Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך רדיולוגיה התערבותי שנקבע להזרקה תוך-תימית בעכברים כדי למנוע את הסיכון לניתוח פתוח ולשפר את הדיוק של זריקות מלעוריות עיוורות.
Abstract
הזרקה תוך-תימית במודלים של עכברים היא טכניקה חשובה לחקר תפקוד התימיק ומערכת החיסון, כולל הפרעות גנטיות ונרכשות בתאי T. לשם כך נדרשות שיטות לתצהיר ישיר של ריאגנטים ו/או תאים לתוך בלוטת התימוס של עכברים חיים. שיטות מסורתיות של הזרקה תוך תמית כוללות ניתוחי חזה או זריקות עיוורות מלעוריות זעיר פולשניות, שלשתיהן יש מגבלות משמעותיות. מכשירי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד אפשרו הזרקות מלעוריות מונחות תמונה בעכברים, ובכך שיפרו מאוד את דיוק ההזרקה של גישת ההזרקה המלעורית ואפשרו הזרקה של מטרות קטנות יותר. עם זאת, הזרקות מונחות תמונה מסתמכות על שימוש במערכת מסילות משולבת, מה שהופך את זה להליך נוקשה וגוזל זמן. כאן מוצגת שיטה ייחודית, בטוחה ויעילה להזרקות תוך תימיות מלעוריות בעכברים, המבטלת את ההסתמכות על מערכת המסילה להזרקות. הטכניקה מסתמכת על שימוש ביחידת מיקרו-אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה כדי לדמות את בלוטת התימוס של העכבר באופן לא פולשני. באמצעות טכניקת יד חופשית, רדיולוג יכול למקם קצה מחט ישירות לתוך בלוטת התימוס של העכבר בהנחיה סונוגרפית. עכברים מנוקים ומורדמים לפני ההדמיה. עבור רדיולוג מנוסה המיומן בהליכים מונחי אולטרסאונד, תקופת הלמידה של הטכניקה המוצהרת היא קצרה למדי, בדרך כלל תוך פגישה אחת. לשיטה יש שיעור תחלואה ותמותה נמוך לעכברים והיא מהירה בהרבה מהטכניקות הקיימות כיום בסיוע מכני להזרקה מלעורית. היא מאפשרת לחוקר לבצע ביעילות זריקות מלעוריות מדויקות ואמינות של תימוזות בכל גודל (כולל איברים קטנים מאוד כמו תימוס של עכברים זקנים או מדוכאי חיסון) עם לחץ מינימלי על החיה. שיטה זו מאפשרת הזרקת אונות בודדות אם רוצים ומאפשרת ניסויים בקנה מידה גדול בשל האופי החוסך בזמן של ההליך.
Introduction
לתימוס יש תפקיד חיוני בהתפתחות תאי T ובחסינות. מחסור בתאי T, אשר יכול להיגרם על ידי התנוונות thymic, הפרעות גנטיות, זיהומים, וטיפולים בסרטן, בין היתר, מוביל לתמותה גבוהה ותחלואה 1,2. מודלים של עכברים הם הכרחיים הן במחקר אימונולוגיה בסיסית והן במחקר אימונולוגיה תרגומית, והם שימשו במשך עשרות שנים לחקר ביולוגיה תימית והתפתחות תאי T, כמו גם לפיתוח טיפולים עבור אלה הסובלים מתפקוד לקוי של בלוטת התימוס ומחסור בתאי T 3,4,5.
חלק מרכזי בחקר התימיקה היה הזרקה תוך-תמית של חומרים ביולוגיים כגון תאים, גנים או חלבונים במודלים של עכברים 6,7,8,9,10,11,12. שיטות הזרקה תוך-תימיות קונבנציונליות משתמשות בכריתת בית החזה ולאחר מכן בהזרקה תוך-תימית בהדמיה ישירה או בהזרקה מלעורית "עיוורת" למדיאסטינום. הגישה הניתוחית מגדילה באופן משמעותי את הסיכון לפנאומוטורקס, בין היתר. יתר על כן, הלחץ המוגבר במהלך ניתוח זה גורם לדיכוי חיסוני, ובכך עלול לפגוע בנתונים אימונולוגיים13. חוקרים מנוסים, לאחר תרגול מסוים, יכולים לבצע את טכניקת ההזרקה העיוורת, אך גישה זו פחות מדויקת ולכן מגבילה את הנבדקים הניסיוניים לעכברים צעירים עם תימוס גדול.
השימוש בהנחיית אולטרסאונד הוכנס כחלופה מדויקת וזעיר פולשנית לגישות ההזרקה התוך-תימיות המסורתיות14. עם זאת, הליך זה גוזל זמן רב בעת שימוש במערכת המסילה המשולבת במקום בטכניקת היד החופשית. ביצוע הזרקות עם תושבת ההזרקה דורש אופטימיזציה ומיקום קפדניים של המתמר בעזרת החיבורים השונים כגון מעמד המתמר והרכבתו, מערכת המיקום X, Y ו- Z, כמו גם הפעלה מיומנת של בקרות המיקרו-מניפולציה והרחבות מערכת המסילה. טכניקה חלופית פשוטה, הזרקת תימי מונחית אולטרסאונד, מוצגת כאן על ידי רדיולוג באמצעות גישה ביד חופשית15, שהיא גם חלופה מהירה וגם מדויקת זעיר פולשנית לשיטות שתוארו לעיל. חשוב לציין, ניתן לבצע את הגישה הנוכחית עם כל מערכת הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה ללא צורך בתושבת הזרקה ומערכת מסילות משולבת. הוא שימושי במיוחד למחקרים הדורשים הזרקה של מספר גדול של עכברים11, לניסויים הכוללים הזרקה של שתי האונות התימיות, או להזרקה מדויקת של תימוזים קטנים בעכברים מזדקנים, מוקרנים או מדוכאי חיסון12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים במרכז לגילוי וחדשנות (פרוטוקול IACUC 290). עבור המחקר הנוכחי, C57BL/6 עכברים (נקבה, 4-6 שבועות), C57BL/6 עכברים (נקבה, בת 6 חודשים), עכברים נקבות J:NU, עכברי נקבות NOD scid gamma (NSG) ו-B6; עכברי CAG-luc, -GFP שימשו כמודל העכבר הצעיר, מודל העכבר הזקן, מודל העירום האתימי, מודל החיסון ומקור התא הביולוגי, בהתאמה. העכברים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). הליך זה ידרוש בדרך כלל שני אנשים (אחד להישאר סטרילי בעת ביצוע הזריקות והשני לטפל בעכברים).
1. הכנת בעלי חיים
- השרימו הרדמה בעכברים באמצעות גז איזופלורן 3%-4% ושמרו על הרדמה באמצעות גז איזופלורן 1%-3% הניתן באמצעות חרוט אף ומכשיר אידוי מכויל מדויק (ראו טבלת חומרים).
- אשרו את עומק ההרדמה/חוסר ההכרה המתאימים על ידי חוסר תגובה לצביטת הכפה האחורית.
- הסר את הפרווה מאזור החזה הקדמי של העכברים על ידי החלת שכבה דקה של קרם דפילציה במשך פחות מדקה אחת. השתמשו במגבת נייר רטובה כדי להסיר את הקרם לחלוטין יחד עם הפרווה הרופפת.
הערה: מריחת קרם רב מדי תגרום לעור באזור החזה להיות מודלק. - הניחו עכבר אחד בכל פעם, בשכיבה, על הפלטפורמה המחוממת של תחנת ההדמיה של אולטרסאונד של בעלי חיים קטנים (ראו טבלת חומרים) עם חרוט האף במקומו (איור 1).
- הצמידו את העכבר לשלב באמצעות סרט דבק רפואי בחלק האחורי ובגפיים הקדמיות (איור 1).
- יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
- יש לחטא את עור בית החזה העליון ללא פרווה באמצעות אפליקטור כלורהקסידין גלוקונאט (ראו טבלת חומרים).
2. הכנת מכשיר האולטרסאונד והשדה הסטרילי
- הפעל את הבדיקה הליניארית בתדר הגבוה ביותר הזמינה, בדרך כלל הבדיקה עם הרזולוציה המרחבית הגבוהה ביותר עבור גודל החיה המצולמת. הפעל את הבדיקה על-ידי הקשה על הלחצן המתאים לאחר מסך האתחול.
הערה: עבור יישום זה עם עכברים, הבדיקה המשמשת מיועדת במיוחד לשימוש עם עכברים וחולדות קטנות (ראה טבלת חומרים). - מטב את הגדרות האולטרסאונד להדמיה והזרקה בהתאם לשלבים הבאים.
- התאם את עומק שדה הראייה לגודל המתאים לחיית המטרה על-ידי התאמת המחוונים המכוונים אנכית בצד ימין של המסך (איור 2). הגדרת העומק המרבית תהיה בדרך כלל כ-6-8 מ"מ לעכברים צעירים.
- כוונן את רווח גווני האפור על-ידי החלקת הלחצן לאורך הסרגל האופקי בתחתית המסך (איור 2). המטרה היא להתחיל עם תמונה שהיא רק מעט כהה יותר מאשר מראה "אפור" טיפוסי.
- התאם את אזור המוקד (חץ כחול בצד ימין של המסך, איור 2) לרמה הצפויה של בלוטת התימוס. עבור עכברים צעירים, זה יהיה סביב עומק של 4 מ"מ.
- אם ברצונך לצלם תמונה, בדוק את הפונקציונליות של תמונת החנות ואחסן לחצני קליפ כדי לוודא שניתן לשמור את התמונות כראוי לאורך כל ההליך. בצע זאת על-ידי הקשה על לחצן שמור קליפ בפינה השמאלית התחתונה של המסך או על-ידי הקשה על לחצן הקפאה ולאחר מכן הקשה על שמור תמונה (איור 2).
- יש למרוח כמות קטנה (~1 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד על משטח המתמר (ראו טבלת חומרים) כשהוא זקוף, כשהוא מונח במחזיק מכשיר האולטרסאונד או בידיו של עוזר.
- הכינו שדה סטרילי קטן ליד הפלטפורמה המחוממת. המיקום האופטימלי לכך הוא בדרך כלל בין הפלטפורמה למכשיר האולטרסאונד.
- רוקנו את הפריטים האלה לשדה הסטרילי: כיסוי בדיקה סטרילי, גומייה, כפפות סטריליות וג'ל אולטרסאונד סטרילי (ראו טבלת חומרים).
- עם הקמת השדה הסטרילי והפריטים במקום, לבשו את הכפפות הסטריליות.
- מניחים בזהירות את כיסוי הבדיקה הסטרילי מעל מתמר האולטרסאונד (כמו גם מעל הג'ל שהונח בתחילה על הבדיקה). לשמור על סטריליות ולגעת רק בכיסוי הסטרילי, שום דבר אחר. החליקו את הגומייה הסטרילית מעל כיסוי הבדיקה הסטרילי כדי לשמור אותה במקומה.
הערה: מוקדי האוויר, ללא קשר לגודלם, עלולים להפריע להדמיית אולטרסאונד. לפיכך, חיוני להחיל את ג'ל האולטרסאונד בין המתמר לכיסוי הבדיקה הסטרילית, ועל גבי כיסוי הבדיקה כדי להבטיח ממשק ללא אוויר בין בדיקת האולטרסאונד לבין החיה. - יש להניח כמות מתונה (2-3 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד סטרילי על המתמר.
הערה: המשתמש מוכן כעת לצלם עכבר מורדם.
3. הדמיה ואיתור בלוטת התימוס
- תוך שמירה על סטריליות, הניחו את הבדיקה בעלת ג'ל האולטרסאונד במאונך על החלק המחוטא של דופן החזה הקדמית של העכבר לצורך הדמיה ראשונית.
- קח רגע להסתכל על תמונת האולטרסאונד ולייעל אותה עוד יותר. חזור לשלב 2.2 והתאם את עצמך כדי לקבל מראה דומה לזה של איור 3.
- סרוק את החזה הקדמי של העכבר במישור רוחבי. בצעו זאת על ידי החזקת המתמר במאונך והזזתו מעלה ומטה מהצוואר אל הבטן בתנועה דמוית מכחול או "סוחפת".
הערה: הלב יהיה המבנה המזוהה ביותר בחזה בשל תנועתו המהירה ומראהו ה"קאמרית". ברגע שהלב ממוקם, זה יכול לשמש כנקודת התייחסות כדי לרכוש תמונה של בלוטת התימוס. - כאשר הלב מרוכז בשדה הראייה, טאטאו את המתמר מעט לכיוון הצוואר. רק עדיף על הלב, התימוס הוא נתקל בדרך כלל.
- דמיינו את בלוטת התימוס כמבנה בילובי, פירמידלי, היפואקואי ("כהה" או "שחור" המופיע על המסך) שמרכזו בקו האמצע, קדמי לאבי העורקים ואחורי לעצם החזה (איור 3A).
- שימו לב לשני המבנים השחורים העגולים (כלומר, "היפואקואיים") משני צדי החזה העליון.
הערה: אלה הם הווריד הקאווה הדו-צדדי. אבי העורקים הוא מבנה היפואקואי מעוגל דומה בקו האמצע בין שני הוורידים. ניתן לזהות אותם בקלות על ידי תנועתם הפועמת.
4. הזרקת התימוס
- במידת הצורך, יש למרוח יותר (2-3 מ"ל) ג'ל אולטרסאונד סטרילי על המתמר.
הערה: כמות גדולה יחסית של ג'ל סטרילי על המתמר (בהשוואה לגודל בית החזה של העכבר) תשמש כ"כרית ג'ל" סביב דופן החזה של העכבר. זה יקטין את מספר ממצאי האולטרסאונד שנעשו על ידי אוויר בתוך שדה הראייה. - באמצעות בדיקת אולטרסאונד, אתר את החלק הרחב ביותר של בלוטת התימוס, שהוא בדרך כלל אתר היעד האידיאלי להזרקה. צפה מסלול מחט אופקי במיקום הנבחר.
- שימו לב היכן נמצאים כלי הדם העיקריים (SVCs ואבי העורקים) באתר זה. הימנע אלה במהלך ההזרקה.
- כלי הדם יהיו מבנים היפוכואיים, פועמים, כמתואר בשלב 3.7. אם אינכם בטוחים, השתמשו במצב דופלר בצבע כדי לבדוק אם יש זרימה בתוך כלי הדם (איור 4A). הפעל את מצב דופלר הצבע על-ידי הקשה על לחצן צבע על המסך.
- אם אחד מכלי הדם העיקריים (או הלב) צפוי להיות לאורך מסלול המחט הצפוי, בחר אזור יעד חדש או מצא גישה/מסלול אחר.
- החזיקו את המתמר ביד אחת ובמחט אינסולין של 30 גרם (ראו טבלת חומרים) עם 10 מיקרוגרם של הזרקה ביד השנייה.
הערה: ההזרקה תשתנה בהתאם לתכנון הניסוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתמיסת מלח עם מאגרי פוספטים, טריפן כחול או D-לוציפרין (0.1 מיקרוגרם/10 מיקרול). - כדי להתחיל בתהליך ההזרקה, הזז את המתמר לרוחב כך שהתימוס יהיה מחוץ למרכז בשדה הראייה של האולטרסאונד. ודא כי הצד השני של שדה הראייה מורכב בעיקר ג'ל אולטרסאונד ולא שום דבר אחר.
- הניחו את קצה המחט בג'ל שמתחת למתמר והזיזו את המחט באיטיות עד שהיא תזוהה בצמוד לפני העור (איור 4B).
- תוך כדי הדמיה רציפה של המחט תחת אולטרסאונד, יש להחדיר את המחט לבלוטת התימוס במסלול מלעורי, הרחק מכלי הדם.
- השתמש במסלול אופקי "קרוס תימוס" כדי למקם את קצה המחט באונה התימית בניגוד לאתר הכניסה. זה מסביר דליפה פוטנציאלית לאורך מערכת המחט (איור 5A).
- ברגע שקצה המחט נמצא בתוך החלק הרצוי של בלוטת התימוס, הזריקו במהירות את התוכן (כגון 10 μL של טריפן כחול או D-לוציפרין, 0.1 מיקרוגרם/10 μL) מהמזרק 30 G תוך שימוש בהדמיה סונוגרפית.
- כדי לייצב את המזרק במהלך החדרת המחט והזרקתה, החזיקו את המזרק בין האגודל לאצבע השלישית ושלטו בבוכנה של המזרק באמצעות האצבע המורה.
- הסר את המחט לאחר שכל התוכן הופקד.
5. ניטור לאחר הזרקה של בעלי חיים
- מעבירים את החיה לכלוב ריק ומתבוננים עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על משכון החזה.
הערה: התאוששות מלאה מההרדמה צפויה להתרחש תוך 2 דקות. - עקוב אחר בעל החיים במשך 10 דקות נוספות לאיתור סימני מצוקה, נשימה מאומצת או דימום.
הערה: כאבים לאחר ההזרקה אינם צפויים, ובדרך כלל אין צורך בשיכוך כאבים לאחר ההזרקה. - לאחר שהתאושש לחלוטין ולאחר תקופת תצפית ללא אירועים לאחר ההזרקה, החזירו את החיה שהוזרקה לחברתם של בעלי חיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היישום המוצלח של טכניקה זו מסתמך על כמה צעדים מרכזיים שיש לעקוב אחריהם. ראשית, יש להבטיח זיהוי אמין של בלוטת התימוס עצמה. בעכברים צעירים, זה פשוט בגלל גודלה הגדול של הבלוטה (איור 3A). בעכברים מבוגרים או בעכברים מדוכאי חיסון, זה יכול להיות מאתגר יותר; עם זאת, זה עדיין אפשרי מאוד עם ציוד אולטרסאונד מודרני (איור 3B,C). שנית, יש חשיבות קריטית לקביעת מסלול המחט כך שהיא תוצג באופן רציף במהלך התקדמות קצה המחט דרך שכבות דופן בית החזה ולתוך בלוטת התימוס. הזרקה מוצלחת תדמיין את המחט במלואה תוך כדי התקדמותה. זה מבטיח למפעיל שהמחט לא חצתה מבנה קריטי, כמו הלב, אבי העורקים או אחד מהוורידים הנחותים (איור 4). זה חל גם על ההזרקה עצמה. יש תמיד לדמיין את קצה המחט במיקום המטרה שלו במהלך ההזרקה, כך שהתצהיר התוך-תאי יאושר (איור 5).
קיימות כמה מלכודות קלות, שאם מכירים בהן, ניתן למתן אותן בקלות יחסית. כאשר מצמידים את העכבר לשלב וחרוט האף, בית החזה של העכבר צריך להיות נייטרלי ככל האפשר (כלומר, ללא סיבוב משמעותי שמאלה או ימינה). אם יש יותר מדי סיבוב של בית החזה, "זווית הגישה" הנכונה של המחט לא יכול להיות בר השגה בקלות. כמו כן, אם העכבר אינו מאובטח במקום מספיק חזק, הוא עלול לזוז או להחליק כאשר מנסים לקדם את המחט, לעוות את האנטומיה ולהקשות על הדמיה. עם זאת, עם טכניקה נכונה והכנה, הזרקה intrathymic מוצלח ניתן להשיג עם עקביות, אמינות, ו reproducibility.
לאחר השלמת ההזרקה, ישנן מספר דרכים לאשר את המיקום התוך-תאי של ההזרקה. המחקר הנוכחי השתמש בלוציפרין כהזרקה לעכברים מהונדסים של לוציפראז. לאחר מכן ניתן להעריך אותם מיד לאחר ההזרקה באמצעות הדמיית ביולומינסנציה, המאשרת את המיקום הנכון של ההזרקה מבלי להקריב את החיה (איור 6A). לטכניקה זו יש יתרון נוסף בכך שניתן לדמות תאים מתויגים של לוציפרין בנקודות זמן מרובות, מה שמבטיח את המשך הפעילות בבלוטת התימוס. לחלופין, ניתן להזריק טריפן כחול כסמן חזותי של אתר ההזרקה, ולאחר מכן ניתן לאשר את דיוק ההזרקה ex vivo עם נמק16 (איור 6B).
איור 1: עכבר מורדם ממוקם על במת ההדמיה לצורך אולטרה-סאונד של בלוטת התימוס. נקבת עכבר C57BL/6 בת 6 שבועות עם חזה מורדם והועברה לתחנת ההדמיה. העכבר נמצא במצב שכיבה, כאשר הרגליים המושטות מאובטחות על ידי סרט הדבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הגדרות מכשיר אולטרסאונד. תמונה של לוח הבקרה של מכשיר האולטרסאונד (מסך מגע). ההתאמות העיקריות של ההגדרות למיטוב ההדמיה יהיו התאמת העומק (חץ אדום), אזור המוקד (מוקף בצהוב) והרווחים (כוכבית אדומה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הדמיית אולטרסאונד של בלוטת התימוס בעכברים צעירים ומבוגרים מדוכאי חיסון ומדוכאי חיסון. (A) עכבר צעיר בעל יכולת חיסונית (C57BL/6, נקבה, בן 4 שבועות, n = 5). התצוגה הסונוגרפית הרוחבית מראה את האונות הימנית והשמאלית של בלוטת התימוס (כוכביות). (B) עכבר זקן בעל יכולת חיסון (C57BL/6, נקבה, בן 6 חודשים, n = 5). בלוטת התימוס (כוכבית) קטנה יותר אך שומרת על מיקומה הטיפוסי ועל צורתה הפירמידלית. (C) עכבר צעיר בעל יכולת חיסונית (NOD scid gamma, נקבה, בת 4 שבועות, n = 5). שימו לב לגודל הקטן בהרבה של בלוטת התימוס (כוכבית) בהשוואה לעכבר הצעיר הרגיל. (D) עכבר עירום אתימי (נקבה, בת 8 שבועות, n = 1). יש היעדר מוחלט של רקמת thymic. יש לציין כי הקו האנכי הכהה (היפוצ'ואי) במרכז התמונה (כוכבית) הוא חפץ הצללה מעצם החזה, ללא רקמה תימית אמיתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הכנה להזרקה . (A) תמונת דופלר צבעונית של בית החזה הקדמי מדגימה את הקשר של בלוטת התימוס עם כלי הדם המדיאסטינליים. המרכז התחתון הוא קשת אבי העורקים (חץ אדום), וכלי הדם המעוגלים משני צדיו הם ראשי החץ הצהובים (venae cavae) העליונים מימין ומשמאל. הדם הזורם לעבר בדיקת ההדמיה מקודד באדום, והדם הזורם הרחק מהמתמר מקודד בכחול. (B) מיקום מחט מלפני התקדמות לחזה מגישה שמאלית. קצה המחט (חץ צהוב) חייב להיות בקו אחד עם מתמר האולטרסאונד ורמת הקצה עם החלק האמצעי של התימוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: טכניקת הזרקה . (A) מיקום מחט להזרקת האונה התימית הימנית של עכבר צעיר בעל יכולת חיסונית. קצה המחט (חץ צהוב) נמצא בחלק המרכזי של האונה הימנית. (B) תמונה לאחר ההזרקה של האונה הימנית המציגה אוסף של נוזל כהה (היפוצ'ואי) ובועות אוויר בהירות (אקוגניות) קטנות באתר ההזרקה (קו אדום מקווקו). החץ הצהוב מציין את קצה המחט. (C) מיקום מחט (חץ צהוב בקצה המחט) להזרקת האונה התימית השמאלית של עכבר צעיר בעל יכולת חיסונית. (D) מיקום מחט (חץ צהוב) להזרקת האונה הימנית של עכבר צעיר בעל יכולת חיסונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: אימות דיוק in vivo ו-ex vivo . (A) הזרקת D-לוציפרין (0.1 מיקרוגרם/10 μL) לתוך בלוטת התימוס של עכבר מהונדס לוציפראז בן 8 שבועות ואחריה 1 שניות של הדמיית in vivo bioluminescence באמצעות מערכת הדמיה in vivo bioluminescence (n = 3). קידוד הצבעים מציג את סך הזוהר הביולומינסנציה (פוטונים·s−1·cm−2·steradian−1) כפי שמצוין בסרגל הצבע מימין. (B) התימוס של שני עכברי C57BL/6 בני 5 שבועות הוזרק עם כחול טריפאן, ודיוק ההזרקה הודגם על ידי נמק (n = 3). פאנל עליון: משטח גב של תימוס מוזרק בגוון כחול טריפאן באתרו. פנל תחתון: משטח גחון של תימוס ex situ מוכתם כחול טריפאן לאחר הזרקת האונה השמאלית. הועתק באישור Tuckett et al.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרקה ידנית חופשית מונחית אולטרסאונד היא טכניקה מדויקת ביותר להעברת חומרי לימוד לבלוטת התימוס בצורה יעילה ואספטית. לאחר העיקור הראשוני של העור באתר ההזרקה, נשמרת סטריליות במהלך ההליך הודות לשימוש בכפפות סטריליות, כיסויי בדיקת אולטרסאונד סטריליים וג'ל אולטרסאונד סטרילי. בניגוד לגישה המלעורית העיוורת 10,17 או הסתמכות על חתכים כירורגיים להדמיה ישירה של בלוטת התימוס18,19, שהן השיטות הנפוצות להזרקות תוך-תימיות בעכברים, שימוש בהנחיית אולטרסאונד ביד חופשית משלב רמה גבוהה של בטיחות ומהירות עם דיוק עצום של ההליך. ביצוע הזרקות מונחות אולטרסאונד באמצעות פלטפורמת הרכבת14 מציע רמה דומה של בטיחות ודיוק, אך גישה מסורבלת זו אורכת בדרך כלל לפחות 5 דקות לכל הזרקה מרגע הרדמת העכבר והתמקמו על פלטפורמת ההדמיה, בהשוואה לטכניקת היד החופשית המאפשרת למומחה להשלים הזרקות בסביבות 20-30 שניות לכל עכבר15.
ניסיון והכשרה משמעותיים הם תנאי סף להשגת רמת מיומנות גבוהה בכל השיטות השונות להזרקה תוך תימית, כולל טכניקת הזרקת יד חופשית מונחית אולטרסאונד. עם זאת, רדיולוג עם ניסיון קליני בהליכים מונחי אולטרסאונד יכול להיות מיומן בהזרקה תוך-תימית של עכברים תוך שעה תרגול אחת.
הגמישות של שיטת ההזרקה ביד חופשית מאפשרת לחוקר להזריק אונה תימית אחת, שתי אונות תימיות במעבר הזרקה אחד, או שתי אונות תימיות בשתי זריקות נפרדות, בהתאם לצרכים הניסיוניים הספציפיים של המחקר. יש לציין כי הזרקת אונות תימיות בודדות עם פלצבו לעומת חומר לימוד יכולה לשמש כאסטרטגיה להפחתת מספר הנבדקים במחקר הדרושים על ידי שימוש באונה המוזרקת פלצבו כבקרה פנימית. לעומת זאת, ההתקנה הנוקשה של מערכת המסילה המשולבת מאפשרת הזרקה לאונה תימית אחת לכל תקופת הזרקה. הזרקה של אונה שנייה תדרוש פירוק של חיבור מחזיק המזרק, התקנתו בצד האחורי של העכבר, והתאמה זהירה של בקרות המיקרו-מניפולציה עד שמסלול המחט יהיה נכון לפני שההזרקה הבאה תוכל להמשיך. בעיות אלה מגדילות באופן משמעותי את החשיפה להרדמה ואת הזמן הדרוש להשלמת הניסוי.
יתרון ייחודי של שיטת האולטרסאונד התוך-תימי ביד חופשית בהשוואה להליך ההזרקה התוך-תימי העיוור הוא הקלות היחסית של הזרקה מדויקת של תימוזים קטנים כמו התימוזים של עכברים מבוגרים (6 חודשים ומעלה), שהם קטנים בהרבה מאלה שבעכברים צעירים (בני 4-10 שבועות). יתרון זה, בשילוב עם קלות ההרחבה, מאפשר לאימונולוגים לערוך מחקרים מבוססי הזרקה תוך-תמית במגוון רחב של מודלים פרה-קליניים של עכברים.
לסיכום, התצפיות מספקות ראיות רבות התומכות בטכניקת היד החופשית להזרקות בטוחות, מהירות ומדויקות המכוונות לאונות תימיות בודדות. שיטה זעיר פולשנית זו, אם כן, מייצגת אפשרות יעילה ומדויקת ביותר למחקר התימוס, ומאפשרת מחקרים פרה-קליניים בקנה מידה גדול בעכברים עם תימוזים הנעים בין גדולים לקטנים מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לריימונד ה. ת'ורנטון על עבודתו המוקדמת התובנה והמקיפה על טכניקה זו. מחקר זה מומן על ידי תמיכה במענקים מהמכון הלאומי לסרטן (NCI 1R37CA250661-01A1), האגודה לחקר לוקמיה בילדים, בית הספר לרפואה של מרידיאן האקנסק, וקרן HUMC / התמודדות עם סרטן ילדים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A.
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A.
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D.
