Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

Summary

Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.

Abstract

Candida albicans is een belangrijke ziekteverwekker bij de mens. Het vermogen om te schakelen tussen morfologische vormen staat centraal in de pathogenese; deze morfologische veranderingen worden gereguleerd door een complex signaleringsnetwerk dat wordt aangestuurd als reactie op omgevingsstimuli. Deze regulerende componenten zijn zeer bestudeerd, maar bijna alle studies gebruiken een verscheidenheid aan in vitro stimuli om filamentatie te activeren. Om te bepalen hoe morfogenese wordt gereguleerd tijdens het pathogeneseproces, hebben we een in vivo microscopiesysteem ontwikkeld om beelden met een hoge ruimtelijke resolutie te verkrijgen van organismen die hyphale vorming ondergaan in de gastheer van het zoogdier. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van dit systeem om kleine verzamelingen van C. albicans mutante stammen te screenen, waardoor we de belangrijkste regulatoren van morfogenese kunnen identificeren zoals deze optreedt op de plaats van infectie. Er worden representatieve resultaten gepresenteerd die aantonen dat sommige regulatoren van morfogenese, zoals de transcriptionele regulator Efg1, consistente fenotypen in vitro en in vivo hebben, terwijl andere regulatoren, zoals adenylcyclase (Cyr1), in vivo significant verschillende fenotypen hebben in vergelijking met in vitro.

Introduction

Candida albicans is een veel voorkomende menselijke schimmelpathogeen, die mucocutane ziekte, gedissemineerde ziekte en gelokaliseerde weefselinfecties veroorzaakt¹. Een belangrijk kenmerk van de fysiologie van C. albicans is de complexe polymorfe groei, die verband houdt met zijn rol als zowel een commensale als een pathogeen ^2,3,4. Onder rijke voedingscondities in vitro bij 30 °C groeit het meestal als een eivormige ontluikende gist. Een verscheidenheid aan omgevingstriggers, waaronder nutriëntengebrek, pH-veranderingen, groei bij 37 °C, blootstelling aan serum en groei wanneer ingebed in agar, resulteren in de overgang naar een gepolariseerd groeipatroon, wat resulteert in de vorming van echte schimmeldraden en / of pseudohyphae⁵. Het initiëren van gepolariseerde groei en de daaruit voortvloeiende groei van filamenteuze organismen wordt morfogenese genoemd.

Vanwege het belang van morfogenese in de virulentie van het organisme, is de regulatie van hyphale vorming uitgebreid bestudeerd ^6,7. Er is een complex netwerk van signaalroutes en transcriptionele regulatie dat morfogenese veroorzaakt. Ondanks de relatie van C. albicans morfogenese met pathogenese, hebben de meeste studies die morfogenese onderzoeken in vitro stimuli gebruikt om hyphale vorming te veroorzaken. Het wordt steeds duidelijker dat de verschillende in vitro modellen van filamentatie niet identiek zijn in termen van de individuele regulatoire routes die worden gestimuleerd. Bovendien komen geen in vitro groeiomstandigheden nauw overeen met de complexe omgeving van de gastheer. Gezien het belang van C. albicans als een menselijke ziekteverwekker, is het doel van dit protocol om de morfogenese ervan te onderzoeken tijdens actieve infectie in een zoogdiergastheer met behulp van een systeem met matige doorvoer, waardoor een onderzoeker C. albicans mutant bibliotheken kan screenen.

Om deze onderzoeken te vergemakkelijken, werd een in vivo beeldvormingssysteem ontwikkeld waarmee we beelden met een hoge ruimtelijke resolutie van C. albicans-cellen kunnen verkrijgen tijdens infectie van de pinna van een verdoofde muis met behulp van een omgekeerde confocale microscoop ^8,9,10. Omdat de huid van de pinna vrij dun is, kunnen deze beelden worden verkregen zonder dat weefseldissectie nodig is. Zo kunnen kwantitatieve fenotypegegevens worden gemeten op de plaats van actieve infecties in het gastheerweefsel. Het hier beschreven protocol omvat de transformatie van een referentiestam en een of meer mutante stammen met verschillende fluorescerende eiwitexpressiecassettes^11,12. De fluorescerende eiwitexpressiestammen worden vervolgens gemengd en gelijktijdig intradermaal geïnjecteerd. Nadat de infectie is vastgesteld, wordt confocale beeldvorming gebruikt om zowel de frequentie van filamentatie als de lengte van de gevormde filamenten te kwantificeren. De gegevens verkregen van de mutante stammen worden genormaliseerd tot die verkregen uit de referentiestam, die in hetzelfde weefselgebied aanwezig is, waardoor een interne controle wordt geboden. Dit systeem heeft ons in staat gesteld om met succes verschillende series C. albicans mutante stammen te screenen, waarvan er vele morfogenesedefecten hebben in vitro ^9,10. Veel van deze stammen filamenten gemakkelijk in vivo, wat het belang van in vivo modellen voor het onderzoek naar morfogenese benadrukt.

Protocol

De studies in dit protocol zijn goedgekeurd door de University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Raadpleeg de CDC-richtlijnen voor apparatuur en procedures voor het werken met BSL2-organismen¹³.

1. Bereiding van Candida albicans soorten

1. Identificeer een geschikte referentiestam voor gebruik als positieve controle. Zorg ervoor dat deze stam nauw aansluit bij de experimentele stammen in termen van afstamming en genetische manipulaties.
   OPMERKING: Voor de hier gepresenteerde representatieve experimenten werden de mutanten gemaakt van de stammen beschreven in Homann, et ^al.14, die werden geconstrueerd uit SN152. Deze mutanten zijn Arg^-. Daarom was de gekozen referentiestam SN250, die ook is gemaakt van SN152 en ook ^Arg-is. Voedingsstressoren zijn van cruciaal belang bij de regulatie van gepolariseerde groei in de gist Saccharomyces cerevisiae¹⁵; ze zijn ook betrokken bij filamentatie in C. albicans en andere schimmels 16,17,18. Daarom moet de referentiestam voor auxotrofieën waar mogelijk worden vergeleken met de experimentele stammen om mogelijke verstorende effecten van voedingsstress te voorkomen.
2. Kies fluorescerende eiwitexpressieconstructen. Maak bij het screenen van een verscheidenheid aan experimentele stammen een referentiestam die één fluorescerend eiwit tot expressie brengt en gebruik andere fluorescerende eiwitten om de gemuteerde stammen te markeren.
   OPMERKING: De hier gepresenteerde representatieve gegevens gebruiken NEON voor de referentiestam en iRFP voor de mutante stammen. Elk fluorescerend eiwit kan worden gebruikt als het sterk tot expressie is gebracht, relatief helder is en kan worden geëxciteerd / gedetecteerd door de microscoop die wordt gebruikt. Controle-experimenten waarin referentiestammen worden vergeleken die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, hebben geen effect van fluorescerende eiwitexpressie op morfogenese aangetoond.
3. Transformeer de stammen met fluorescerende eiwitexpressieconstructen.
   OPMERKING: Veel instellingen vereisen het gebruik van biologische veiligheidsniveau 2-voorzorgsmaatregelen voor het werken met C. albicans. Alle werkzaamheden moeten de lokale veiligheidsvoorschriften volgen. Ongeacht de lokale regelgeving moeten onderzoekers die met C. albicans werken, worden opgeleid in de veilige omgang met het organisme.
   1. Transformeer de referentie- en experimentele stammen met behulp van standaard lithiumacetaatprotocollen¹⁹.
      OPMERKING: De hier beschreven experimenten gebruiken de pENO1-NEON-NAT^R en pENO1-iRFP-NAT^R plasmiden, genereus verstrekt door Dr. Robert Wheeler^11,12. Plasmiden werden gelineariseerd met notI⁹.
   2. Selecteer de transformatoren op basis van groei op nourseothricine of een ander relevant selectiemedium.
   3. Identificeer succesvolle transformanten. Kies een kleine schar cellen uit elke kolonie met behulp van een tandenstoker en meng ze vervolgens in een waterdruppel van 2,5 μL op een microscoopglaasje. Breng een coverslip aan en onderzoek met een vergroting van 10x-40x. Onderzoek met een confocaal beeldvormingssysteem (gebruikt voor de rest van het protocol) of een standaard breedveldfluorescentiemicroscoop. Geschikte transformatoren hebben een helder signaal met de juiste excitatie- en emissiegolflengten.
      OPMERKING: Voor de representatieve resultaten werden NEON-uitdrukkende stammen gevisualiseerd met behulp van een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop met een long pass-filterset met een 472/30 nm bandpass-excitatiefilter, een 520/35 nm bandpass-emissiefilter en een 495 nm enkelzijdige dichroïsche bundelsplitser. Omdat iRFP niet zichtbaar is voor het oog, werden iRFP-uitdrukkende spanningen gevisualiseerd met behulp van het confocale microscopiesysteem dat wordt gebruikt voor in vivo beeldvorming, met behulp van een 638 nm-laser voor excitatie en het detecteren van emissielicht van 655-755 nm.
      1. U kunt ook macroscopische koloniefluorescentie evalueren met behulp van fluorescentiestereomicroscopie, handgehelderde fluorescentie-excitatiesystemen of fluorescentiedetectiesystemen die meestal worden gebruikt voor gels en Western blots.
      2. Maak diepvriesvoorraden van geselecteerde transformatoren.
4. Ent YPD (gistextract pepton dextrose) vaste media met een fluorescerende eiwitexpressiereferentie en experimentele stammen uit diepvriesvoorraden 3 dagen voorafgaand aan de injectie, met behulp van een tandenstoker om een schar organismen van de diepvriesvoorraad naar de YPD vaste media over te brengen. Incubeer bij 30 °C gedurende 2 dagen.
5. Ent voor elke stam een kolf met 25 ml YPD met C. albicans-cellen uit verschillende kolonies 1 dag voorafgaand aan de injectie. Doe dit door een tandenstoker te gebruiken om een schar organismen van één kolonie naar de YPD over te brengen; herhaal meerdere keren om cellen uit verschillende kolonies te verkrijgen. Incubeer 's nachts bij 30 °C in een orbitale schudmachine-incubator bij 175 tpm.
   OPMERKING: Het is belangrijk om meerdere kolonies te gebruiken als bron voor het entmateriaal omdat C. albicans een hoge frequentie van spontane genetische veranderingen heeft. Het gebruik van meerdere kolonies bij het starten van de entcultuur minimaliseert de kans dat alle organismen in het entmateriaal ontstaan uit een ouder met significante spontane veranderingen.
6. Op de dag van injectie:
   1. Centrifugeer 1 ml van de cultuur gedurende 2 min bij 500 x g.
   2. Was de kweek driemaal met 1 ml steriele Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (dPBS). Na de laatste wasbeurt resuspenseer je de pellet in 1 ml steriele dPBS.
   3. Verdun een monster van de gewassen cultuur op 1:100 en tel met behulp van een hemocytometer.
   4. Pas de dichtheid van de gewassen cultuur aan op 1 x 10⁸ organismen per ml met behulp van dPBS.
   5. Maak voor elke set te injecteren stammen het entmateriaal door gelijke volumes van de referentiestam en experimentele stam(en) te mengen. Hierdoor blijft de dichtheid van het entmateriaal op 1 x 10⁸ organismen per ml.
      OPMERKING: Het aantal stammen dat per oor kan worden geëvalueerd, wordt beperkt door het vermogen van het microscopiesysteem dat wordt gebruikt om het signaal van elk fluorescerend eiwit duidelijk te onderscheiden.
   6. Zodra het entmateriaal is bereid, gaat u direct verder met de dierlijke injecties. Bewaar het entmateriaal niet voor gebruik.

2. Voorbereiding van dieren

1. Verkrijg goedkeuring van de lokale Institutional Animal Care and Use Committee of het relevante lokale bestuursorgaan.
2. Verkrijg muizen van 6-12 weken oud van een leverancier of fokprogramma. Huismuizen in de faciliteit waarin ze gedurende het hele experiment gedurende ten minste 1 week voorafgaand aan de inenting zullen leven.
   OPMERKING: Voor de representatieve resultaten werden 6 weken oude vrouwelijke DBA2 / N-muizen gebruikt.
3. Voer dieren chlorofylvrije chow gedurende ten minste 7 dagen voorafgaand aan de inenting.

3. Ontharing en inenting

1. Induceer een chirurgisch vlak van anesthesie (figuur 1).
   LET OP: Geïnhaleerde anesthetica zijn gevaarlijke materialen en kunnen oog- of huidirritatie en toxiciteit van het zenuwstelsel veroorzaken. Alle institutionele beleidslijnen en procedures en algemene laboratoriumveiligheidspraktijken voor het gebruik van geïnhaleerde anesthetica moeten worden gevolgd. Alleen personen die getraind zijn in het gebruik van geïnhaleerde anesthetica mogen deze stappen uitvoeren. Standaardpraktijken omvatten het dragen van handschoenen, een laboratoriumjas, oogbescherming, gebruik van een anesthesie-aasetersysteem en zorgvuldige registratie volgens institutionele richtlijnen.
   1. Plaats een muis in een voorverwarmde inductiekamer voor anesthesie. Houd het dier in een warme omgeving tijdens de algemene anesthesie. Bereik dit met behulp van warming pads die voor dit doel zijn ontworpen en een verwarmde microscoopfase. Gebruik geen vrij verkrijgbaar verwarmingskussen, omdat dit oververhit kan raken en brandwonden kan veroorzaken.
   2. Geef 2% -3% isofluraan aan de inductiekamer totdat de muis zijn rechtzettingsreflex heeft verloren en de ademhaling langzaam en gestaag verloopt. Reinig de inductiekamer van de anesthesie en breng het dier over naar een niet-rebreather neuskegel die 1% -2% isofluraan levert.
   3. Valideer het niveau van anesthesie met behulp van de teenknijflex of andere verificatiemechanismen. Controleer gedurende het experiment het ademhalingspatroon en het anesthetische vlak van het dier en pas de anesthetische concentratie indien nodig aan.
   4. Breng oogsmeermiddel aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
2. Ontharing (figuur 1C,D)
   1. Breng een vrij verkrijgbare ontharingscrème royaal aan op het binnen- en buitenoppervlak van beide oren met behulp van een wattenstaafje.
   2. Veeg na 2-3 minuten (of volgens de aanwijzingen van de fabrikant) het oor voorzichtig af met een droog gaasje om alle crème en haar te verwijderen. Veeg nog twee keer af met gaasjes verzadigd met steriel water om ontharingsresten volledig te verwijderen. Het niet verwijderen van alle ontharingscrème zal resulteren in huidirritatie / ontsteking.
3. Injectie (figuur 1E, F)
   1. Veeg het oppervlak van het oor af dat moet worden geïnjecteerd met een gaasje verzadigd met 70% ethanol en laat aan de lucht drogen.
   2. Meng het entmateriaal goed door meerdere keren om te keren of te vortexen.
   3. Zuig 20-30 μL entmateriaal op in een insulinespuit. Houd de naald omhoog gericht en tik zachtjes op de spuit om ervoor te zorgen dat eventuele lucht in de loop zich aan de bovenkant bevindt. Werp lucht en overtollig entmateriaal voorzichtig terug in de entafbuis of een afvalbuis, zodat de zuiger op de 10 μL-markering staat.
   4. Draag een vingerhoed op een vinger of duim van de niet-dominante hand en stabiliseer het oor door het over de vingerhoed te wikkelen. U kunt ook vrij verkrijgbare dubbelzijdige huidtape (modeltape) aanbrengen op een kleine conische of ronde plastic buis en het oor over de tape draperen. Zorg ervoor dat u de anesthesieneuskegel niet losmaakt terwijl u dit doet. Het kan nuttig zijn om de neuskegel op het werkoppervlak te plakken.
      OPMERKING: De binnen- of buitenkant van het oor kan worden geïnjecteerd op basis van het fysieke comfort van de onderzoeker. Voor microscopie moet u de muis zo plaatsen dat de zijkant van het geïnjecteerde oor naar de objectieflens is gericht.
   5. Houd de naald van de spuit bijna volledig parallel aan de huid en vermijd grote aderen, steek de punt van de naald in de buitenste laag van de huid totdat de schuine kant net bedekt is.
   6. Injecteer het entmateriaal langzaam intradermaal. Een goede intradermale injectie zal een kleine bubbel in de huid verhogen. Houd de naald 15-20 s op zijn plaats voordat u deze uit het oor verwijdert om lekkage te minimaliseren.
      1. Als de onderkant van het oor van het dier vochtig wordt, was de naald te diep en ging hij volledig door het oor. Herhaal in dat geval de injectie in een ander deel van het oor.
   7. Herhaal het proces met behulp van het andere oor van het dier. Dit kan worden gedaan met dezelfde C. albicans stammen voor een replica of met een andere set C. albicans stammen.
   8. Als het dier niet onmiddellijk in beeld wordt gebracht, plaatst u het dier in een verwarmde herstelkamer. Observeer het dier totdat het is hersteld van de anesthesie en breng het vervolgens terug naar de kooi.
   9. Volg institutionele protocollen, markeer de kooi duidelijk met biohazard-labels en geef aan dat dieren in de kooi zijn geïnfecteerd met Candida albicans.
   10. Voltooi alle vereiste registratie met betrekking tot dierlijke anesthesie en andere vereiste institutionele praktijken.
   11. Huisvest het dier in omstandigheden van dierenfaciliteiten met behulp van voorzorgsmaatregelen van dierbiologisch veiligheidsniveau 2.

4. Kwantificeer in vitro morfogenese voor vergelijking met in vivo resultaten

1. Gebruik dezelfde gewassen culturen die werden gebruikt om het entmateriaal te bereiden, creëer een 1:50 verdunning van organismen in RPMI1640 + 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum en incubeer bij 37 °C met tuimelen gedurende 4 uur. Als alternatief kunnen andere media worden gebruikt die morfogenese in vitro stimuleren.
2. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 500 x g en resuspenseer in 0,5 ml dPBS.
3. Verdun het monster in een verhouding van 1:10, plaats 2,5 μL van het verdunde monster op een microscoopglaasje en bedek het met een coverslip.
4. Onderzoek het monster met een fluorescentiemicroscoop. Tel ten minste 100 cellen en noteer het aantal gist- en filamenteuze cellen voor elke stam. In de hier gepresenteerde representatieve resultaten wordt een filamenteuze cel gedefinieerd als elke cel met een lengte van meer dan tweemaal de lengte van de moedercel.
   OPMERKING: Kwantificering van in vitro morfogenese kan worden gedaan op dezelfde dag als de inenting van de dieren. Het is mogelijk om de in vitro morfogenesetest te starten tijdens het voorbereiden van het entmateriaal voor injectie en de inenting van de dieren uit te voeren tijdens de incubatietijd van 4 uur. Als alle dierlijke procedures vóór het einde van de incubatietijd van 4 uur zijn voltooid, ga dan direct verder met het onderzoek van de in vitro gestimuleerde cellen. Als alternatief kunnen cellen worden geresuspendeerd in 3,7% formaldehyde in dPBS (in stap 4.2) en gedurende enkele dagen bij 4 °C worden bewaard. De vaste organismen kunnen vervolgens worden gekwantificeerd als de tijd het toelaat. De inenting van de dieren mag niet worden uitgesteld voor de in vitro kwantificeringstest.

5. Voorbereiding voor in vivo beeldvorming

1. Bereid de microscoop voor (figuur 2A).
   1. Schakel alle microscopieapparatuur in en start de beeldbewerkingssoftware.
      1. Laad, indien beschikbaar, alle vooraf bepaalde beeldinstellingen.
      2. Activeer de lasers en detectoren die nodig zijn om de fluorescerende eiwitten te detecteren die worden gebruikt.
   2. Zet het verwarmde microscoopstadium aan en laat het opwarmen tot 37 °C.
      OPMERKING: Het is mogelijk om een microscoop te gebruiken met een volledig afgesloten omgevingskamer in plaats van een verwarmd podium.
   3. Stel een referentiepunt van de z-as in met het scherpstelvlak aan de bovenkant van de coverslip.  Dit kan door een coverslip op zijn plaats over de podiumopening te plakken en een druppel water op de cover slip te plaatsen.  Gebruik een "droog" objectief met een lagere vergroting (10x) om scherp te stellen op de rand van de waterdruppel en stel vervolgens het referentiepunt van de z-as in.  Gebruik een stuk handdoek om het water van de deklip te absorberen voordat u het van het podium verwijdert.
   4. Draai het zeer lange werkafstandsobjectief op zijn plaats en plaats een druppel onderdompelingsvloeistof op de lens. Laat de lens zakken om mogelijke schade te voorkomen bij het plaatsen van de coverslip.
   5. Plaats een #1.5 coverslip over de podiumopening en plak deze op zijn plaats. Zorg ervoor dat de tape alle randen van de coverslip volledig bedekt om te voorkomen dat er vloeistof onder de coverslip in de microscoop terechtkomt. Verhoog het objectief naar het referentiepunt van de z-as, zodat de dompelvloeistof in contact komt met zowel de objectieflens als de coverslip.
   6. Bereid meerdere stukken drukgevoelige tape voor, zodat ze klaar zijn voor gebruik bij het positioneren van de neuskegel en de muis.
2. Induceer algemene anesthesie in de muis om te worden afgebeeld zoals hierboven (stap 3.1).
3. Plaats de muis (figuur 2B-D).
   1. Bevestig een anesthesieneuskegel op het microscooppodium met de neuskegel zo geplaatst dat deze de neus van het dier volledig bedekt wanneer het dier in positie is voor beeldvorming. Dit kan gemakkelijker worden bereikt met twee onderzoekers. Laat de eerste onderzoeker de neus van de verdoofde muis in de neuskegel plaatsen en de muis in positie brengen voor beeldvorming terwijl hij de neuskegel boven de neus van het dier blijft houden. Laat de andere onderzoeker de neuskegel en de slang op hun plaats plakken, zodat deze stabiel over de neus van de muis zit. Zodra de neuskegel op zijn plaats is geplakt, laat u deze daar voor de rest van de beeldvormingssessie.
   2. Nadat u de beste plaats hebt vastgesteld om de neuskegel te plaatsen, let dan op de positie ervan. Voor volgende beeldvormingssessies kan de neuskegel aan het stadium worden bevestigd voordat een dier naar de microscoop wordt gebracht.
   3. Plaats een druppel steriel water op de coverslip boven de objectieflens.
   4. Plaats de muis op het microscoopstadium. Zorg ervoor dat het oor bovenop de waterdruppel ligt en plat tegen de coverslip.
   5. Gebruik een tweede (bovenste) coverslip om het oor plat te maken.
      1. Plaats de rand van de afdekplaat parallel aan het lichaam van de muis, waarbij de rand de muis raakt waar het oor het hoofd ontmoet.
      2. Laat de vrije rand van de coverslip met een scharnierbeweging naar de microscoopfase zakken. Als de coverslip tegen het microscoopstadium komt, zal het oor worden afgevlakt. Zorg ervoor dat u geen plooien of ribbels in het oor creëert.
      3. Plak de bovenste hoeslip stevig op zijn plaats, zodat deze net genoeg druk vasthoudt om het oor plat te houden. Zorg ervoor dat u het haar of de snorharen van de muis niet in de tape vangt.
   6. Tenzij een microscoop met een omgevingskamer wordt gebruikt, bedek het lichaam van de muis losjes met een steriel gordijn om een normotherme omgeving te behouden.
4. Identificeer een interessegebied.
   1. Zorg ervoor dat het doel zich op het referentiepunt van de z-as bevindt.
   2. Gebruik wit licht/wide-field imaging om het focusvlak in het oorweefsel aan te passen. Een goede strategie is om je te concentreren op de bloedvaten - als je rode bloedcellen in de bloedvaten kunt zien bewegen, bevindt het focusvlak zich in het weefsel.
   3. Als de microscoop is uitgerust met fluorescentievermogen met een breed veld, gebruik deze dan om een interessegebied te identificeren. Zo niet, gebruik dan confocale beeldvorming. Over het algemeen is het gebruik van wide-field microscopie om interessegebieden te identificeren sneller en vereist minder bestraling van het oorweefsel.
      1. Met behulp van een filterkubus voor de detectie van het fluorescerende eiwit uitgedrukt in de referentiestam, identificeert u een gezichtsveld met een fluorescerend signaal van de referentiestam. Houd er rekening mee dat onscherp licht waarschijnlijk het vermogen om zich op individuele organismen te concentreren zal voorkomen. Het doel van deze stap is om een interessegebied te identificeren voor confocale beeldvorming.
      2. Verander naar een filterkubus die het fluorescerende eiwit detecteert dat door de experimentele stam(en) wordt uitgedrukt en hun aanwezigheid in het geselecteerde gezichtsveld verifieert.

6. Beeldvorming

1. Bepaal de instellingen.
   1. Terwijl de beeldvormingssoftware zich in live confocale modus bevindt, onderzoekt u het interessegebied terwijl het brandpuntsvlak door de z-as wordt bewogen. Kies een z-asvlak met een sterk signaal van alle fluorescerende eiwitten die worden gebruikt.
   2. Pas het laservermogen en/of de beeldsnelheid aan om een signaal te verkrijgen dat sterk genoeg is, zodat de morfologie kan worden bepaald voor alle cellen in het gezichtsveld. Om weefselschade te voorkomen, gebruikt u het laagst mogelijke laservermogen.
      OPMERKING: Zoals bij alle beeldvorming, is er een balans tussen laservermogen, acquisitiesnelheid en resolutie. Identificeer instellingen die de morfologie van het organisme duidelijk identificeren, terwijl snelheid en laservermogen in evenwicht worden gebracht om bestraling van het oorweefsel te minimaliseren. Omdat beeldvorming plaatsvindt via de buitenste dermis, is een hoger laservermogen vereist voor excitatie dan typisch nodig is voor confocale beeldvorming van traditionele monsters die op dia's zijn gemonteerd. Gelukkig is het niveau van ruimtelijke resolutie dat nodig is voor de analyse van morfologie niet extreem. Het verkrijgen van beelden met een voldoende signaal om de morfologie van het organisme te bepalen zonder weefselschade te veroorzaken, is dus gemakkelijk haalbaar.
   3. Zodra deze parameters zijn vastgesteld, gebruikt u deze gedurende de beeldvormingssessie om als uitgangspunt te dienen voor volgende beeldvormingssessies. Het is dus handig om de beeldinstellingen op te slaan.
      OPMERKING: Individuele infectiegebieden kunnen ondieper of dieper in het weefsel zijn. Diepere gebieden kunnen een toename van het laservermogen vereisen. Omdat deze test afhankelijk is van de ruimtelijke verdeling van het signaal in plaats van de intensiteit ervan, is het acceptabel om de beeldinstellingen tussen velden naar behoefte te wijzigen.
2. Verkrijg de afbeeldingen.
   1. Kies een gezichtsveld met duidelijke filamentvorming in de referentiestam en waar de meeste organismen voldoende verspreid zijn om hun morfologie te bepalen.
   2. Stel de bovenste en onderste scherpstelvlakken in voor een z-stack. Het is niet nodig om de volledige diepte van het geïnfecteerde gebied te bedekken, maar houd er rekening mee dat organismen aan de boven- of onderkant van het afgebeelde volume meestal worden uitgesloten van de analyse.
   3. Verkrijg z-stack-afbeeldingen, pseudokleur elk kanaal om elke stam te onderscheiden en leg de kanalen over elkaar. Sla de afbeeldingen op.
   4. Herhaal dit voor andere gezichtsvelden. Morfogenese kan variëren van locatie tot locatie; daarom is het belangrijk om ten minste drie velden van elk oor te verwerven en te analyseren.

7. Handmatige tweedimensionale analyse: frequentie van filamentatie

1. Gebruik beeldbewerkingssoftware om een maximale projectie van de z-stack uit te voeren in een tweedimensionale afbeelding. Instructies hier zijn voor FIJI / Image J.
   1. Open microscopieafbeeldingen met ImageJ-software.
   2. Breng indien nodig een pseudo-kleur aan op elk kanaal om een eenvoudige identificatie van elke C. albicans-stam mogelijk te maken. Klik hiervoor op Afbeelding > Opzoektabel > LUT-kleur en selecteer de gekozen pseudo-kleur.
   3. Converteer het stapelbestand naar een tweedimensionale afbeelding met maximale intensiteitsprojectie:
      1. Selecteer het z-stack bestand. Klik op Afbeelding > stapels > Z-projectie.
      2. Selecteer het bovenste en onderste vlak en selecteer het projectietype Max Intensity.
2. Tel elk organisme dat in de maximale projectiebeelden wordt gezien op stamtype (onderscheiden door kanaalkleur) en morfologie.
   1. Organismen die elkaar aanzienlijk overlappen of gebieden met een zeer hoge organismedichtheid zullen moeilijk nauwkeurig te tellen zijn. Sluit deze uit van de telling, maar zorg ervoor dat u geen bias introduceert tegen filamenteuze vormen, die eerder overlappen.
   2. Filamenteuze vormen die recht in of uit de z-stack projecteren, verschijnen als kleine ronde objecten in een maximale projectie. Evenzo kunnen organismen die door de rand van het beeld worden afgesneden, gist lijken te zijn omdat het filament buiten het gezichtsveld ligt. Tweedimensionale analyse zal dus altijd het percentage gistvormen overschatten. Aangezien dit op gelijke wijze zal gebeuren met de referentie- en experimentele stam(en), vergelijkt u de experimentele resultaten altijd met die van een referentiestam.
3. Voer statistische vergelijkingen van de resultaten uit zoals gedicteerd door het experimentele ontwerp.

8. Handmatige tweedimensionale analyse: filamentlengte

1. Voor C. albicans kan afwijkende filamentvorming optreden omdat: a) minder "moeder" gistcellen morfogenese ondergaan, b) filamenten langzamer groeien, of c) filamenten filamentgroei wordt geïnitieerd maar niet gehandhaafd. Om deze mogelijkheden te evalueren, kwantificeert u de lengte van het curvepad van elk filament in het maximale projectiebeeld als surrogaat voor de werkelijke driedimensionale lengte (hieronder besproken).
   1. Wanneer een knop zich ontwikkelt op een moedercel, is het niet mogelijk om te zeggen of het een filament of een gist zal worden. Om ervoor te zorgen dat alleen filamenteuze cellen in deze analyse worden opgenomen, meet u alleen organismen waarin de dochtercel ten minste tweemaal de lengte van de moedercel heeft.
2. Open de maximale projectieafbeelding die in stap 7 is gemaakt.
3. Klik in de ImageJ-toolset met de rechtermuisknop op het gereedschap Rechte / Gesegmenteerde lijn en kies de optie Gesegmenteerde lijn. Met de optie voor gesegmenteerde lijnen kan de gebruiker de filamentlengte langs een gebogen pad meten, een noodzaak gezien de plasticiteit van C. albicans-filamenten .
4. Meet de filamentlengte van de knophals tot het groeiende uiteinde van het filament. Klik met de linkermuisknop op de knophals; de aanwijzer verandert in een klein vierkantje. Traceer het filament over de lengte en klik op het midden van het filament telkens wanneer er een curve, draai of verandering van de lange as van het filament is. Dubbelklik op de groeipunt van het filament.
5. Druk op Control + M. Hiermee wordt een pop-upvenster geopend waarin de metingen Gebied, Gemiddelde, Min, Max en Lengte in tabelvorm worden weergegeven. Druk na het meten van elk filament nogmaals op Control + M om de huidige meting aan de meettabel toe te voegen.
6. Wanneer alle filamenten zijn gemeten, kopieert en plakt u de lengtemetingen in een gegevensanalysebestand.
7. Statistische analyse uitvoeren om de verdeling van filamentlengtes in de referentiestam en de mutantenstam te evalueren.

9. Handmatige driedimensionale analyse

1. Om een nauwkeurigere meting van morfogenese te verkrijgen die de overschatting van gistvormen vermijdt en discriminatie tussen pseudohyphae en schimmeldraden mogelijk maakt, scrolt u handmatig op en neer door de z-stack terwijl u de morfologie van elk organisme in drie dimensies evalueert.
2. U kunt ook een driedimensionale afbeelding van elke z-stack maken en de vorm van elk organisme analyseren terwijl u de afbeelding roteert.

10. Geautomatiseerde analyse

1. Automatiseer met behulp van de beeldvormingssoftware de opsomming van organismen en hun morfologie in twee of drie dimensies.
   OPMERKING: Sommige algoritmen voor de discriminatie van morfologietypen kunnen vertekening introduceren. Automatiseringsstrategieën moeten dus zorgvuldig worden gevalideerd in relatie tot het experimentele ontwerp. Goed ontworpen en gevalideerde geautomatiseerde beeldanalyse kan de doorvoer van de analysestap verhogen.

Representative Results

De hier gepresenteerde resultaten zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde rapporten ^9,10. Het doel van deze analyse is om kwantitatief het vermogen van mutante C. albicans-stammen om morfogenese te ondergaan tijdens actieve infecties kwantitatief te evalueren. De typische parameters die pseudohyphae van schimmeldraden onderscheiden, kunnen moeilijk te evalueren zijn in organismen die in drie dimensies groeien in een complexe in vivo omgeving. Dit geldt met name wanneer wordt gekeken naar de tweedimensionale doorsneden die worden gecreëerd door confocale beeldvorming. Daarom is deze screeningsanalyse gericht op het identificeren van organismen die groeien als filamenteus versus gist. Voor vervolgstudies met behulp van een meer diepgaande analyse, inclusief driedimensionale reconstructies, kan deze methode worden aangepast om gist, schimmeldraden en pseudohyphae te onderscheiden.

De expressie van een fluorescerend eiwit in een referentie- of mutante stam van C. albicans maakt een eenvoudige detectie van stammorfologie in vivo mogelijk (figuur 3 en figuur 4). Over het algemeen kan kwantitatieve lichtmicroscopieanalyse het beste worden uitgevoerd wanneer weinig tot geen van de pixels in het beeld verzadigd zijn. Voor dit protocol vereenvoudigt een verzadiging van het beeld echter vaak de analyse. Fluorescerende eiwitlokalisatie is niet uniform in de hele cel en is vaak hoger in de moedergist dan in filamenten. Gelukkig bepaalt voor het onderzoek naar morfogenese de ruimtelijke verdeling van het signaal, in plaats van de intensiteit ervan, de uitkomst. Daarom verbetert het verkrijgen van afbeeldingen waarin veel pixels verzadigd zijn het vermogen om morfogenese in deze test te kwantificeren.

Om het belang van het evalueren van morfogenese in vivo te illustreren, worden representatieve resultaten gepresenteerd voor de referentiestam (SN250) en twee mutanten: een zonder de transcriptiefactor Efg1 en de andere zonder adenylcyclase Cyr1. In vitro groeien geen van deze stammen als filamenten^20,21. Wanneer de referentiestam in vitro wordt gekweekt in RPMI-medium aangevuld met 10% serum, vormt de referentiestam snel filamenten, terwijl de efg1ΔΔ- en cyr1ΔΔ-stammen dat niet doen (figuur 3 en figuur 4). Onder deze omstandigheden vertoont de efg1ΔΔ-mutant een enigszins gepolariseerde groei, waarbij de dochtercellen enigszins langwerpig zijn in vergelijking met de moedercellen. Dit benadrukt het belang van het gebruik van een duidelijke definitie van filamentatie. Een dergelijke definitie is standaard willekeurig, maar het is noodzakelijk voor een consistente evaluatie van het fenotype. Voor deze studies wordt een filamenteus groeipatroon gedefinieerd als een organisme met de langste dimensie van een dochtercel die meer dan twee keer zo groot is als die van de moedercel. Volgens deze definitie zijn de langwerpige efg1ΔΔ-cellen niet filamenteus.

In overeenstemming met zijn in vitro fenotype vertoont de efg1ΔΔ in vivo een significant filamentatiedefect: ongeveer 9% van de efg1ΔΔ-cellen groeide in vivo als filamenten (figuur 3). Daarentegen groeide 53% van de cyr1ΔΔ mutante cellen in vivo als filamenten (figuur 4). Hoewel het aantal cyr1ΔΔ-mutantcellen dat in vivo filamentatie onderging significant lager was dan de referentiestam, betekent het vermogen van de cyr1ΔΔ-mutant om filamenten in vivo te vormen een substantiële verandering ten opzichte van het volledige gebrek aan morfogenese in vitro. Visueel bleken de filamenten gevormd door de cyr1ΔΔ mutant korter te zijn dan de referentiestam. Om dit kwantitatief te evalueren, werd de lengte van het curvepad van de filamenteuze cellen gemeten met behulp van een tweedimensionale projectie van de in vivo beelden (figuur 4E). De mediane lengte van cyr1ΔΔ filamenten was 29% korter dan filamenten van de referentiestam.

Figuur 1: Anesthesie en inenting. (A) Inductie van anesthesie met behulp van een inductiekamer. (B) Anesthesie wordt gehandhaafd met behulp van een neuskegel, waardoor de muis indien nodig kan worden verplaatst. (C) Ontharingscrème wordt aangebracht met behulp van een applicator met katoenpunt. Oogbevochtigingsgel is aangebracht om de ogen te beschermen tijdens anesthesie. (D) Effectieve ontharing van het rechteroor. Vergelijk met het onbehandelde linkeroor. (E) Intradermale injectie van C. albicans in het muizenoor. Het oor wordt op zijn plaats gehouden met behulp van de punt van een conische buis omwikkeld met dubbelzijdige huidtape (modetape). (F) Close-up van intradermale injectie. Een bleke bubbel wordt gevormd in de huid, wat een teken is van een succesvolle intradermale plaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbereiding voor beeldvorming. (A) Microscoopstadium voorbereid voor beeldvorming. De anesthesieneuskegel is op zijn plaats vastgezet. Een coverslip wordt op het podium geplakt dat de lensopening bedekt. Extra stukjes tape zijn beschikbaar. Het verwarmde stadium wordt voorverwarmd tot 37 °C (niet aangegeven). (B) Plaatsing van de verdoofde muis in de anesthesieneuskegel. (C) De muis wordt iets gedraaid zodat de kant van het oor die is ingeënt naar de onderste coverlip / objectieflens is gericht. Het oor wordt vervolgens afgeplat tegen de onderste coverslip en op zijn plaats vastgezet door een tweede coverslip bovenop het oor te plaatsen. (D) De bovenste coverslip wordt op het podium geplakt om het oor op zijn plaats te houden ten opzichte van het microscoopstadium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: In vitro en in vivo morfologie van de efg1ΔΔ mutantenstam. (A) Widefield-afbeelding van WT- en efg1ΔΔ-mutante stammen na in vitro inductie van filamentatie door groeiende cellen in RPMI + 10% serum bij 37 °C gedurende 4 uur. Schaalbalken vertegenwoordigen 10 μm. Het beeldcontrast werd aangepast met behulp van fotobewerkingssoftware om het bekijken te vergemakkelijken. (B) Percentage filamentatie in vitro waargenomen in de WT- en efg1ΔΔ-mutantenstammen. Und = niet detecteerbaar (er werden geen filamenten gedetecteerd). Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit drie onafhankelijke experimenten waarin ten minste 100 cellen werden gekwantificeerd. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). C) Confocale micrografie van WT (groen) en de efg1ΔΔ mutant (rood) die in vivo 24 uur na inenting groeit. Pijlen geven voorbeelden aan van efg1ΔΔ-mutante cellen die voldoen aan onze definitie van "filamenteus". Schaalstaaf vertegenwoordigt 50 μm. (D) Percentage filamentatie in vivo waargenomen in de WT- en efg1ΔΔ-mutante stammen. Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit twee onafhankelijke experimenten. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: In vitro en in vivo morfologie van de cyr1ΔΔ mutantenstam. (A) Widefield-afbeelding van de cyr1ΔΔ mutante stam na in vitro inductie van filamentatie door groeiende cellen in RPMI + 10% serum bij 37 °C gedurende 4 uur. De schaalbalk staat voor 10 μm. Het beeldcontrast werd aangepast met behulp van fotobewerkingssoftware om het bekijken te vergemakkelijken. (B) Percentage filamentatie in vitro waargenomen in de mutantenstammen WT en cyr1ΔΔ. Und = niet detecteerbaar (er werden geen filamenten gedetecteerd). Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit drie onafhankelijke experimenten waarin ten minste 100 cellen werden gekwantificeerd. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). (C) Confocale micrografie van WT (groen) en de cyr1ΔΔ mutant (rood) die in vivo 24 uur na inenting groeit. De schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. (D) Percentage filamentatie in vivo waargenomen in de mutantenstammen WT en cyr1ΔΔ. Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit twee onafhankelijke experimenten. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). (E) Verdeling van de filamentlengte in vivo, zoals gemeten aan de hand van de lengte van het curvepad in een tweedimensionale projectie van de z-stack. Elke stip vertegenwoordigt de lengte van één filament. Cellen die als gist groeiden, werden niet in deze analyse opgenomen. De balk geeft de mediane filamentlengte aan. De verdeling van lengtes is significant verschillend wanneer geanalyseerd met behulp van een Mann-Whitney U-test (p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit model maakt gebruik van confocale microscopie om beelden te verkrijgen van C. albicans-organismen terwijl ze groeien in het weefsel van een zoogdiergastheer, waardoor we morfogenesefenotypen tijdens actieve infectie kunnen evalueren. Het proces van morfogenese staat centraal in de pathogenese van C. albicans en is op grote schaal bestudeerd met behulp van een verscheidenheid aan in vitro assays ^2,3,4. Geen enkele in vitro test kan echter de complexe biochemische en structurele omgeving van de gastheer volledig modelleren.

Het hier beschreven protocol is gericht op het gebruik van dit in vivo beeldvormingssysteem om een reeks / bibliotheek van C. albicans-mutanten te screenen om de genen te identificeren die betrokken zijn bij morfogenese tijdens infectie. Het gebruik van C. albicans-stammen die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, stelt ons in staat om in vivo morfogenese van C. albicans mutante stammen te kwantificeren in vergelijking met die van een referentiestam. Het vergelijken van morfogenese in de mutant met de referentiestam binnen hetzelfde infectiegebied zorgt ervoor dat de organismen worden blootgesteld aan identieke omgevingen. Dit maakt kwantitatieve meting mogelijk van het percentage cellen dat filamentatie ondergaat, evenals de mate van filamentatie. Normalisatie van de metingen van de mutante stam(en) ten opzichte van die van de referentiestam stelt ons in staat om de prestaties van de ene mutant beter met de andere te vergelijken.

De hier gepresenteerde representatieve resultaten tonen het potentieel aan voor een significante discrepantie tussen in vitro en in vivo fenotypen. De C. albicans efg1ΔΔ mutante stam wordt vaak gebruikt als een negatieve controle voor morfogenese-assays omdat het in bijna alle in vitro omstandigheden niet^{filamenteert 20}. Hoewel de in vivo resultaten sterk leken op de in vitro resultaten, vormde zelfs deze ernstig belemmerde stam af en toe filamenten in de gastheerweefselomgeving (figuur 3). Dit benadrukt de kracht van de gastheeromgeving bij het activeren van morfogenese.

Daarentegen vertoont de cyr1ΔΔ mutante stam een aanzienlijke discrepantie tussen in vitro en in vivo groei; hoewel geen van de mutante cellen in vitro filamentatie ondergaat, groeit ongeveer de helft van de cellen in vivo als filamenten (figuur 4)^10,21. Interessant is dat deze filamenten significant korter waren dan die gevormd door de referentiestam, wat suggereert dat CYR1 bijdraagt aan de snelheid van filamentgroei of het vermogen om een filamenteus fenotype te behouden. Om de analyse van de filamentlengte te vergemakkelijken, werd de lengte van het curvepad van de filamenten gemeten met behulp van een tweedimensionale projectie van de afbeeldingen. In tweedimensionale projecties van filamenten die in drie dimensies groeien, zal elk filament dat groeit op een as die niet evenwijdig is aan het xy-vlak, net zo korter projecteren dan zijn werkelijke lengte. Aangezien deze foreshortening ook voorkomt voor de referentiestam, maakt het evalueren van de verdeling van filamentlengtes in een tweedimensionale projectie nog steeds een kwantitatieve vergelijking mogelijk tussen de referentie- en mutante stammen. Analyse van filamentlengte in twee in plaats van drie dimensies vereist minder intensieve beeldanalyse; het kan dus relatief snel worden uitgevoerd op een typische desktopcomputer. Het gebruik van deze eenvoudigere analyse maakt het mogelijk om filamentlengteverdeling op te nemen als onderdeel van een screeningprotocol, waardoor een genuanceerder inzicht ontstaat in het vermogen van elke mutant om morfogenese te ondergaan zonder aanzienlijke vertragingen in de doorvoer te veroorzaken.

De hier gepresenteerde representatieve studies werden uitgevoerd met behulp van DBA2/N-muizen, die een defect in hun complementsysteem hebben waardoor neutrofielen niet worden gerekruteerd naar de plaats van C. albicans-infectie ²². Het doel van deze studies was om mechanismen van de regulatie van C. albicans filamentatie in het gastheerweefsel te onderzoeken. Daarom werden DBA2/N-muizen gebruikt om te voorkomen dat de resultaten in de war raakten vanwege de gevoeligheid of resistentie van een individuele stam tegen neutrofielen. Aangezien de neutrofiele anti-C. albicans-respons de filamentatie kan beïnvloeden²³, kan neutrofielenrekrutering naar de plaats van infectie de resultaten van een morfogenesetest beïnvloeden. Als een stam in staat is om in vivo te filamenteren, maar sterk wordt geremd door filamentatie wanneer neutrofielen aanwezig zijn, zou filamentatie worden gedetecteerd in DBA2 / N-muizen, maar zou het onwaarschijnlijk zijn dat het wordt gezien bij het gebruik van muizen met intacte neutrofiele chemotaxis. De stam van de muis die als gastheer wordt gebruikt, is dus een belangrijke factor bij het gebruik van dit protocol.

De waarneming dat de efg1ΔΔ mutante stam niet in vivo filamenteert, is waarschijnlijk niet gerelateerd aan gastheerneurtrofiele reacties, omdat deze stam ook niet in vitro filamenteert. De filamentatie die in vivo wordt waargenomen met de cyr1ΔΔ-stam is discordant met het falen van filamentatie in vitro. Gegevens van het zebravismodel van C. albicans-infectie geven aan dat reagerende neutrofielen belangrijk zijn bij de preventie van morfogenese²⁴. Daarom is het onwaarschijnlijk dat het gebruik van DBA2/N-muizen, die geen neutrofiele responsen hebben, de toename van de filamentatie van de cyr1ΔΔ in vivo in vergelijking met in vitro verklaart. Niettemin heeft de in vivo omgeving duidelijk invloed op de morfogenese van de cyr1ΔΔ-stam; verder onderzoek van deze stam kan dus belangrijke informatie opleveren over de regulatie van C. albicans morfogenese tijdens actieve infecties. Het hier beschreven protocol is ontworpen als een screeningstest om stammen zoals de cyr1ΔΔ-stam te identificeren die in toekomstige studies zullen worden gebruikt.

Het gebruik van een low-flow gas anesthesiesysteem is zeer nuttig voor dit protocol (figuur 1A,B). Tijdens de eerste ontwikkeling van dit protocol werden muizen verdoofd met behulp van een injecteerbare anesthetische cocktail van ketamine gemengd met xylazine. Hoewel het mogelijk was om beperkte beeldvorming uit te voeren met die anesthesiemethode, was de duur van de anesthesie onvoorspelbaar, waardoor beeldvormingssessies snel moesten worden beëindigd om te voorkomen dat de muis tijdens de beeldvorming herstelde van anesthesie. Traditionele geïnhaleerde anesthetische systemen zijn omvangrijk en vereisen hoge stroomsnelheden van anesthetische gassen, waardoor ze vaak in een zuurkast moeten worden gebruikt. Traditionele geïnhaleerde anestheticasystemen zouden dus zeer moeilijk te gebruiken zijn met de ruimtebeperkingen van een confocale microscoop zonder de onderzoekers per ongeluk bloot te stellen aan de anesthetica. Het gebruik van een low-flow geïnhaleerd anestheticumsysteem maakt consistente anesthesie van het dier mogelijk met behoud van een veilige omgeving voor de onderzoeker. De low-flow nosecone maakt een eenvoudige positionering van het dier mogelijk voor zowel inenting als microscopie. De kleine kaliber, low-volume delivery tubing maakt het gebruik van relatief lange buizen mogelijk, waardoor het anesthesieapparaat op voldoende afstand kan worden geplaatst om microscopie niet te verstoren.

Het chlorofyl dat aanwezig is in typische muizen chow leidt tot significante weefselautofluorescentie²⁵. Dit zorgt voor aanzienlijke ruis in de beelden, waardoor het moeilijk is om beelden van hoge kwaliteit en een hoge ruimtelijke resolutie te verkrijgen. Wanneer dieren gedurende 7 dagen voorafgaand aan beeldvorming chlorofylvrije chow kregen, was de achtergrond van autofluorescentie aanzienlijk afgenomen in weefsel, maar chlorofyl afgezet in het haar bleef problematisch. Het verwijderen van het haar op de pinnae met behulp van een vrij verkrijgbare chemische ontharingscrème is effectief in het minimaliseren van autofluorescentie in het haar (figuur 1C, D). De combinatie van chlorofylvrije chow en adequate ontharing verminderde dus aanzienlijk de autofluorescentie en verbeterde de beeldkwaliteit dramatisch. Omdat het haar uit het oor wordt verwijderd voorafgaand aan de beeldvorming, heeft de kleur van het haar van het dier geen invloed op dit systeem. Dit protocol is met succes gebruikt om C. albicans-infecties te bestuderen bij BALB / c (wit), C57BL / 6 (zwart) en DBA2 / N (bruine) muizen. Het protocol kan ook worden gebruikt met C57BL/6 knock-out muizen die een tekort hebben aan verschillende gastheergenen; dit zal toekomstige onderzoeken mogelijk maken naar hoe het immuunsysteem van de gastheer van zoogdieren de filamentatie beïnvloedt. Een kenmerk van dit model dat niet in dit protocol wordt besproken, is dat, omdat dit beeldvormingssysteem niet-invasief is, hetzelfde dier gedurende meerdere dagen herhaaldelijk kan worden afgebeeld, waardoor de voortgang van individuele infectie in de loop van de tijd kan worden gevolgd. Deze functie zal waarschijnlijk een sleutelrol spelen in toekomstige studies naar de gastheer-pathogeen interactie.

Samenvattend resulteert dit protocol in beelden met een hoge ruimtelijke resolutie van C. albicans die groeien in het weefsel van een levende zoogdiergastheer, waardoor een nauwkeurige evaluatie van morfogenese in mutante stammen mogelijk is ^8,9,10. De hier gepresenteerde resultaten laten zien hoe dit protocol kan worden gebruikt om een bibliotheek van C. albicans-mutanten te screenen. Van de tot nu toe geteste C. albicans-mutanten ondergaat een groot deel van de mutanten met bekende defecten in morfogenese in vitro gemakkelijk filamentatie in vivo ^9,10. Dit benadrukt het belang van het opnemen van een in vivo systeem zoals dit in experimenten die zijn ontworpen om de mechanismen van C. albicans pathogenese op te helderen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 coverslips	Thermo-Fisher	20811	large enough to cover the universal stage opening
0.1 mL Insulin syringes	EXELint	26018	Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G
3.7% formaldehyde in dPBS	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% Ethanol/30% water	Decon Laboratories	A05061001A
Alcohol prep pads	Covidien	5110	Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol
C.albicans reference strain and experimental strains	SN250	FGSC Online Catalog	The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.
Chlorophyl free mouse chow	Envigo	2920x
Computer	Dell	Optiplex 7050	Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.
Cotton tip applicator	Pro Advantage	76200
DBA2/N (6-12 week old mice)			BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.  The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)	local pharmacy or grocery store		Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.  This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.  It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.  Examples:  https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	Must be sterile; open a new container for every experiment
Fetal bovine serum	Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
Gauze pad	Pro Advantage	P157112
Gel eye lurbicant	local pharmacy or grocery store
ImageJ or FIJI analysis software	NIH	ImageJ (FIJI)
Isoflurane	Akorn	J119005
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens	Leica	DMi8 (SP8)	The objective lens  (Leica 11506375) used here  is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free  spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair hair remover lotion	local pharmacy or grocery store		Over the counter depilatory cream
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids			Fluorescent protein expression transformation constructs  generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)
Pressure sensitive laboratory tape	Tape & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640 cell culture medium	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes	Falcon	352196	To safely hold the animals ear during injectinos