Användning av in vivo-avbildning för att screena för morfogenesfenotyper i Candida albicans mutanta stammar under aktiv infektion hos en däggdjursvärd

Summary

Detta manuskript beskriver en metod för screening av måttligt stora Candida albicans mutantbibliotek för morfogenesfenotyper under aktiv infektion hos en däggdjursvärd med hjälp av icke-invasiv konfokalmikroskopi.

Abstract

Candida albicans är en viktig mänsklig patogen. Dess förmåga att växla mellan morfologiska former är central för dess patogenes; Dessa morfologiska förändringar regleras av ett komplext signalnätverk som styrs som svar på miljöstimuli. Dessa regulatoriska komponenter har studerats mycket, men nästan alla studier använder en mängd olika in vitro-stimuli för att utlösa filamentation. För att bestämma hur morfogenesen regleras under patogenesprocessen utvecklade vi ett in vivo-mikroskopisystem för att få bilder med hög rumslig upplösning av organismer som genomgår hyphalbildning inom däggdjursvärden. Protokollet som presenteras här beskriver användningen av detta system för att screena små samlingar av C. albicans mutantstammar, så att vi kan identifiera viktiga regulatorer för morfogenes som det inträffar på infektionsstället. Representativa resultat presenteras, vilket visar att vissa regulatorer för morfogenes, såsom transkriptionsregulatorn Efg1, har konsekventa fenotyper in vitro och in vivo, medan andra regulatorer, såsom adenylcyklas (Cyr1), har signifikant olika fenotyper in vivo jämfört med in vitro.

Introduction

Candida albicans är en vanlig mänsklig svamppatogen som orsakar mukokutan sjukdom, spridd sjukdom och lokaliserade vävnadsinfektioner¹. Ett viktigt inslag i C. albicans fysiologi är dess komplexa polymorfa tillväxt, som är kopplad till dess roll som både en kommensal och en patogen 2,3,4. Under rika näringsförhållanden in vitro vid 30 ° C växer den vanligtvis som en äggformad spirande jäst. En mängd olika miljöutlösare, inklusive näringsbrist, pH-förändringar, tillväxt vid 37 ° C, exponering för serum och tillväxt när de är inbäddade i agar, resulterar i övergången till ett polariserat tillväxtmönster, vilket resulterar i bildandet av sanna hyfer och / eller pseudohyfer⁵. Initieringen av polariserad tillväxt och den resulterande tillväxten av trådformiga organismer kallas morfogenes.

På grund av betydelsen av morfogenes i organismens virulens har regleringen av hyphalbildning studerats omfattande ^6,7. Det finns ett komplext nätverk av signalvägar och transkriptionell reglering som utlöser morfogenes. Trots förhållandet mellan C. albicans morfogenes och patogenes, de flesta studier som undersöker morfogenes har använt in vitro-stimuli för att utlösa hyphalbildning. Det blir allt tydligare att de olika in vitro-modellerna av filamentation inte är identiska när det gäller de individuella regleringsvägar som stimuleras. Dessutom motsvarar inga in vitro-tillväxtförhållanden tätt med värdens komplexa miljö. Med tanke på betydelsen av C. albicans som en mänsklig patogen är målet med detta protokoll att undersöka dess morfogenes under aktiv infektion hos en däggdjursvärd med hjälp av ett system med måttlig genomströmning, vilket gör det möjligt för en utredare att screena C. albicans mutantbibliotek.

För att underlätta dessa undersökningar utvecklades ett in vivo-avbildningssystem som gör det möjligt för oss att få bilder med hög rumslig upplösning av C. albicans-celler under infektion av pinna hos en bedövad mus med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop 8,9,10. Eftersom pinnaens hud är ganska tunn kan dessa bilder erhållas utan behov av vävnadsdissektion. Således kan kvantitativa fenotypdata mätas på platsen för aktiva infektioner i värdvävnaden. Protokollet som beskrivs här innefattar omvandling av en referensstam och en eller flera mutanta stammar med olika fluorescerande proteinuttryckskassetter^11,12. De fluorescerande proteinuttryckande stammarna blandas sedan och injiceras intradermalt. Efter att infektionen har etablerats används konfokal avbildning för att kvantifiera både filamentationsfrekvensen och längden på de bildade filamenten. De data som erhålls från mutantstammarna normaliseras till de som erhålls från referensstammen, som finns i samma vävnadsregion, vilket ger en intern kontroll. Detta system har gjort det möjligt för oss att framgångsrikt screena flera serier av C. albicans mutanta stammar, varav många har morfogenesdefekter in vitro ^9,10. Många av dessa stammar filament lätt in vivo, vilket belyser vikten av in vivo-modeller för undersökning av morfogenes.

Protocol

Studierna i detta protokoll godkändes av University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Se CDC:s riktlinjer för utrustning och procedurer för arbete med BSL2-organismer¹³.

1. Förbereda Candida albicans stammar

1. Identifiera en lämplig referensstam för användning som en positiv kontroll. Se till att denna stam nära matchar de experimentella stammarna när det gäller dess härstamning och genetiska manipulationer.
   OBS: För de representativa experiment som presenteras här skapades mutanterna från de stammar som beskrivs i Homann, et ^al.14, som konstruerades från SN152. Dessa mutanter är Arg^-. Därför valdes referensstammen SN250, som också skapades från SN152 och också är Arg^-. Näringsmässiga stressfaktorer är avgörande för regleringen av polariserad tillväxt i jästen Saccharomyces cerevisiae¹⁵; de har också varit inblandade i filamentation i C. albicans och andra svampar^16,17,18. Därför bör referensstammen matchas för auxotrofer med experimentstammarna när så är möjligt för att undvika potentiella förvirrande effekter från näringsstress.
2. Välj fluorescerande proteinuttryckskonstruktioner. När du screenar en mängd olika experimentella stammar, skapa en referensstam som uttrycker ett fluorescerande protein och använd andra fluorescerande proteiner för att markera mutantstammarna.
   OBS: De representativa data som presenteras här använder NEON för referensstammen och iRFP för mutantstammarna. Vilket fluorescerande protein som helst kan användas om det är mycket uttryckt, relativt ljust och kan exciteras / detekteras av mikroskopet som används. Kontrollexperiment som jämför referensstammar som uttrycker olika fluorescerande proteiner har inte visat någon inverkan av fluorescerande proteinuttryck på morfogenes.
3. Transformera stammarna med fluorescerande proteinuttryckskonstruktioner.
   OBS: Många institutioner kräver användning av försiktighetsåtgärder för biologisk säkerhetsnivå 2 för arbete med C. albicans. Allt arbete ska följa lokala säkerhetsföreskrifter. Oavsett lokala bestämmelser måste utredare som arbetar med C. albicans utbildas i säker hantering av organismen.
   1. Transformera referens- och experimentstammarna med hjälp av standard litiumacetatprotokoll¹⁹.
      OBS: Experimenten som beskrivs här använder pENO1-NEON-NAT R och pENO1-iRFP-NAT^R-plasmider, generöst tillhandahållna av Dr. Robert Wheeler^11,12. Plasmider linjäriserades med hjälp av NotI⁹.
   2. Välj transformanter baserat på tillväxt på nourseothricin eller annat relevant urvalsmedium.
   3. Identifiera framgångsrika transformanter. Välj en liten klick celler från varje koloni med en tandpetare och blanda dem sedan i en 2,5 μL droppe vatten på ett mikroskopglas. Applicera en täckskiva och undersök med 10x-40x förstoring. Undersök med ett konfokalt bildsystem (som används för resten av protokollet) eller något vanligt fluorescensmikroskop med brett fält. Lämpliga transformanter kommer att ha en ljus signal med lämpliga excitations- och emissionsvåglängder.
      OBS: För de representativa resultaten visualiserades NEON-uttryckande stammar med hjälp av ett upprätt fluorescensmikroskop med ett långt passfilteruppsättning med ett 472/30 nm bandpass excitationsfilter, ett 520/35 nm bandpassemissionsfilter och en 495 nm enkantig dikroisk stråldelare. Eftersom iRFP inte är synligt för ögat visualiserades iRFP-uttryckande stammar med hjälp av det konfokalmikroskopisystem som används för in vivo-avbildning , med hjälp av en 638 nm laser för excitation och detektion av emissionsljus från 655-755 nm.
      1. Alternativt kan du utvärdera makroskopisk kolonifluorescens med hjälp av fluorescensstereomikroskopi, handhållna fluorescensexcitationssystem eller fluorescensdetekteringssystem som vanligtvis används för geler och västerländska blottar.
      2. Skapa fryslager av utvalda transformanter.
4. Inokulera YPD (jästextrakt pepton dextros) fasta medier med en fluorescerande proteinuttryckande referens och experimentella stammar från fryslager 3 dagar före injektion, med hjälp av en tandpetare för att överföra en klick organismer från frysbeståndet till YPD fasta medier. Inkubera vid 30 °C i 2 dagar.
5. För varje stam, inokulera en kolv som innehåller 25 ml YPD med C. albicans-celler som tagits från flera kolonier 1 dag före injektionen. Gör detta genom att använda en tandpetare för att överföra en klick organismer från en koloni till YPD; Upprepa flera gånger för att få celler från flera olika kolonier. Inkubera över natten vid 30 °C i en orbital shaker-inkubator vid 175 rpm.
   OBS: Det är viktigt att använda flera kolonier som en källa för inokulum eftersom C. albicans har en hög frekvens av spontana genetiska förändringar. Att använda flera kolonier när man startar ympkulturen minimerar risken för att alla organismer i inokulumet uppstår från en förälder med signifikanta spontana förändringar.
6. På injektionsdagen:
   1. Centrifugera 1 ml av kulturen i 2 min vid 500 x g.
   2. Tvätta kulturen tre gånger med 1 ml steril Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (dPBS). Efter den sista tvätten, återsuspendera pelleten i 1 ml steril dPBS.
   3. Späd ett prov av den tvättade kulturen vid 1:100 och räkna med en hemocytometer.
   4. Justera densiteten hos den tvättade kulturen till 1 x 10⁸ organismer per ml med dPBS.
   5. För varje uppsättning stammar som ska injiceras, skapa inokulumet genom att blanda lika stora volymer av referensstammen och experimentell stam(er). Detta upprätthåller inokulumets densitet vid 1 x 10⁸ organismer per ml.
      OBS: Antalet stammar som kan utvärderas per öra begränsas av förmågan hos det mikroskopisystem som används för att tydligt skilja signalen från varje fluorescerande protein.
   6. När inokulumet är berett, fortsätt direkt till djurinjektionerna. Förvara inte inokulumet före användning.

2. Beredning av djur

1. Få godkännande från den lokala institutionella djurvårds- och användningskommittén eller det relevanta lokala styrande organet.
2. Skaffa 6-12 veckor gamla möss från en leverantör eller avelsprogram. Husmöss i anläggningen där de kommer att leva under hela experimentet i minst 1 vecka före ympning.
   OBS: För de representativa resultaten användes 6 veckor gamla kvinnliga DBA2 / N-möss.
3. Foderdjur klorofyllfri chow i minst 7 dagar före ympning.

3. Hårborttagning och ympning

1. Inducera ett kirurgiskt anestesiplan (figur 1).
   VARNING: Inhalerade bedövningsmedel är farliga material och kan orsaka ögon- eller hudirritation samt nervsystemets toxicitet. Alla institutionella policyer och förfaranden och allmänna laboratoriesäkerhetsrutiner för användning av inhalerade anestetika måste följas. Endast personer som är utbildade i användning av inhalerade anestetika får utföra dessa steg. Standardpraxis inkluderar att bära handskar, en laboratorierock, ögonskydd, användning av ett anestesiavskiljningssystem och noggrann journalföring enligt institutionella riktlinjer.
   1. Placera en mus i en förvärmd anestesiinduktionskammare. Håll djuret i en varm miljö under hela generell anestesi. Uppnå detta med hjälp av värmedynor utformade för detta ändamål och ett uppvärmt mikroskopsteg. Använd inte en receptfri värmedyna eftersom den kan överhettas och orsaka brännskador.
   2. Ge 2%-3% isofluran till induktionskammaren tills musen har förlorat sin rätande reflex och andningen är långsam och stadig. Rensa anestesiens induktionskammare och överför djuret till en näskotte som inte är rebreather och ger 1% -2% isofluran.
   3. Validera anestesiplanet med hjälp av tåklämreflexen eller andra verifieringsmekanismer. Under hela experimentet, övervaka djurets andningsmönster och bedövningsplan och justera anestesikoncentrationen efter behov.
   4. Applicera ögonsmörjmedel för att förhindra uttorkning av hornhinnan.
2. Hårborttagning (figur 1C,D)
   1. Applicera en receptfri hårborttagningskräm på insidan och utsidan av båda öronen med en bomullspinne.
   2. Efter 2-3 min (eller enligt tillverkarens anvisningar), torka försiktigt örat med en torr gasbinda för att ta bort all kräm och hår. Torka två gånger till med gasbindor mättade i sterilt vatten för att helt avlägsna hårborttagningskrämrester. Underlåtenhet att ta bort all hårborttagningskräm kommer att resultera i hudirritation / inflammation.
3. Injektion (figur 1E, F)
   1. Torka av ytan på örat som ska injiceras med en gasväv mättad i 70% etanol och låt lufttorka.
   2. Blanda inokulumet väl genom att invertera flera gånger eller virvla.
   3. Dra upp 20-30 μl inokulum i en insulinspruta. Håll nålen pekande uppåt och knacka försiktigt på sprutan för att säkerställa att eventuell luft i pipan är överst. Mata försiktigt ut luft och överskott av inokulum tillbaka i ympröret eller ett avfallsrör så att kolven är vid 10 μl-märket.
   4. Bär en fingerborg på ett finger eller tumme på den icke-dominerande handen, stabilisera örat genom att linda det över fingerborgen. Alternativt kan du applicera receptfritt dubbelhäftande hudtejp (modetejp) på ett litet koniskt eller rundbottnat plaströr och drapera örat över tejpen. Var försiktig så att du inte lossnar anestesinäskonen medan du gör detta. Det kan vara bra att tejpa fast noskonen på arbetsytan.
      OBS: Antingen insidan eller utsidan av örat kan injiceras baserat på utredarens fysiska komfort. För mikroskopi, var noga med att placera musen så att den sida av örat som injiceras är vänd mot objektivlinsen.
   5. Håll sprutnålen nästan helt parallell med huden och undvik stora vener, sätt in nålspetsen i det yttersta lagret av huden tills avfasningen bara är täckt.
   6. Injicera långsamt inokulumet intradermalt. En bra intradermal injektion kommer att höja en liten bubbla i huden. Håll nålen på plats i 15-20 sekunder innan du tar bort den från örat för att minimera läckage.
      1. Om undersidan av djurets öra blir fuktig, var nålen för djup och passerade helt genom örat. Upprepa i så fall injektionen i ett annat område av örat.
   7. Upprepa processen med djurets andra öra. Detta kan göras med samma C. albicans-stammar för en replikat eller med en annan uppsättning C. albicans-stammar.
   8. Om du inte avbildar omedelbart, placera djuret i en uppvärmd återhämtningskammare. Observera djuret tills det har återhämtat sig från anestesi och återför det sedan till sin bostadsbur.
   9. Efter institutionella protokoll, märk buren tydligt med biohazard-etiketter och ange att djur i buren är infekterade med Candida albicans.
   10. Fyll i all nödvändig journalföring relaterad till djurbedövning och andra nödvändiga institutionella metoder.
   11. Inhys i djuranläggningens förhållanden med hjälp av försiktighetsåtgärder för djurbiologisk säkerhetsnivå 2.

4. Kvantifiera in vitro-morfogenes för jämförelse med in vivo-resultat

1. Med hjälp av samma tvättade kulturer som användes för att framställa inokulumet skapar du en 1:50 utspädning av organismer i RPMI1640 + 10% värmeinaktiverat fosterbovint serum och inkuberar vid 37 ° C med tumling i 4 timmar. Alternativt kan andra medier som stimulerar morfogenes in vitro användas.
2. Centrifugera provet i 5 min vid 500 x g och återsuspendera i 0,5 ml dPBS.
3. Späd provet i förhållandet 1:10, placera 2,5 μl av det utspädda provet på ett mikroskopglas och täck det med en täckglas.
4. Undersök provet med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Räkna minst 100 celler och registrera antalet jäst- och trådformiga celler för varje stam. I de representativa resultaten som presenteras här definieras en trådformig cell som vilken cell som helst med en längd på mer än dubbelt så lång som modercellen.
   OBS: Kvantifiering av in vitro-morfogenes kan göras samma dag som inokulering av djuren. Det är möjligt att initiera in vitro-morfogenesanalysen medan man förbereder inokulumet för injektion och utför inokuleringen av djuren under inkubationsperioden på 4 timmar. Om alla djurförsök slutförs före slutet av inkubationsperioden på 4 timmar, fortsätt direkt till undersökningen av de in vitro-stimulerade cellerna. Alternativt kan celler återsuspenderas i 3,7% formaldehyd i dPBS (i steg 4.2) och förvaras vid 4 °C i flera dagar. De fasta organismerna kan sedan kvantifieras allteftersom tiden tillåter. Inokuleringen av djuren får inte fördröjas för in vitro-kvantifieringstestet.

5. Förberedelse för in vivo-avbildning

1. Förbered mikroskopet (figur 2A).
   1. Slå på all mikroskopiutrustning och starta bildprogramvaran.
      1. Om det är tillgängligt läser du in eventuella förutbestämda bildinställningar.
      2. Aktivera de lasrar och detektorer som behövs för att detektera de fluorescerande proteiner som används.
   2. Slå på det uppvärmda mikroskopsteget och låt det värmas till 37 °C.
      OBS: Det är möjligt att använda ett mikroskop med en helt sluten miljökammare snarare än ett uppvärmt steg.
   3. Ställ in en z-axelreferenspunkt med fokusplanet längst upp på täckglaset.  Detta kan göras genom att tejpa en täckglas på plats över scenöppningen och sätta en droppe vatten på locket.  Använd ett lägre förstoringsmål (10x) "torrt" för att fokusera på vattendroppens kant och ställ sedan in z-axelns referenspunkt.  Använd en bit handduk för att absorbera vattnet från täckglaset innan du tar bort det från scenen.
   4. Rotera målet för mycket långt arbetsavstånd på plats och placera en droppe nedsänkningsvätska på linsen. Sänk linsen för att undvika eventuella skador när du placerar täckglaset.
   5. Placera en #1.5 täckskiva över scenöppningen och tejpa fast den på plats. Se till att tejpen täcker alla kanter på täckglaset helt för att förhindra att vätska transporteras under täckglaset in i mikroskopet. Höj målet till z-axelns referenspunkt så att nedsänkningsvätskan är i kontakt med både objektivlinsen och täckglaset.
   6. Förbered flera bitar av tryckkänslig tejp så att de är redo att användas när du placerar noskonen och musen.
2. Inducera narkos i musen att avbildas enligt ovan (steg 3.1).
3. Placera musen (bild 2B-D).
   1. Säkra en anestesinoskon på mikroskopstadiet med noskonen placerad så att den täcker djurets näsa helt när djuret är i position för avbildning. Detta kan lättare åstadkommas med två utredare. Låt den första utredaren placera den sövda musens näsa i noskonen och flytta musen i position för avbildning medan du fortsätter att hålla noskonen över djurets näsa. Låt den andra utredaren tejpa noskonen och slangen på plats så den sitter stabilt över musens näsa. När noskonen är tejpad på plats, lämna den där under resten av bildsessionen.
   2. Efter att ha fastställt det bästa stället att placera näskonen, notera dess position. För efterföljande avbildningssessioner kan noskonen säkras till scenen innan ett djur förs till mikroskopet.
   3. Placera en droppe sterilt vatten på täckglaset ovanför objektivlinsen.
   4. Placera musen på mikroskopstadiet. Se till att örat är ovanpå vattendroppen och plant mot täckglaset.
   5. Använd en andra (översta) täckskiva för att platta ut örat.
      1. Placera kanten på täckglaset parallellt med musens kropp, med kanten vidrör musen där örat möter huvudet.
      2. Sänk den fria kanten på täckglaset till mikroskopsteget med en gångjärnsrörelse. När täckglaset kommer mot mikroskopstadiet kommer det att platta ut örat. Var försiktig så att du inte skapar veck eller åsar i örat.
      3. Tejpa fast den övre täckplattan ordentligt så att den håller precis tillräckligt med tryck för att hålla örat plant. Var försiktig så att du inte fångar musens hår eller whiskers i tejpen.
   6. Om inte ett mikroskop med en miljökammare används, täck löst musens kropp med ett sterilt draperi för att upprätthålla en normotermisk miljö.
4. Identifiera ett intresseområde.
   1. Kontrollera att målet är vid z-axelns referenspunkt.
   2. Använd vitt ljus/vidvinkelavbildning och justera fokusplanet i öronvävnaden. En bra strategi är att fokusera på blodkärlen - om man kan se röda blodkroppar röra sig i blodkärlen är fokusplanet i vävnaden.
   3. Om mikroskopet är utrustat med bredfältfluorescensförmåga, använd det för att identifiera ett intresseområde. Om inte, använd konfokal avbildning. I allmänhet är det snabbare att använda bredfältmikroskopi för att identifiera intressanta områden och kräver mindre bestrålning av öronvävnaden.
      1. Använd en filterkub för detektion av det fluorescerande protein som uttrycks i referensstammen, identifiera ett synfält som har en fluorescerande signal från referensstammen. Tänk på att ljus utanför fokus sannolikt kommer att förhindra förmågan att fokusera på enskilda organismer. Målet med detta steg är att identifiera ett intresseområde för konfokal avbildning.
      2. Byt till en filterkub som detekterar det fluorescerande protein som uttrycks av experimentstammarna och verifierar deras närvaro i det valda synfältet.

6. Bildbehandling

1. Bestäm inställningarna.
   1. Medan bildprogramvaran är i live konfokalt läge, undersök intressefältet när fokalplanet flyttas genom z-axeln. Välj ett z-axelplan med en stark signal från alla fluorescerande proteiner som används.
   2. Justera lasereffekten och/eller bildhastigheten för att få en tillräckligt stark signal så att morfologin kan bestämmas för alla celler i synfältet. För att undvika vävnadsskador, använd lägsta möjliga lasereffekt.
      OBS: Som med all avbildning finns det en balans mellan laserkraft, förvärvshastighet och upplösning. Identifiera inställningar som tydligt identifierar organismmorfologi samtidigt som du balanserar hastighet och laserkraft för att minimera bestrålning av öronvävnaden. Eftersom avbildning sker genom yttre dermis krävs högre lasereffekt för excitation än vad som vanligtvis är nödvändigt för konfokal avbildning av traditionella prover monterade på objektglas. Lyckligtvis är nivån på rumslig upplösning som krävs för analys av morfologi inte extrem. Således är det lätt att uppnå bilder med en tillräcklig signal för att bestämma organismmorfologi utan att orsaka vävnadsskada.
   3. När dessa parametrar har fastställts använder du dem under hela bildsessionen för att fungera som utgångspunkt för efterföljande bildsessioner. Det är därför bra att spara bildinställningarna.
      OBS: Enskilda infektionsområden kan vara grundare eller djupare i vävnaden. Djupare områden kan kräva en ökning av laserkraften. Eftersom denna analys är beroende av den rumsliga fördelningen av signal snarare än dess intensitet, är det acceptabelt att ändra bildinställningar mellan fält efter behov.
2. Hämta bilderna.
   1. Välj ett synfält som har tydlig glödtrådsbildning i referensstammen och där de flesta organismer är tillräckligt utspridda för att deras morfologi ska kunna bestämmas.
   2. Ställ in de övre och nedre planen med fokus för en z-stack. Det är inte nödvändigt att täcka hela djupet av det infekterade området, men kom ihåg att organismer längst upp eller längst ner på den avbildade volymen vanligtvis utesluts från analysen.
   3. Skaffa z-stack-bilder, pseudofärga varje kanal för att skilja varje stam och lägg över kanalerna. Spara bilderna.
   4. Upprepa för andra synfält. Morfogenes kan variera från plats till plats; Därför är det viktigt att förvärva och analysera minst tre fält från varje öra.

7. Manuell tvådimensionell analys: Frekvens av filamentation

1. Använd bildprogramvara för att utföra en maximal projektion av z-stacken till en tvådimensionell bild. Instruktioner som tillhandahålls här är för FIJI / Image J.
   1. Öppna mikroskopibilder med ImageJ-programvaran.
   2. Applicera vid behov en pseudofärg på varje kanal för att möjliggöra enkel identifiering av varje C. albicans-stam. För detta klickar du på Bild > Uppslagstabell > LUT-färg och väljer den valda pseudofärgen.
   3. Konvertera stackfilen till en tvådimensionell bild med maximal intensitet:
      1. Välj z-stack-filen. Klicka på Bild > staplar > Z-projektion.
      2. Välj det övre och nedre planet och välj projektionstypen Max intensitet.
2. Räkna varje organism som ses i de maximala projektionsbilderna efter stamtyp (särskiljs av kanalfärg) och morfologi.
   1. Organismer som är signifikant överlappande eller områden med mycket hög organismdensitet kommer att vara svåra att räkna exakt. Uteslut dessa från räkningen, men var noga med att inte införa bias mot trådformiga former, som är mer benägna att överlappa varandra.
   2. Filamentösa former som skjuter rakt in i eller ut ur z-stacken visas som små runda objekt i en maximal projektion. På samma sätt kan organismer som är avskurna av bildens kant tyckas vara jäst eftersom filamentet är utanför synfältet. Således kommer tvådimensionell analys alltid att överskatta andelen jästformer. Eftersom detta kommer att ske på samma sätt med referens- och experimentstammarna, jämför alltid experimentella resultat med en referensstam.
3. Utföra statistiska jämförelser av resultaten enligt den experimentella designen.

8. Manuell tvådimensionell analys: Filamentlängd

1. För C. albicans kan avvikande filamentbildning uppstå eftersom: a) färre "moder" jästceller genomgår morfogenes, b) filament växer långsammare, eller c) trådformig tillväxt initieras men upprätthålls inte. För att utvärdera dessa möjligheter, kvantifiera kurvbanans längd för varje filament i maxprojektionsbilden som ett surrogat för den sanna tredimensionella längden (diskuteras nedan).
   1. När en knopp utvecklas på en modercell är det inte möjligt att säga om det kommer att bli ett filament eller en jäst. För att säkerställa att endast trådformiga celler ingår i denna analys, mät endast organismer där dottercellen är minst dubbelt så lång som modercellen.
2. Öppna den maximala projektionsbilden som skapades i steg 7.
3. På ImageJ-verktygsuppsättningen högerklickar du på verktyget Rak / segmenterad linje och väljer alternativet Segmenterad linje. Det segmenterade linjealternativet gör det möjligt för användaren att mäta filamentlängden längs en krökt bana, en nödvändighet med tanke på plasticiteten hos C. albicans filament.
4. Mät filamentlängden från knopphalsen till filamentets växande ände. Vänsterklicka på knopphalsen; pekaren ändras till en liten fyrkant. Spåra filamentet längs dess längd och klicka på mitten av glödtråden varje gång det finns en kurva, vridning eller förändring av filamentets långa axel. Dubbelklicka på filamentets växande spets.
5. Tryck på Control + M. Detta öppnar ett popup-fönster som tabellerar mätningarna Area, Mean, Min, Max och Length. Efter mätning av varje filament, tryck på Control + M igen för att lägga till strömmätningen i mättabellen.
6. När alla filament har mätts, kopiera och klistra in längdmätningarna i en dataanalysfil.
7. Utföra statistisk analys för att utvärdera fördelningen av glödtrådslängder i referensstammen och mutantstammen.

9. Manuell tredimensionell analys

1. För att få en mer exakt mätning av morfogenes som undviker överskattning av jästformer och kan tillåta diskriminering mellan pseudohyfer och hyfer, bläddra manuellt upp och ner genom z-stacken medan du utvärderar morfologin för varje organism i tre dimensioner.
2. Alternativt kan du skapa en tredimensionell bild av varje z-stack och analysera formen på varje organism medan du roterar bilden.

10. Automatiserad analys

1. Med hjälp av bildprogramvaran automatiserar du uppräkningen av organismer och deras morfologi i två eller tre dimensioner.
   OBS: Vissa algoritmer för diskriminering av morfologityper kan införa bias. Således måste automatiseringsstrategier valideras noggrant i förhållande till den experimentella designen. Väl utformad och validerad automatiserad bildanalys kan öka analysstegets genomströmning.

Representative Results

Resultaten som presenteras här är baserade på tidigare publicerade rapporter ^9,10. Målet med denna analys är att kvantitativt utvärdera förmågan hos mutanta C. albicans-stammar att genomgå morfogenes under aktiva infektioner. De typiska parametrarna som skiljer pseudohyfer från hyfer kan vara svåra att utvärdera i organismer som växer i tre dimensioner i en komplex in vivo-miljö. Detta gäller särskilt när man tittar på de tvådimensionella tvärsnitt som skapas av konfokal avbildning. Därför är denna screeninganalys inriktad på att identifiera organismer som växer som trådformiga kontra jäst. För uppföljningsstudier med en mer djupgående analys, inklusive tredimensionella rekonstruktioner, kan denna metod anpassas för att diskriminera jäst, hyfer och pseudohyfer.

Uttrycket av ett fluorescerande protein i en referens- eller mutantstam av C. albicans gör det möjligt att enkelt detektera stammorfologi in vivo (figur 3 och figur 4). I allmänhet utförs kvantitativ ljusmikroskopianalys bäst när få eller inga av pixlarna i bilden är mättade. För detta protokoll förenklar dock en mättnad av bilden ofta analysen. Fluorescerande proteinlokalisering är inte enhetlig i hela cellen och är ofta högre i moderjästen än i filament. Lyckligtvis, för undersökningen av morfogenes, definierar den rumsliga fördelningen av signalen, snarare än dess intensitet, resultatet. Att få bilder där många pixlar är mättade förbättrar därför förmågan att kvantifiera morfogenes i denna analys.

För att illustrera vikten av att utvärdera morfogenes in vivo presenteras representativa resultat för referensstammen (SN250) och två mutanter: den ena saknar transkriptionsfaktorn Efg1 och den andra saknar adenylylcyklas Cyr1. In vitro växer ingen av dessa stammar som filament^20,21. När referensstammen odlas in vitro i RPMI-medium kompletterat med 10 % serum bildar den snabbt filament, medan efg1ΔΔ- och cyr1ΔΔ-stammarna inte gör det (figur 3 och figur 4). Under dessa förhållanden uppvisar efg1ΔΔ-mutanten något polariserad tillväxt, med dottercellerna något långsträckta jämfört med modercellerna. Detta betonar vikten av att använda en tydlig definition av filamentation. Varje sådan definition är som standard godtycklig, men det är nödvändigt för konsekvent utvärdering av fenotypen. För dessa studier definieras ett trådformigt tillväxtmönster som en organism med den längsta dimensionen av en dottercell mer än dubbelt så stor som modercellens. Med hjälp av denna definition är de långsträckta efg1ΔΔ-cellerna inte trådformiga.

I överensstämmelse med sin in vitro-fenotyp uppvisar efg1 ΔΔ en signifikant filamentationsdefekt in vivo: cirka 9% av efg1ΔΔ-cellerna växte som filament in vivo (Figur 3). Däremot växte 53 % av cyr1ΔΔ-mutantcellerna som filament in vivo (figur 4). Även om antalet cyr1 ΔΔ-mutanta celler som genomgår filamentation in vivo var signifikant lägre än referensstammen, representerar cyr1ΔΔ-mutantens förmåga att bilda filament in vivo en väsentlig förändring från dess fullständiga brist på morfogenes in vitro. Visuellt verkade filamenten som bildades av cyr1ΔΔ-mutanten vara kortare än referensstammen. För att utvärdera detta kvantitativt mättes kurvvägslängden för de trådformiga cellerna med hjälp av en tvådimensionell projektion av in vivo-bilderna (figur 4E). Medianlängden för cyr1ΔΔ-filamenten var 29 % kortare än filamenten i referensstammen.

Figur 1: Anestesi och ympning . (A) Induktion av anestesi med hjälp av en induktionskammare. (B) Anestesi upprätthålls med hjälp av en näskon, så att musen kan flyttas efter behov. (C) Hårborttagningskräm appliceras med en bomullsspetsapplikator. Ögonsmörjgel har applicerats för att skydda ögonen under anestesi. (D) Effektivt hårborttagning av höger öra. Jämför med det obehandlade vänstra örat. (E) Intradermal injektion av C. albicans i musörat. Örat hålls på plats med spetsen på ett koniskt rör lindat med dubbelsidig hudtejp (modeband). (F) Närbild av intradermal injektion. En blek bubbla bildas i huden, vilket är ett tecken på en framgångsrik intradermal placering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Förberedelse för avbildning. (A) Mikroskopsteg förberett för avbildning. Narkosnoskonen är säkrad på plats. En täckglas tejpas fast på scenen som täcker linsöppningen. Ytterligare tejpbitar finns tillgängliga. Det uppvärmda steget förvärms till 37 °C (visas inte). (B) Placering av den bedövade musen i anestesinäskonen. (C) Musen roteras något så att den sida av örat som ympades är vänd mot bottenlocket/objektivlinsen. Örat plattas sedan till mot bottenlocket och säkras på plats genom att placera en andra täckskiva ovanpå örat. (D) Den övre täckskivan tejpas fast på scenen för att säkra örat på plats i förhållande till mikroskopsteget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: In vitro- och in vivo-morfologi för efg1ΔΔ-mutantstammen. (A) Widefield-bild av WT- och efg1ΔΔ-mutantstammar efter in vitro-induktion av filamentation av växande celler i RPMI + 10% serum vid 37 °C i 4 timmar. Skalstänger representerar 10 μm. Bildkontrasten justerades med hjälp av fotoredigeringsprogram för att underlätta visning. B) Procentandel in vitro-filamentation som observerats i muterade WT- och EFG1ΔΔ-stammar. Und = omätbar (inga filament detekterades). Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från tre oberoende experiment där minst 100 celler kvantifierades. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämfört med elevens t-test, p < 0,001). C) Konfokalmikroskop av WT (grön) och efg1ΔΔ-mutanten (röd) som växer in vivo 24 timmar efter inokulering. Pilar indikerar exempel på efg1ΔΔ-mutanta celler som uppfyller vår definition av "trådformiga". Skalstrecket representerar 50 μm. (D) Procentandel av glödtråden in vivo observerad i WT- och efg1ΔΔ-mutantstammarna. Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från två oberoende experiment. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämfört med elevens t-test, p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: In vitro- och in vivo-morfologi för cyr1 ΔΔ-mutantstammen. (A) Widefield-bildav cyr1ΔΔ-mutantstammen efter in vitro-induktion av filamentation av växande celler i RPMI + 10% serum vid 37 °C i 4 timmar. Skalstången representerar 10 μm. Bildkontrasten justerades med hjälp av fotoredigeringsprogram för att underlätta visning. B) Procentandel in vitro-filamentation som observerats i mutantstammarna WT och cyr1ΔΔ. Und = omätbar (inga filament detekterades). Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från tre oberoende experiment där minst 100 celler kvantifierades. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämförda med elevens t-test, p < 0,001). C) Konfokalmikroskop av WT (grön) och cyr1ΔΔ-mutanten (röd) som växer in vivo 24 timmar efter inokulering. Skalstrecket representerar 50 μm. D) Procentandel filamentation in vivo som observerats i muterade stammarna WT och cyr1ΔΔ. Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från två oberoende experiment. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämfört med elevens t-test, p < 0,001). (E) Fördelning av glödtrådens längd in vivo, mätt som kurvbanans längd i en tvådimensionell projektion av z-stacken. Varje punkt representerar längden på en glödtråd. Celler som växer som jäst ingick inte i denna analys. Stapeln anger medianlängden på filamentet. Fördelningen av längder är signifikant annorlunda när den analyseras med hjälp av ett Mann-Whitney U-test (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Denna modell använder konfokalmikroskopi för att få bilder av C. albicans organismer när de växer i vävnaden hos en däggdjursvärd, vilket gör att vi kan utvärdera morfogenesfenotyper under aktiv infektion. Processen för morfogenes är central för C. albicans patogenes och har studerats i stor utsträckning med hjälp av en mängd olika in vitro-analyser ^2,3,4. Ingen in vitro-analys kan dock helt modellera värdens komplexa biokemiska och strukturella miljö.

Protokollet som beskrivs här är inriktat på användningen av detta in vivo-bildsystem för att screena en serie / bibliotek av C. albicans-mutanter för att identifiera generna som är involverade i morfogenes under infektion. Användningen av C. albicans-stammar som uttrycker olika fluorescerande proteiner gör det möjligt för oss att kvantifiera in vivo-morfogenesen av C. albicans mutanta stammar jämfört med en referensstam. Genom att jämföra morfogenesen hos mutanten med referensstammen inom samma infektionsområde säkerställs att organismerna utsätts för identiska miljöer. Detta möjliggör kvantitativ mätning av andelen celler som genomgår filamentation, liksom omfattningen av filamentation. Normalisering av mätningarna av mutantstammarna till referensstammens mätningar gör det möjligt för oss att bättre jämföra prestanda hos en mutant med en annan.

De representativa resultat som presenteras här visar potentialen för en signifikant skillnad mellan in vitro - och in vivo-fenotyper . C. albicans efg1ΔΔ-mutantstam används ofta som en negativ kontroll för morfogenesanalyser eftersom den inte filament under nästan alla in vitro-förhållanden ²⁰. Även om in vivo-resultaten var mycket lika in vitro-resultaten , bildade även denna allvarligt hämmade stam ibland filament i värdvävnadsmiljön (figur 3). Detta betonar värdmiljöns styrka när det gäller att utlösa morfogenes.

Däremot uppvisar cyr1ΔΔ-mutantstammen en betydande diskrepans mellan in vitro- och in vivo-tillväxt; Även om ingen av mutantcellerna genomgår filamentation in vitro, växer ungefär hälften av cellerna som filament in vivo (figur 4)^10,21. Intressant nog var dessa filament signifikant kortare än de som bildades av referensstammen, vilket tyder på att CYR1 bidrar till antingen filamenttillväxten eller förmågan att upprätthålla en trådformig fenotyp. För att underlätta analysen av filamentlängden mättes filamentens kurvvägslängd med hjälp av en tvådimensionell projektion av bilderna. I tvådimensionella projektioner av filament som växer i tre dimensioner kommer alla filament som växer på en axel som inte är parallell med xy-planet att projicera som kortare än dess verkliga längd. Eftersom denna förskjutning också sker för referensstammen, möjliggör utvärdering av filamentlängdernas fördelning i en tvådimensionell projektion fortfarande en kvantitativ jämförelse mellan referens- och mutantstammarna. Analys av filamentlängd i två snarare än tre dimensioner kräver mindre intensiv bildanalys; Således kan den utföras relativt snabbt på en typisk stationär dator. Genom att använda denna enklare analys kan filamentlängdsfördelning inkluderas som en del av ett screeningprotokoll, vilket ger en mer nyanserad förståelse av varje mutants förmåga att genomgå morfogenes utan att orsaka betydande förseningar i genomströmningen.

De representativa studier som presenteras här utfördes med DBA2/N-möss, som har en defekt i sitt komplementsystem som orsakar ett misslyckande med att rekrytera neutrofiler till platsen för C. albicans-infektion ²². Målet med dessa studier var att undersöka mekanismer för reglering av C. albicans filamentation i värdvävnaden. Därför användes DBA2/N-möss för att undvika att förvirra resultaten på grund av en enskild stams mottaglighet eller resistens mot neutrofiler. Eftersom det neutrofila anti-C. albicans-svaret kan påverka filamentation²³, kan neutrofilrekrytering till infektionsstället påverka resultaten av en morfogenesanalys. Om en stam kan glödtrådas in vivo men starkt hämmas från filamentation när neutrofiler är närvarande, skulle filamentation detekteras hos DBA2/N-möss men det är osannolikt att den ses vid användning av möss med intakt neutrofil kemotaxi. Således är musens belastning som används som värd en viktig faktor när du använder detta protokoll.

Observationen att efg1ΔΔ-mutantstammen inte filament in vivo är osannolikt att vara relaterad till värdens neutrofila svar, eftersom denna stam inte heller filament in vitro. Den filamentation som observerats in vivo med cyr1ΔΔ-stammen är disharmonisk med dess underlåtenhet att filamentera in vitro. Data från zebrafiskmodellen av C. albicans-infektion indikerar att svarande neutrofiler är viktiga för att förebygga morfogenes²⁴. Därför är det osannolikt att användningen av DBA2/N-möss, som saknar neutrofila svar, kommer att förklara ökningen av filamentationen av cyr1ΔΔ in vivo jämfört med in vitro. Icke desto mindre påverkar in vivo-miljön tydligt morfogenesen hos cyr1ΔΔ-stammen. Således kan ytterligare undersökning av denna stam ge viktig information om regleringen av C. albicans morfogenes under aktiva infektioner. Protokollet som beskrivs här är utformat som en screeninganalys för att identifiera stammar som cyr1ΔΔ-stammen som ska användas i framtida studier.

Användningen av ett gasanestesisystem med lågt flöde är till stor hjälp för detta protokoll (figur 1A, B). Under den första utvecklingen av detta protokoll bedövades möss med hjälp av en injicerbar bedövningscocktail av ketamin blandad med xylazin. Även om det var möjligt att utföra begränsad avbildning med den bedövningsmetoden, var anestesiens varaktighet oförutsägbar, vilket krävde att avbildningssessioner avslutades snabbt för att undvika att musen återhämtade sig från anestesi under avbildning. Traditionella inhalerade anestesisystem är skrymmande och kräver höga flödeshastigheter av anestesigaser, vilket ofta kräver att de används i en dragskåp. Således skulle traditionella inhalerade anestesisystem vara mycket svåra att använda med utrymmesbegränsningarna i ett konfokalmikroskop utan att oavsiktligt utsätta utredarna för bedövningsmedlen. Användningen av ett lågflödesinandat bedövningssystem möjliggör konsekvent anestesi hos djuret samtidigt som en säker miljö för utredaren upprätthålls. Den lågflödesnoskonen möjliggör enkel positionering av djuret för både ympning och mikroskopi. Den lilla kalibern leveransslangen med låg volym möjliggör användning av relativt långa rör, vilket gör att anestesimaskinen kan placeras på tillräckligt avstånd för att inte störa mikroskopi.

Klorofyllet som finns i typisk muschow leder till signifikant vävnadsautofluorescens²⁵. Detta skapar betydande brus i bilderna, vilket gör det svårt att få högkvalitativa, högrumsliga upplösningsbilder. När djur matades klorofyllfri chow i 7 dagar före avbildning minskade bakgrunden från autofluorescens avsevärt i vävnad, men klorofyll avsatt i håret fortsatte att vara problematiskt. Att ta bort håret på pinnae med en receptfri kemisk hårborttagningskräm är effektivt för att minimera autofluorescens i håret (figur 1C,D). Således minskade kombinationen av klorofyllfri chow och adekvat hårborttagning avsevärt autofluorescens och förbättrade bildkvaliteten dramatiskt. Eftersom håret tas bort från örat före avbildning påverkar färgen på djurets hår inte detta system. Detta protokoll har använts framgångsrikt för att studera C. albicans infektioner i BALB/c (vit), C57BL/6 (svart) och DBA2/N (brun) möss. Protokollet kan också användas med C57BL/6 knockoutmöss som har brist på olika värdgener; Detta kommer att möjliggöra framtida undersökningar av hur däggdjursvärdets immunsystem påverkar filamentation. En egenskap hos denna modell som inte diskuteras i detta protokoll är att eftersom detta bildsystem är icke-invasivt kan samma djur avbildas upprepade gånger under flera dagar, vilket gör det möjligt att följa utvecklingen av individuell infektion över tiden. Denna funktion kommer sannolikt att spela en nyckelroll i framtida studier om värd-patogeninteraktionen.

Sammanfattningsvis resulterar detta protokoll i högupplösta bilder av C. albicans som växer i vävnaden hos en levande däggdjursvärd, vilket möjliggör noggrann utvärdering av morfogenes i mutanta stammar 8,9,10. Resultaten som presenteras här visar hur detta protokoll kan användas för att screena ett bibliotek med C. albicans-mutanter. Av de C. albicans-mutanter som hittills testats genomgår en stor del av mutanterna med kända defekter i morfogenes in vitro lätt filamentation in vivo ^9,10. Detta belyser vikten av att inkludera ett in vivo-system som detta i experiment som är utformade för att belysa mekanismerna för C. albicans patogenes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 coverslips	Thermo-Fisher	20811	large enough to cover the universal stage opening
0.1 mL Insulin syringes	EXELint	26018	Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G
3.7% formaldehyde in dPBS	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% Ethanol/30% water	Decon Laboratories	A05061001A
Alcohol prep pads	Covidien	5110	Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol
C.albicans reference strain and experimental strains	SN250	FGSC Online Catalog	The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.
Chlorophyl free mouse chow	Envigo	2920x
Computer	Dell	Optiplex 7050	Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.
Cotton tip applicator	Pro Advantage	76200
DBA2/N (6-12 week old mice)			BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.  The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)	local pharmacy or grocery store		Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.  This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.  It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.  Examples:  https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	Must be sterile; open a new container for every experiment
Fetal bovine serum	Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
Gauze pad	Pro Advantage	P157112
Gel eye lurbicant	local pharmacy or grocery store
ImageJ or FIJI analysis software	NIH	ImageJ (FIJI)
Isoflurane	Akorn	J119005
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens	Leica	DMi8 (SP8)	The objective lens  (Leica 11506375) used here  is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free  spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair hair remover lotion	local pharmacy or grocery store		Over the counter depilatory cream
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids			Fluorescent protein expression transformation constructs  generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)
Pressure sensitive laboratory tape	Tape & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640 cell culture medium	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes	Falcon	352196	To safely hold the animals ear during injectinos