Summary
Mikrobilgisayarlı tomografi (μBT), preklinik çalışmalarda kemik yapısının değerlendirilmesinde etkili olan tahribatsız bir görüntüleme aracıdır, ancak kemik iyileşmesi nasırını analiz etmek için μBT prosedürleri konusunda fikir birliği yoktur. Bu çalışma, kırık iyileşmesinin izlenmesine izin veren adım adım bir μCT protokolü sunmaktadır.
Abstract
Mikro-bilgisayarlı tomografi (μBT), translasyonel bilim araştırmalarında kırık iyileşmesi sırasında kemiğin ve yeni oluşan kemiğin üç boyutlu (3D) morfolojisini karakterize etmek için en yaygın görüntüleme yöntemidir. Kemirgenlerde uzun kemik kırığı iyileşmesi çalışmaları tipik olarak ikincil iyileşmeyi ve mineralize bir kallus oluşumunu içerir. Oluşan nasırın şekli ve yeni oluşan kemiğin yoğunluğu, zaman noktaları ve tedaviler arasında önemli ölçüde değişebilir. Sağlam kortikal ve trabeküler kemiğin parametrelerini ölçmek için standart metodolojiler yaygın olarak kullanılsa ve ticari olarak temin edilebilen yazılımlara gömülüyken, iyileşen nasırı analiz etme prosedürleri konusunda fikir birliği eksikliği vardır. Bu çalışmanın amacı, iyileşen kallusta kemik hacmi fraksiyonunu ve kallus mineral yoğunluğunu ölçen standart bir protokolü tanımlamaktır. Protokol, görüntüleme sırasında numune hizalaması, ilgilenilen hacmin boyutu ve nasırı tanımlamak için konturlanan dilim sayısı dahil olmak üzere görüntüleme ve analiz sırasında dikkate alınması gereken farklı parametreleri açıklar.
Introduction
Mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) görüntüleme, klinik öncesi kemik araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve kemiklerin mikro yapısını değerlendirmek için noninvaziv, yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar 1,2,3,4,5. μCT, dönen bir numuneden veya dönen bir X-ışını kaynağı ve dedektörü kullanılarak elde edilen çok sayıda X-ışını görüntüsünü içerir. Algoritmalar, 3B hacimsel verileri bir görüntü dilimleri yığını biçiminde yeniden oluşturmak için kullanılır. Klinik BT, insan kemiklerinin 3D görüntülenmesi için altın standarttır ve μCT, deney hayvanlarındakemik iyileşme etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir 1,2,3,4,6,7. Mineralize kemik, X-ışını ile mükemmel kontrasta sahipken, yumuşak dokular, kontrast madde kullanılmadıkça nispeten zayıf kontrasta sahiptir. Kırık iyileşmesinin değerlendirilmesinde μCT, mineralize kallusun 3 boyutlu yapısı ve yoğunluğu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayan görüntüler üretir. İn vivo μCT taraması, kırık iyileşmesinin uzunlamasına, zaman seyri değerlendirmesi için de kullanılabilir.
μCT kullanılarak sağlam kortikal ve trabeküler kemiğin miktar tayini genellikle iyi kurulmuş ve standardize edilmiştir8. Klinik öncesi çalışmalar, kırık iyileşmesini analiz etmek için çeşitli kantifikasyon metodolojileri kullansada 9,10,11, kallus kantitifikasyonu için ayrıntılı bir μCT görüntü analizi protokolü henüz yayınlanmamıştır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, μBT görüntüleme ve kemik iyileşmesi nasırının analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol, ötenazi uygulanmış farelerden toplanan uzun kemik iyileşmeli nasırı karakterize etmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, adımların çoğu sıçanlara uygulanabilir ve ayrıca kırık kemiklerin in vivo taraması için de kullanılabilir. Protokol, belirli bir μCT sistemini ve belirli görüntü işleme, analiz ve görselleştirme yazılımını tanımlar (bkz. Malzeme Tablosu), ancak metodoloji genellikle diğer tarayıcılar ve yazılımlar için geçerlidir. Protokol, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada kullanılan fareler 16 haftalık, erkek C57BL / 6J farelerdi (ortalama ağırlık 31.45 ± 3.2 g).
1. Doku toplama ve koruma
NOT: Uygun bir fare kırığı modeli kullanın. Bu çalışma için12,13'te tarif edilen standart protokole göre orta diyafiz açık tibia kırığı modeli kullanıldı.
- Kırılma modeli deneyinin sonunda, intraperitoneal ketamin veya ksilazin enjeksiyonu (sırasıyla 500 mg / kg veya 50 mg / kg) uygulayarak fareyi ötenazi yapın.
- Makas kullanarak, kırık bölgesini bozmadan kırık kemiği orta femurdan tibiotalar ekleme kadar alın. Kemiği çevreleyen kasları çıkarın, sonraki işlem adımları sırasında kırık bölgesini desteklemek için yalnızca kemikle doğrudan temas halinde olan yumuşak dokuyu bırakın. Mikro sivrisinek düz hemostatik forseps kullanarak intramedüller pimi çıkarın.
- Numuneleri 4 °C'de formalin içinde veya -20 °C'de tuzlu su içinde saklayın. Koruma aracının seçimi, μCT'ye kadar olan amaçlanan uygulamalara bağlıdır. Bu çalışmada örnekler -20 °C'de tuzlu su içinde muhafaza edilmiştir.
2. μCT taraması
- Numune hazırlama
- Birden fazla numunenin aynı anda taranması için, altı adede kadar numuneyi özel olarak geliştirilmiş, 3D baskılı bir tarama fikstürüne (Şekil 1 A,B) veya benzerine yerleştirin. Eşzamanlı tarama, tarama süresini ve maliyetini azaltır. Bu çalışmada kullanılan özelleştirilmiş fikstür, uzun kemik örneklerini tutmak için altı yuva ve bir hidroksiapatit (HA) fantomu için bir merkez deliği içerir (Şekil 1A,B; Malzeme Tablosu).
NOT: HA fantom, μCT birimlerini (tipik olarak Hounsfield) HA yoğunluğuna (mgHA/ccm) dönüştürmek için adım 4.2'de (aşağıya bakın) bir standart olarak hizmet edecektir. - Hazırlanan fikstürü, görüş alanının çapına benzer bir şırıngaya veya konik bir tüpe yerleştirin (FOV; Şekil 1C). Bu çalışmada, 21,5 mm'lik görüş alanına uyması için 20 mm'lik bir şırınga kullanıldı.
- Tarama işlemi sırasında numunelerin kurumasını önlemek için, şırıngayı veya kanonik tüpü adım 1.3'te kullanılan koruyucu ile doldurun (bu çalışmada salin kullanılmıştır).
- Birden fazla numunenin aynı anda taranması için, altı adede kadar numuneyi özel olarak geliştirilmiş, 3D baskılı bir tarama fikstürüne (Şekil 1 A,B) veya benzerine yerleştirin. Eşzamanlı tarama, tarama süresini ve maliyetini azaltır. Bu çalışmada kullanılan özelleştirilmiş fikstür, uzun kemik örneklerini tutmak için altı yuva ve bir hidroksiapatit (HA) fantomu için bir merkez deliği içerir (Şekil 1A,B; Malzeme Tablosu).
- Tarama
- Taramadan önce, μCT makinesinin aşağıdaki gibi kalibre edildiğini onaylayın: μCT FOV'un merkez hattına bir HA fantomu yerleştirin, fantomu tarayın ve HA yoğunluğunu ölçün. Ölçülen yoğunluğun üretici tarafından sağlanan yoğunlukla tutarlı olduğundan emin olun.
- S'yi hizalayınampfikstür merkez hattı μCT FOV'un yaklaşık merkez hattı ile. Bu, numunelerin FOV içinde olmasını ve uzun eksenlerinin, elde edilen görüntülerin eksenel yönü ile yaklaşık olarak çakışan oryantasyona sahip olmasını sağlar.
NOT: Bu standartlaştırılmış oryantasyon, daha sonra analiz prosedürünün, ilgilenilen hacim içinde dikkate alınan doku miktarı gibi değişkenliklere daha az eğilimli olmasına yardımcı olabilir. - μCT sisteminin tarama parametrelerini ayarlayın (Malzeme Tablosu). Bu çalışmada kullanılan parametreler 10.5 μm (izotropik voksel boyutu), 55 kVp (enerji/yoğunluk), 145 μA (akım) ve 300 ms'dir (entegrasyon süresi). Fare trabeküllerinin yaklaşık kalınlığına (20-60 μm) göre voksel boyutunu belirleyin8. Tüm kallus örneklerinin tüm hacmini kapsadığından emin olmak için taramayı farklı görünümlerde görsel olarak inceleyin.
Şekil 1: Özelleştirilmiş tarama fikstürünün yapısı. (A) Altı numune yuvasını ve HA fantomunu (altta) gösteren tarama fikstürünün (üstte) görüntüleri. (B) Özel yuvalara yerleştirilmiş uzun kemik örneğini (üstte) ve HA fantomunu (altta) gösteren görüntüler. (C) 20 mm'lik bir şırıngaya yerleştirilmiş tarama fikstürünü gösteren resimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Görüntü segmentasyonu
NOT: Ham görüntüler, görüntü dizisi verilerine otomatik olarak yeniden oluşturulur.
- Görüntü dönüştürme: yeniden yapılandırılmış görüntü dizisi verilerini bir görüntü işleme yazılımı kullanarak DICOM görüntü dizilerine dönüştürün (bkz. Görüntü işleme, analiz ve görselleştirme için DICOM görüntü dizilerini yazılıma aktarın (Malzeme Tablosuna bakın) (Şekil 2A).
- Görüntü kırpma: her seferinde bir örnek, her görüntü yığınını kırpın ve tüm örneğin kırpılan hacme dahil edildiğinden emin olun (Şekil 2B). Kırpılan görüntüyü şu şekilde kaydedin: Ekranın sol üst tarafındaki Dosya sekmesine tıklayın, Projeyi Kaydet'i seçin ve ardından ekranda görünen seçeneklerden Proje Boyutunu En Aza İndir'i seçin. Dosya, ticari yazılım biçiminde kaydedilecektir.
- Görüntü gürültü giderme: gürültü seviyesini azaltmak ve bulanıklıkları önlemek için aşağıdaki gibi bir filtreleme yöntemi kullanın.
- Dosya sekmesine tıklayın ve Açık Veri kullanılarak işlenecek görüntüyü seçin. Açılan görüntü, ekranın sol üst köşesindeki proje görünümü penceresinde görünecektir.
- Görüntü İşleme'yi ve ardından Filtre Korumalı Alanı'nı seçmek için sağ tıklayın. Oluştur'u tıklayın.
- Özellikler penceresinde (ekranın sol alt köşesinde) aşağıdakileri gerçekleştirin: önizleme türü olarak Veri'yi seçin; Filtre'nin yanındaki açılır menüden filtre türünü seçin; yorumlama için 3D'yi seçin; çekirdek türünün yanındaki açılır menüden Ayrılabilir'i seçin; standart sapma ve çekirdek boyutu faktörü için kullanılacak değerleri her birinin yanındaki boş kutuya doldurun; seçin Girişle aynı , çıktının yanındaki açılır menüden; Uygula'yı tıklayın.
NOT: Filtre türü seçimi (kullanılabilir seçenekler iki taraflı, kutu, Gauss, ortanca, özyinelemeli üstel, sınırlayıcı, anizotropik difüzyon, yerel olmayan araçlar, keskin olmayan maskeleme ve FFT filtresidir) ve parametreler, taranan görüntülerin gürültü düzeyine ve voksel boyutuna bağlıdır. Gauss filtresi için, çekirdek boyutu faktörü için yaygın olarak kullanılan 3 x 3 x 3 ve 5 x 5 x 5 değerlerdir ve standart sapma8 için yaygın olarak 0,5-2,0 kullanılır. Bu çalışmada Gauss filtresi uygulanmış, çekirdek boyut faktörü ve standart sapma için sırasıyla 5 x 5 x 5 ve 0.8 kullanılmıştır.
- Görüntünün yeniden hizalanması
NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır. Tarama işlemi sırasında görüntüleme sisteminin koordinat eksenlerine göre uzun kemik örneklerinin yanlış hizalanması meydana geldiğinde, yanlış hizalamayı düzeltmek için dijital bir hizalama yöntemi uygulanabilir (Şekil 2C).- Aşağıdaki gibi örneğin 3B işlenmiş bir görüntüsünü oluşturun. Proje görünümü penceresinde, filtrelenmiş, kırpılmış görüntüyü seçin (adım 3.3'te oluşturulan). Açılır menüden Ekran'ı ve ardından Volume Rendering'i seçmek için sağ tıklayın, ardından Oluştur'a tıklayın. 3B oluşturulmuş görüntüyü sagital ve frontal düzlemlerde görsel olarak kontrol edin.
- Uzunlamasına eksende iyi bir hizalama elde etmek için oluşturulan hacmi manuel olarak döndürün. Döndürülen görüntülere dönüşümü aşağıdaki gibi uygulayın: özellikler penceresinde Dönüştürme Düzenleyicisi'ne tıklayın, ardından dönüştürme düzenleyicisi-manipülatörüne gidin ve açılır menüden Transformatör'ü seçin. Artık örnek döndürülebilir ve yeniden hizalanabilir. Yeniden hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, görüntüyü kilitlemek için Dönüştürme Düzenleyicisi'ne tekrar tıklayın.
- Yeni enine (eksenel) düzlem görüntü dilimleri oluşturmak için filtrelenmiş görüntüyü (adım 3.3'te oluşturulan) aşağıdaki gibi yeniden örnekleyin: Proje görünümü penceresinde, adım 3.4.2'deki görüntüyü seçin. Geometri Dönüşümü'nü seçmek için sağ tıklayın ve ardından açılır menüden Dönüştürülen Görüntüyü Yeniden Örnekle ve Oluştur'a tıklayın. Özellikler penceresinde Veri'ye gidin ve aşağıdakileri gerçekleştirin: enterpolasyon için açılır menüden Standart'ı seçin; mod için Genişletilmiş'i seçin; korumak için Voksel Boyutu'nu seçin; Dolgu değeri için, kullanılabilir boş kutuya sıfır girin. Ardından Uygula'yı tıklayın.
- İlgilenilen hacmin (VOI) tanımlanması
- Enine görüntü dilimlerinden geçin ve kırık nasırının merkez düzlemini belirleyin. Nasırın proksimal ve distal uçlarına göre VOI'yi tanımlayın. Kalır uçlarının tanımlanmasının zor olduğu durumlarda, VOI'yi kallus merkez düzleminden uzakta standartlaştırılmış bir mesafeye göre tanımlayın (Şekil 2D).
NOT: Kemiğin yeniden şekillenmesinden önceki iyileşme aşamalarında, mineralize kallusun kenarlarını tanımlamak kolaydır çünkü yeni oluşturulan dokuma kemiğin trabeküler yapısı orijinal kemiğin kortikal yapısından farklıdır. Bununla birlikte, yeniden şekillenme aşaması başladığında, yeni oluşan kemik kortikal yapıyı yavaş yavaş kazanır; Bu nedenle, nasırın kenarlarını tanımlamak giderek zorlaşır.
- Enine görüntü dilimlerinden geçin ve kırık nasırının merkez düzlemini belirleyin. Nasırın proksimal ve distal uçlarına göre VOI'yi tanımlayın. Kalır uçlarının tanımlanmasının zor olduğu durumlarda, VOI'yi kallus merkez düzleminden uzakta standartlaştırılmış bir mesafeye göre tanımlayın (Şekil 2D).
Şekil 2: Görüntü bölütleme . (A) Bir taramada altı örneği gösteren bir görüntü. (B) Tek tek örnekleri izole etmek için görüntü kırpma. (C) Yanlış hizalanmış uzunlamasına ekseni (sarı noktalı çizgi) düzeltmek için dijital hizalama. (D) VOI ve kallus merkez düzleminin tanımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Görüntü analizi
- Nasır ve kortikal kemiğin segmentasyonu
- Otomatik izleme ve izleme kenarları seçenekleriyle segmentasyon kement aracını kullanarak nasırın dış sınırını yarı otomatik olarak konturlayın (Şekil 3A) aşağıdaki gibi:
- Dönüştürülen görüntülerin yeniden birleştirilmesinin ardından (adım 3.4.3), ekranın üst kısmındaki ikinci sekme satırındaki Segmentasyon sekmesine tıklayın. Segmentasyon düzenleyicisi penceresinde, görüntünün yanındaki açılır menüden dönüştürülmüş bir görüntü (adım 3.4.3'te oluşturulan) seçin.
- MALZEMELER penceresinde Ekle'ye çift tıklayın; Bunu yaptığınızda, Malzeme3 ve Malzeme4 adlı iki sekme görünecektir. Malzeme3'ü nasır ve malzeme4'ü kortikal kemik olarak yeniden adlandırmak için sağ tıklayın.
- SEÇİM penceresinde kement simgesine tıklayın; görüntülenen seçeneklerden 2D modu için Serbest El'i , 3D Modu için İçeri'yi ve seçenekler için hem Otomatik izleme hem de Kenarları izle'yi seçin. İlgilenilen bölgeleri işaretlemek için kementi kullanın.
- Bu şekillendirme adımını VOI boyunca örneklenen dilimlerle tekrarlayın (Şekil 3B). Konturlu dilimler aralıklı olarak yerleştirilebilir (örneğin, 20 dilimle ayrılarak).
NOT: Karmaşık kallus yapılarına sahip bölgelerde, kullanıcı daha fazla parça yakalamak için konturlu dilimler arasındaki boşluğu azaltmayı düşünebilir (Şekil 3A,B). - Aşağıdaki gibi tam bir kallus etiketi (Şekil 3C,D) oluşturmak için konturlu kallus anahatları boyunca enterpolasyon yapın: MALZEMELER penceresinde, Callus dosyasını seçin (adım 4.1.1.2'de oluşturulan), ekranın üst kısmındaki Seçim sekmesine tıklayın ve açılır menüden Enterpolasyon Yap'ı seçin. SEÇİM penceresinde artı işaretine tıklayın.
- Adım 4.1.1.2'de oluşturulan Kortikal Kemik dosyasını açın. Medüller boşluk da dahil olmak üzere kortikal kemiği, 4.1.1 ve 4.1.2 adımlarında kallus için belirtildiği gibi segmentlere ayırın. (Şekil 4A,B). Adım 4.1.3'te kallus için belirtildiği gibi bir kortikal kemik etiketi oluşturmak için konturlu periosteal korteksi enterpolasyon yapın (Şekil 4C, D).
- Nasırın konturlu hacmini ve ortalama gri değerini aşağıdaki gibi hesaplayın: ekranın üst satırındaki Segmentasyon sekmesine tıklayın ve açılır menüden Malzeme İstatistikleri'ni seçin. Bu, hesaplanan tüm değerleri içeren bir tablo oluşturur. Kortikal kemik ve kallus değerleri (kortikal kemiğin çıkarılmasından sonra) ayrı ayrı sağlanır. Tablo oluşturulduktan sonra, verileri kaydetmek için Çalışma Alanına Aktar'a tıklayın.
- Otomatik izleme ve izleme kenarları seçenekleriyle segmentasyon kement aracını kullanarak nasırın dış sınırını yarı otomatik olarak konturlayın (Şekil 3A) aşağıdaki gibi:
- Gri tonlamalı birimlerin kemik mineral yoğunluğuna dönüştürülmesi
- 3 mm HA fantomunun (Şekil 4.5B) 2D görüntüsünü tüm görüntüden kırpın ve Segmentasyon'a tıklayın. HA fantomunun reçinesi beş küçük HA silindiri içerir (Şekil 1A). En yüksek yoğunluğa sahip HA silindiri için, görsel inceleme ile ilk ve son dilimleri tanımlayın.
- Fırça aracını (Şekil 5A) kullanarak ilk ve son dilimlerde (kenarlardan kaçınarak) aşağıdaki gibi iki daire çizin: MALZEMELER penceresinde, dört kez Ekle'yi tıklatın. Malzeme3, malzeme4, malzeme5 ve malzeme6'yı sırasıyla fantom1, fantom2, fantom3 ve fantom4 olarak yeniden adlandırmak için sağ tıklayın. Phantom1'i seçin, SELECTION penceresindeki fırça simgesini tıklatın ve kaydırıcıyı kullanarak fırça boyutunu (dairesel izleme) fantomun boyutuna göre ayarlayın (dairenin boyutu fantomunkinden daha küçük olmalıdır).
- Her HA silindiri için bir hacim oluşturmak üzere iki daire arasında enterpolasyon uygulayın (Şekil 5B) aşağıdaki gibi: MALZEMELER penceresinde Phantom1'i seçin, ekranın üst satırındaki Seçim sekmesine tıklayın ve açılır menüden Enterpolasyon Yap'ı seçin. SEÇİM penceresinde, Artı işaret.
- İkinci en yüksek HA yoğunluğundan başlayıp ikinci en düşük HA yoğunluğu ile biten kalan HA silindirlerinden üçü ile segmentasyon işlemini tekrarlayın (Şekil 5B). En düşük HA yoğunluğuna sahip silindir, bölümlere ayrılması genellikle zor olduğu için hariç tutulabilir.
- Analiz edilen dört HA silindirinin ortalama gri değerlerini hesaplamak için oluşturulan 3D etiketleri kullanın. Bir elektronik tablo (Malzeme Tablosuna bakın) veya benzerini kullanarak, fantom üreticisi tarafından sağlanan ortalama gri değerleri ve karşılık gelen kemik mineral yoğunluğu (BMD) değerlerini çizin. Doğrusal regresyon kullanarak BMD ile gri değerler arasında bir korelasyon denklemi oluşturun.
- Mineralize kallusun segmentasyonu ve KMY'nin hesaplanması
- Adım 4.2.5'te oluşturulan korelasyon denklemine ve mineralize ve mineralize olmayan kallusu ayırt eden seçilen eşiğe dayanarak, karşılık gelen gri değer eşiğini belirleyin. Buna göre, eşikten büyük gri değerlere sahip kallus alanını mineralize kallus olarak etiketleyin ve geri kalanını mineralize olmayan olarak etiketleyin (Şekil 6A,B). Bu çalışmada mineralize kallus için eşik olarak 250 mgHA/ccmkullanılmıştır 14,15.
- Toplam kallus ve mineralize kallus hacimlerini hesaplayın. Bu değerlere dayanarak, kemik hacmi fraksiyonunu hesaplayın (toplam kallus hacmine normalize edilmiş mineralize kallus hacmi = BV / TV). 4.2.5'te oluşturulan korelasyon denklemini kullanarak kallus KMY'sini hesaplamak için toplam kallus için ölçülen ortalama gri değeri kullanın.
NOT: Çalışmanın amacına ve analiz için kullanılan yazılıma bağlı olarak, SMI (yapı modeli indeksi), trabeküler kalınlık ve anizotropi derecesi gibi diğer parametreler hesaplanabilir.
Şekil 3: Nasır dış sınırının segmentasyonu. (A) Nasırın dış sınırının bir konturu (kırmızı çizgi). (B) VOI boyunca örneklenen dilimlerdeki konturlar (kırmızı dilimler). (C) Enterpolasyon (kırmızı hacim) ile oluşturulan bir 3D kallus etiketi. (D) C'de gösterilen kallus etiketinin bir kesiti (kortikal kemik dahil). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kortikal kemiğin segmentasyonu. (A) Korteksin periosteal yüzeyinin bir konturu (yeşil çizgi). (B) VOI boyunca örneklenen dilimlerdeki konturlar (yeşil dilimler). (C) Kortikal kemiğin (medüller boşluğu içeren; yeşil) ve periosteal korteks ve nasırın enterpolasyonlu etiketlerinden oluşturulan kallusun (kırmızı) 3 boyutlu etiketi. (D) Nasır (kırmızı) ve kortikal kemiğin (intramedüller boşluğu içeren; yeşil) bir kesiti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Gri tonlamalı birimlerin KMY'ye dönüştürülmesi. (A) HA silindirinin ilk ve son dilimlerdeki konturları (kırmızı daireler). (B) 3D enterpolasyonlu HA silindirleri (solda) ve kesitler (sağda). Kahverengi: en yüksek HA yoğunluğu; mavi: ikinci en yüksek HA yoğunluğu; menekşe: üçüncü en yüksek HA yoğunluğu; yeşil: dördüncü en yüksek HA yoğunluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Mineralize kallusun segmentasyonu. (A) Mineralize kallus (≥250 mgHA / ccm) mavi renkte, nasırın geri kalanı (<250 mgHA / ccm) kırmızı renkte ve orijinal kemiğe karşılık gelen boşluk yeşil renkte gösterilmiştir. (B) İzole edilmiş her etiketin 3D görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kırık iyileşmesi sırasında kemik oluşumunu izlemek için, yetişkin, erkek C75BL / 6J farelerinde orta diyafiz açık tibia kırığı indüklendi. Kırık, yerleşik bir sekonder iyileşme modeli olan intramedüller çivi kullanılarak stabilize edildi13. Nasır dokuları kırık sonrası 14, 21 ve 28. günlerdealındı 12. Bu zaman noktaları, iyileşmenin farklı aşamalarını temsil eder. İkincil kemik iyileşmesi sırasında endokondral kemik oluşumu, kırık boşluğundaki mikrohareketi azaltmak için daha sonraki aşamalarda mineralize olan ve kırık hattı boyunca yeni kan damarlarının oluşumuna izin veren bir fibro-kıkırdaklı (yumuşak) kallusun ilk oluşumu yoluyla ilerler13. Bu çalışmada kullanılan murin kırığı modelinde kırık sonrası 14. gün, mineralize yumuşak kallus evresini temsil etmektedir. İyileşme 14. günden 21. güne kadar ilerledikçe, mineralize yumuşak nasır tamamen yeni oluşan dokuma kemikle değiştirilir ve bu da kırık boşluğunun13 kemikli köprülenmesine neden olur. 21 ve 28. günler arasında, kortikal kemiğin karakteristik yapısını yeniden oluşturmak için nasır rezorpsiyon ve yeniden şekillenme geçirir12.
μCT görüntüleri, yukarıda açıklanan protokol kullanılarak üç zaman noktasında elde edildi ve analiz edildi. Her zaman noktasında en az 10 numune analiz edildi. Her örnek için kemik volüm fraksiyonu ve KMY hesaplandı. Kemik volüm fraksiyonu, mineralize kallus (BV) hacminin toplam kallus hacmine (TV) bölünmesiyle hesaplandı. Sonuçlar, 14. günde önemli ölçüde mineralize kallus oluşumu (Şekil 7A, B) ve iyileşme 14. günden 21. ve 28. günlere (Şekil 7A, B) ilerledikçe kemik fraksiyonu hacminde ve KMY'de artımlı artışlar gösterdi. Beklendiği gibi, toplam kallus hacmindeki düşüşle kanıtlandığı gibi, nasır 21 ve 28. günler arasında rezorpsiyon/yeniden şekillenme geçirdi (Şekil 7A,B). Nasırın kortikal köprülenmesi 28. günde önceki herhangi bir zaman noktasından daha belirgindi. Bu sonuçlar, sağlanan μCT protokolünün kemik iyileşmesinin farklı aşamalarında kemik oluşumunun ve kallus yapısının izlenmesine izin verdiğini göstermektedir.
Şekil 7: μCT kullanarak kemik iyileşmesinin izlenmesi. (A) Belirtilen kırık sonrası zaman noktalarında μCT tarafından oluşturulan iyileşme nasırının 2D (sagital, sol panel) ve 3D (sağ panel) görüntüleri. (B) BMD, kemik hacmi fraksiyonu (BV / TV) ve A'da gösterilen görüntülerden hesaplanan toplam kallus hacmi. N = 10-12 olur. Çizgi grafiğindeki noktalar ortalama ± SEM'i temsil eder. (*) p 0.05 < tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in post-hoc testi kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın amacı, kemik ve kırık iyileşme çalışmalarında genellikle temel olan 3D mineralize kallus yapısının doğru bir şekilde ölçülmesi amacıyla μCT analizi için ayrıntılı bir protokol tanımlamaktır. Protokol, görüntü görselleştirmeyi, segmentasyon/etiketlemeyi ve basitten karmaşığa değişen ölçümleri kolaylaştıran genel amaçlı, son teknoloji ürünü bir 3D görüntü analiz yazılımı platformu kullanır.
Protokoldeki en çok zaman alan görev, kortikal kemik ve medüller kanal hariç tutularak nasırın yarı otomatik segmentasyonudur. Bu bölge daha önceki birçok çalışmada da dışlanmıştır 9,16,17,18. Bazı çalışmalarda doğal kortikal kemik ve kanal bölgelerianalizlerine dahil edilmiştir 19,21, diğer çalışmalarda ise yaklaşım net değildi. Doğal kortekslerin dahil edilmesi, kırık kortekslerin parçalanmış bölgelerinin şekillendirilmesindeki zorluğu ve potansiyel öznelliği önler, ancak kallus mineralizasyon önlemlerini şişirir.
Protokol, toplam kallus hacmi, mineralize hacim, kemik hacmi fraksiyonu ve kemik mineral yoğunluğu dahil olmak üzere çıktı ölçümleri elde etmeye odaklanır. Bu parametreler kolayca yorumlanır ve literatürde yaygın olarak bildirilir. Mineralize hacim ve kemik hacmi fraksiyonu, mineralize ve mineralize olmayanları ayırt etmek için seçilen eşiğe bağlıdır, oysa kemik mineral yoğunluğu değildir. Doku mineral yoğunluğu, hem mineralize hem de mineralize olmayan kallusa dayalı kemik mineral yoğunluğu yerine, yalnızca mineralize olarak etiketlenmiş dokuya göre de hesaplanabilir. Doku mineral yoğunluğunun burulma mukavemeti ve sertliği ile ilişkili olduğu bildirilmiştir9; Bununla birlikte, bu ölçümlerin kemik mineral yoğunluğundan ziyade kısmi hacim etkilerinden ve görüntüleme çözünürlüğünden etkilenmesi daha olasıdır.
Araştırmacılar, niceliksel 3D kortikal köprüleme ile kallus gücü ve sertliği arasında iyi bir korelasyon olduğunu bildirmişlerdir (2D radyografilerde değerlendirilen kortikal köprüleme, insan hastalarda genellikle klinik olarak değerlendirilir)20. Literatürde bildirilen ek 3D kallus özellikleri, nasırın geometrik dağılımını (yani dokunun ne kadar yayıldığını) karakterize eden atalet momentlerini(10,15,19) içerir. Polar atalet momenti teorik olarak burulma direnci ile ilgilidir ve eğilme atalet momenti eğilme direnci ile ilgilidir. Bu özellikler, bu çalışmada açıklanan segmentli kallus verilerine dayanarak hesaplanabilse de, ölçülen biyomekanik özelliklerle korelasyonlarının tutarsız olduğu bildirilmiştir 9,19,2 1. Daha önce bildirilen diğer kallus özellikleri arasında bağlantı yoğunluğu, trabeküler kalınlık ve yapı modeli indeksi11,17,,2 2 bulunur. Bu parametreler genellikle trabeküler kemiği karakterize etmek için kullanılır ve μCT tarayıcı yazılımı ile kolayca hesaplanır; Bununla birlikte, kırık iyileşme kalitesi ile ilişkileri o kadar net değildir. Bu protokolde kullanılan yazılım, kemiğe özgü olmayan genel amaçlı bir programdır. Bu nedenle, trabeküler kalınlık gibi belirli kemik parametreleri bu protokolün dışında hesaplanırsa, bölümlere ayrılmış veriler daha fazla analiz için diğer programlara aktarılabilir (örneğin, Watson ve ark.23'te olduğu gibi).
Bu protokol, analiz için birden fazla programın gerekli olduğu diğer yöntemlere kıyasla, tek bir yazılım ortamından karmaşık kallus yapısı karakterizasyonu ve kalite kontrolü için ayrıntılı iş akışları sağlar2, 4. Bu nedenle, zaman tasarrufu bu protokolün potansiyel bir avantajıdır. Yazılım, doğru analiz sağlamaya yardımcı olan ve aynı zamanda tüm sonuçların paralel tablolanmasına izin veren çeşitli esnek, sofistike 3D görselleştirme yöntemlerine olanak tanır.
μCT analiz protokolü, farelerde ve sıçanlarda farklı kırılma modellerine uyarlanabilir; Diğer uygulamalar için, sonuç varyasyonunu en aza indirmeyi sağlamak için bazı kritik adımların optimizasyonu önerilir. Özellikle, VOI'nin boyutunu veya VOI içindeki konturlu dilimlerin sayısını değiştirmenin sonuçların tekrarlanabilirliği üzerindeki etkisinin araştırılması düşünülmelidir. Ayrıca, adım 3.4'te açıklandığı gibi dijital yeniden hizalamanın kullanılması önerilir, ancak analiz için farklı bir yazılım kullanılıyorsa, dijital yeniden hizalama ile ve dijital yeniden hizalama olmadan oluşturulan verileri karşılaştırarak bu adımın gerekliliğinin değerlendirilmesi gerekebilir.
Bu protokolde kallusun tanımlanması ve kortikal kemik ve ilikten ayrılması için yarı otomatik segmentasyon yaklaşımı kullanılmıştır. Parçalı kırıklar gibi nasırın yapısının son derece karmaşık olduğu durumlarda, nasırı ve korteksin periosteal yüzeyini şekillendirmek zorlaşır. Bu durumlarda, öznelliği değerlendirmek ve sınırlamaya çalışmak için şekillendirmenin birden fazla deneyci ile yapılması tavsiye edilir.
Bu protokolde sınırlamalar vardır. Protokol, görüntülerin daha sonra ek yazılımlarda analiz edilebilmesi için DICOM görüntülerinin dönüştürülmesini ve dışa aktarılmasını gerektirir; Bu adım biraz daha zaman alır ve görüntüde bir kalibrasyon fantomunun kullanılmasını gerektirebilir. Makine öğrenimine dayalı olanlar da dahil olmak üzere otomatik segmentasyon teknikleri gelişmeye devam ettikçe, protokolün manuel şekillendirme bölümlerini bu yeni tekniklerle değiştirmek avantajlı olabilir. Genel olarak, kemirgenlerde kemik iyileşmesi nasırının analizi için burada açıklanan ayrıntılı protokol, özellikle önemli μCT analizi deneyimi olmayan laboratuvarlara fayda sağlayabilir ve alan genelinde daha tutarlı ve standartlaştırılmış bir yaklaşım oluşturulmasına yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 tarafından R.A.E'ye DK121327 ve R01 AR071968 F.K. tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher chemical | SF100-20 | Used for bone tissue fixation |
| Avizo | Thermo Scientific | Image processing and analysis software | |
| Hydroxyapatite phantom | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| Image Processing Language | Scanco | Used to convert raw images to DICOM images | |
| Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps | Medline | Used to remove the intramedullary pin | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| Scanco mCT system (vivaCT 40) | Scanco | Used for µCT imaging |
References
- Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).
- Müller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
- Waarsing, J. H., et al. Detecting and tracking local changes in the tibiae of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data. Bone. 34 (1), 163-169 (2004).
- Boyd, S. K., Davison, P., Müller, R., Gasser, J. A. Monitoring individual morphological changes over time in ovariectomized rats by in vivo micro-computed tomography. Bone. 39 (4), 854-862 (2006).
- Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
- Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. Micro-CT in small animal and specimen imaging. Trends in Biotechnology. 20 (8), 34-39 (2002).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical function. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
- O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
- Bissinger, O., et al. Fully automated segmentation of callus by micro-CT compared to biomechanics. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 108 (2017).
- Brown, M. L., et al. Delayed fracture healing and increased callus adiposity in a C57BL/6J murine model of obesity-associated type 2 diabetes mellitus. PLOS One. 9 (6), 99656 (2014).
- Khajuria, D. K., et al. Aberrant structure of fibrillar collagen and elevated levels of advanced glycation end products typify delayed fracture healing in the diet-induced obesity mouse model. Bone. 137, 115436 (2020).
- Sigurdsen, U., Reikeras, O., Hoiseth, A., Utvag, S. E. Correlations between strength and quantitative computed tomography measurement of callus mineralization in experimental tibial fractures. Clinical Biomechanics. 26 (1), 95-100 (2011).
- Duvall, C. L., Taylor, W. R., Weiss, D., Wojtowicz, A. M., Guldberg, R. E. Impaired angiogenesis, early callus formation, and late stage remodeling in fracture healing of osteopontin-deficient mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (2), 286-297 (2007).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Comparison of effects of the bisphosphonate alendronate versus the RANKL inhibitor denosumab on murine fracture healing. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 196-208 (2009).
- Alentado, V. J., et al. Validation of the modified radiographic union score for tibia fractures (mRUST) in murine femoral fractures. Frontiers in Endocrinology. 13, 911058 (2022).
- Yu, K. E., et al. Enhancement of impaired MRSA-infected fracture healing by combinatorial antibiotics and modulation of sustained inflammation. Journal of Bone and Mineral Research. 37 (1), 1352-1365 (2022).
- Nyman, J. S., et al. Quantitative measures of femoral fracture repair in rats derived by micro-computed tomography. Journal of Biomechanics. 42 (7), 891-897 (2009).
- Fiset, S., et al. Experimental validation of the radiographic union score for tibial fractures (RUST) using micro-computed tomography scanning and biomechanical testing in an in-vivo rat model. The Journal of Bone and Joint Surgery. 100 (21), 1871-1878 (2018).
- Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
- Liu, Y., et al. Glucocorticoid-induced delayed fracture healing and impaired bone biomechanical properties in mice. Clinical Interventions in Aging. 13, 1465-1474 (2018).
- Watson, P. J., Fitton, L. C., Meloro, C., Fagan, M. J., Gröning, F. Mechanical adaptation of trabecular bone morphology in the mammalian mandible. Scientific Reports. 8 (1), 7277 (2018).
- Nie, C., Wang, Z., Liu, X. The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 1705-1713 (2018).
