Bruk av in vivo imaging for å skjerme for morfogenese fenotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infeksjon i en pattedyrvert

Summary

Dette manuskriptet beskriver en metode for screening av moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefenotyper under aktiv infeksjon hos en pattedyrvert ved bruk av ikke-invasiv konfokal mikroskopi.

Abstract

Candida albicans er et viktig humant patogen. Dens evne til å bytte mellom morfologiske former er sentral for patogenesen; Disse morfologiske endringene reguleres av et komplekst signalnettverk kontrollert som respons på miljøstimuli. Disse regulatoriske komponentene har blitt sterkt studert, men nesten alle studier bruker en rekke in vitro stimuli for å utløse filamentasjon. For å bestemme hvordan morfogenese reguleres under patogeneseprosessen, utviklet vi et in vivo mikroskopisystem for å oppnå bilder med høy romlig oppløsning av organismer som gjennomgår hyphaldannelse i pattedyrverten. Protokollen som presenteres her beskriver bruken av dette systemet for å skjerme små samlinger av C. albicans mutantstammer, slik at vi kan identifisere viktige regulatorer av morfogenese som det skjer på infeksjonsstedet. Representative resultater presenteres, og viser at noen regulatorer av morfogenese, som transkripsjonsregulatoren Efg1, har konsistente fenotyper in vitro og in vivo, mens andre regulatorer, som adenylsyklase (Cyr1), har signifikant forskjellige fenotyper in vivo sammenlignet med in vitro.

Introduction

Candida albicans er et vanlig humant sopppatogen, som forårsaker mukokutan sykdom, disseminert sykdom og lokaliserte vevsinfeksjoner¹. Et sentralt trekk ved C. albicans fysiologi er dens komplekse polymorfe vekst, som er knyttet til dens rolle som både en commensal og et patogen ^2,3,4. Under rike næringsforhold in vitro ved 30 ° C vokser det vanligvis som en ovoid spirende gjær. En rekke miljøutløsere, inkludert næringsdeprivasjon, pH-endringer, vekst ved 37 ° C, eksponering for serum og vekst når de er innebygd i agar, resulterer i overgangen til et polarisert vekstmønster, noe som resulterer i dannelse av ekte hyfer og / eller pseudohyphae⁵. Initiering av polarisert vekst og den resulterende veksten av filamentøse organismer refereres til som morfogenese.

På grunn av betydningen av morfogenese i organismens virulens, har reguleringen av hyphaldannelse blitt grundig studert ^6,7. Det er et komplekst nettverk av signalveier og transkripsjonsregulering som utløser morfogenese. Til tross for forholdet mellom C. albicans morfogenese og patogenese, har de fleste studier som undersøker morfogenese brukt in vitro stimuli for å utløse hyphaldannelse. Det blir stadig tydeligere at de ulike in vitro-modellene for filamentasjon ikke er identiske når det gjelder de individuelle reguleringsveiene som stimuleres. Videre samsvarer ingen in vitro vekstforhold tett med vertens komplekse miljø. Gitt betydningen av C. albicans som et humant patogen, er målet med denne protokollen å undersøke dens morfogenese under aktiv infeksjon i en pattedyrvert ved hjelp av et system med moderat gjennomstrømning, slik at en etterforsker kan skjerme C. albicans mutantbiblioteker.

For å lette disse undersøkelsene ble det utviklet et in vivo bildebehandlingssystem som lar oss oppnå bilder med høy romlig oppløsning av C. albicans-celler under infeksjon av pinna av en bedøvet mus ved hjelp av et omvendt konfokalt mikroskop ^8,9,10. Fordi huden på pinna er ganske tynn, kan disse bildene oppnås uten behov for vevsdisseksjon. Dermed kan kvantitative fenotypedata måles på stedet for aktive infeksjoner i vertsvevet. Protokollen beskrevet her innebærer transformasjon av en referansestamme og en eller flere mutantstammer med forskjellige fluorescerende proteinuttrykkskassetter^11,12. De fluorescerende proteinuttrykkende stammene blandes deretter og injiseres samtidig intradermalt. Etter at infeksjonen er etablert, brukes konfokal avbildning til å kvantifisere både frekvensen av filamentasjon og lengden på de dannede filamentene. Dataene oppnådd fra mutantstammene normaliseres til det som er oppnådd fra referansestammen, som er tilstede i samme vevsområde, og gir dermed en intern kontroll. Dette systemet har gjort det mulig for oss å skjerme flere serier av C. albicans mutantstammer, hvorav mange har morfogenesedefekter in vitro ^9,10. Mange av disse stammene filament lett in vivo, og fremhever viktigheten av in vivo-modeller for undersøkelse av morfogenese.

Protocol

Studiene i denne protokollen ble godkjent av University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Se CDCs retningslinjer for utstyr og prosedyrer for arbeid med BSL2-organismer¹³.

1. Forberedelse av Candida albicans-stammer

1. Identifiser en passende referansestamme for bruk som en positiv kontroll. Sørg for at denne stammen samsvarer tett med de eksperimentelle stammene når det gjelder avstamning og genetiske manipulasjoner.
   MERK: For de representative eksperimentene som presenteres her, ble mutantene opprettet fra stammene beskrevet i Homann, et ^al.14, som ble konstruert fra SN152. Disse mutantene er Arg^-. Derfor var referansestammen valgt SN250, som også ble opprettet fra SN152 og er også Arg^-. Ernæringsmessige stressorer er kritiske i reguleringen av polarisert vekst i gjær Saccharomyces cerevisiae¹⁵; de har også vært innblandet i filamentasjon i C. albicans og andre sopp^16,17,18. Derfor bør referansestammen matches for auxotrofeer med eksperimentelle stammer når det er mulig for å unngå potensielle forstyrrende effekter fra ernæringsmessig stress.
2. Velg fluorescerende proteinuttrykkskonstruksjoner. Når du screener en rekke eksperimentelle stammer, opprett en referansestamme som uttrykker ett fluorescerende protein og bruk andre fluorescerende proteiner for å markere mutantstammene.
   MERK: De representative dataene som presenteres her, bruker NEON for referansestammen og iRFP for mutantstammene. Ethvert fluorescerende protein kan brukes hvis det er sterkt uttrykt, relativt lyst og i stand til å bli begeistret / oppdaget av mikroskopet som brukes. Kontrolleksperimenter som sammenligner referansestammer som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner, har ikke vist noen innvirkning av fluorescerende proteinuttrykk på morfogenese.
3. Transformer stammene med fluorescerende proteinuttrykkskonstruksjoner.
   MERK: Mange institusjoner krever bruk av forholdsregler for biologisk sikkerhetsnivå 2 for arbeid med C. albicans. Alt arbeid skal følge lokale sikkerhetsforskrifter. Uavhengig av lokale forskrifter, må etterforskere som arbeider med C. albicans få opplæring i sikker håndtering av organismen.
   1. Transformer referanse- og eksperimentelle stammer ved hjelp av standard litiumacetatprotokoller¹⁹.
      MERK: Eksperimentene beskrevet her bruker pENO1-NEON-NAT R og pENO1-iRFP-NAT^R plasmider, sjenerøst levert av Dr. Robert Wheeler^11,12. Plasmider ble linearisert ved hjelp av NotI⁹.
   2. Velg transformantene basert på vekst på nourseothricin eller annet relevant seleksjonsmedium.
   3. Identifiser vellykkede transformanter. Velg en liten klatt celler fra hver koloni ved hjelp av en tannpirker, og bland dem deretter inn i en 2,5 μL dråpe vann på et mikroskopglass. Påfør en coverslip og undersøk ved 10x-40x forstørrelse. Undersøk med et konfokalt bildebehandlingssystem (brukes til resten av protokollen) eller et hvilket som helst standard bredfeltfluorescensmikroskop. Passende transformanter vil ha et lyst signal med passende eksitasjons- og emisjonsbølgelengder.
      MERK: For de representative resultatene ble NEON-uttrykkende stammer visualisert ved hjelp av et oppreist fluorescensmikroskop med et langpassfilter satt med et 472/30 nm båndpasseksitasjonsfilter, et 520/35 nm båndpassutslippsfilter og en 495 nm enkeltkantet dikroisk strålesplitter. Fordi iRFP ikke er synlig for øyet, ble iRFP som uttrykker stammer visualisert ved hjelp av det konfokale mikroskopisystemet som brukes til in vivo-avbildning , ved hjelp av en 638 nm laser for eksitasjon og deteksjon av utslippslys fra 655-755 nm.
      1. Alternativt kan du evaluere makroskopisk kolonifluorescens ved hjelp av fluorescensstereomikroskopi, håndholdte fluorescenseksitasjonssystemer eller fluorescensdeteksjonssystemer som vanligvis brukes til geler og vestlige flekker.
      2. Opprett fryselagre med valgte transformanter.
4. Inokulere YPD (gjærekstrakt peptondekstrose) faste medier med en fluorescerende proteinuttrykkende referanse og eksperimentelle stammer fra fryselager 3 dager før injeksjon, ved hjelp av en tannpirker for å overføre en dab av organismer fra fryselageret til YPD faste medier. Inkuber ved 30 °C i 2 dager.
5. For hver stamme, inokulere en kolbe som inneholder 25 ml YPD med C. albicans celler tatt fra flere kolonier 1 dag før injeksjon. Gjør dette ved å bruke en tannpirker for å overføre en dab av organismer fra en koloni til YPD; Gjenta flere ganger for å få celler fra flere forskjellige kolonier. Inkuber over natten ved 30 °C i en orbital shaker-inkubator ved 175 o / min.
   MERK: Det er viktig å bruke flere kolonier som kilde for inokulum fordi C. albicans har en høy frekvens av spontane genetiske endringer. Bruk av flere kolonier når du starter inokulumkulturen minimerer sjansen for at alle organismer i inokulum oppstår fra en forelder med betydelige spontane endringer.
6. På injeksjonsdagen:
   1. Sentrifuge 1 ml av kulturen i 2 minutter ved 500 x g.
   2. Vask kulturen tre ganger med 1 ml steril Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (dPBS). Etter den endelige vasken, resuspender pelleten i 1 ml steril dPBS.
   3. Fortynn en prøve av den vaskede kulturen kl. 1:100 og tell ved hjelp av et hemocytometer.
   4. Juster tettheten av den vaskede kulturen til 1 x 10⁸ organismer per ml ved hjelp av dPBS.
   5. For hvert sett med stammer som skal injiseres, lag inokulumet ved å blande like volumer av referansestammen og eksperimentelle stammer (er). Dette opprettholder tettheten av inokulum på 1 x 10⁸ organismer per ml.
      MERK: Antall stammer som kan evalueres per øre, er begrenset av mikroskopisystemets evne til å tydelig diskriminere signalet fra hvert fluorescerende protein.
   6. Når inokulumet er forberedt, fortsett direkte til dyreinjeksjonene. Ikke oppbevar inokulum før bruk.

2. Forberedelse av dyr

1. Få godkjenning fra den lokale Institutional Animal Care and Use Committee eller det relevante lokale styringsorganet.
2. Få 6-12 uker gamle mus fra en leverandør eller avlsprogram. Hus mus i anlegget der de skal leve gjennom hele forsøket i minst 1 uke før inokulering.
   MERK: For de representative resultatene ble 6 uker gamle kvinnelige DBA2 / N-mus brukt.
3. Fôr dyr klorofyllfri chow i minst 7 dager før inokulering.

3. Hårfjerning og inokulering

1. Indusere et kirurgisk anestesiplan (figur 1).
   FORSIKTIG: Inhalerte bedøvelsesmidler er farlige stoffer og kan forårsake øye- eller hudirritasjon samt toksisitet i nervesystemet. Alle institusjonelle retningslinjer og prosedyrer og generell laboratoriesikkerhetspraksis for bruk av inhalerte anestetika må følges. Bare personer som er opplært i bruk av inhalerte anestetika kan utføre disse trinnene. Standard praksis inkluderer bruk av hansker, laboratoriefrakk, øyevern, bruk av et anestesi-scavenger-system og nøye journalføring i henhold til institusjonelle retningslinjer.
   1. Plasser en mus i et forvarmet anestesiinduksjonskammer. Hold dyret i et varmt miljø gjennom generell anestesi. Oppnå dette ved hjelp av varmeputer designet for dette formålet og et oppvarmet mikroskopstadium. Ikke bruk en over-the-counter varmepute, da den kan overopphetes og forårsake brannskader.
   2. Gi 2%-3% isofluran til induksjonskammeret til musen har mistet sin rette refleks og respirasjonen er langsom og stabil. Rens anestesiens induksjonskammer og overfør dyret til en ikke-rebreather nesekjegle som gir 1% -2% isofluran.
   3. Valider anestesiplanet ved hjelp av tåklemmerefleksen eller andre verifikasjonsmekanismer. Gjennom hele forsøket, overvåke dyrets respiratoriske mønster og bedøvelsesplan, og juster bedøvelseskonsentrasjonen etter behov.
   4. Påfør øye smøremiddel for å forhindre uttørking av hornhinnen.
2. Hårfjerning (figur 1C,D)
   1. Påfør en over-the-counter hårfjerningskrem liberalt på den indre og ytre overflaten av begge ørene ved hjelp av en bomullspinne.
   2. Etter 2-3 minutter (eller i henhold til produsentens anvisninger), tørk forsiktig øret med en tørr gasbind for å fjerne all krem og hår. Tørk to ganger til med gasbind mettet i sterilt vann for å fjerne hårfjerningskremrester. Unnlatelse av å fjerne all hårfjerningskrem vil resultere i hudirritasjon / betennelse.
3. Injeksjon (figur 1E, F)
   1. Tørk overflaten av øret som skal injiseres med en gasbind pute mettet i 70% etanol og la det lufttørke.
   2. Bland inokulumet godt ved å invertere flere ganger eller vortexing.
   3. Trekk opp 20-30 μL inokulum i en insulinsprøyte. Hold nålen pekende oppover, bank forsiktig på sprøyten for å sikre at det er luft i sylinderen øverst. Kast forsiktig ut luft og overflødig inokulum tilbake i inokulumrøret eller et avfallsrør slik at stempelet er på 10 μL-merket.
   4. Bruk en fingerbøl på en finger eller tommel av den ikke-dominerende hånden, stabilisere øret ved å pakke det over fingerbøl. Alternativt kan du bruke over-the-counter dobbeltsidig hud tape (mote tape) til en liten konisk eller rundbunnet plast rør og drapere øret over tape. Pass på at du ikke løsner anestesi nesekeglen mens du gjør dette. Det kan være nyttig å tape nosecone til arbeidsflaten.
      MERK: Enten den indre eller ytre siden av øret kan injiseres basert på den fysiske komforten til etterforskeren. For mikroskopi, sørg for å plassere musen slik at siden av det injiserte øret vender mot objektivlinsen.
   5. Hold sprøytenålen nesten helt parallelt med huden og unngå store vener, stikk spissen av nålen inn i det ytterste laget av huden til skråkanten nettopp er dekket.
   6. Injiser inokulum sakte intradermalt. En god intradermal injeksjon vil heve en liten boble i huden. Hold nålen på plass i 15-20 s før du fjerner den fra øret for å minimere lekkasje.
      1. Hvis undersiden av dyrets øre blir fuktig, var nålen for dyp og passerte helt gjennom øret. I så fall gjenta injeksjonen i et annet område av øret.
   7. Gjenta prosessen ved hjelp av dyrets andre øre. Dette kan gjøres med de samme C. albicans-stammene for en replikasjon eller med et annet sett med C. albicans-stammer.
   8. Hvis ikke bildebehandling umiddelbart, plasser dyret i et oppvarmet gjenopprettingskammer. Observer dyret til det har gjenopprettet fra anestesi, og returner det deretter til boligburet.
   9. Etter institusjonelle protokoller, merk buret tydelig med biohazard-etiketter og angi at dyr i buret er infisert med Candida albicans.
   10. Fullfør all nødvendig journalføring relatert til dyrebedøvelse og annen nødvendig institusjonell praksis.
   11. Hus dyret i dyreanleggsforhold ved hjelp av forholdsregler for dyrebiologisk sikkerhetsnivå 2.

4. Kvantifiser in vitro morfogenese for sammenligning med in vivo resultater

1. Ved å bruke de samme vasket kulturer som ble brukt til å forberede inokulumet, opprett en 1:50 fortynning av organismer i RPMI1640 + 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og inkuber ved 37 ° C med tumbling i 4 timer. Alternativt kan andre medier som stimulerer morfogenese in vitro brukes.
2. Sentrifuge prøven i 5 min ved 500 x g og resuspendere i 0,5 ml dPBS.
3. Fortynn prøven i forholdet 1:10, plasser 2,5 μL av den fortynnede prøven på et mikroskopglass, og dekk det med et deksel.
4. Undersøk prøven ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Telle minst 100 celler, registrere antall gjær og filamentøse celler for hver stamme. I de representative resultatene som presenteres her, er en filamentøs celle definert som en hvilken som helst celle med en lengde på mer enn dobbelt så lang som modercellen.
   MERK: Kvantifisering av in vitro morfogenese kan gjøres på samme dag som inokulering av dyrene. Det er mulig å initiere in vitro morfogenese analysen mens du forbereder inokulum til injeksjon og utføre inokulering av dyrene i løpet av 4 timers inkubasjonsperiode. Hvis alle dyreprosedyrer er fullført før slutten av inkubasjonsperioden på 4 timer, fortsett direkte til undersøkelse av de in vitro-stimulerte cellene. Alternativt kan cellene resuspenderes i 3,7 % formaldehyd i dPBS (i trinn 4,2) og lagres ved 4 °C i flere dager. De faste organismene kan da kvantifiseres etter hvert som tiden tillater det. Inokulering av dyrene må ikke utsettes på grunn av in vitro-kvantifiseringsanalysen.

5. Forberedelse for in vivo avbildning

1. Forbered mikroskopet (figur 2A).
   1. Slå på alt mikroskopiutstyret og start bildebehandlingsprogramvaren.
      1. Last inn eventuelle forhåndsbestemte bildeinnstillinger hvis tilgjengelig.
      2. Aktiver lasere og detektorer som trengs for å oppdage fluorescerende proteiner som brukes.
   2. Slå på det oppvarmede mikroskopstadiet og la det varme til 37 °C.
      MERK: Det er mulig å bruke et mikroskop med et helt lukket miljøkammer i stedet for et oppvarmet stadium.
   3. Angi et referansepunkt for z-aksen med fokusplanet øverst på forsiden av dekselet.  Dette kan gjøres ved å teipe et deksel på plass over sceneåpningen og legge en dråpe vann på dekselslippen.  Bruk et "tørt" mål med lavere forstørrelse (10x) for å fokusere på kanten av vanndråpen, og angi deretter referansepunktet for z-aksen.  Bruk et håndkle for å absorbere vannet fra dekselet før du fjerner det fra scenen.
   4. Roter målet med svært lang arbeidsavstand på plass og legg en dråpe nedsenkningsvæske på linsen. Senk linsen for å unngå mulig skade når du plasserer dekselet.
   5. Plasser en #1.5 coverslip over sceneåpningen og teip den på plass. Forsikre deg om at tapen dekker alle kantene på dekselet helt for å forhindre at væske transporterer under dekselet inn i mikroskopet. Løft målet til referansepunktet for z-aksen slik at nedsenkningsvæsken er i kontakt med både objektivlinsen og dekselet.
   6. Forbered flere stykker trykkfølsom tape slik at de er klare til bruk når du plasserer nosecone og musen.
2. Induser generell anestesi i musen som skal avbildes som ovenfor (trinn 3.1).
3. Plasser musen (figur 2B-D).
   1. Fest en nesekjegle på mikroskopstadiet med nesekonen plassert slik at den vil dekke dyrets nese helt når dyret er på plass for avbildning. Dette kan gjøres lettere med to etterforskere. Få den første etterforskeren til å plassere den bedøvede musens nese inn i nesen og flytte musen på plass for avbildning mens du fortsetter å holde nosecone over dyrets nese. Få den andre etterforskeren til å teipe nesen og slangen på plass slik at den sitter stabilt over musens nese. Når nosecone er teipet på plass, la den være der for resten av bildebehandlingsøkten.
   2. Etter å ha etablert det beste stedet å plassere nosecone, legg merke til posisjonen. For påfølgende bildebehandlingsøkter kan nosecone sikres til scenen før du bringer et dyr til mikroskopet.
   3. Plasser en dråpe sterilt vann på dekselet over objektivlinsen.
   4. Plasser musen på mikroskopstadiet. Forsikre deg om at øret er på toppen av vanndråpen og flatt mot dekselet.
   5. Bruk et ekstra (øverst) deksel for å flate ut øret.
      1. Plasser kanten av dekselet parallelt med musens kropp, med kanten som berører musen der øret møter hodet.
      2. Senk den frie kanten av dekselet til mikroskoptrinnet med en hengselbevegelse. Når dekselet kommer mot mikroskopstadiet, vil det flate ut øret. Pass på at du ikke lager bretter eller rygger i øret.
      3. Teip toppdekselet sikkert på plass slik at det holder akkurat nok trykk til å holde øret flatt. Pass på at du ikke fanger musens hår eller whiskers i båndet.
   6. Med mindre et mikroskop med et miljøkammer brukes, dekk musens kropp løst med en steril drapering for å opprettholde et normotermisk miljø.
4. Identifiser et interessefelt.
   1. Kontroller at målet er på referansepunktet for z-aksen.
   2. Bruk hvitt lys / vidvinkelbilder til å justere fokusplanet inn i ørevevet. En god strategi er å fokusere på blodårene - hvis man kan se røde blodlegemer som beveger seg i blodårene, er fokusplanet i vevet.
   3. Hvis mikroskopet er utstyrt med bredfeltfluorescensevne, bruk det til å identifisere et interessefelt. Hvis ikke, bruk konfokal bildebehandling. Generelt er bruk av bredfeltsmikroskopi for å identifisere interesseområder raskere og krever mindre bestråling av ørevevet.
      1. Bruk en filterkube for påvisning av det fluorescerende proteinet uttrykt i referansestammen, identifiser et synsfelt som har et fluorescerende signal fra referansestammen. Husk at lys som er ute av fokus, sannsynligvis vil forhindre evnen til å fokusere på individuelle organismer. Målet med dette trinnet er å identifisere et område av interesse for konfokal bildebehandling.
      2. Bytt til en filterkube som vil oppdage det fluorescerende proteinet uttrykt av den eksperimentelle stammen (e) og verifisere deres tilstedeværelse i det valgte synsfeltet.

6. Bildebehandling

1. Bestem innstillingene.
   1. Mens bildebehandlingsprogramvaren er i live konfokalmodus, undersøk interessefeltet når fokalplanet beveges gjennom z-aksen. Velg et z-akseplan med et sterkt signal fra alle fluorescerende proteiner som brukes.
   2. Juster lasereffekten og/eller bildehastigheten for å få et sterkt nok signal slik at morfologi kan bestemmes for alle celler i synsfeltet. For å unngå vevskader, bruk lavest mulig lasereffekt.
      MERK: Som med all bildebehandling, er det en balanse mellom laserkraft, anskaffelseshastighet og oppløsning. Identifiser innstillinger som tydelig identifiserer organismens morfologi mens du balanserer hastighet og laserkraft for å minimere bestråling av ørevevet. Fordi bildebehandling skjer gjennom ytre dermis, er det nødvendig med høyere lasereffekt for eksitasjon enn det som vanligvis er nødvendig for konfokal avbildning av tradisjonelle prøver montert på lysbilder. Heldigvis er nivået av romlig oppløsning som kreves for analyse av morfologi ikke ekstremt. Dermed er det lett å oppnå bilder med et tilstrekkelig signal for å bestemme organismens morfologi uten å forårsake vevskader.
   3. Når disse parametrene er etablert, bruk disse gjennom hele bildeøkten for å tjene som utgangspunkt for påfølgende bildebehandlingsøkter. Det er derfor nyttig å lagre bildeinnstillingene.
      MERK: Enkelte områder av infeksjon kan være grunnere eller dypere i vevet. Dypere områder kan kreve en økning i laserkraft. Fordi denne analysen er avhengig av den romlige fordelingen av signal i stedet for intensiteten, er det akseptabelt å endre bildeinnstillinger mellom felt etter behov.
2. Få tak i bildene.
   1. Velg et synsfelt som har tydelig filamentdannelse i referansestammen og hvor de fleste organismer er spredt ut nok til at deres morfologi kan bestemmes.
   2. Angi fokus øverst og nederst for en z-stack. Det er ikke nødvendig å dekke hele dybden av det infiserte området, men husk at organismer øverst eller nederst i det avbildede volumet vanligvis utelukkes fra analysen.
   3. Skaff z-stack-bilder, pseudofarge hver kanal for å skille hver belastning, og legg over kanalene. Lagre bildene.
   4. Gjenta for andre synsfelt. Morfogenese kan variere fra sted til sted; Derfor er det viktig å anskaffe og analysere minst tre felt fra hvert øre.

7. Manuell todimensjonal analyse: Hyppighet av filamentasjon

1. Bruk bildebehandlingsprogramvare til å utføre en maksimal projeksjon av z-stacken i et todimensjonalt bilde. Instruksjoner gitt her er for FIJI / Image J.
   1. Åpne mikroskopibilder ved hjelp av ImageJ-programvare.
   2. Bruk om nødvendig en pseudofarge på hver kanal for å muliggjøre enkel identifisering av hver C. albicans-stamme. For dette, klikk på Image > Lookup Table > LUT Color og velg den valgte pseudofargen.
   3. Konverter stakkfilen til et todimensjonalt bilde med maksimal intensitetsprojeksjon:
      1. Velg z-stack-filen. Klikk på Bilde > stabler > Z-projeksjon.
      2. Velg topp- og bunnplanet, og velg projeksjonstypen Maks intensitet.
2. Tell hver organisme sett i de maksimale projeksjonsbildene etter belastningstype (preget av kanalfarge) og morfologi.
   1. Organismer som er vesentlig overlappende eller områder med svært høy organismetetthet vil være vanskelig å telle nøyaktig. Ekskluder disse fra tellingen, men pass på å ikke introdusere bias mot filamentøse former, som er mer sannsynlig å overlappe.
   2. Filamentøse former som projiserer rett inn i eller ut av z-stacken, vises som små runde objekter i en maksimal projeksjon. På samme måte kan organismer som er avskåret av kanten av bildet se ut til å være gjær fordi filamentet er ute av synsfeltet. Dermed vil todimensjonal analyse alltid overvurdere prosentandelen gjærformer. Siden dette vil skje likt med referanse- og eksperimentstammen(e), må du alltid sammenligne eksperimentelle resultater med resultatene fra en referansestamme.
3. Utfør statistiske sammenligninger av resultatene som diktert av eksperimentell design.

8. Manuell todimensjonal analyse: Filamentlengde

1. For C. albicans kan avvikende filamentdannelse oppstå fordi: a) færre "mor" gjærceller gjennomgår morfogenese, b) filamenter vokser langsommere, eller c) filamentøs vekst initieres, men opprettholdes ikke. For å evaluere disse mulighetene, kvantifisere kurvebanelengden til hvert filament i det maksimale projeksjonsbildet som et surrogat for den sanne tredimensjonale lengden (diskutert nedenfor).
   1. Når en knopp utvikler seg på en morcelle, er det ikke mulig å fortelle om det vil bli et filament eller en gjær. For å sikre at bare filamentøse celler er inkludert i denne analysen, måler du bare organismer der dattercellen er minst dobbelt så lang som modercellen.
2. Åpne bildet med maksimalt projeksjon som ble opprettet i trinn 7.
3. På ImageJ-verktøysettet høyreklikker du på verktøyet Rett / segmentert linje og velger alternativet Segmentert linje. Det segmenterte linjealternativet lar brukeren måle filamentlengden langs en buet bane, en nødvendighet gitt plastisiteten til C. albicans filamenter.
4. Mål filamentlengden fra knopphalsen til den voksende enden av filamentet. Venstreklikk på knopphalsen; Pekeren endres til en liten firkant. Spor filamentet langs lengden, og klikk på midten av filamentet hver gang det er en kurve, sving eller endring av filamentets lange akse. Dobbeltklikk på den voksende spissen av filamentet.
5. Trykk på Ctrl + M. Dette åpner et popup-vindu som tabulerer målene Område, Gjennomsnitt, Min, Maks og Lengde. Etter å ha målt hvert filament, trykk på Control + M igjen for å legge til gjeldende måling i måletabellen.
6. Når alle filamenter er målt, kopierer og limer du inn lengdemålene i en dataanalysefil.
7. Utføre statistisk analyse for å evaluere fordelingen av filamentlengder i referansestammen og mutantstammen.

9. Manuell tredimensjonal analyse

1. For å oppnå en mer presis måling av morfogenese som unngår overestimering av gjærformer og kan tillate diskriminering mellom pseudohyphae og hyfer, rull manuelt opp og ned gjennom z-stack mens du evaluerer morfologien til hver organisme i tre dimensjoner.
2. Alternativt kan du lage et tredimensjonalt bilde av hver z-stack og analysere formen til hver organisme mens du roterer bildet.

10. Automatisert analyse

1. Bruk bildebehandlingsprogramvaren til å automatisere oppregningen av organismer og deres morfologi i to eller tre dimensjoner.
   MERK: Noen algoritmer for diskriminering av morfologityper kan introdusere skjevhet. Dermed må automatiseringsstrategier valideres nøye i forhold til eksperimentell design. Godt designet og validert automatisert bildeanalyse kan øke gjennomstrømningen av analysetrinnet.

Representative Results

Resultatene som presenteres her er basert på tidligere publiserte rapporter ^9,10. Målet med denne analysen er å kvantitativt evaluere evnen til mutante C. albicans-stammer til å gjennomgå morfogenese under aktive infeksjoner. De typiske parametrene som skiller pseudohyfer fra hyfer kan være vanskelige å evaluere i organismer som vokser i tre dimensjoner i et komplekst in vivo-miljø. Dette gjelder spesielt når man ser på de todimensjonale tverrsnittene skapt av konfokal avbildning. Derfor er denne screeninganalysen fokusert på å identifisere organismer som vokser som filamentøse versus gjær. For oppfølgingsstudier som bruker en mer grundig analyse, inkludert tredimensjonale rekonstruksjoner, kan denne metoden tilpasses for å diskriminere gjær, hyfer og pseudohypfer.

Uttrykket av et fluorescerende protein i en referanse- eller mutantstamme av C. albicans tillater enkel påvisning av stammemorfologi in vivo (figur 3 og figur 4). Generelt utføres kvantitativ lysmikroskopianalyse best når få eller ingen av pikslene i bildet er mettede. For denne protokollen forenkler imidlertid en metning av bildet ofte analysen. Fluorescerende proteinlokalisering er ikke jevn i hele cellen og er ofte høyere i modergjæren enn i filamenter. Heldigvis, for undersøkelsen av morfogenese, definerer den romlige fordeling av signalet, i stedet for dets intensitet, utfallet. Derfor, å skaffe bilder der mange piksler er mettet, forbedrer evnen til å kvantifisere morfogenese i denne analysen.

For å illustrere viktigheten av å evaluere morfogenese in vivo presenteres representative resultater for referansestammen (SN250) og to mutanter: den ene mangler transkripsjonsfaktoren Efg1 og den andre mangler adenylylsyklase Cyr1. In vitro vokser ingen av disse stammene som filamenter^20,21. Når den dyrkes in vitro i RPMI-medium supplert med 10% serum, danner referansestammen raskt filamenter, mens efg1ΔΔ- og cyr1ΔΔ-stammene ikke gjør det (figur 3 og figur 4). Under disse forholdene utviser efg1ΔΔ-mutanten noe polarisert vekst, med dattercellene litt langstrakte sammenlignet med morcellene. Dette understreker viktigheten av å bruke en klar definisjon av filamentasjon. Enhver slik definisjon er som standard vilkårlig, men det er nødvendig for konsekvent evaluering av fenotypen. For disse studiene er et filamentøst vekstmønster definert som en organisme med den lengste dimensjonen av en dattercelle mer enn dobbelt så stor som morcellen. Ved hjelp av denne definisjonen er de langstrakte efg1ΔΔ-cellene ikke filamentøse.

I samsvar med sin in vitro fenotype utviser efg1 ΔΔ en signifikant filamentasjonsdefekt in vivo: ca. 9 % av efg1ΔΔ-cellene vokste som filamenter in vivo (figur 3). Derimot vokste 53 % av cyr1ΔΔ-mutantcellene som filamenter in vivo (figur 4). Selv om antallet cyr1 ΔΔ mutantceller som gjennomgår filamentasjon in vivo var signifikant lavere enn referansestammen, representerer cyr1ΔΔ-mutantens evne til å danne filamenter in vivo en betydelig endring fra dens fullstendige mangel på morfogenese in vitro. Visuelt syntes filamentene dannet av cyr1ΔΔ-mutanten å være kortere enn referansestammen. For å evaluere dette kvantitativt ble kurvebanelengden til de filamentøse cellene målt ved hjelp av en todimensjonal projeksjon av in vivo-bildene (figur 4E). Median lengde på cyr1ΔΔ-filamenter var 29 % kortere enn filamenter av referansestammen.

Figur 1: Anestesi og inokulasjon . (A) Induksjon av anestesi ved bruk av et induksjonskammer. (B) Anestesi opprettholdes ved hjelp av en nesekegle, slik at musen kan flyttes etter behov. (C) Hårfjerningskrem påføres med en bomullsspisset applikator. Øyesmøregel har blitt brukt for å beskytte øynene under anestesi. (D) Effektiv hårfjerning av høyre øre. Sammenlign med det ubehandlede venstre øret. (E) Intradermal injeksjon av C. albicans i museøret. Øret holdes på plass ved hjelp av spissen av et konisk rør innpakket med dobbeltsidig hudbånd (motebånd). (F) Nærbilde av intradermal injeksjon. En blek boble dannes i huden, noe som er et tegn på en vellykket intradermal plassering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Forberedelse for bildebehandling . (A) Mikroskopstadium klargjort for avbildning. Anestesi nesekjeglen er sikret på plass. En coverslip er teipet til scenen som dekker linseåpningen. Ytterligere stykker tape er tilgjengelig. Det oppvarmede trinnet er forvarmet til 37 °C (ikke vist). (B) Plassering av den bedøvede musen i anestesi nesekeglen. (C) Musen roteres litt slik at den siden av øret som ble inokulert, vender mot bunndekselet/objektivlinsen. Øret blir deretter flatet mot bunndekselet og festet på plass ved å plassere en annen coverslip på toppen av øret. (D) Toppdekselet teipes til scenen for å sikre øret på plass i forhold til mikroskopstadiet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: In vitro og in vivo morfologi av efg1ΔΔ mutantstammen. (A) Widefield-bilde av WT- og efg1ΔΔ-mutantstammer etter in vitro-induksjon av filamentasjon ved å dyrke celler i RPMI + 10 % serum ved 37 °C i 4 timer. Skalastenger representerer 10 μm. Bildekontrasten ble justert ved hjelp av fotoredigeringsprogramvare for å lette visningen. (B) Prosentandel av filamentasjon in vitro observert i WT og efg1ΔΔ mutantstammer. Und = kan ikke oppdages (ingen filamenter ble oppdaget). Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra tre uavhengige eksperimenter hvor minst 100 celler ble kvantifisert. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med studentens t-test, p < 0,001). (C) Konfokal mikrografi av WT (grønn) og efg1ΔΔ mutant (rød) vokser in vivo 24 timer etter inokulering. Pilene indikerer eksempler på efg1ΔΔ mutantceller som oppfyller vår definisjon av "filamentøs". Skala bar representerer 50 μm. (D) Prosentandel av filamentasjon in vivo observert i WT og efg1ΔΔ mutantstammer. Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra to uavhengige eksperimenter. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med studentens t-test, p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: In vitro og in vivo morfologi av cyr1 ΔΔ mutantstammen. (A) Widefield-bilde av cyr1ΔΔ mutantstammen etter in vitro induksjon av filamentasjon ved å vokse celler i RPMI + 10 % serum ved 37 °C i 4 timer. Skalalinjen representerer 10 μm. Bildekontrasten ble justert ved hjelp av fotoredigeringsprogramvare for å lette visningen. (B) Prosentandel av filamentasjon in vitro observert i WT og cyr1ΔΔ mutantstammer. Und = kan ikke oppdages (ingen filamenter ble oppdaget). Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra tre uavhengige eksperimenter hvor minst 100 celler ble kvantifisert. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med studentens t-test, p < 0,001). (C) Konfokal mikrograf av WT (grønn) og cyr1ΔΔ mutant (rød) vokser in vivo 24 timer etter inokulasjon. Skalalinjen representerer 50 μm. (D) Prosentandel av filamentasjon in vivo observert i WT og cyr1ΔΔ mutantstammer. Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra to uavhengige eksperimenter. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med student t-test, p < 0,001). (E) Fordeling av filamentlengde in vivo, målt ved kurvebanelengde i en todimensjonal projeksjon av z-stacken. Hver prikk representerer lengden på ett filament. Celler som vokser som gjær ble ikke inkludert i denne analysen. Bar indikerer median filamentlengde. Fordelingen av lengder er signifikant forskjellig når den analyseres ved hjelp av en Mann-Whitney U-test (p < 0, 001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne modellen benytter konfokal mikroskopi for å få bilder av C. albicans organismer når de vokser i vevet til en pattedyrvert, slik at vi kan evaluere morfogenesefenotyper under aktiv infeksjon. Prosessen med morfogenese er sentral for C. albicans patogenese og har blitt mye studert ved hjelp av en rekke in vitro analyser 2,3,4. Imidlertid kan ingen in vitro-analyse fullt ut modellere det komplekse biokjemiske og strukturelle miljøet til verten.

Protokollen beskrevet her er fokusert på bruk av dette in vivo bildebehandlingssystemet for å skjerme en serie / bibliotek av C. albicans mutanter for å identifisere gener involvert i morfogenese under infeksjon. Bruken av C. albicans-stammer som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner gjør at vi kan kvantifisere in vivo morfogenese av C. albicans mutantstammer sammenlignet med en referansestamme. Sammenligning av morfogenese i mutanten med referansestammen innenfor samme infeksjonsområde sikrer at organismene blir utsatt for identiske miljøer. Dette muliggjør kvantitativ måling av prosentandelen celler som gjennomgår filamentasjon, samt omfanget av filamentasjon. Normalisering av målingene av mutantstammen (e) til referansestammen (e) gjør at vi bedre kan sammenligne ytelsen til en mutant til en annen.

De representative resultatene som presenteres her viser potensialet for et signifikant avvik mellom in vitro og in vivo fenotyper. C. albicans efg1ΔΔ mutantstamme brukes ofte som en negativ kontroll for morfogeneseanalyser, da den ikke klarer å filament i nesten alle in vitro-forhold ²⁰. Selv om in vivo-resultatene var svært lik in vitro-resultatene , dannet selv denne sterkt hemmede stammen av og til filamenter i vertsvevsmiljøet (figur 3). Dette understreker vertsmiljøets styrke i å utløse morfogenese.

I kontrast demonstrerer cyr1ΔΔ mutantstammen en betydelig uenighet mellom in vitro og in vivo vekst; Selv om ingen av mutantcellene gjennomgår filamentasjon in vitro, vokser omtrent halvparten av cellene som filamenter in vivo (figur 4)^10,21. Interessant nok var disse filamentene signifikant kortere enn de som ble dannet av referansestammen, noe som tyder på at CYR1 bidrar til enten filamentveksten eller evnen til å opprettholde en filamentøs fenotype. For å lette analysen av filamentlengden ble kurvebanelengden til filamentene målt ved hjelp av en todimensjonal projeksjon av bildene. I todimensjonale projeksjoner av filamenter som vokser i tre dimensjoner, vil ethvert filament som vokser på en akse som ikke er parallell med xy-planet, projisere som kortere enn den sanne lengden. Siden denne forkortingen også forekommer for referansestammen, tillater evaluering av fordelingen av filamentlengder i en todimensjonal projeksjon fortsatt en kvantitativ sammenligning mellom referanse- og mutantstammene. Analyse av filamentlengde i to snarere enn tre dimensjoner krever mindre intensiv bildeanalyse; Dermed kan den utføres relativt raskt på en typisk stasjonær datamaskin. Ved å bruke denne enklere analysen kan man inkludere filamentlengdefordeling som en del av en screeningprotokoll, noe som gir en mer nyansert forståelse av hver mutants evne til å gjennomgå morfogenese uten å forårsake betydelige forsinkelser i gjennomstrømningen.

De representative studiene som presenteres her ble utført ved bruk av DBA2 / N-mus, som har en defekt i komplementsystemet som forårsaker manglende rekruttering av nøytrofiler til stedet for C. albicans-infeksjon ²². Målet med disse studiene var å undersøke mekanismer for regulering av C. albicans filamentasjon i vertsvevet. Derfor ble DBA2 / N-mus brukt for å unngå å forstyrre resultatene på grunn av en individuell stammes følsomhet eller motstand mot nøytrofiler. Siden nøytrofil anti-C. albicans respons kan påvirke filamentasjon²³, kan nøytrofil rekruttering til infeksjonsstedet påvirke resultatene av en morfogeneseanalyse. Hvis en stamme er i stand til å filamentering in vivo , men er sterkt hemmet fra filamentasjon når nøytrofiler er tilstede, vil filamentasjon bli detektert i DBA2 / N-mus, men det er usannsynlig å bli sett ved bruk av mus med intakt nøytrofil kjemotaksis. Dermed er belastningen av musen som brukes som vert en viktig faktor når du bruker denne protokollen.

Observasjonen om at efg1ΔΔ-mutantstammen ikke klarer å filament in vivo , er usannsynlig å være relatert til vertsnøytrofile responser, fordi denne stammen heller ikke klarer å filament in vitro. Filamentasjonen observert in vivo med cyr1ΔΔ-stammen er uoverensstemmende med dens manglende filamentasjon in vitro. Data fra sebrafiskmodellen for C. albicans-infeksjon indikerer at responderende nøytrofiler er viktige for å forebygge morfogenese²⁴. Det er derfor lite sannsynlig at bruk av DBA2/N-mus, som mangler nøytrofil respons, vil forklare økningen i filamentasjon av cyr1ΔΔ in vivo sammenlignet med in vitro. Likevel påvirker in vivo-miljøet tydelig morfogenesen til cyr1ΔΔ-stammen; Dermed kan videre undersøkelser av denne stammen gi viktig informasjon om reguleringen av C. albicans morfogenese under aktive infeksjoner. Protokollen beskrevet her er utformet som en screeninganalyse for å identifisere stammer som cyr1ΔΔ-stammen som skal brukes i fremtidige studier.

Bruken av et lavstrømnings gassbedøvelsessystem er svært nyttig for denne protokollen (figur 1A, B). Under den første utviklingen av denne protokollen ble mus bedøvet ved hjelp av en injiserbar bedøvelsescocktail av ketamin blandet med xylazin. Mens det var mulig å utføre begrenset bildebehandling med den bedøvelsesmetoden, var anestesiens varighet uforutsigbar, noe som krevde at bildebehandlingsøkter ble avsluttet raskt for å unngå at musen gjenoppretter fra anestesi under avbildning. Tradisjonelle inhalerte bedøvelsessystemer er store og krever høye strømningshastigheter av bedøvelsesgasser, noe som ofte krever at de brukes i en avtrekksvifte. Dermed ville tradisjonelle inhalerte bedøvelsessystemer være svært vanskelig å bruke med plassbegrensningene til et konfokalt mikroskop uten utilsiktet å utsette etterforskerne for bedøvelsesmidlene. Bruken av et lav-flow inhalert bedøvelsessystem tillater konsekvent anestesi av dyret samtidig som det opprettholder et trygt miljø for etterforskeren. Nosecone med lav strømning tillater enkel posisjonering av dyret for både inokulering og mikroskopi. Den lille kaliber, lavvolum leveringsslangen tillater bruk av relativt lange rør, noe som gjør at anestesimaskinen kan plasseres i tilstrekkelig avstand for ikke å forstyrre mikroskopi.

Klorofyllet som er tilstede i typisk mus chow fører til betydelig vevsautofluorescens²⁵. Dette skaper betydelig støy i bildene, noe som gjør det vanskelig å få tak i bilder av høy kvalitet med høy romlig oppløsning. Når dyr ble matet klorofyllfri chow i 7 dager før avbildning, ble bakgrunnen fra autofluorescens betydelig redusert i vev, men klorofyll avsatt i håret fortsatte å være problematisk. Fjerning av håret på pinnae ved hjelp av en over-the-counter kjemisk hårfjerningskrem er effektiv for å minimere autofluorescens i håret (figur 1C, D). Dermed reduserte kombinasjonen av klorofyllfri chow og tilstrekkelig hårfjerning betydelig autofluorescens og forbedret bildekvaliteten dramatisk. Fordi håret fjernes fra øret før avbildning, påvirker ikke fargen på dyrets hår dette systemet. Denne protokollen har blitt brukt med hell for å studere C. albicans infeksjoner i BALB / c (hvit), C57BL / 6 (svart) og DBA2 / N (brun) mus. Protokollen kan også brukes med C57BL/6 knockoutmus som mangler ulike vertsgener; Dette vil tillate fremtidige undersøkelser av hvordan pattedyrets vertsimmunsystem påvirker filamentasjon. Et trekk ved denne modellen som ikke er diskutert i denne protokollen, er at fordi dette bildebehandlingssystemet er ikke-invasivt, kan det samme dyret avbildes gjentatte ganger over flere dager, slik at man kan følge utviklingen av individuell infeksjon over tid. Denne funksjonen vil trolig spille en nøkkelrolle i fremtidige studier på vert-patogen-interaksjonen.

Oppsummert resulterer denne protokollen i bilder med høy romlig oppløsning av C. albicans som vokser i vevet til en levende pattedyrvert, noe som muliggjør nøyaktig evaluering av morfogenese i mutantstammer 8,9,10. Resultatene som presenteres her viser hvordan denne protokollen kan brukes til å skjerme et bibliotek med C. albicans mutanter. Av C. albicans mutanter testet til dags dato, gjennomgår en stor del av mutanter med kjente defekter i morfogenese in vitro lett filamentasjon in vivo ^9,10. Dette fremhever viktigheten av å inkludere et in vivo-system som dette i eksperimenter designet for å belyse mekanismene til C. albicans patogenese.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 coverslips	Thermo-Fisher	20811	large enough to cover the universal stage opening
0.1 mL Insulin syringes	EXELint	26018	Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G
3.7% formaldehyde in dPBS	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% Ethanol/30% water	Decon Laboratories	A05061001A
Alcohol prep pads	Covidien	5110	Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol
C.albicans reference strain and experimental strains	SN250	FGSC Online Catalog	The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.
Chlorophyl free mouse chow	Envigo	2920x
Computer	Dell	Optiplex 7050	Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.
Cotton tip applicator	Pro Advantage	76200
DBA2/N (6-12 week old mice)			BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.  The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)	local pharmacy or grocery store		Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.  This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.  It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.  Examples:  https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	Must be sterile; open a new container for every experiment
Fetal bovine serum	Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
Gauze pad	Pro Advantage	P157112
Gel eye lurbicant	local pharmacy or grocery store
ImageJ or FIJI analysis software	NIH	ImageJ (FIJI)
Isoflurane	Akorn	J119005
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens	Leica	DMi8 (SP8)	The objective lens  (Leica 11506375) used here  is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free  spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair hair remover lotion	local pharmacy or grocery store		Over the counter depilatory cream
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids			Fluorescent protein expression transformation constructs  generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)
Pressure sensitive laboratory tape	Tape & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640 cell culture medium	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes	Falcon	352196	To safely hold the animals ear during injectinos