Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av dubbelnegativa tymocyter från mustymus följt av retroviral transduktion och samodling på det deltaliknande 4-uttryckande benmärgstromala cellinje-samodlingssystemet (OP9-DL4) för ytterligare funktionell analys.
Abstract
Transducerade musomogna tymocyter kan differentieras till T-celler in vitro med hjälp av det deltaliknande 4-uttryckande benmärgstromala cellinje-samodlingssystemet (OP9-DL4). Eftersom retroviral transduktion kräver delande celler för transgenintegration, ger OP9-DL4 en lämplig in vitro-miljö för odling av hematopoetiska stamceller. Detta är särskilt fördelaktigt när man studerar effekterna av uttrycket av en specifik gen under normal T-cellutveckling och leukemogenes, eftersom det gör det möjligt för forskare att kringgå den tidskrävande processen att generera transgena möss. För att uppnå framgångsrika resultat måste en serie samordnade steg som involverar samtidig manipulation av olika typer av celler utföras noggrant. Även om dessa är mycket väletablerade procedurer, innebär bristen på en gemensam källa i litteraturen ofta att en serie optimeringar krävs, vilket kan vara tidskrävande. Detta protokoll har visat sig vara effektivt vid transducering av primära tymocyter följt av differentiering på OP9-DL4-celler. Här beskrivs ett protokoll som kan fungera som en snabb och optimerad guide för samodling av retroviralt transducerade tymocyter på OP9-DL4 stromaceller.
Introduction
OP9 benmärgs stromacellinje ger ett användbart in vitro-system för induktion av lymfopoes från flera källor av förfäder1. De första studierna som använde OP9-celler visade att bristen på makrofagkolonistimulerande faktoruttryck (MCSF) bidrog till OP9-cellinjens förmåga att stödja hematopoes och B-celldifferentiering från benmärgshärledda hematopoetiska stamceller (HSC), vilket senare också visades för embryonala stamceller (ESC)2,3,4,5 . I tidigare studier möjliggjorde genereringen av deltaliknande 1/4-uttryckande OP9-celler (OP9-DL1/OP9-DL4) induktion av T-cellinjeengagemang6 och visade förmågan att framgångsrikt rekapitulera tymmognad 7,8. Kortfattat har T-cellutveckling beskrivits genom sekventiellt uttryck av CD4- och CD8-molekyler. Omogna tymocyter är "dubbelnegativa" (DN, CD4− CD8−) och kan delas in ytterligare enligt ytuttrycket av CD44 och CD25. DN-tymocyter differentieras genom det omogna enkelpositiva (ISP) -stadiet, kännetecknat av CD8-uttryck hos möss och CD4 hos människor, följt av det dubbelpositiva (DP) -stadiet, kännetecknat av samuttrycket av CD4 och CD8, och slutligen det mogna enstaka positiva stadiet, kännetecknat av uttrycket av CD4 eller CD89. HSC uttrycker Notch1-receptorn, som normalt interagerar med den deltaliknande 4 (DL4) uttryckt på tymepitelceller för att inducera T-härstamningsdifferentiering10. Därför har intresset för OP9-DL1/4-modellen gradvis ökat, vilket har lett till en omfattande användning av detta tillvägagångssätt i en mängd olika applikationer under de senaste två decennierna 8,11,12,13. Även om DL1 och DL4 båda kan stödja T-celldifferentiering in vitro, visar de differentiella krav in vivo, och några studier har föreslagit att OP9_DL4 är effektivare än OP9_DL1 för att rekapitulera mustymmiljön 7,14.
Bland de potentiella tillämpningarna av OP9-DL1/4-systemet finns det särskilt intresse för kombinationen av detta system med transduktion av DN-celler eller HSC med retrovirala vektorer. Denna kombination är ett effektivt sätt att manipulera genuttryck under normal T-cellsutveckling och leukemogenes och har visat sig vara en effektiv metod för att inducera eller hämma funktionen hos en gen av intresse15,16,17. Denna modell har särskilt framgångsrikt använts för att studera samarbetet mellan onkogener som driver leukemi15 eftersom den är flexibel och möjliggör undersökning av effekterna av flera genkombinationer i rimlig tid, i motsats till att generera transgena möss. Dessutom har liknande modeller tidigare använts för att bedöma effekterna av att införa onkogener i normala celler15,16,17. Dessutom kräver retroviral transduktion delande celler för transgenintegration18, och medan lentiviral transduktion skulle övervinna denna begränsning genom att eliminera behovet av delande celler för transgenintegration, har vi inte kunnat uppnå den framgångsrika transduktionen av DN-tymocyter med lentivirala vektorer. Således är OP9-DL1 / DL4 ett lämpligt verktyg för odling av hematopoetiska stamceller.
Standardprotokollet för lymfopoies av transducerade tymocyter på OP9-DL4 innefattar en serie samordnade steg som måste utföras noggrant för att uppnå ett framgångsrikt resultat. Även om det här är tekniker som har tjänat samhället väl i många år, är ofta de protokoll som finns tillgängliga i litteraturen fragmenterade. Som ett resultat tvingas varje laboratorium att anpassa och optimera olika steg i proceduren, vilket kan vara tidskrävande. Här beskriver detta protokoll isoleringen av DN-tymocyter från mustymus, följt av retroviral transduktion och samodling på OP9-DL4 stromaceller för vidare funktionell analys. Detta etablerade protokoll har visat sig vara effektivt och reproducerbart vid transducering av primära tymocyter, följt av differentiering på OP9-DL4-celler eller induktion av T-cell akut lymfoblastisk leukemi15.
Protocol
Alla beskrivna djurförsök godkändes av NIH Institutional Biosafety Committee (IBC) och Animal Care and Use Committee (ACUC). Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla reagenser och material som används i detta protokoll. Se publicerade riktlinjer19 för mer information om cellodling och underhållsförfaranden som producerar retrovirusproducenter. Se figur 1 för en översikt över protokollet.
1. Starta kulturen av OP9-DL4-celler (dag 1)
- Tina OP9-DL4-cellerna snabbt genom att hålla injektionsflaskan och skaka försiktigt i ett vattenbad vid 37 °C. Överför omedelbart cellerna till ett centrifugrör innehållande 5 ml OP9-medium (MEM-alfamedium, 10% FBS, 50 E/ml penicillin/streptomycin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin) för att avlägsna kryoskyddsmedlen.
- Centrifugera vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i 1 ml OP9-medium.
- Placera 5 ml OP9-medium i en T25-kolv och tillsätt de återsuspenderade cellerna till kolven. Kultur vid 37 °C och 5 %CO2.
- Efter 2-3 dagar, subkultur cellerna med en 1: 3 split (passera cellerna varje måndag, onsdag och fredag).
OBS: Dela OP9-DL4-cellerna innan de når sammanflöde. OP9-DL4-kolven måste vara 80–90 % sammanflytande dag 6–7 och dag 8–9+ för samodling med tymocyter. Därför är det viktigt att planera hur många OP9-DL4-celler som kommer att krävas på dessa dagar medan OP9-DL4-cellerna delas.- Kassera mediet från kolven och tvätta monolagret med 1x PBS. Kassera PBS, tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin och inkubera i 1–5 minuter vid 37 °C, eller tills cellerna har lossnat från kolven. Dunka kolven för att lossa cellerna.
OBS: (Valfritt) Utvecklingen av celldissociation kan kontrolleras med mikroskopi. - Tillsätt 5 ml OP9-medium för att inaktivera trypsinet och suspendera cellerna igen genom att skölja kolvens celltäckta yta under resuspensionen.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur och suspendera igen i 3 ml OP9-medium (för en delning 1:3).
- Placera 1 ml cellsuspension i en T25-kolv som redan innehåller 5 ml färskt OP9-medium. Frys/kassera de återstående cellerna.
- För att frysa OP9-DL4-cellerna, suspendera cellerna i 90% FBS / 10% DMSO i förhållandet 1 ml frysmedium till en injektionsflaska med celler.
- Frys i 1 ml kryovialer vid -80 ° C eller i flytande kväve, beroende på framtida krav. Förvaras i flytande kväve för långvarig lagring.
- Kassera mediet från kolven och tvätta monolagret med 1x PBS. Kassera PBS, tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin och inkubera i 1–5 minuter vid 37 °C, eller tills cellerna har lossnat från kolven. Dunka kolven för att lossa cellerna.
2. Starta kulturen av retrovirusproducentcellinjen (dag 1)
- Tina snabbt den retrovirusproducerande cellinjen genom att hålla injektionsflaskan och försiktigt skaka i ett vattenbad vid 37 °C. Överför omedelbart cellerna till ett centrifugrör innehållande 5 ml retrovirusproducerande cellmedium (RPC: DMEM, 10% FBS) för att avlägsna kryoskyddsmedlet.
- Centrifugera vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i 1 ml RPC-medium.
- Placera 5 ml RPC-medium i en T25-kolv och tillsätt de återsuspenderade cellerna till kolven. Kultur vid 37 °C och 5 %CO2.
- Passera cellerna var 2-3 dagar vid en delning på 1: 5 till 1: 8.
- Doppa kolven för att lossa cellerna och suspendera cellerna igen genom att pipettera aggressivt.
OBS: Dessa celler kan avlägsnas från kolvens yta genom aggressiv pipettering utan trypsin. Alternativt trypsinisera (0,05% trypsin / 0,53 mM EDTA) tills cellerna lätt lossnar och lätt kan pipetteras till en encellssuspension.
- Doppa kolven för att lossa cellerna och suspendera cellerna igen genom att pipettera aggressivt.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 × g i 5 minuter och suspendera igen i 5 ml RPC-medium (för en delning 1:5).
- Placera 1 ml av cellsuspensionen i en T25-kolv som redan innehåller 5 ml färskt RPC-medium. Frys/kassera de återstående cellerna. Frys de retrovirusproducerande cellerna på samma sätt som beskrivits för OP9-DL4-celler (steg 1.4.4.1–1.4.4.2).
3. Börja kulturen av retrovirusproducentcellerna i 6-brunnsplattor (dag 4–5)
- Frö retrovirusproducentcellerna 18–24 timmar före transfektion vid 70–90 % sammanflöde i varje brunn av en 6-brunns vävnadsodlingsplatta i 2 ml RPC-medium och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2.
OBS: Transfekt två brunnar av retrovirusproducentcellerna för varje 2-5 × 105 till 1 × 106 tymocyter som kommer att transduceras.
4. Transfektering av retrovirusproducentcellerna för att generera retroviruset som innehåller generna av intresse (dag 5–6)
- Byt ut mediet mot ett nytt RPC-medium 1 timme före transfektion.
- Bered lipofektionsblandningar (för varje brunn på en 6-brunnsplatta – skala upp efter behov): Späd 4 μg DNA (2 μg hjälparplasmid (pCL-Eco) och 2 μg överföringsplasmid (pMIG) i 250 μL reducerat serummedium. Blanda försiktigt.
- Blanda 10 μl transfektionsreagens med 250 u l reducerat serummedium från steg 4.2. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Efter 5 minuters inkubation kombineras det utspädda DNA:t med det utspädda transfektionsreagenset (total volym = 500 μl). Blanda försiktigt och inkubera i 20–25 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt försiktigt 500 μL DNA/transfektionsreagensblandningar till brunnen som innehåller retrovirusproducentcellerna genom att släppa på cellerna med en cirkelrörelse. Blanda försiktigt genom att gunga plattan fram och tillbaka och inkubera plattan i en 37 °C inkubator i 16–24 timmar.
OBS: Subkonfluenta celler (80% -90%) är bäst lämpade för transfektion och genererar potentiellt den högsta virala titeren. Eftersom retrovirusproducentcellerna lossnar mycket lätt från kolven, undvik plötsliga rörelser vid hantering av dessa celler.
5. Ändra det retrovirusproducentella cellmediet (dag 6–7)
- Byt ut det gamla mediet cirka 16 timmar efter transfektion mot 2 ml färskt RPC-medium. Fortsätt att inkubera celler vid 37 °C i 20–24 timmar.
- Utvärdera transfektionseffektiviteten under ett fluorescensmikroskop (valfritt).
OBS: I detta protokoll är GFP-positiva celler cellerna av intresse (se figur 2). Detta steg beror på den retrovirusvektor som valts för användning i detta protokoll (om en reportergen finns i ryggraden).
6. Tymocytberedning och utarmning av CD4 + och CD8 + -celler (dag 6–7)
- Skörda brässen från en 4–6 veckor gammal C57BL/6-mus. För mer information om brässkörd, se Xing och Högquist20.
OBS: Möss avlivades genom CO2-inhalation följt av cervikal dislokation. - Förbered en tymocyt encellssuspension genom att placera tymus i 5 ml PBS i en petriskål. Använd sterila glasskivor, placera tymus mellan de frostade ytorna på glasen och gnugga försiktigt glasen ihop och rulla tymus mellan de två bilderna. Skölj glasskivorna för att samla cellerna och kassera den kvarvarande tymiska stromavävnaden.
OBS: Det uppskattade utbytet från en tymus är 90 × 10 6-100 × 106-celler, och cirka 1% av cellerna kommer att förbli efter CD4- och CD8-utarmning. Använd tymusvävnad från yngre möss för ett bättre utbyte av celler, eftersom cellulariteten hos mustymus under de första veckorna efter födseln ökar snabbt, når en platå vid 4-6 veckors ålder och gradvis involverar därefter21. Räkna cellerna med hjälp av en automatisk blodcellsräknare eller någon alternativ metod. - Filtrera den tymiska suspensionen genom ett 30 μm eller 40 μm filter genom att pipettera 5 ml av den tymiska suspensionen genom en cellsil. Centrifugera cellerna vid 300 × g i 10 minuter.
- Ta bort supernatanten och lysera de röda blodkropparna med ACK-lysbuffert genom att tillsätta (beroende på provstorlek) 1 ml buffert per rör i 1 min. Tillsätt 5 ml cellutarmningsbuffert (500 ml PBS [pH 7.2], 0,5% BSA, 2 mM 0,5M EDTA, pH 8.0) för att inaktivera ACK-lysbufferten, centrifugera vid 300 × g i 10 minuter och resuspendera i 1–5 ml cellutarmningsbuffert för räkning.
OBS: Lägg åt följande på is före uttömning (före uttömning): 70 μL cellsuspension för att räkna (variera detta beroende på vilken räknecellmetod som valts) och 200 μL cellsuspension för att bestämma effektiviteten av utarmning genom färgning för CD4 och CD8 och analysera med flödescytometri22,23. - Räkna cellerna och centrifugera vid 300 × g i 10 minuter. Resuspendera cellerna vid 1 × 107/80 μL cellutarmningsbuffert. Tillsätt 10 μL vardera av CD4- och CD8-mikrokulor per 1 × 107 celler. Blanda väl och inkubera i 15 min i mörker i kylskåp (2–8 °C).
- Förbered en tömningskolonn genom att skölja den med 2 ml uttömningsbuffert och kassera genomströmningen.
- Tvätta cellerna från steg 6.6 genom att tillsätta 1–2 ml uttömningsbuffert per 1 × 107 celler och centrifugera vid 300 × g i 10 minuter. Ta bort och kassera supernatanten.
- Resuspendera upp till 1,25 × 108 celler i 500 μL uttömningsbuffert. Applicera cellsuspensionen på kolonnen och samla flödesgenomströmningen (omärkta celler). Tvätta kolonnen 2x med 1 ml buffert och samla genomflödet.
Lägg bara till ny buffert när kolonnbehållaren är tom. Lägg åt sidan följande på is efter uttömning (kontroll efter uttömning): 70 μL cellsuspension för räkning (variera detta beroende på vilken räknecellmetod som valts) och 1 000 μL cellsuspension för att bestämma uttömningseffektiviteten genom färgning för CD4 och CD8 och analysera med flödescytometri22,23. - Färga kontrollerna av utarmningseffektiviteten genom att dela upp de 200 μL celler som samlats in före uttömningen i fyra FACS-rör: ofärgade, CD4 enkelfärgade, CD8 enkelfärgade och CD4/CD8 dubbelfärgade (använd de ofärgade och enkelfärgade proverna för att ställa in flödescytometriparametrarna). Använd de 1 000 μL celler som samlats in efter utarmning för att färga för CD4 och CD8 och jämför med det dubbelfärgade provet som samlats in före utarmning (se typiska uttömningsresultat i figur 3).
OBS: Justera volymerna för färgning av flödescytometri enligt antikroppstillverkarens rekommendation (t.ex. 1 μL anti-CD4-FITC + 0,5 μL anti-CD8-PE per 1 x 106 celler i 50 μL buffert).
7. Odling av tymocyter på OP9-DL4-celler (dag 6–7)
- Placera 2–5 × 105 till 1 × 106 tymocyter efter uttömning i en T25-kolv med 80–90 % konfluenta OP9-DL4-celler i OP9-medium innehållande cytokiner (10 ng/ml rekombinant IL-7 och rekombinant hFLT-3). Kultur vid 37 °C och 5 %CO2. Väx i cirka 24 timmar på OP9-DL4-celler.
OBS: Denna varaktighet krävs för att göra T-cellerna transducerbara (se ett typiskt resultat i figur 4). Reservera en T25-kolv av samkulturen av tymocyter och OP9-DL4-celler för användning som kontroll (otransducerad). De otransducerade tymocyterna färgas tillsammans med de transducerade tymocyterna (steg 9.1) som en negativ kontroll för att utvärdera transduktionseffektiviteten. Otransducerade tymocyter kan också användas för att mäta effekten av transgenuttrycket på celldifferentiering. Kassera det cytokininnehållande mediet efter 1 månad.
8. Skörda retroviruset från supernatanten och använda det för att transducera tymocyterna (dag 8–9)
- Samla upp supernatanten som innehåller retrovirusen från de transfekterade cellerna genom att luta 6-brunnsplattan och placera en 3-5 ml spruta längst ner på plattan medan du drar kolven för att aspirera supernatanten. Byt ut mediet mot 2 ml färskt RPC-medium. Fortsätt att inkubera cellerna vid 37 °C i 20–24 timmar för den andra transduktionen i steg 8.9.
- Filtrera retrovirussupernatanten genom ett 0,45 μm sprutfilter och samla upp filtratet i ett 50 ml rör.
OBS: Frys inte den retrovirala supernatanten. Använd ett nytillverkat viruspreparat för transduktion. - Samla upp tymocyter från OP9-DL4-kulturen genom aggressiv pipettering för att avlägsna tymocyterna och OP9-DL4-cellerna från kolvens yta. Filtrera cellsuspensionen genom en 40 μm cellsil för att avlägsna de flesta OP9-DL4-cellerna och samla upp filtratet i ett 50 ml rör.
OBS: OP9-celler är mycket vidhäftande. Även om aggressiv pipettering kan avlägsna några av OP9-DL4-cellerna från kolven, är störningen av OP9-DL4-monolagret under denna process minimal, och OP9-DL4-cellerna som lossnar kommer att filtreras bort med 40 μm-cellsilen, eftersom OP9-DL4-cellerna är mycket större än de primära tymocyterna. Om OP9-DL4-cellerna fortfarande är 80% -90% sammanflytande, ta bort tymocyterna och platta dem igen i samma OP9-DL4-kolv. Alternativt måste en ny OP9-DL4-kolv förberedas. - Centrifugera tymocyterna i filtratet från steg 8.3 vid 300 × g i 5 minuter. Kassera supernatanten.
- I 50 ml röret, resuspendera tymocyterna i 0,5–1 ml OP9-medium + cytokiner (se steg 7.1). Tillsätt 1–2 ml RPC-medium innehållande viruset (dubbelt så mycket RPC-medium som tymocytmedium). Tillsätt hexametrinbromid (10 μg/μl stamkoncentration) till 8 μg hexametrinbromid/ml total cellsuspension.
- Spinokulera genom centrifugering av cellerna vid 850 × g i 1 h vid rumstemperatur.
- Suspendera cellerna på nytt i 6 ml OP9-medium + cytokiner per kolv (se steg 7.1) och tillsätt suspensionen tillbaka till monolagret i OP9-DL4-cellen.
OBS: Alternativt kan du ha nya OP9-DL4-kolvar redo att ta emot de transducerade tymocyterna. Om tymocyterna ska placeras tillbaka i en använd OP9-DL4-kolv, se till att tillsätta nytt OP9-medium till OP9-DL4-cellerna under 1 h tymocytspinoculation för att hålla cellerna friska och säkerställa 80% -90% sammanflöde. - Inkubera vid 37 °C över natten.
- Upprepa steg 8.2–8.7 med en ny brunn av den retrovirusinnehållande cellsupernatanten.
9. Upprätthålla transducerade tymocyter på OP9-DL4-kulturen i 2-5 dagar eller frysa efter behov (dag 9+)
- Bedöm tymocytdifferentieringen genom flödescytometri genom färgning av tymocyter för T-cellutvecklingsmarkörer såsom CD4, CD8, CD25 och CD4423. Se typiska tymocytdifferentieringsresultat i figur 5.
Representative Results
Utarmningseffektiviteten kan bedömas flödescytometriskt genom att märka den magnetiskt omärkta cellfraktionen för CD4 och CD8 efter immunomagnetisk cellseparation (MACS) och analysera detta på ett tvådimensionellt bivariat punktdiagram (figur 3). Ett bra utbyte av dubbla negativa (CD4−, CD8−) celler är 95% eller högre, som representeras i figur 3. Två av de vanligaste orsakerna till lägre avkastning är felberäkning av mikrokulorna baserat på antalet celler och antalet märkta celler som överstiger kolonnkapaciteten. Vi rekommenderar att du väljer rätt antal MACS-kolumner enligt antalet märkta celler. När man arbetar med tymocyter är antalet märkta celler (DP- och SP-celler) nästan lika med antalet totala celler (mer än 96%). Cellräkning kan göras i en automatisk cellräknare, en Neubauer-kammare eller med någon alternativ metod. Som ett resultat kan volymerna som allokeras för cellräkning behöva justeras beroende på den specifika maskinen och den valda räkningsmetoden.
Det är viktigt att bestämma antalet celler som finns före och efter utarmning. Dessa celltal behövs för att beräkna antalet LD-uttömningskolonner som behövs och för att jämnt fördela DN-tymocyterna i lämpligt antal OP9-DL4-kolvar. Kontrollerna för flödescytometri (omärkta celler, celler märkta för CD4 och celler märkta för CD8) kan utföras med det reserverade provet före utarmning, eftersom detta innehåller fler celler. Men eftersom de flesta cellerna förväntas behållas i kolumnen kommer provet efter utarmning som ska märkas att kräva en högre volym. Följaktligen kan justeringar behöva göras enligt det valda märkningsprotokollet.
Vid användning av vektorer som uttrycker screeningbara markörer, såsom en fluorescensgen, kan transfektionen och transduktionen grovt och empiriskt bedömas genom fluorescensmikroskopi (figur 2). Transduktionseffektiviteten kan analyseras genom att skörda tymocyten från OP9-DL4-monolagret, som beskrivs i steg 8.3, och titta på uttrycket av en fluorescensgen genom flödescytometri. Effektiviteten av transduktion med användning av en tom retroviral vektor med GFP som reportergen var 84,2% (figur 4).
T-celldifferentiering på OP9-DL4-celler kan observeras 4 dagar efter transduktion. Flödescytometri utförs vanligtvis för att bedöma celldifferentieringen inducerad av samkulturen på OP9-DL4-celler och / eller transgenuttrycket, som representeras i figur 5, där cellerna märktes för CD4, CD8, CD44 och CD25. Det finns flera möjliga kombinationer av cellytemolekylmärkning som har visat sig vara användbara för att undersöka de molekylära och cellulära mekanismerna för T-cellutveckling hos möss24,25,26,27. Därför kan panelerna av fluorescerande antikroppar variera beroende på frågan om intresse som behandlas. Transduktionen av DN-tymocyter med den tomma retrovirala vektorn pMIG, som visas i panel B, presenterade ungefär samma proportioner av enstaka positiva (CD4+ eller CD8+), dubbla positiva (CD4+/CD8+), dubbla negativa (CD4−/CD8−), och dess delsteg dubbelnegativa 1–4 (DN1–DN4) som de otransducerade tymocyterna, som visas i panel A, vilket indikerar att T-cellutvecklingen inte påverkades av transduktionsprocessen.
Figur 1: Diagram över stegen för tymocytisolering, transduktion och samkultur. Förkortning: DN = dubbelnegativ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Samodlingsfluorescensmikroskopi av GFP-transducerade tymocyter eller otransducerade tymocyter och OP9-DL4-celler. (A) Otransducerade tymocyter och (B) stabila GFP-uttryckande murina tymocyter på OP9-DL4 dag 3 efter den andra transduktionen. Ett Olympus-IX71 fluorescensmikroskop med en 40x lins och ett 480/30 filter lämpligt för GFP-detektion användes. Skalstång = 40 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; DN = dubbel-negativ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Flödescytometri av tymocytutarmning. Representativa flödescytometridiagram som analyserar uttrycket av CD4 och CD8 på tymocyter erhållna från 7-8 veckor gamla C57BL / 6J honmöss (A) före utarmning och (B) efter utarmning av CD4 + och CD8 + med användning av mikrokulor och LD-kolumner enligt tillverkarens instruktioner. Punktdiagrammen till vänster visar grindar baserat på händelsens storlek och komplexitet (FCS-A respektive SSC-A). Den mellersta panelen visar FSC-H kontra FSC-A för att grinda enskilda celler och utesluta dubbletter. I diagrammen till höger definierades celler som CD4 och CD8 från encellsporten. Förkortningar: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-H = spridning-topphöjd framåt, FITC = fluoresceinisotiocyanat, PE = fykoerytrin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Flödescytometri för tymocytens retrovirala transduktionseffektivitet. a) Otransducerade tymocyter samodlade på OP9-DL4. (B) retroviralt transducerade tymocyter på OP9-DL4 dag 3 efter transduktion. Förkortningar: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-H = spridning-topphöjd framåt, FITC = fluoresceinisotiocyanat, PE = fykoerytrin; DN = dubbel-negativ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Flödescytometri av transducerade tymocyter efter 4 dagars samodling av OP9-DL4. (A) Otransducerad och (B) transducerad med pMIG retrovirus. Cellerna gated först på levande celler och sedan gated baserat på storlek och komplexitet (FCS-A respektive SSC-A), följt av plottning av FSC-H kontra FSC-A för att grinda på enskilda celler och utesluta dubbletter. För otransducerade celler använde vi följande grindstrategi. Från encellsgrinden definierades cellerna som enstaka positiva (CD4 + eller CD8 +), dubbla positiva (CD4 + / CD8 +) och dubbla negativa (CD4 − / CD8 −). Sedan, från grinden för dubbla negativ (CD4−/CD8−), definierades cellerna som CD44+, CD25+, CD44+/CD25+ och CD44−/CD25−, som visas i panel A. För de pMIG-transducerade cellerna, som visas i panel B, från encellsgrinden, definierades cellerna först som GFP+/GFP−, och sedan från GFP+-celler bestämdes cellpopulationsfördelningen till de stora T-cellutvecklingsstadierna, som definierats av CD4-, CD8-, CD44- och CD25-uttryck, med samma grindstrategi som för de otraducerade cellerna. Förkortningar: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-H = spridning-topphöjd framåt, FITC = fluoresceinisotiocyanat, GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Protokollet som beskrivs här utvecklades specifikt för tymus-härledda DN (CD4−/CD8−) T-cellsstudier med retroviral transfektion följt av en OP9-DL4 differentieringsmodell. Det är emellertid troligt att målcellerna som kommer att utsättas för detta transduktionsprotokoll följt av celldifferentiering kommer att ha ett bredare tvärvetenskapligt verktyg. Således, förutom omogna tymocyter, kan hematopoetiska stamceller, såsom celler härledda från antingen fosterlever eller benmärg, potentiellt användas i detta protokoll.
OP9-DL4-systemet har visat sig vara en effektiv modell för att studera genfunktion i en mängd olika aspekter, inklusive celldifferentiering17 och onkogenes15. Medan retroviral modifiering av hematopoetiska förfäder är en väletablerad teknik som möjliggör stabil genetisk modifiering, kräver kombinationen av induktion av celldifferentiering på OP9-DL4-systemet och retroviral transduktion noggrannhet och skicklighet. Den kritiska aspekten för att uppnå framgång med detta protokoll är att säkerställa att alla steg är väl samordnade, eftersom protokollet innebär att man använder tre olika celltyper som måste hållas friska och vid det ideala sammanflödet som krävs för varje specifikt steg. Med detta i åtanke är det viktigt att utföra alla kvalitetskontrollpunktsanalyser efter genomförandet av varje steg innan du går vidare till nästa steg. Detta kommer att säkerställa att alla steg fungerar. Därför är det viktigt att kontrollera utarmnings-, transfektions- och transduktionseffektiviteten för ett framgångsrikt genomförande av detta protokoll (se ett typiskt resultat för transduktionseffektivitet i figur 4). God primär celltransduktionseffektivitet är kopplad till en hög viral titer. Vanligtvis resulterar större insatser i lägre virustitrar18. För träningsändamål använder vi en tom vektor för att representera de resultat som kan erhållas med detta protokoll. Enligt vår erfarenhet varierar transduktions- och transfektionseffektiviteten beroende på skärets storlek, särskilt med tanke på de virala ryggradsuttryckande reportergenerna, såsom GFP. En strategi som kan användas när man studerar interaktionen mellan mer än en gen är att klona varje gen till en annan överföringsvektor, följt av individuell virusproduktion och slutligen samtransduktion av målcellen. I så fall kan ett urvalssteg tillämpas för att eliminera de enskilt transducerade cellerna och behålla endast de samtransducerade cellerna.
Det är värt att notera att majoriteten av OP9-DL1 / DL4 stromala matarskiktcellinjer har genetiskt konstruerats för att uttrycka GFP som en del av DL1- eller DL4-konstruktionerna7. I detta protokoll använde vi en retroviral vektor som också uttrycker GFP; Det är emellertid ljusare än GFP-proteinet som uttrycks av OP9-DL4-celler och stör inte transduktionsinspektionen när man visualiserar samkulturen under fluorescensmikroskopet.
OP9-celler differentieras till adipocyter efter många passager, långa perioder i odling eller under förhållanden med översammanflöde19. Detta framgår av utvecklingen av stora vakuoler. OP9-celler som uppvisar dessa egenskaper bör därför inte användas i detta protokoll. Transfektering av alltför konfluenta retrovirusproducentceller kommer att resultera i en låg virustiter. Faktum är att det subkonfluenta stadiet är när cellerna är mest transfektbara. Dessutom kommer transfekterande retrovirusproducerande celler med låg sammanflöde att minska cellstressen i transfektionsprocessen och ge den högsta virustitern.
Medan vi i detta protokoll inte titrerar virussupernatanten, måste titrering av virus supernatant övervägas i vissa fall, till exempel i frånvaro av en reportergen i den retrovirala vektorn, vilket skulle förhindra indirekt bestämning av virusproduktion, eller i fall där den experimentella designen kräver att ett mer exakt antal transgenkopior integreras i målcellgenomet. Det är dock viktigt att notera att titern av retroviral vektorsupernatant minskar signifikant vid förvaring vid −80 °C eller 4 °C tills titreringsresultaten erhålls. Därför kommer användning av nyberedd virussupernatant för transduktion att ge bättre transduktionseffektivitet.
Tymus innehåller ett stort antal dubbelpositiva (DP) tymocyter (mer än 85%) och cirka 10% enkelpositiva15 celler (CD4 eller CD8), vilka är tymocyterna efter DN-stadiet. DP-cellerna kan inte överleva in vitro för retroviral manipulation, medan SP-cellerna är otransducibla. Därför kan detta protokoll tillämpas för att generera retrovirala vektortransducibla DN-tymocyter.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det intramurala programmet för National Cancer Institute, projekt ZIABC009287. OP9-DL4 erhölls från Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Kanada). Författarna tackar NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program för deras fortsatta tekniska hjälp och experimentella råd och input, liksom Jeff Carrel, Megan Karwan och Kimberly Klarmann för flödescytometrihjälp. Vi är tacksamma mot Howard Young för kritiska råd och synpunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
- Zuniga-Pflucker, J. C.
- Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science. 272 (5262), 722-724 (1996).
- Ueno, H., et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).
- Jaleco, A. C., et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation. Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).
- Mohtashami, M., et al. Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).
- Mazzucchelli, R., Durum, S. K. Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).
- Robey, E. A., Bluestone, J. A. Notch signaling in lymphocyte development and function. Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).
- Lavaert, M., et al. Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes. Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).
- Roh, K. H., Roy, K. Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis. Biomaterials Research. 20 (20), (2016).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).
- Cramer, S. D., et al. Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).
- Treanor, L. M., et al. Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential. Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).
- Yokoyama, K., et al. In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).
- Simmons, A., Alberola-Ila, J. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors. Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).
- Retroviral systems. , Nolan Lab. Available from: https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html (2022).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).
- Gray, D. H., et al. Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells. Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).
- Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).
- Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system. BD Biosciences–Application Note. , (2012).
- Sakaguchi, N., et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).
- He, X., Park, K., Kappes, D. J. The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment. Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).
- Wang, Y., et al. A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling. PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).
- Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program. Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).
