Summary
Analysen av förändringar i kontraktil funktion och cellulär integritet hos humana iPSC-härledda kardiomyocyter är av enorm betydelse för icke-klinisk läkemedelsutveckling. Ett hybrid 96-brunns cellanalyssystem adresserar båda parametrarna på ett realtids- och fysiologiskt sätt för tillförlitliga, människorelevanta resultat, nödvändiga för en säker övergång till kliniska stadier.
Abstract
Hjärtkontraktilitetsbedömning är av enorm betydelse för utvecklingen av nya terapier och deras säkra övergång till kliniska stadier. Medan humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) lovar att fungera som en människorelevant modell i prekliniska faser av läkemedelsupptäckt och säkerhetsfarmakologi, är deras mognad fortfarande kontroversiell i det vetenskapliga samfundet och under ständig utveckling. Vi presenterar en hybridkontraktilitet och impedans/extracellulär fältpotential (EFP) -teknik, vilket ger betydande pro-mognadsfunktioner till en branschstandard 96-brunnsplattform.
Impedansen/EFP-systemet övervakar mobilfunktionaliteten i realtid. Förutom takthastigheten för kontraktila celler upptäcker de elektriska impedansspektroskopiavläsningarna föreningsinducerade morfologiska förändringar som celldensitet och integritet hos det cellulära monoskiktet. I den andra komponenten i hybridcellanalyssystemet odlas cellerna på biokompatibla membran som efterliknar den mekaniska miljön i verklig hjärtvävnad. Denna fysiologiska miljö stöder mognad av hiPSC-CMs in vitro, vilket leder till mer vuxenliknande kontraktila svar inklusive positiva inotropa effekter efter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametrar som amplituden för sammandragningskraft (mN/mm2) och slagvaraktighet avslöjar också nedströmseffekter av föreningar med påverkan på elektrofysiologiska egenskaper och kalciumhantering.
Hybridsystemet ger det perfekta verktyget för holistisk cellanalys, vilket möjliggör preklinisk hjärtriskbedömning utöver de nuvarande perspektiven för humanrelevanta cellbaserade analyser.
Introduction
Ett av de viktigaste målen med modern läkemedelsutveckling är att förbättra framgångsgraden från bänk till säng för nya terapier i pipelinen för läkemedelsupptäckt. Säkerhetsfarmakologiska tester av dessa nya läkemedel avslöjar ofta biverkningar på hjärt-kärlsystemet som står för nästan en fjärdedel av läkemedelsförlusten vid prekliniska stadier1. Utvecklingen och integrationen av nya metodmetoder (NAMs) spelar en nyckelroll i moderniseringen av preklinisk bedömning, särskilt kärnbatteriorgan som hjärtat. Eftersom dessa metoder är djurfria tillvägagångssätt blev användningen av människobaserade cellmodeller som kardiomyocyter (CM) av inducerat pluripotent stamcellsursprung (iPSC) arbetshästen under det senaste decenniet för den moderna bedömningen av säkerhetsfarmakologiska och toxikologiska frågor2. Allmänt använda analyssystem för sådana undersökningar är mikroelektrodmatris (MEA) och spänningskänsliga färgämnesbaserade experimentella metoder3.
Icke desto mindre sätter den påstådda fenotypiska och funktionella omogenheten av denna celltyp hinder i vägen för en idealisk människobaserad cellmodell, med potential att minska translationella luckor mellan icke-kliniska och kliniska studier4.
Enorm forskning har genomförts genom åren för att förstå orsaken till den underförstådda omogna fenotypen och för att hitta sätt att driva mognadsprocessen för humana iPSC-CMs in vitro.
Brist på hjärtmognadssignaler som förlängda cellodlingstider, frånvaro av andra celltyper i närheten eller brist på hormonell stimulering visade sig påverka mognadsprocessen5. Den icke-fysiologiska miljön hos vanliga cellodlingsplattor identifierades också som en signifikant orsak som hindrar mognaden av humana iPSC-CM på grund av den saknade fysiologiska substratstyvheten hos det ursprungliga mänskliga hjärtat 5,6.
Olika analyssystem med fokus på inhemska fysiologiska förhållanden utvecklades för att hantera denna fråga, inklusive 3D-cellodlingssystem där celler är inriktade tredimensionellt för att likna inhemsk hjärtarkitektur istället för typiska tvådimensionella cellkulturer7. Även om förbättrad mognad uppnås med 3D-analyser, hindrar behovet av en kvalificerad arbetskraft och den låga genomströmningen av dessa system en riklig användning av detta i läkemedelsutvecklingsprocessen, eftersom tid och kostnad spelar en grundläggande roll i bedömningen av nya terapier på finansiell nivå8.
Viktiga avläsningar för säkerhetsfarmakologisk och toxikologisk bedömning av nya terapier är förändringar i funktionella och strukturella egenskaper hos humana iPSC-CM, eftersom sammansatta inducerade biverkningar i hjärt-kärlsystemet vanligtvis påverkar en eller båda av dessa egenskaper 1,9. Välkända exempel på sådana breda biverkningar är läkemedel mot cancer i antracyklinfamiljen. Här rapporteras farliga funktionella och negativa strukturella effekter på hjärt-kärlsystemet i stor utsträckning under och efter cancerbehandling hos patienter samt med in vitro-cellbaserade analyser10,11.
I den aktuella studien beskriver vi en omfattande metodik för bedömning av både funktionella och strukturella sammansatta biverkningar på hiPSC-CM. Metodiken inkluderar analys av kardiomyocytkontraktil kraft och impedans / extracellulär fältpotential (EFP) analys. Den kontraktila kraften mäts under fysiologiska mekaniska förhållanden, med cellerna odlade på mjuka (33 kPa) silikonsubstrat, vilket återspeglar den mekaniska miljön i naturlig mänsklig hjärtvävnad.
Systemet är utrustat med 96-brunnsplattor för analys med hög genomströmning av humana iPSC-CM för prekliniska hjärtsäkerhetsfarmakologiska och toxikologiska studier, och ger därmed en fördel för för närvarande använda 3D-metoder som Langendorff-hjärta eller hjärtskivor12,13.
I detalj består hybridsystemet av två moduler, antingen för bedömning av hjärtkontraktilitet under fysiologiska förhållanden eller analys av cellulär strukturell toxiciteti realtid 6,14. Båda modulerna arbetar med specialiserade 96-brunnsplattor med hög genomströmning för snabb och kostnadseffektiv datainsamling.
Utan behov av en 3D-konstruktion använder kontraktilitetsmodulen specialplattor som innehåller flexibla silikonmembran som substrat för cellerna istället för det styva glaset eller plasten som vanliga cellodlingsplattor vanligtvis består av. Membranen återspeglar typiska humana biomekaniska hjärtegenskaper och efterliknar därför in vivo-förhållanden på ett sätt med hög genomströmning. Medan humana iPSC-CMs ofta misslyckas med att visa vuxen kardiomyocytbeteende angående sammansatt inducerad positiv inotropi i andra cellbaserade analyser14, kan en mer vuxenliknande reaktion bedömas när cellerna odlas på plattorna i kontraktilitetsmodulen. I tidigare studier har det visats att iPSC-CM uppvisar positiva inotropa effekter vid behandling med föreningar som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Här kan flera kontraktilitetsparametrar bedömas, såsom primära parametrar som amplituden för sammandragningskraft (mN / mm2), slagvaraktighet och slaghastighet, samt sekundära parametrar för kontraktionscykeln som område under kurvan, sammandragning och avslappningslutningar, takthastighetsvariationer och arytmier (kompletterande figur 1)16 . Läkemedelsinducerade förändringar i alla parametrar bedöms icke-invasivt genom kapacitiv avståndsavkänning. Rådata analyseras därefter av specialiserad programvara.
Den strukturella toxicitetsmodulen lägger till sina unika impedans- och EFP-parametrar som en avläsning för strukturell cellulär toxicitet och analys av elektrofysiologiska egenskaper17,18. Den elektriska impedansspektroskopitekniken avslöjar föreningsinducerade förändringar i celldensitet eller cell- och monolagerintegritet övervakad i realtid, vilket visas med humana iPSC-CM behandlade med kända kardiotoxiska föreningar13. Med impedansavläsningar vid olika frekvenser (1-100 kHz) är det möjligt att dissekera ett fysiologiskt svar ytterligare, och därmed är det möjligt att avslöja förändringar i membrantopografi, cell-cell- eller cellmatriskorsningar. Den ytterligare EFP-registreringen av humana iPSC-CM möjliggör ytterligare analys av elektrofysiologiska effekter som framkallas av föreningsbehandling, vilket visades i ljuset av CiPA-studien17,19.
I den aktuella studien användes humana iPSC-CM, behandlade med epirubicin och doxorubicin, båda väl beskrivna som kardiotoxiska antracykliner, och erlotinib, en tyrosinkinashämmare (TKI) med en ganska låg risk för kardiovaskulär toxicitet. Kronisk bedömning med epirubicin, doxorubicin och erlotinib utfördes i 5 dagar. Resultatet visar mindre förändringar i kontraktilitet och basimpedans när celler behandlades med erlotinib, men en tids- och dosberoende toxisk minskning av kontraktionsamplitud och basimpedans vid behandling med epirubicin respektive doxorubicin. Akuta mätningar utfördes med kalciumkanalblockeraren nifedipin och visar en minskning av sammandragningsamplituden, fältpotentialvaraktighet och basimpedans, vilket visar kardiotoxiska biverkningar av denna förening på funktionella såväl som strukturella nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Arbetsflödet för kontraktilitet och impedans/EFP-mätning anges i tilläggsfigur 2.
1. Plåtbeläggning
- Öppna den vakuumförseglade förpackningen och ta ut 96-brunnsplattan. Hanteringsprocedurer för 96-brunnsplattor av båda modulerna är desamma. Låt kontraktionsplattan täckas av det extra medföljande membranskyddet tills mätning i kontraktilitetsmodulen.
- Täck de flexibla 96-brunnsplattorna för sådd av kardiomyocyter.
- Bered en utspädd EHS-gelbeläggningslösning genom att överföra 2,75 ml EHS-gelfärdig lösning i ett sterilt centrifugrör. Lägg sedan till 8,25 ml DPBS med Ca 2+ och Mg2+. Blanda lösningen försiktigt.
OBS: Eventuellt kan fibronektin också användas för beläggning av brunnarna: förbered 13 ml fibronektinbeläggningslösning i ett sterilt centrifugrör genom att späda 650 μl fibronektinstamlösning (1 μg / ml) i 13 ml DPBS med Ca 2+ och Mg2+, vilket resulterar i en arbetslösning på 50 μg / ml. Blanda lösningen försiktigt.
- Bered en utspädd EHS-gelbeläggningslösning genom att överföra 2,75 ml EHS-gelfärdig lösning i ett sterilt centrifugrör. Lägg sedan till 8,25 ml DPBS med Ca 2+ och Mg2+. Blanda lösningen försiktigt.
- Överför beläggningslösningen till en steril reagensbehållare placerad i labbautomatiseringsroboten.
- Tillsätt 100 μL av beläggningslösningen per brunn med labbautomatiseringsroboten med hjälp av programmet "ADD100μL". Sätt tillbaka locket på 96-brunnsplattan och inkubera i 3 timmar vid 37 °C.
OBS: Programmet för labbautomatiseringsroboten måste förinställas manuellt i förväg.
2. Sådd av humana iPSC-härledda kardiomyocyter i flexibla 96-brunnsplattor (dag 0)
- Tina cellerna enligt tillverkarens riktlinjer.
- Räkna cellerna med en manuell räknekammare och justera cellerna i det rekommenderade pläteringsmediet enligt celltillverkarens instruktioner (t.ex. 1 x 105 celler/brunn), vilket resulterar i 11 x 106 celler/11 ml för sådd av en hel 96-brunnsplatta.
- Ta bort EHS-gellösningen från brunnarna med labbautomatiseringsroboten med programmet "REMOVE100μL". Ta bort reagensbehållaren som innehåller den dispenserade beläggningslösningen från roboten.
- Överför cellsuspensionen (totalt 11 ml) till en steril reagensbehållare placerad i labbautomatiseringsroboten och frö cellerna med 100 μl / brunn med programmet "CELLS_ADD100 μL".
- Omedelbart efter cellsådd, överför den flexibla 96-brunnsplattan till inkubatorn (37 ° C, 5% CO2, fuktkontrollerad) och låt cellerna sätta sig över natten.
3. Medium utbyte av flexibla 96-brunnsplattor (dag 1)
- Värm minst 22 ml kardiomyocytunderhållsmedium per platta till 37 °C i ett 50 ml centrifugrör, 18-24 timmar efter sådd av plattorna.
- Överför det färska mediet (minst 22 ml) till en steril reagensbehållare och lämna den precis bredvid labbautomatiseringsroboten. Placera en tom reagensbehållare i roboten och utför medium borttagning med programmet "REMOVE100μL". Byt därefter ut reagensbehållaren som innehåller avfallsmediet mot reagensbehållaren som innehåller det färska mediet och dosera 200 μL av det färska mediet per brunn med programmet "ADD100μL". Utför detta steg två gånger för att nå 200 μl/brunn.
- Omedelbart efter medium utbyte, överför plattan tillbaka till inkubatorn.
- Utför ett medium utbyte (200 μL/brunn) varannan dag tills föreningen tillsätts.
4. Slutligt mediumutbyte före sammansatt tillsats (dag 5-7)
- Utför en slutlig mediumförändring 4-6 h före sammansatt tillsats.
- Värm minst 22 ml analysbuffert för en flexibel 96-brunnsplatta. Analysbufferten består av underhållsmedium eller derivat därav (t.ex. lågt/inget serummedium, fenolröda fria medier eller andra isotoniska buffertar).
- Överför det färska mediet till en steril reagensbehållare och lämna det precis bredvid labbautomatiseringsroboten. Placera en tom reagensbehållare i roboten och utför medium borttagning. Byt därefter ut reagensbehållaren som innehåller avfallsmediet mot reagensbehållaren som innehåller det färska mediet och dosera 200 μl/brunn av det färska mediet.
- Omedelbart efter medelutbyte, överför den flexibla plattan tillbaka till inkubatorn.
5. Sammansatt tillsats och dataregistrering (dag 5-7)
OBS: Ett exempel på mätplan för experimentet ges i kompletterande figur 3.
- Förbered arbetslösningen per förening vid 4x koncentration i den laminära flödeshuven med en steril vanlig 96-djup brunnsplatta. Den sammansatta lösningen är baserad på analysbufferten som används i steg 4. Överför den 96-djupa brunnsplattan innehållande den sammansatta lösningen i minst 1 h till inkubatorn för att justera den till samma tillstånd som den flexibla plattan.
OBS: 1x koncentrationen av varje läkemedel som används för varje experiment tillhandahålls i figurerna och legenderna. - Överför plattan till respektive mätanordning 1 h innan du utför en baslinjemätning.
- Öppna Edit Protocol i styrprogramvaran (en del av hybridcellanalyssystemet) och välj respektive mätläge kontraktilitet eller impedans/EFP.
- Definiera sveplängden (längden på en mätning; t.ex. 30 s) och repetitionsintervallet (tid mellan mätningarna; t.ex. 5 min) och spara protokollnumret.
- Välj Starta protokoll > Fortsätt och fyll i de begärda fälten.
- Välj slutligen Starta mätning. Utför minst tre baslinjemätningar (svep) i 5 minuters intervall strax före sammansatt tillsats.
OBS: Exempeldata för en kontraktilitetsbaslinjemätning med kontraktilitetsmodulen innan sammansatt addition visas i tilläggsfigur 4 - Ta bort 50 μL av analysbufferten från varje brunn utan att ta bort den flexibla 96-brunnsplattan från mätanordningen.
- Tillsätt 50 μl av den 4x koncentrerade sammansatta lösningen i varje brunn på plattan, enligt mätplanen.
- Välj Lägg till regionmarkör och definiera den sammansatta plattans layout och volymen av den sammansatta lösningen efter tillsats av föreningar.
- Välj slutligen Fortsätt med standardmätning eller Fortsätt med mätserier enligt experimentplanen.
6. Analys av data
- Med inspelningsprogramvara mäter du svep, vars längd och repetitionsintervall definieras av användaren.
- Med analysprogramvara kan du fånga signalens form genom att läsa av parametrar som amplitud, takthastighet, pulsbredd och så vidare, automatiskt.
OBS: En genomsnittlig signal inklusive standardavvikelsen, den så kallade genomsnittliga takten, beräknas automatiskt baserat på data från ett svep. Användaren kan definiera de kontraktilitets-/IMP/EFP-parametrar som programvaran beräknar och visar. - Med analysprogramvara beräkna dos-responskurvan och IC50/EC50 för varje förening.
OBS: Rådata och analysresultat som genereras med analysprogramvaran kan enkelt exporteras i en mängd olika format. Slutligen genereras datarapporterna automatiskt för att sammanfatta och arkivera de experimentella resultaten. En omfattande beskrivning av vad och hur en EFP-signal mäts diskuteras i 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekterna av kinashämmare erlotinib på kontraktiliteten hos hiPSC-CM visas i figur 1. Cellerna behandlades med koncentrationer från 10 nM till 10 μM i 5 dagar och beatparametrar registrerades dagligen. Erlotinib, en EGFR (epidermal tillväxtfaktorreceptor) och tyrosinkinashämmare med en jämförelsevis låg risk för kardiotoxicitet, hade en mindre dos och tidsberoende effekt på hiPSC-CM endast vid koncentrationer i det mikromolära intervallet. Vid den lägsta koncentrationen (10 nM) inducerade erlotinib en statistiskt obetydlig minskning av amplituden vid den första mätningen efter applicering av föreningar (1 h). I alla efterföljande mätningar mättes ingen jämförbar effekt vid denna koncentration. Den övergående minskningen kan vara resultatet av en sammansatt effekt, men också bero på en övergående förvrängning av taktmönstret under det sammansatta additionsförfarandet, till exempel av termisk eller mekanisk natur. Mikromolära koncentrationer av erlotinib visade små men signifikanta tids- och dosberoende kardiotoxiska effekter. Effekten sågs från 96 h med 1 μM erlotinib, medan 10 μM resulterade i en signifikant minskning endast 24 h efter sammansatt tillsats.
Kemoterapimedel epirubicin hade både en tids- och dosberoende effekt på hiPSC-CM (figur 2). Cellerna upphörde att slå inom 24 timmar efter applicering av 10 μM epirubicin. Med 1 μM följdes en drastisk minskning av amplituden till 44% ± 2% av kontrollen efter 24 h av fullständigt beatstopp till 48 h efter sammansatt tillsats. Vid 100 nM observerades en tidsberoende minskning av slagamplituden under en period av 5 dagar med en återstående amplitud på 25% ± 3% på dag 5. Vid den lägsta koncentrationen på 10 nM var effekten av epirubicin endast dosberoende men inte tidsberoende, med början vid den första mätningen (1 h efter tillsats av föreningar). Amplituden fluktuerade stadigt mellan 60%-80% av kontrollen under 5 dagar. Avvikelserna i denna grupp var större jämfört med de högre koncentrationerna. En möjlig orsak kan vara att denna koncentration endast hade en mätbar effekt på en del av brunnarna.
Doxorubicin är en annan antracyklinklass av medicinering, och cellens vitalitet hos hiPSC-CMs undersöktes genom att övervaka basimpedansen över tid. Figur 3 visar att en exponering på 24 timmar för doxorubicin på 300, 1, 3 och 10 μM minskar cellviabiliteten på ett koncentrations- och tidsberoende sätt.
Nifedpinie är en dihydropyridin kalciumkanalblockerare som främst blockerar kalciumkanaler av L-typ. Långtidsövervakning över 24 timmars cellviabilitet avslöjar en tids- och koncentrationsberoende minskning av basimpedans som används som ett mått på toxicitet (figur 4A). Vid tillämpning av ökande nifedipinkoncentrationer (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM) visar fältpotentialregistreringar på hiPSC-CM en koncentrationsberoende förkortning av fältvaraktigheten normaliserad (FPD) som förväntat (figur 4B,C). Nifedipinbedömning avseende hjärtkontraktilitet visade också en signifikant koncentrationsberoende amplitudminskning vid akut mätning med 10 nM och 30 nM koncentrationer (figur 5).
Resultaten som erhållits med hybridcellanalyssystemet visar att tre hjärtslutpunkter (kontraktilitet, struktur och elektrofysiologi) för hiPSC-CM kan bedömas med hjälp av ett system.
Figur 1: Kontraktilitetsbedömning av humana iPSC-härledda kardiomyocyter behandlade med erlotinib i 5 dagar. X-axeln visar tid i timmar, y-axeln ritar parameteramplituden i procent. Asterisker representerar statistisk signifikans med p < 0,05 (*) eller p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kontraktilitetsbedömning av humana iPSC-härledda kardiomyocyter behandlade med kardiotoxisk antracyklin epirubicin under 5 dagar. X-axeln visar tid i timmar, y-axeln ritar parameteramplituden i procent. Asterisker representerar statistisk signifikans med p < 0,05 (*) eller p < 0. 01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Basimpedans för humana iPSC-härledda kardiomyocyter efter doxorubicinbehandling. Tidsförlopp för basimpedansen hos humana iPSC-härledda kardiomyocyter för 24 timmars exponering för 300, 1, 3 och 10 μM doxorubicin (n = 5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Impedans- och EFP-registreringar av humana iPSC-härledda kardiomyocyter. (A) Tidsförlopp för basimpedansen hos humana iPSC-härledda kardiomyocyter i 24 timmar, vid exponering för 3, 10, 30 och 100 nM nifedipin (n = 5). (B) Tidsförlopp för fältets potentiella varaktighet för humana iPSC-härledda kardiomyocyter i 1 timme, vid exponering för 3, 10, 30 och 100 nM nifedipin (n = 5). C) Elektrodutformningen på impedans-/EFP-plattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kontraktilitetsbedömning (kontraktilitetsmodul) av humana iPSC-härledda kardiomyocyter behandlade med nifedipin i 20 minuter. X-axeln visar tid i min, Y-axeln ritar parameteramplituden i procent. Asterisker representerar statistisk signifikans med p < 0. 05 (*) eller p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Kontraktilitetsparametrar och rådata bedömda med kontraktilitetsmodulen. (Vänster) Parametrar bedöms med kontraktilitetsmodulen. Parametrar: Amplitud för sammandragningskraft (mN/mm2), taktvaraktighet, uppslags- och nedslagshastighet, uppslag och nedslagsområde under kurva (AUC), takthastighet, slaghastighetsvariationer, arytmiska händelser. (Höger) Kontraktilitet rådatainspelningar av en brunn med obehandlad kardiomyocyt (A) takthastighet, (B) takthastighetsvariationer, (C) tidigt efter sammandragningar och (D) arytmiska händelser. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Arbetsflöde för kontraktilitet och impedans/EFP-mätning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Exempel på layout av en mätplan för en 96-brunnsplatta. Fyra föreningar (markerade med rött, ljusgrönt, brunt och mörkgrönt) med fyra koncentrationer och fyra replikat avbildas. Positiva och negativa kontroller (t.ex. förodlingsförhållanden och DMSO) markeras med gult. Säkerhetskopieringsceller markeras med blått. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Exempeldata för en kontraktilitetsbaslinjemätning med kontraktilitetsmodulen före sammansatt tillsats. I varje diagram visas medelvärdet av alla sammandragningscykler för ett svep. För att visualisera taktfrekvensen visas två på varandra följande sammandragningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hybridsystemet impedans/EFP/kontraktilitet är en omfattande metod för farmakologisk och toxikologisk bedömning av hjärtskulder för preklinisk läkemedelsutveckling med hög genomströmning. Det ger ett modernt tillvägagångssätt för preklinisk säkerhetstestning utan användning av djurmodeller, men med högre genomströmningskapacitet som avsevärt minskar tid och kostnader. Detta system har potential att användas som ett kompletterande tillvägagångssätt för Langendorff Heart och andra djurmodeller för preklinisk funktionell och strukturell toxicitetsbedömning.
Som ett djurfritt tillvägagångssätt används mänskliga iPSC-CM för hybridsystemet20. Här ger de speciella flexibla 96-brunnsplattorna med pro-mognadseffekten på humana iPSC-CM en viktig fördel jämfört med andra cellbaserade analyser21,22, eftersom genomströmning och en fysiologisk miljö kombineras unikt för mer vuxenliknande mänsklig hjärtriskbedömning 6,15.
Det mest kritiska steget i protokollet är appliceringen av föreningen, särskilt när akuta effekter ska undersökas. Eftersom cellerna odlas på mjuka substrat som leder mekaniska krafter kan överdriven acceleration under platthantering och applicering av skjuvkrafter under pipettering resultera i övergående (5-10 min) förändringar av sammandragningsparametrarna och bör undvikas. I allmänhet bör man vara försiktig under mediebyten för att undvika störningar i membranen. Användning av laboratorieautomationsutrustning rekommenderas.
Innan föreningsanalysen utförs krävs ett förodlingssteg på 5-7 dagar, så att humana iPSC-CM, vanligtvis förvärvade i kryokonserverat tillstånd, kan återhämta sig från upptiningsproceduren och bygga ett korrekt syncytium. För båda modulerna ger sammandragningsamplituden, liksom slagfrekvensen, insikt i den ideala utgångspunkten för mätningen som vanligtvis sker mellan dag 5-7. Baslinjemätningen är ett kritiskt steg för att identifiera funktionella baslinjeegenskaper som används som inklusionskriterier för de hiPSC-CMs som studerats3. Baslinjevärdena måste registreras precis före föreningsbehandling så att förändringar i kontraktionsbeteende kan jämföras med icke-behandlingstillstånd (kompletterande figur 3).
Att redovisa variabiliteter och ha definierade baslinjeegenskaper är nyckeln till framgångsrika mätningar av hiPSC-CM och datatolkning. Av denna anledning följs rekommendationer om bästa praxis från Gintant et al., med hjälp av hybridcellanalyssystemet; Till exempel ska baslinjen registreras före den sammansatta tillsatsen, och baslinjeregistreringen bör uppfylla vissa förutsättningar3.
Även om de flexibla 96-brunnsplattorna är utrustade med bräckliga membran, kommer en medföljande skyddsplatta i kombination med försiktig hantering att förhindra skador. Membranen förbehandlas för att möjliggöra stabil fastsättning av celler till silikonsubstratet, som har låg inneboende biokompatibilitet. Behandlingen är stabil i minst 6 månader. Medan cellerna ständigt hålls vid 37 °C, är de mekaniska egenskaperna hos silikonmaterial stabila över ett brett temperaturområde. Dessutom påverkar varken läkemedel eller lösningsmedel silikonets egenskaper vid koncentrationer som används i cellbaserade analyser (t.ex. förblir DMSO-koncentrationerna under 0,1%).
Systemet validerades och optimerades med ett brett utbud av kommersiellt tillgängliga hiPSC-CM. Vid användning av skräddarsydda celler rekommenderas testning av standard extracellulära matrisproteiner (ECM) för optimal cellbindning (t.ex. fibronektin, EHS-matris och poly-L-lysin 6,15).
Elektrofysiologi, kalciumsignalering och kontraktilitet är de tre huvudsakliga hjärtmåtten som behandlas i preklinisk utveckling. Hybridsystemet är för närvarande begränsat till att analysera två av dessa hjärtslutpunkter-kontraktilitet och elektrofysiologi. Kalciumsignalering i kardiomyocyter kan inte analyseras direkt utan detekteras tangentiellt via kontraktilitet och elektrofysiologiska egenskaper.
Både impedansen/EFP samt kontraktionskraftmätningen utförs med monolager av kardiomyocyter. Trots fördelen med en fysiologisk mekanisk substratstyvhet under sammandragningsmätning upplever cellerna inte den tredimensionella miljön hos verklig mänsklig vävnad. Å andra sidan tillåter detta användning av endast en bråkdel av de dyra stamcellsbaserade cellmodellerna med standard laboratorieutrustning. Därför lovar denna applikation att ha ett gynnsamt förhållande mellan kostnad, robusthet och förutsägbarhet jämfört med in vivo / ex vivo - eller 3D-modeller. Framtida tillämpningar av hybridsystemet kan inkludera analys av andra kontraktila celltyper såsom glattmuskelceller. Vid reglering av kardiovaskulär homeostas spelar dessa celler en viktig roll som motsvarigheter till kardiomyocyter. Hybridsystemet tillhandahåller också tillägg för specifika projekt, såsom optisk stimulering av mänskliga iPSC-CM. För detta ändamål kan ett dedikerat optiskt lock appliceras på båda modulerna för stimulering av humana iPSC-CM som transfekterades med Channelrhodopsin-2 under förodlingstider.
Således möjliggör impedans / EFP / kontraktilitetshybridsystemet modern preklinisk säkerhets- och toxicitetsbedömning genom att analysera tre olika hjärtslutpunkter (kontraktilitet, strukturella förändringar och elektrofysiologi) inom en metod. Fördelen med att adressera dessa slutpunkter med en människobaserad hjärtcellsmodell på en hög genomströmningsnivå lyfter detta hybridsystem bortom de nuvarande perspektiven för preklinisk hjärtriskbedömning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go. och P.L. är anställda på innoVitro GmbH, tillverkare av de flexibla plattorna. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. och S.S. är anställda på Nanion Technologies GmbH, tillverkare av hybridenheten.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från det tyska federala ministeriet för ekonomi och klimatåtgärder (ZIM) och från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (KMUinnovativ). Vi tackar FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) för att vänligen tillhandahålla kardiomyocyter och Ncardia B.V. (Leiden, Nederländerna) för att vänligen tillhandahålla kardiomyocyter, som används i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
