen, gevolgd door het topisch aanbrengen van de caspase-9-remmer Pen1-XBir3 op de ogen zoals in7.
- Immunostain de netvliezen voor caspase-7 (een down-stream effector caspase), vasculaire markers en DAPI zoals hierboven beschreven in rubriek 2.
- Afbeelding en kwantificering zoals hierboven beschreven in secties 3 en 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschreven protocol stelt de gebruiker in staat om caspase-9-niveaus in het netvliesweefsel te analyseren en te kwantificeren. Daarnaast presenteert het tools om caspase-9 en downstream substraten verder te identificeren, valideren en specifiek te targeten. De samengevatte stappen maken kwantificeerbare analyse van caspaseniveaus en cellulaire specificiteit in fluorescerende fotomicrografieën mogelijk. Alle cijfers tonen representatieve fotomicrografieën en kwantificering van de aangegeven caspaseniveaus in het totale netvlies, endotheelcellen en neuronen in ongewonde en 1-daagse P-RVO retina-doorsneden. De retinale doorsnede maakt visualisatie mogelijk van retinale kernen in de retinale ganglionlaag (RGL), de binnenste nucleaire laag (INL) en de buitenste nucleaire laag (ONL) wanneer gekleurd met Hoechst. Bovendien zijn retinale bloedvaten zichtbaar in de retinale plexiforme lagen of tussen de RGL en INL, en tussen de INL en ONL. Vanwege de histologische aard van bloedvaten, wanneer het netvlies wordt doorsneden, zullen bloedvaten verschijnen als losgekoppeld en gescheiden, waardoor de plexiforme lagen worden geleverd. Figuur 2 identificeert caspase-9 als sterk gereguleerde 1-daagse P-RVO. Figuur 3 valideert de functionele relevantie van endotheel caspase-9 door gebruik te maken van induceerbare endotheelcel knock-out muizen. Figuur 4 laat zien dat targeting van actief caspase-9 farmacologisch de inductie van een downstream target van caspase-9-caspase-7 blokkeert. Het protocol identificeert de cellulaire lokalisatie van de caspasen en de neuronale retinale lagen waarin de caspasen tot expressie komen.
Figuur 1: Retinaal beeldvormingsschema. (A) Aanbevolen plaatsing van retinale secties in de microscoopglaas. (B) Overzicht van de beeldvormende gebieden in het netvlies. (C) Weergave van retinale weergave bij 20x objectief. Retinale lagen: RGL = retinale ganglionlaag, INL = binnenste nucleaire laag, ONL = buitenste nucleaire laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: RVO induceert caspase-9 in endotheelcellen en neuronen. (A) Representatieve retinale doorsneden van ongewonde en 1-daagse P-RVO gekleurd met cl-caspase-9 1:800 (groen), isolectine 1:200 (rood) en DAPI (wit). (B) Kwantificering van het aantal neuronen met cl-caspase-9 (zie Materiaaltabel voor details over de antilichamen). (C) Kwantificering van het aantal endotheelcellen met cl-caspase-9. (D) Totaal aantal cellen dat cl-caspase-9 tot expressie brengt. Ongedeerd, n = 6; 1-daagse P-RVO, n = 5. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM; One-way ANOVA, Fisher's LSD-test. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Endotheelceldeletie van endotheel caspase-9 blokkeert RVO-inductie van caspase-7. (A) Representatieve retinale doorsneden van iEC Casp9WT en iEC Casp9KO nestmate muizen 1-daagse P-RVO gekleurd met caspase-7 (groen), cl-caspase-9 (blauw), CD31, een vasculaire marker (rood) en DAPI (wit). (B) Kwantificering van het aantal cellen in het binnenste netvlies met cl-caspase-9 en met caspase-7. (C) Kwantificering van het aantal endotheelcellen met cl-caspase-9 en met caspase-7. (D) Totaal aantal cellen dat cl-caspase-9 of caspase-7 tot expressie brengt. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM; One-way ANOVA, Fisher's LSD-test. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Remming van caspase-9-activiteit remt caspase-7-expressie P-RVO. (A) Representatieve retinale doorsneden van ongewonde en 1-daagse P-RVO behandeld of onbehandeld met Pen1-XBIR3 gekleurd met caspase-7 (groen), isolectine (rood) en DAPI (wit). (B) Kwantificering van het aantal endotheelcellen met caspase-7. C) Kwantificering van het aantal leukocyten met caspase-7. (D) Kwantificering van het aantal neuronen per neuronale laag met caspase-7. (E) Totaal aantal cellen dat caspase-7 tot expressie brengt. Ongedeerde Pen1 Zoutoplossing, n = 6; ongedeerd Pen1-XBIR3, n = 5; 1-daagse P-RVO Pen1 Zoutoplossing, n = 5; 1-daagse P-RVO Pen1-XBIR3, n = 3. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM; One-way ANOVA, Fisher's LSD-test. Afkortingen: RGL = retinale ganglionlaag, INL = binnenste kernlaag en ONL = buitenste kernlaag. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Caspasen zijn een meergedelige familie van proteasen die het best bestudeerd kunnen worden voor hun rol bij celdood en ontsteking; meer recent zijn echter verschillende niet-doodsfuncties ontdekt voor sommige familieleden 4,5. Veel van ons begrip van de caspase-functie is afgeleid van werk in celkweek en van inferentiële gegevens van menselijke ziekten. Hoewel het wordt gewaardeerd dat er afwijkende inductie, activering of inactivatie van caspasen bij ziekte is, is het een uitdaging geweest om functioneel te bepalen of de caspasen de pathologie van de ziekte veroorzaken. Veel hulpmiddelen die worden gebruikt om specifieke caspasen te beoordelen, detecteren meerdere familieleden, waardoor de functionele relevantie van gegevens die met deze reagentia zijn verkregen, wordt ondermijnd17. Hier bieden we een protocol om caspasen in complex weefsel te bestuderen, met het netvlies als voorbeeld. In het zenuwstelsel is caspase-expressie pre- en postnataal gereguleerd. Dit maakt het gebruik van specifieke antilichamen mogelijk om veranderingen in caspaseniveaus in een ziektemodel te testen.
Hoewel de focus van het protocol ligt op beeldverwerking en -analyse, is het succes van de techniek ook afhankelijk van zorgvuldige weefselvoorbereiding, evenals IHC en microscopische beeldvorming om consistentie, validiteit en betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen. Er moet voor worden gezorgd dat dezelfde parameters worden gebruikt om een volledige dataset in beeld te brengen. Afbeeldingen van slechte kwaliteit, een laag contrast en een wazige focus leveren geen betrouwbare gegevens op. Bij het doorsnijden en afbeelden van P-RVO-gebieden van het netvlies moeten tranen en vouwen worden vermeden, omdat deze gebieden kunnen resulteren in artefacten. Gebieden met directe schade moeten ook worden vermeden. De onderzoeker die de beeldvorming uitvoert, moet blind zijn voor de behandeling van het weefsel. Voor analyse wordt aanbevolen dat twee onafhankelijke waarnemers, geblindeerd voor de behandelingsgroep, de analyse uitvoeren. Bovendien mogen primaire muizenantistoffen niet worden gebruikt in muisletselmodellen, omdat de secundaire antilichamen niet-specifiek aan de vasculatuur binden. Een alternatief is om direct geconjugeerde primaire antilichamen te gebruiken.
Een alternatieve benadering van celtelling is kwantificering van het percentage van het expressiegebied. Dit kan worden gebruikt wanneer celtelling niet mogelijk is (bijvoorbeeld als caspase-expressie is gelokaliseerd in neuronale processen of fotoreceptorsegmenten). Centraal en perifeer netvlies worden differentieel beïnvloed in verschillende verwondingsmodellen. De methode kan worden aangepast om specifiek verschillende retinale regio's te analyseren. Als BRVO wordt uitgevoerd, moeten secties worden geselecteerd uit het gewonde deel van het oog. Het protocol voorziet ook in kleuring van verschillende celmarkers om te identificeren waar de caspase tot expressie komt.
Beperkingen van de methode zijn onder meer dat het geen onderscheid maakt tussen hoge en lage niveaus van caspase-signaal in een bepaalde cel. Bovendien is het gebruik van een nucleaire kleuring om neuronale lagen te identificeren handig, maar geeft het niet definitief neuronale expressie aan (glia en leukocyten zijn ook in deze lagen aanwezig). Aanvullende neuronale markers kunnen worden gebruikt om neuronale expressie te valideren. Er zijn ook verschillende antilichamen beschikbaar om caspase-expressie te evalueren; deze zijn het best gedefinieerd voor humaan caspase-9, waar er antilichamen zijn voor caspase-9 over de volledige lengte/gesplitste (cl), autocleaved caspase-9 en caspase-3-splitaved caspase-9.
De gemiddelde intensiteit van het IHC-signaal wordt vaak gerapporteerd als een kwantificeringsmethode. Achtergrondgeluid of autofluoresentie van rode bloedcellen kan echter onnauwkeurige resultaten opleveren. Celspecifieke kwantificering maakt bepaling en discriminatie van achtergrond, niet-specifieke kleuring en autofluoresentie mogelijk.
Dit protocol kan worden gebruikt om weefselbrede veranderingen in de expressie van individuele caspasen, veranderingen in expressie in een specifiek celtype, zoals een endotheelcel, en veranderingen in specifieke celtypen op specifieke locaties, zoals neuronen in verschillende retinale lagen, te meten. Deze flexibiliteit stelt de experimentator in staat om na te gaan hoe de ziektetoestand individuele caspase-niveaus verandert. Bestaande / alternatieve methoden gebruiken western blotting-analyse voor semikwantificatieve vergelijking van caspase-signalering, hoewel methoden niet de duidelijke scheiding van cellulaire lokalisatie bieden die dit protocol doet. Met name in figuur 3D is caspase-9-remming effectiever in het verminderen van neuronale caspase-9 in de INL en ONL, vergeleken met de RGL. Dit soort oplossingen is een uitdaging om met andere methoden te bereiken. Bovendien, wanneer een heel weefsel biochemisch wordt geanalyseerd, kunnen de niveaus van caspasen die veranderen te laag zijn om op te pikken, omdat er veel verschillende celtypen in een complex weefsel zijn.
De antilichamen, die door de gebruiker moeten worden gevalideerd, bieden specificiteit voor de onderzochte caspase. Caspasen kunnen werken in cascades (d.w.z. initiator activerende effector en vervolgens leiden tot uitkomst - dood, ontsteking, celsignalering). Dit protocol kan worden gebruikt in monsters die op verschillende tijdstippen na de schade zijn verzameld; in de hier gepresenteerde voorbeelden worden monsters verzameld op verschillende tijdstippen na RVO. In eerder gepubliceerd werk is gebleken dat caspase-9 binnen 1 uur na RVO7 was verhoogd, wat leidde tot verdere validatie- en targetingstudies. Na het identificeren van endotheel caspase-9 als een potentiële aanjager van RVO-pathologie, werd een muis met induceerbare endotheelcel caspase-9KO gebruikt om endotheel caspase-9 te valideren. Het gebruik van induceerbare celspecifieke caspase KO-muizen biedt een ander niveau van specificiteit en vermijdt de ontwikkelingsdood die wordt gezien met constitutieve caspase-9KO18. Het vermijdt ook compenserende veranderingen bij andere familieleden waarvan is aangetoond dat ze optreden bij constitutieve caspase KO-muizen19. Bovendien maakt het gebruik van celspecifieke induceerbare caspase KO-muizen de identificatie mogelijk van het celtype waarin de caspase de pathologie in het weefsel reguleert. Het protocol biedt ook de stappen om de werkzaamheid van een therapeutische aanpak, gericht op actieve caspase-9 in RVO, te onderzoeken. Deze aanpak kan ook worden toegepast op andere weefsels, waaronder de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren de volgende concurrerende belangen: C.M.T. heeft de volgende octrooiaanvragen US20200164026, US20190142915 en US20150165061. C.M.T. en S.S. hebben een patentaanvraag US 20140024597. C.M.T., A.M.P. en M.I.A. hebben een patentaanvraag US2020058683. C.M.T. en Y.Y.J. hebben een octrooiaanvraag WO2018013519. M.I.A en C.M.T worden vermeld als uitvinders op een patentaanvraag WO / 2020 / 223212 door de trustees van Columbia University in de stad New York. De overige auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) subsidie DGE - 1644869 en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) van de National Institutes of Health (NIH), awardnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (aan CKCO), het National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (aan AMP), het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 naar CMT) en het Department of Defense Army/Air Force (DURIP naar CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
