Summary
在这里,我们描述了一种用于高效生成转基因小鼠的简单技术,称为CRISPR RNP受精卵电穿孔(CRISPR-EZ)。该方法通过电穿孔将编辑试剂以接近100%的效率输送到胚胎中。该方案对哺乳动物胚胎中的点突变、小基因组插入和缺失有效。
Abstract
凭借卓越的效率、准确性和易用性,CRISPR/Cas9系统显著改善了细胞培养和实验动物实验中的基因组编辑。在生成动物模型时,受精卵电穿孔可提供更高的效率、简单性、成本和通量,作为显微注射金标准方法的替代方案。电穿孔也更温和,具有更高的活力,并且可靠地将Cas9/单向导RNA(sgRNA)核糖核蛋白(RNP)递送到常见实验室小鼠品系(例如C57BL / 6J和C57BL / 6N)的受精卵中,接近100%的递送效率。该技术可实现插入/缺失(插入缺失)突变、点突变、整个基因或外显子的缺失,以及 100-200 bp 范围内的小插入以插入 LoxP 或短标签,如 FLAG、HA 或 V5。在不断改进的同时,我们在这里展示了CRISPR-EZ的当前状态,其中包括通过 体外 转录,胚胎处理,RNP组装,电穿孔和植入前胚胎的基因分型产生sgRNA。具有最少操作胚胎经验的研究生水平的研究人员可以使用该协议在不到 1 周的时间内获得经过基因编辑的胚胎。在这里,我们提供了一种简单,低成本,高效,高容量的方法,可用于小鼠胚胎。
Introduction
自CRISPR编辑1,2,3出现以来,活小鼠的基因组编辑已经大大简化,并且变得容易获得且更实惠。最初的动物编辑尝试使用显微注射将CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA递送到前核阶段胚胎中4,5,6。虽然显微注射非常有效,但完全掌握它所需的练习量可能不适合受训者和学生,并且还需要昂贵的设备,而资金有限的实验室无法负担。显微注射通常由转基因设施的专家技术人员进行,其时间表和服务价格对许多研究人员来说是限速的。一种更容易获得的方法是电穿孔,它已被证明对于将CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA递送到前核阶段胚胎中非常有效7。CRISPR基因组编辑和递送策略的进一步改进表明,已经与sgRNA结合的预组装RNP可能是减少嵌合体的有效手段8。
开发和使用该方案背后的基本原理是绕过与显微注射相关的许多限制和障碍。顾名思义,一种简单、内部且经济高效的方法可以快速确定未经测试的 sgRNA 设计是否值得在显微进样实验中使用,这将是一个非常方便的首过质量控制步骤(图 1)。虽然这种方法不能取代显微注射用于更复杂的策略,例如为基于重组的结果引入长供体DNA序列,但它是不太复杂的策略的理想选择,如小的缺失或插入以及标记基因。这种方法适用于具有基本胚胎操作技能的研究人员,他们有简单的编辑需求,希望在植入前发育的时间范围内测试他们的假设,或者更喜欢在安排与显微注射专家的预约之前测试胚胎中的sgRNA。在这里,编辑试剂通过电穿孔(一系列电脉冲) 以 Cas9 / sgRNA RNP的形式瞬时递送到前核阶段胚胎中,以最大限度地提高效率,同时减少嵌合体8。使用胚胎基因分型方法,编辑结果可在大约 1 周内获得9,从而以显着降低的成本减少了对各种显微注射应用的需求。
该方法的有效性在原核胚胎阶段达到峰值,此时胚胎尚未融合母本和父本原核或进入S期(图2)。超排卵用于最大化受精卵的数量,但同时产生原核受精卵和未受精卵。健康的受精卵也可以在电穿孔前预先选择,以提高整体效率。由于其他电穿孔方案已经有效地编辑了受精卵,而无需包括类似的步骤7,10,11,12,13,14,15,因此该协议的可选步骤是透明带(ZP)的轻微侵蚀。ZP 是一种糖蛋白层,有助于精子结合、顶体反应和核前期胚胎周围的受精。根据我们的经验,我们发现对ZP的温和酸基侵蚀提供了可靠的Cas9 RNP电穿孔递送,对活性的影响很小。
我们已经观察到,在C57BL / 6J和C57BL /6N 9,16等研究中常用的小鼠品系中,通过电穿孔的RNP递送率高达100%。独立小组还开发了基于电穿孔的程序,其效率大于或匹配显微注射11,12,13,14,15,17,电穿孔方案在大鼠18,19,猪20,21,22和牛23中运行良好,因此我们建议读者比较协议以找到最适合其实验和设备需求的条件。这里描述的系统使用常见的材料和设备,只需要基本的胚胎操作技能。该技术对一系列编辑策略有效,使该方法被研究界广泛使用。
设计理想的小向导RNA(sgRNA)对于高效编辑至关重要。我们建议直接在小鼠胚胎中为每个靶位点筛选两到三种sgRNA策略,尤其是在需要生成小鼠系的情况下。一旦设计出来,建议使用体外转录(IVT)等无克隆方法来产生高质量的sgRNA3。将RNP和sgRNA与30-50个处理过的前核阶段胚胎混合,并暴露于一系列电脉冲中,首先暂时透化ZP和细胞膜,随后的脉冲保持孔隙打开并通过受精卵24对RNP进行电泳。优化后,我们发现在30 V下对大体胚胎(~50)的6个3 ms脉冲最适合编辑有效性和活力,提供高效的Cas9 / sgRNA RNP递送9,16,25。可以使用 CRISPR 编辑中常见的各种验证策略来确认单个小鼠桑葚中的编辑事件,例如限制性片段长度多态性 (RFLP)、T7 核酸内切酶消化和感兴趣区域的 Sanger 测序26。
目前的方法最适合简单的编辑方案(图3),例如插入/缺失(插入缺失),外显子大小的500-2000 bp缺失,以及点突变和小插入的传递,例如C或N端标签(例如,FLAG,HA或V5)9,16,27。复杂基因组编辑的潜力,如大量插入荧光标签或条件等位基因,仍然不确定,并且是即将进行的改进的当前重点。
该方法易于掌握,可用于在1周内 快速测试培养小鼠胚胎中的sgRNA(图1)。这项工作中提出的是一个六步方案,其中包括1)sgRNA设计;2)sgRNA合成;3)超排卵和交配;4)胚胎培养、采集和加工;5)RNP组装和电穿孔;6)胚胎培养和基因分型。提供有关所有所用材料的信息(材料表)。作为阳性对照,编辑 酪氨酸酶(Tyr)位点9,16 的试剂已包含在 补充表1中。
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Protocol
在整个协议中,所有动物护理和使用都遵守《动物福利法》政策,ILAR实验动物护理和使用指南,并遵循AVMA安乐死和宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指导方针和政策。宾夕法尼亚大学IACUC为该项目审查并批准了动物护理和使用协议。作为合规性和谨慎起见,请在尝试此协议之前寻求所有必要的授权。
1. sgRNA和可选的供体寡核苷酸设计
- sgRNA设计
- 从任何广泛使用的在线算法中选择候选的sgRNA,例如CRISPR序列扫描(SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 或CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29。由于每个平台都是独一无二的,请仔细阅读用户说明,以设计理想的sgRNA。对于 in/del 实验,选择两到三个 sgRNA 进行测试。对于缺失,建议使用靶区两侧的sgRNA,例如,靶标上游的两个sgRNA,靶标下游的两个sgRNA。
注意:虽然各种在线 sgRNA 算法会考虑脱靶以避免有缺陷的 sgRNA 设计,但 NCBI 的 BLAST 工具有助于确认所选 sgRNA 序列的质量。 - 将上一步(1.1.1)测定的19-20个核苷酸(nt)插入sgRNA寡核苷酸的可变区域(补充表1),并购买合成的sgRNA作为定制DNA寡核苷酸。
注意:不需要页面纯化。
- 从任何广泛使用的在线算法中选择候选的sgRNA,例如CRISPR序列扫描(SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 或CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29。由于每个平台都是独一无二的,请仔细阅读用户说明,以设计理想的sgRNA。对于 in/del 实验,选择两到三个 sgRNA 进行测试。对于缺失,建议使用靶区两侧的sgRNA,例如,靶标上游的两个sgRNA,靶标下游的两个sgRNA。
- (可选)供体寡核苷酸设计用于同源定向修复 (HDR) 介导的敲入。
- 根据所需的实验结果(精确点突变、loxP插入、小标签插入等)设计合适的单链寡脱氧核苷酸(ssODN),将总长度保持在100-200 nt,同源臂为50 nt或更多,位于中心区域的两侧。
- 为了确保更高的敲入效率,将sgRNA设计为与ssODN30互补,并用沉默突变替换原间隔相邻基序(PAM)序列,以防止Cas9酶反复切割。
- 使用自定义寡核苷酸选项订购 ssODN。
2. sgRNA合成
- 用于体外转录 (IVT) 的模板生成
- 要通过 PCR 生成 sgRNA IVT 的 DNA 模板,请在不含 RNA 酶的 PCR 试管中制备 IVT 反应。(见 补充表2)。
- 使用以下热循环仪条件:
95°C2分钟;30次循环,95°C持续2分钟,57°C10秒,72°C10秒;然后在72°C下2分钟 - 为了验证 sgRNA DNA 模板 PCR 反应的成功,在 2%(重量/体积)琼脂糖凝胶上电泳 5 μL 产物与 1 μL 6x 上样染料相结合。
注意:预计产品尺寸为 127 bp。任何剩余的PCR反应都可以在-20°C下储存长达5个月。
- sgRNA的体外转录(IVT)
- 要生成 sgRNA,请在 PCR 管中制备反应混合物(按照制造商说明的 T7 IVT)并轻弹以混合试剂。
注意:有关反应设置示例,请参见 补充表3 。IVT反应对RNase污染敏感;因此,请尽一切努力提供无RNase的环境。 - 为了使反应开始并继续进行,将IVT反应混合物在37°C下在热循环仪或加热块中孵育>18小时。
- 要降解原始DNA模板(步骤2.1.3),引入1μLDNase I(每个反应2单位),并在室温(RT)下孵育反应20分钟。
- 为了促进RNA与磁性纯化微球的结合,在反应中加入129 μL 100%乙醇,现在为150 μL。
- 要重悬在储存期间容易沉降的纯化珠,请将等分试样涡旋至少 10 秒。
- 为了纯化sgRNA,将100μL重悬的磁珠(步骤2.2.5)加入IVT反应(步骤2.2.4),并通过上下移液10x轻轻混合。
- 为了允许结合,让混合物在室温下静置5分钟。
- 为了从未掺入的反应产物中分离sgRNA,将反应物在室温下放在磁性支架上5分钟,然后等待形成小颗粒。
- 要洗涤sgRNA,首先小心地弃去上清液,然后从沉淀中加入200μL的80%乙醇。
注意:在80%(体积/体积)乙醇洗涤步骤中,避免通过移液干扰沉淀至关重要,因为这将大大降低sgRNA浓度。相反,轻轻移液80%乙醇,使沉淀浸没,然后用移液器轻轻取出体积。 - 重复上一步(步骤2.2.9)并将沉淀风干不超过5-6分钟,否则sgRNA将与珠子永久结合。
- 用 20μL 无核酸酶水洗脱 sgRNA,方法是将沉淀移液 10 倍,在 (室温) 下孵育 2 分钟,然后将其放回磁性支架上以将磁珠与现在纯化的 sgRNA 分离。
- 要评估sgRNA的质量和数量,请使用分光光度计或生物分析仪等仪器。或者,在 2% 琼脂糖凝胶上,运行 2 μL sgRNA,类似于步骤 2.1.3。
注:质量由单个清晰带确认。其余的sgRNA可以立即使用或储存在-80°C条件下。
- 要生成 sgRNA,请在 PCR 管中制备反应混合物(按照制造商说明的 T7 IVT)并轻弹以混合试剂。
3. 超排卵
- 为了提供足够的胚胎来测试每个sgRNA设计,如前所述,超排卵两到三个3-5周大的C57BL / 6J雌性,如前所述9。建议每个sgRNA电化20-30个胚胎,以产生足够的结果来确认有效性。
注意:如果受精成功,预计每次交配有 10-20 个胚胎。 - 要诱导排卵,请遵循以下激素注射时间表:
- 第 1 天:使用 26 G 注射器通过腹膜内 (IP) 注射到 3-5 周龄雌性小鼠中,给予 5 IU 妊娠母马血清促性腺激素 (PMSG)(100 μL)。
- 第3天:PMSG注射46-48小时后,通过IP注射注射5IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)(100μL)以诱导排卵。
- 要建立繁殖,请在注射 hCG 后立即将雌性与可靠繁殖的雄性 1:1 配对。
注意:为防止激素降解和失去活性,请在解冻后30分钟内进行注射。
4. 胚胎收集和处理
- 胚胎采集
- 如前所述,要对女性实施安乐死并取回必要的材料31,请务必首先根据机构政策确认适当的方法。例如,使用CO 2 窒息、颈椎脱位和/或其他批准的方法。
注意:正常情况下,>75%的激素刺激的雌性表现出交配塞,表明交配成功。 - 为防止毛发使组织收集困难,请将安乐死的女性放在背上,并在腹部区域喷洒70%(体积/体积)乙醇进行手术打开。
注意:从这一点开始,建议在通风罩中进行手术步骤,以保持无菌环境并减少污染的可能性。 - 要打开腹腔并移除输卵管,请用手术剪刀切开皮肤/头发(皮下)层,并找到卵巢(图4),卵巢位于肾脏附近并共享脂肪垫的一部分。输卵管位于卵巢近端(图4)。通过手术从雌性中取出两个输卵管,并将它们放入单个 50 μL 液滴的 M2+BSA(4 mg/mL BSA)培养基中(图 5A)。
注意:可以使用先前发布的协议直观地查看此过程的此部分的详细说明31或逐步遵循9。 - 为了释放含有卵母细胞的卵丘 - 卵母细胞复合物(CoC)(图4),使用解剖钳切开输卵管的壶腹,同时通过体视显微镜观察。
- 为了减少碎片(血液、脂肪、组织)的数量,使用设置为20-30 μL的手持式移液管将每个CoC转移并合并到单个50 μL M2 + BSA培养基液滴中,以避免碎片的携带。
- 如前所述,要对女性实施安乐死并取回必要的材料31,请务必首先根据机构政策确认适当的方法。例如,使用CO 2 窒息、颈椎脱位和/或其他批准的方法。
- 去除卵丘细胞
- 要开始从受精卵中去除卵丘细胞(图4),将CoC与尽可能少的额外培养基转移到100μL M2 +透明质酸酶的液滴中(图5B),并通过移液CoC轻轻混合,直到胚胎明显与更小的积云细胞分离。一定要将M2+透明质酸酶与胚胎的暴露保持在最低限度,因为它可能会影响生存能力。
注意:如果胚胎在2分钟内未与积云细胞分离,则可以预热(37°C)或额外添加50μL M 2 +透明质酸酶。 - 要稀释透明质酸酶并从受精卵中清除松散的积云细胞,请使用口控移液管将受精卵移动到新鲜的 50 μL M2+BSA 液滴中。
注意:除非另有说明,否则超过此点的大多数步骤都需要使用口控移液器。虽然用户污染的风险很低,但建议使用在线空气过滤器来保持无菌环境。请参考前面描述的制备和使用本仪器的方法9,31。 - 使用口移液管,将胚胎至少再通过四到五个 50 μL M2+BSA 液滴以减少积云细胞的数量。
- 要开始从受精卵中去除卵丘细胞(图4),将CoC与尽可能少的额外培养基转移到100μL M2 +透明质酸酶的液滴中(图5B),并通过移液CoC轻轻混合,直到胚胎明显与更小的积云细胞分离。一定要将M2+透明质酸酶与胚胎的暴露保持在最低限度,因为它可能会影响生存能力。
- (可选)用酸性泰罗德(AT)溶液稀释透明带。
- 为了侵蚀胚胎的透明带并减少试剂递送的额外物理障碍,将胚胎转移到60mm板上预热(37°C)100μLAT溶液液滴中(图5C)。使用体视显微镜连续观察受精卵,直到大约 30% 的透明带被侵蚀9.总AT暴露必须为60-90秒。长时间暴露于AT会完全溶解透明带并危及胚胎活力。
注意:有关此过程的详细说明和图像,请参阅先前发布的方法9,16。 - 要稀释 AT,请使用口移管将胚胎通过至少四个 50 μL 的 M2+BSA 液滴。
- 要确定是否处理了适当数量的胚胎,请使用体视显微镜对胚胎进行计数。根据所使用的雌性小鼠数量,可以预期每只雌性大约有10-20个活的受精卵。
注意:在这个阶段,胚胎应该相对没有碎片,这些碎片会妨碍对数量和质量的评估。例如,如果使用五个雌性,预期的受精卵数量可能在50-100之间,并且机械细胞计数器适合跟踪胚胎。由于受精失败或低质量的卵母细胞排卵,通常会失去约10%-20%的胚胎。在下一步中,将胚胎短暂储存在50μL M 2 + BSA中,在培养箱中不超过30分钟。
- 为了侵蚀胚胎的透明带并减少试剂递送的额外物理障碍,将胚胎转移到60mm板上预热(37°C)100μLAT溶液液滴中(图5C)。使用体视显微镜连续观察受精卵,直到大约 30% 的透明带被侵蚀9.总AT暴露必须为60-90秒。长时间暴露于AT会完全溶解透明带并危及胚胎活力。
5. RNP组装和电穿孔
- 核糖核酸组装
- 要组装RNP复合物,请使用随附的示例表,根据所需的编辑策略在RNP缓冲液(100 mM HEPES pH 7.5、750 mM KCl、5 mM MgCl 2、50%甘油和100 mM Tris(2-羧乙基)盐酸膦[TCEP]无核酸酶水中)中混合适当的反应混合物。
注意:TCEP是一种方便的还原剂,但在水溶液中的半衰期很短;因此,在 RNP 复合物组装之前添加 TCEP。- 对于非同源末端连接(NHEJ)介导的插入缺失,请参阅 补充表4。
- 有关同源定向修复(HDR)介导的编辑,请参阅 补充表5。
- 有关使用配对sgRNA的工程缺失,请参阅 补充表6。
- 无论采用何种策略,都将所需的试剂在室温下合并到PCR管中。
- 为了允许RNP复合物形成,将混合物在37°C孵育10分钟。
注意:RNP复合物可以在室温下储存长达1小时。
- 要组装RNP复合物,请使用随附的示例表,根据所需的编辑策略在RNP缓冲液(100 mM HEPES pH 7.5、750 mM KCl、5 mM MgCl 2、50%甘油和100 mM Tris(2-羧乙基)盐酸膦[TCEP]无核酸酶水中)中混合适当的反应混合物。
- 电穿孔
- 为了在电穿孔前稀释BSA,将胚胎通过至少两滴50μL还原血清培养基。
注意:BSA在电穿孔过程中增加阻力,并可能损坏受精卵。 - 为了制备受精卵(步骤4.3.2)与RNP复合物(步骤5.1.1.2)进行电穿孔,将25-30个胚胎吸液到10μL还原血清培养基液滴中,然后使用手持式移液管加入10μLRNP复合物(步骤5.1.1.2)。
- 为了稀释RNP复合物中的粘性甘油并使样品均质化,请使用体视显微镜通过移液10倍进行混合,直到混合物不再显示出粘度迹象(涡流模式)。
- 为了准备插入电穿孔器的样品,请将这 20 μL 胚胎 + RNP 混合物移液到 0.1 cm 电穿孔比色皿中,同时避免气泡。
- 为了将编辑试剂递送到受精卵中,请使用方波方案在以下条件下电穿孔胚胎:30 V,4-6脉冲,3 ms脉冲长度和100脉冲间隔。
- 要从比色皿中取出受精卵,请使用手持移液器将 50 μL KSOM+BSA(1mg/mL BSA)输送到比色皿顶部,以冲洗可能已沉降到底部的胚胎。轻轻地将这种混合物移出并移液到60毫米板上。
- 重复步骤5.2.6至少2x-3x,并将每个冲洗物放在60毫米的板上,直到大多数胚胎恢复。
注意:典型的恢复是原始加载胚胎的>90%。为确保胚胎存活,请测试培养箱并检查所有试剂的有效期。胚胎容易受到非理想培养条件的影响,例如温度、CO2 水平、湿度和 pH 值。
- 为了在电穿孔前稀释BSA,将胚胎通过至少两滴50μL还原血清培养基。
6. 胚胎培养和基因分型
- 胚胎培养
- 要将受精卵培养到所需阶段,请使用口移液管将20-30个受精卵转移到预平衡培养板中的KSOM + BSA液滴中,并将胚胎移至液滴(图5D)。将板在37°C,湿度为95%的5%CO2中孵育过夜。
注意:通过在孵育前一天或孵育前至少4小时将准备好的35mm培养板放入培养箱中来预平衡(图5D)。 - 为了促进理想的生长条件,第二天仅使用体视显微镜将双细胞胚胎转移到KSOM + BSA混合物的新液滴中,然后返回培养箱。一定要留下或丢弃死亡或未受精的胚胎。
注意:核前阶段胚胎通常在培养72小时后生长成桑葚,在84小时后长成囊胚。
- 要将受精卵培养到所需阶段,请使用口移液管将20-30个受精卵转移到预平衡培养板中的KSOM + BSA液滴中,并将胚胎移至液滴(图5D)。将板在37°C,湿度为95%的5%CO2中孵育过夜。
- 基因分型
- 为了稀释可能干扰PCR反应的培养基成分,请使用吸管通过两滴DPBS清洗桑葚/囊胚胚胎。
- 要加载单个胚胎进行裂解,通过将移液器设置为 1 μL 将单个胚胎转移到 8 孔 PCR 条的一个孔中,然后加入 10 μL 裂解缓冲液(50 mM KCl、10 mM Tris-HCl pH 8.5、2.5 mM MgCl 2、0.1 mg/mL 明胶、0.45% Nonidet P-40、0.45% 吐温 20、0.2 mg/mL 蛋白酶 K 在无核酸酶H 2O 中)。
注意:在制备裂解缓冲液之前加入蛋白酶K。 - 为了裂解胚胎,将热循环仪编程至55°C4小时,然后在95°C孵育10分钟使蛋白酶K失活。
注意:特别是对于首次使用的用户,请尝试在 Tyr 位点进行编辑实验。此工作流程已优化,可用作阳性对照。如有必要,在PCR分析之前将胚胎裂解物在4°C下储存2-3天或在冰箱中储存长达2周。防止反复冻融循环。 - 为了增加基因分型分析成功的机会,通过扩增靶位点两侧稍长的DNA片段以及将用于扩增更精确DNA片段的区域来执行嵌套PCR策略。遵循 补充表7中的条件。
- 遵循以下提到的热循环仪条件:
95°C2分钟
30+ 次循环:95 °C 持续 2 分钟,60 °C 持续 10 秒,72 °C 持续 10 秒
72°C2分钟 - 为了制备巢式PCR策略的第二阶段,对第一个PCR产物进行1:10稀释(步骤6.2.5),并将其中加载2 μL到下一个PCR反应中(引物设计为在前一个扩增子内部)。
注意:必须稀释第一个PCR反应,以减少第二个PCR反应中侧翼引物的残留。按照 补充表8中的步骤制备巢式PCR。 - 使用以下循环条件将PCR反应置于热循环仪中:
95°C2分钟
30 次循环:95 °C 2 分钟,60 °C 10 秒,72 °C 10 秒
72°C2分钟
注意:通常,当扩增子大小为500 bp或更小时,>90%的PCR反应是成功的。 - (可选控制)对于使用 Tyr 作为阳性对照的 NHEJ 介导的 in/del 突变,通过在 37 °C 下使用 10 U HinfI 在 20 μL 反应中孵育 4 小时来消化步骤 6.2.7 中的 10 μL 巢式 PCR 产物(参见 补充表 9)。在 2% 琼脂糖凝胶上,运行消化产物以评估编辑并使用未消化的 PCR 产物作为上样对照。在135 V下运行凝胶30分钟。
注意:选择使用HinfI作为适当的限制性内切酶是因为sgRNA靶区域内存在位置方便的HinfI位点,预计在NHEJ编辑成功后将被消融。详细的方法和结果已在前面描述9,16。 - (可选控制)对于使用 Tyr 作为阳性对照的 HDR 介导的突变,在 20 μL 反应中使用 10 U EcoRI 在 37 °C 下孵育 4 小时,消化步骤 6.2.7 中的 10 μL 巢式 PCR 产物(参见 补充表 10)。在 2% 琼脂糖凝胶上,运行消化产物以评估编辑并使用未消化的 PCR 产物作为上样对照。在135 V下运行凝胶30分钟。
注意:选择EcoRI作为诊断限制性内切酶利用了在sgRNA靶区发现的原始序列,其中,在成功的HDR中,天然存在的HinfI位点被EcoRI位点取代,并且被迫发生移码突变,干扰 Tyr 基因。对于HDR分析,对每个样本执行NHEJ(步骤6.2.8)和HDR(步骤6.2.9)分析,因为这两种结果都可能发生,并且可以帮助确定镶嵌。详细的方法和结果已在前面描述9,16。
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Representative Results
该方法可产生超过 100 μg 的 sgRNA(浓度为 >6,000 ng/L 时为 20 μL),可实现高效的 Cas9/sgRNA RNP 组装。这里描述的常规超排卵方法通常为每个插入的雌性产生10-20个活胚胎。由于与胚胎操作相关的处理错误和典型损失,预计80%的胚胎在电穿孔后受精,存活且状况良好。为了帮助研究人员执行成功的实验,我们提供了一个将小鼠Tyr位点作为阳性对照的示例策略(图6),包括寡核苷酸设计(图6A,补充表1)和NHEJ和HDR事件的基因分型策略(图6B)(步骤6.2)。实验成功和结果的详细例子可用9,16。
在之前将该协议与显微注射进行比较的努力中,总共有 30 多次不同的编辑尝试涉及七个不同的实验室以生成小鼠模型,均成功9,16。此外,该方法还用于研究和报告哺乳动物发育中第一个必需的反转录转座子27。当使用简单的策略(例如递送单个sgRNA)时,C57BL / 6J和C57BL / 6N小鼠品系中RNP的递送率高达100%,in/del形成发生率为50-100%,基于寡核苷酸的小替换量范围为14%-63%9,16 (表1)。当对基因组缺失进行工程处理时,编辑效果可以从3%到100%不等,其中影响因素包括基因组位置、sgRNA设计和缺失大小(表2)。例如,小于 1,000bp 的缺失比大于 1,000 bp 的缺失更成功9,16。
当使用60个胚胎进行电穿孔时,该方案在编辑效果方面超过了显微注射,与显微注射的1只创始人相比,产生了3-4只创始人动物9。对于使用相同sgRNA的C57BL / 6N小鼠品系的基因敲除实验,该方法优于显微注射,平均产生四只创始人动物9 (表2)。对于小插入,如V5或HA标记,ssODNs高达162 nt已经成功测试,目前的目标是扩展到1000-2000 nt。这些实验的成功在很大程度上取决于用于HDR结果的sgRNA的有效性。几乎所有的HDR结果都是马赛克的,但31%-64%的胚胎显示出一些插入的证据9,16。
图1:CRISPR-EZ的概述。 工作流的图形概述。一旦制定了策略和设计,就可以在大约 1 周内生成和测试编辑的胚胎。该图经Modzelewski等人9许可修改。和陈等人16。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:执行该过程的理想时间。 该图显示了受精后第一次细胞分裂的相关特征和时间点。为了实施这种方法,研究人员获得了一些可见的线索,例如形态变化,细胞周期时间估计以及在第一次切割之前经常观察到的化学标记。由于授精和受精的确切时间未知,明智的建议是将第 0 小时视为午夜。在受精卵进入S期之前是为NHEJ或HDR提供编辑机制的理想时刻,这意味着在早上7点到11点之间执行该协议。该图经Modzelewski等人9许可修改。请点击此处查看此图的大图。
图 3:编辑策略的成功。简单的策略,如单个sgRNA,通过NHEJ修复产生in/del,或者当通过HDR与ssODN模板结合时,产生精确突变。NHEJ修复也可用于使用多个sgRNA的缺失。一般来说,策略越简单,CRISPR-EZ就越有效,无需进一步优化。该图经Modzelewski等人9许可修改。请点击此处查看此图的大图。
图 4:定位输卵管和安瓿。手术分离生殖组织后,应用镊子对脂肪垫施加轻微的压力来保护该区域。脂肪垫是一个相对安全的区域,可以操纵而不会伤害卵巢/输卵管。虚线正方形中的区域应移除并放入M2液滴中以进行进一步解剖。卡通图显示了感兴趣的区域,并标记了相关的解剖结构。该图经Modzelewski等人9许可修改。请点击此处查看此图的大图。
图 5:建议的处理和培养板设置。 示意图显示了各种板设置,以帮助研究人员进行胚胎处理和培养。(A) 典型的 M2+BSA 清洗板。(B)用于去除卵丘细胞的M2 +透明质酸酶板。(C) 用于带状减薄的可选 AT 溶液板。(D) 用于胚胎培养的 KSOM+BSA 板,具有维持 pH、湿度和温度所需的矿物油覆盖层。该图经Modzelewski等人9许可修改。请点击此处查看此图的大图。
图6:NHEJ和HDR结果的基因分型示例。 (A)小鼠基因组中Tyr基因周围区域的卡通图。以下是未编辑(WT)序列的详细信息,其中发现了天然存在的HinfI限制性位点,该位点位于sgRNA的靶标识别位点内(红色文本)。下面是成功靶向CRISPR/Cas9后形成的“in/del”之后的许多可能结果之一。这种编辑的确切性质很难预测,但几乎肯定会破坏HinfI网站。下面是供体寡核苷酸序列,它改变两个碱基对,将HinfI位点变成EcoRI识别位点。(B)编辑后的代表性限制性片段长度多态性(RFLP)结果。显示了 NHEJ(顶部)和 HDR(底部)编辑示例。该图经Modzelewski等人9许可修改。该图经Modzelewski等人9许可修改。请点击此处查看此图的大图。
表1:Tyr编辑的受精卵和小鼠的表型和活力。 本表经Modzelewski等人9许可改编。请按此下载此表格。
表2:CRISPR-EZ和显微注射缺失实验的结果。 本表经Modzelewski等人9许可改编。请按此下载此表格。
补充表1:寡核苷酸和供体ssODN列表。 本表经Modzelewski等人9许可改编。请点击此处下载此文件。
补充表2:用于sgRNA反应装置的DNA模板。 本表经Modzelewski等人9许可改编。请点击此处下载此文件。
补充表3:体外转录设置。此表已经 Modzelewski 等人许可修改9。请点击此处下载此文件。
补充表4:用于NHEJ形成的RNP复合物设置。请点击此处下载此文件。
补充表5:用于HDR形成的RNP复合物设置。 本表经Modzelewski等人9许可改编。请点击此处下载此文件。
补充表6:用于删除的RNP复杂设置。 此表已经 Modzelewski 等人许可修改9。请点击此处下载此文件。
补充表7:基因分型PCR设置。 此表已经 Modzelewski 等人许可修改9。请点击此处下载此文件。
补充表8:巢式基因分型PCR设置。 此表已经 Modzelewski 等人许可修改9。请点击此处下载此文件。
补充表9:HinfI限制性酶切酶切设置。请点击此处下载此文件。
补充表 10:EcoRi 限制性摘要设置。请点击此处下载此文件。
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Discussion
这里介绍的是一种简单高效的小鼠基因组编辑技术。电穿孔可用于在1-2周内产生修饰的胚胎(图1),并且可以在6周内产生经过编辑的小鼠9。与同时期开发的基于电穿孔的RNPs7,10,11,12,13,14,15,17,32的方案相比,此处描述的方法在概念上相似,并且在相同的范围内提供效率,在试剂开发和参数方面只有微小的差异。因此,我们建议读者根据需求和设备访问进行比较和对比。顾名思义,该协议是在考虑“普通小鼠实验室”的情况下开发的,只有常用方法(IVT,PCR,凝胶电泳),试剂(标准胚胎和组织培养耗材)或设备(通常用于细菌转染的电穿孔器和比色皿),大多数有兴趣并能够收集胚胎的实验室(或善意地询问邻近的实验室)都可以使用。具有基本胚胎处理技能的研究生级研究人员可以在植入前开发的时间范围内测试sgRNA的效率或多次进行数据生成实验,而无需安排核心设施。然而,如果期望的目标是在不需要显微注射或胚胎操作的情况下生成动物模型,则可以使用侵入性较小的方法10,32。
影响Cas9效率的许多因素正在积极研究中,例如基因组靶标的特异性,sgRNA序列参数,基因组可及性和拓扑结构,尤其是细胞类型。因此,设计和测试sgRNA对于成功至关重要。该协议和其他独立开发的电穿孔方法已经过优化,可快速、短暂地将 Cas9 蛋白/sgRNA RNP 递送到受精卵期胚胎中,提高效率,同时最大限度地减少由于早期发育阶段递送而导致的嵌合体和 RNP7,9,10,11,12,13,14,15,16,33,34.
对于最常见的基因组编辑策略和各种小鼠品系,该方法在成本、效率、小插入、in/del 突变、外显子缺失、插入和点突变方面优于显微注射9.使用当前的协议,该方法非常适合创建高达2.6 kb的in/del突变和缺失,这比蛋白质编码外显子的典型长度170 bp35要长得多。长删除效率较低;但是,此限制并非此协议所独有。因此,随着Cas9介导的编辑的改进和新的Cas蛋白变体的开发,该方法的模块化性质允许这些改进直接增强我们协议的功能。
虽然这种方法可以执行各种简单的编辑,但它在更大和更复杂的策略中的潜力,例如插入条件等位基因或荧光标签,目前正在我们的实验室中进行测试。更长的ssODN可以为复杂的基因组编辑提供一种可行的方法,并在基于显微注射的胚胎编辑中显示出成功36;然而,较长的ssODN合成成本很高,并且尚未用电穿孔37进行广泛测试。使用腺相关病毒(AAV)引入高达3.3 kb的供体序列也显示出成功,但大多数实验室可能无法获得25。目前,我们建议对复杂的小鼠基因组工程进行标准的胚胎干细胞基因组编辑和显微注射。
对Cas9脱靶效应的担忧仍然是8,38,39。工程Cas9变异可能会增加靶标特异性,尽管在RNP胚胎电穿孔研究中尚未对此进行充分研究。CRISPR-EZ可能是创建化合物突变模型以探索复杂遗传学的有用方法。虽然显微注射使同时编辑多个位点成为可能40,但像这里描述的电穿孔方法使这更加方便和有效。
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Disclosures
提交人没有相关的财务申报。
Acknowledgments
A.J.M.创造了导致CRISPR-EZ发展的原始概念并产生了这些数字。C.K.D.为当前手稿汇编并改编了内部和已发表的协议。A.J.M. 由 NIH (R00HD096108) 提供支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
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