Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Spermaverzameling en computerondersteunde spermaanalyse in het Teleost-model Japanse Medaka (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

Dit artikel beschrijft twee snelle en efficiënte methoden voor het verzamelen van sperma van het kleine modelvis medaka (Oryzias latipes), evenals een protocol voor het betrouwbaar beoordelen van de spermakwaliteit met behulp van computerondersteunde spermaanalyse (CASA).

Abstract

Japanse medaka (Oryzias latipes) is een teleostvis en een opkomend gewerveld model voor ecotoxicologie, ontwikkelings-, genetica- en fysiologieonderzoek. Medaka wordt ook op grote schaal gebruikt om de voortplanting van gewervelde dieren te onderzoeken, wat een essentiële biologische functie is omdat het een soort in staat stelt om te bestendigen. De kwaliteit van het sperma is een belangrijke indicator voor de mannelijke vruchtbaarheid en dus het succes van de voortplanting. Technieken voor het extraheren van sperma- en spermaanalyse zijn goed gedocumenteerd voor veel soorten, waaronder teleostvissen. Het verzamelen van sperma is relatief eenvoudig in grotere vissen, maar kan ingewikkelder zijn in kleine modelvissen omdat ze minder sperma produceren en delicater zijn. Dit artikel beschrijft daarom twee methoden voor het verzamelen van sperma in de kleine modelvis, Japanse medaka: teelballendissectie en buikmassage. Dit artikel toont aan dat beide benaderingen haalbaar zijn voor medaka en laat zien dat buikmassage een herhaald aantal keren kan worden uitgevoerd, omdat de vissen snel herstellen van de procedure. Dit artikel beschrijft ook een protocol voor computerondersteunde spermaanalyse in medaka om objectief verschillende belangrijke indicatoren van medaka-spermakwaliteit te beoordelen (motiliteit, progressiviteit, duur van motiliteit, relatieve concentratie). Deze procedures, gespecificeerd voor dit nuttige kleine teleostmodel, zullen het begrip van de omgevings-, fysiologische en genetische factoren die de vruchtbaarheid bij gewervelde mannen beïnvloeden, aanzienlijk verbeteren.

Introduction

Japanse medaka is een kleine, eierleggende zoetwater teleost vis afkomstig uit Oost-Azië. Medaka is een uitstekend modelsysteem voor gewervelde dieren geworden voor ecotoxicologie, ontwikkelingsgenetica, genomica en evolutionaire biologie en fysiologiestudies 1,2. Net als de populaire zebravissen zijn ze relatief gemakkelijk te kweken en zeer resistent tegen veel voorkomende visziekten 1,2. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van medaka als model, waaronder een korte generatietijd, transparante embryo's 1,2 en een gesequenced genoom3. In tegenstelling tot zebravissen heeft medaka een geslachtsbepalend gen4 en een hoge temperatuur (van 4-40 °C) en zoutgehalte (euryhaliene soort) tolerantie5. Ook zijn veel genetische en anatomische hulpmiddelen, evenals protocollen 6,7,8,9,10,11,12, ontwikkeld in medaka om de studie van de biologie te vergemakkelijken.

Voortplanting is een essentiële fysiologische functie omdat het een soort in staat stelt om te bestendigen. Gewervelde reproductie vereist een groot aantal nauwkeurig georkestreerde gebeurtenissen, waaronder de productie van eicellen bij vrouwen en de productie van sperma bij mannen. Sperma zijn unieke cellen, geproduceerd door het complexe proces van spermatogenese, waarbij er een aantal controlepunten zijn om de levering van een hoogwaardig product te garanderen13. Gametenkwaliteit is een focus geworden in aquacultuur- en vispopulatiestudies vanwege de impact op het succes van de bevruchting en de overleving van larven. De kwaliteit van het sperma is daarom een belangrijke indicator voor de mannelijke vruchtbaarheid bij gewervelde dieren.

Drie nuttige factoren voor het beoordelen van de kwaliteit van het sperma van vissen zijn beweeglijkheid, progressiviteit en levensduur. Procentuele beweeglijkheid en progressieve beweeglijkheid zijn veel voorkomende indicatoren van de spermakwaliteit, omdat progressieve beweging noodzakelijk is voor en sterk correleert met bevruchtingssucces14,15. De duur van de beweging is ook een belangrijke indicator bij vissen, omdat sperma bij de meeste teleostsoorten minder dan 2 minuten volledig beweeglijk blijft en het traject van sperma over het algemeen minder lineair is dan bij zoogdieren15. Veel studies die de beweeglijkheid van sperma in het verleden beoordeelden, vertrouwden echter op subjectieve of semi-kwantitatieve methoden voor het analyseren van sperma15,16. De beweeglijkheid van het sperma in medaka is bijvoorbeeld in het verleden visueel geschat onder een microscoop17. Het is ook geschat door spermabewegingen te registreren en beeldvormingssoftware te gebruiken om frames samen te voegen en zwempad en -snelheid te meten 18,19,20. Dergelijke benaderingen missen vaak robuustheid en leveren verschillende resultaten op volgens de persoon die de analyse uitvoert15,21.

Computer-assisted sperm analysis (CASA) werd in eerste instantie ontwikkeld voor zoogdieren. CASA is een snelle kwantitatieve methode om de spermakwaliteit te beoordelen door de snelheid en het traject op een geautomatiseerde manier te registreren en te meten15. Bij vissen is het in verschillende soorten gebruikt om de effecten van verschillende waterverontreinigende stoffen op de spermakwaliteit te monitoren, voor het identificeren van interessante voorlopers om het broedbestand te verbeteren, om de efficiëntie van cryopreservatie en opslag te verbeteren en om de omstandigheden voor bevruchting te optimaliseren15. Daarom is het een krachtig hulpmiddel voor het betrouwbaar beoordelen van de spermakwaliteit bij verschillende gewervelde soorten. Vanwege de belangrijke diversiteit in voortplantingsstrategieën tussen vissen, verschilt het sperma van teleostvissen echter van dat van zoogdieren en van de ene vissoort tot de andere. Teleostvissen, die voornamelijk eieren extern bevruchten door gameten in water vrij te geven, hebben sterk geconcentreerd sperma dat relatief eenvoudig van structuur is zonder acrosoom, in tegenstelling tot zoogdieren, die intern bevruchten en daarom niet hoeven te compenseren voor verdunning in water, maar wel meer viskeuze vloeistoffen moeten weerstaan14. Bovendien beweegt sperma van de meeste vissen snel, maar is het minder dan 2 minuten na activering volledig beweeglijk, hoewel er verschillende uitzonderingen zijn15,22. Omdat de beweeglijkheid bij de meeste vissen snel kan afnemen, moet uiterste voorzichtigheid worden betracht met de timing van de analyse na activering bij het bepalen van een spermaanalyseprotocol voor vissen.

Reproductie is een van de gebieden in de biologie waarin teleosts en medaka op grote schaal zijn gebruikt als modelorganismen. Inderdaad, medaka-mannetjes vertonen interessant reproductief en sociaal gedrag, zoals partnerbewakingvan 23,24. Daarnaast bestaan er verschillende transgene lijnen om de neuro-endocriene controle van de voortplanting bij deze soort te bestuderen 25,26,27. Spermabemonstering, een procedure die relatief eenvoudig is bij grotere vissen, kan ingewikkelder zijn bij kleine modelvissen omdat ze minder sperma produceren en delicater zijn. Om deze reden, de meeste studies met sperma bemonstering in medaka extract milt (vis sperma) door het verpletteren van ontleed teelballen 17,28,29,30. Een paar studies gebruiken ook een gemodificeerde buikmassage om de milt direct uit te drukken in activerend medium 18,19,20; met deze methode is het echter moeilijk om de hoeveelheid en kleur van milt geëxtraheerd te visualiseren. Bij zebravissen wordt buikmassage vaak gebruikt om milt uit te drukken, dat onmiddellijk wordt verzameld in een capillaire buis 31,32,33. Deze methode maakt het mogelijk om het volume milt te schatten, evenals observatie van de ejaculaatkleur, wat een snelle en eenvoudige indicator is van de spermakwaliteit32,33. Daarom ontbreekt een duidelijk en goed beschreven protocol voor spermaverzameling en -analyse voor medaka.

Dit artikel beschrijft daarom twee methoden van spermaverzameling in de kleine modelvis Japanse medaka: teelballendissectie en buikmassage met capillaire buisjes. Het toont aan dat beide benaderingen haalbaar zijn voor medaka en laat zien dat buikmassage een herhaald aantal keren kan worden uitgevoerd, omdat de vis snel herstelt van de procedure. Het beschrijft ook een protocol voor computerondersteunde spermaanalyse in medaka om op betrouwbare wijze verschillende belangrijke indicatoren van medaka-spermakwaliteit te meten (beweeglijkheid, progressiviteit, levensduur en relatieve spermaconcentratie). Deze procedures, gespecificeerd voor dit nuttige kleine teleostmodel, zullen het begrip van de omgevings-, fysiologische en genetische factoren die de vruchtbaarheid bij gewervelde mannen beïnvloeden, aanzienlijk verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten en dierbehandeling werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen over het welzijn van proefdieren aan de Noorse Universiteit voor Levenswetenschappen (NMBU). De experimenten werden uitgevoerd met volwassen (6-9 maanden oude) mannelijke Japanse medaka (Hd-rR-stam) opgegroeid bij NMBU (Ås, Noorwegen). De methoden werden ook kort getest bij 9 maanden oude mannelijke Japanse medaka (CAB-stam) die is opgegroeid aan het National Research Institute for Agriculture, Food and the Environment (INRAE, Rennes, Frankrijk).

1. Voorbereiding van instrumenten en oplossingen

  1. Bereid anesthetische stockoplossing (0,6% Tricaine).
    1. Verdun 0,6 g Tricaine (MS-222) in 100 ml 10x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
    2. Aliquot 2 ml van de anesthetische stamoplossing in 50 plastic buisjes van 2 ml en bewaar bij -20 °C tot gebruik voor anesthesie of euthanasie.
  2. Bereid terugwinningswater (0,9% natriumchloride [NaCl] oplossing).
    1. Voeg 27 g NaCl toe aan 3 L aquariumwater.
    2. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik.
  3. Pas indien nodig het activeringsmedium aan (Hank's gebalanceerde zoutoplossing [HBSS]).
    OPMERKING: HBSS kan commercieel worden gekocht of in het laboratorium worden gemaakt (materiaaltabel).
    1. Meet de pH van de HBSS met behulp van een pH-meter. Pas de pH indien nodig aan met zoutzuur of natriumhydroxide, zodat de uiteindelijke pH 7,1-7,3 is.
    2. Meet de osmolaliteit van de HBSS met behulp van een osmometer voor toekomstige rapportage.
      OPMERKING: Het bereik op het commerciële product is 266-294 mOsmol / kg; in de huidige studie was de osmolaliteit 287 mOsmol/kg. Het kan indien gewenst worden verdund met gedestilleerd water om de osmolaliteit te verminderen, maar dit is niet nodig omdat er geen groot verschil is in de activering van medaka-sperma in 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. Bewaar de oplossing bij RT tot gebruik.
  4. Bereid de houdspons voor.
    1. Snijd een zachte spons om goed in een petrischaaltje te passen.
    2. Knip een rechte lijn in het midden van de spons die lang genoeg is om de vis (3-4 cm) en ongeveer 1 cm diep te ontvangen (figuur 1A). Deze spleet in de spons houdt de ventrale kant van de vis omhoog om de cloaca bloot te leggen.

2. Spermaverzameling

OPMERKING: Spermaverzameling kan worden bereikt door twee verschillende methoden: buikmassage of teelballendissectie.

  1. Spermaverzameling door buikmassage
    1. Bereid 0,03% anesthetische oplossing door één tube Tricaine-bouillon (0,6%) in 38 ml aquariumwater in een glazen container van 100 ml te verdunnen.
    2. Bereid de instrumenten voor, inclusief een gladde eindtang en een gekalibreerde glazen micropipette en aspiratorbuis van 10 μL (figuur 1A). Bevochtig de in stap 1.4 bereide bewaarspons met de verdovende oplossing.
    3. Bereid buizen met 36 μL van de activerende oplossing voor onmiddellijke analyse. Verwarm de activerende oplossing gedurende ten minste 5 minuten voor in een waterbad of incubator op 27 °C.
      OPMERKING: Hoewel monsters van individuele vissen kunnen worden geanalyseerd, kan individuele variatie worden verminderd door monsters van meerdere mannetjes in dezelfde activerende oplossing te poolen. Gebruik bij het poolen van monsters van meerdere vissen 36 μL activerende oplossing per vis. Deze verdunning moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van de stam of opfokomstandigheden van de gebruikte medaka, omdat deze factoren de spermaconcentratie en het volume kunnen beïnvloeden. Het CASA-programma zal aangeven of de concentratie te hoog is om sperma te identificeren.
    4. Verdoof de vis door hem gedurende 30-90 s in een verdovingsoplossing te plaatsen.
      OPMERKING: De duur van de anesthesie moet worden aangepast omdat deze varieert afhankelijk van de grootte van de vis. Om ervoor te zorgen dat de vis volledig verdoofd is, knijp je voorzichtig in de caudale steel met een tang. Als de vis niet reageert, kan de massage worden gestart.
    5. Haal de vis uit de verdovingsoplossing en gebruik een papieren handdoek of veeg voorzichtig af om de buik van de vis te drogen. Plaats de vis in de trog van de vochtige spons ventrale kant naar boven, zodat de kieuwen worden blootgesteld aan de verdovingsoplossing in de spons (figuur 1B).
    6. Als het gebied rond de cloaca nat is, droog dan voorzichtig de onderkant van de vis met een wegwerpdoekje.
    7. Plaats de vis in de houdspons onder een ontleedmicroscoop en plaats de micropipette met een aspiratorbuis bevestigd tegen de cloaca van de vis (figuur 1C).
    8. Masseer de buik van de vis door zachtjes te knijpen met een stompe gladde tang in een rostrale tot caudale beweging terwijl je tegelijkertijd zuigt om de uitgestoten milt in de pipet te verzamelen (figuur 1D).
    9. Laat de vis uit de spons los in het herstelwater. Laat ze minstens 15 minuten in de oplossing herstellen voordat ze terugkeren naar het aquariumsysteem.
    10. Breng de milt meerdere keren over in een voorbereide buis met voorverwarmde activeringsoplossing en pipet meerdere keren op en neer door op de aspiratorbuis te zuigen en te blazen.
    11. Homogeniseer het verdunde sperma voorzichtig door vóór de analyse over de buisjes te vegen.
      OPMERKING: Analyseer voor de beste resultaten monsters onmiddellijk (bijv. 5 s) na activering. Bij medaka kan de analyse indien nodig worden uitgesteld, omdat sperma enkele uren beweeglijk blijft, maar de tijd moet consistent blijven tussen de monsters omdat de beweeglijkheid met de tijd afneemt.
  2. Spermaverzameling door teelballendissectie
    1. Bereid 0,08% euthanasie-oplossing door twee tubes Tricaine-bouillon (0,6%) te verdunnen in 26 ml aquariumwater in een glazen container van 100 ml.
    2. Bereid dissectiegereedschappen voor, waaronder stompe en fijne tangen en kleine ontleedscharen (figuur 1E).
    3. Bereid voor elk monster een buis met 120 μL activerende oplossing voor onmiddellijke analyse. Verwarm de activerende oplossing gedurende ten minste 5 minuten voor in een waterbad of incubator op 27 °C.
      OPMERKING: Hoewel monsters van individuele vissen kunnen worden geanalyseerd, kan individuele variatie worden verminderd door monsters van meerdere mannetjes in dezelfde activerende oplossing te poolen. Gebruik voor het poolen van monsters van meerdere vissen 120 μL activerende oplossing per vis. Deze verdunning moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van de stam of opfokomstandigheden van de gebruikte medaka, omdat deze factoren de spermaconcentratie en het volume kunnen beïnvloeden. Het CASA-programma zal aangeven of de concentratie te hoog is om sperma te identificeren.
    4. Euthanaseer de vis door deze gedurende 30-90 s in de 0,08% anesthetische oplossing te plaatsen.
      OPMERKING: De duur is afhankelijk van de grootte van de vis. Om ervoor te zorgen dat de vis wordt geëuthanaseerd, wacht u tot de operculumbewegingen stoppen. De vis mag niet reageren op de aanraking van een tang.
    5. Haal de vis uit de euthanasie-oplossing en droog de vis voorzichtig af met een papieren handdoek of veeg voorzichtig af.
      OPMERKING: Bij deze stap kan de vis worden gewogen om later de gonadosomatische index (GSI, gonadaal gewicht / lichaamsgewicht) te berekenen.
    6. Plaats de vis onder een ontleedmicroscoop met de linker zijzijde naar boven gericht (figuur 1F).
    7. Knip met een kleine ontleedschaar een flap dorsaal van de cloaca en vervolgens over de ribben naar de kieuwen om de inwendige organen bloot te leggen (figuur 1G).
    8. Lokaliseer de teelballen, snijd het opzetstuk aan beide uiteinden met een fijne tang en verwijder de teelballen (figuur 1H).
      OPMERKING: Om de GSI te berekenen, kunnen de teelballen bij deze stap worden gewogen. Werk snel om uitdroging van het weefsel te voorkomen.
    9. Breng de teelballen over in een voorbereide buis met de voorverwarmde activeringsoplossing.
    10. Gebruik een tang om de teelballen meerdere keren tegen de zijkant van de buis te verpletteren om het sperma vrij te geven. Het vrijkomen van sperma kan meestal worden gevisualiseerd en zal de oplossing enigszins troebel maken.
    11. Homogeniseer het verdunde sperma voorzichtig door vóór de analyse over de buisjes te vegen.
      OPMERKING: Analyseer voor de beste resultaten monsters onmiddellijk (bijv. 5 s) na activering. Bij medaka kan de analyse indien nodig worden uitgesteld, omdat sperma enkele uren beweeglijk blijft, maar de tijd moet consistent blijven tussen de monsters omdat de beweeglijkheid met de tijd afneemt.

Figure 1
Figuur 1: Milt collectie door abdominale massage (A-D) en teelballendissectie (E-H). (A) Instrumenten voor buikmassage: spons vasthouden, stompe gladde tang, en 10 μL wegwerp gekalibreerde glazen micropipette met aspiratorbuisassemblage; B) positie van de vis in de houdspons, met kieuwen blootgesteld aan anesthesie in de spons en cloaca naar boven gericht; (C) Positie van stompe gladde tangen op buik en micropipette tegen cloaca; (D) Milt in micropipette na zachte massage en zuigen. (E) Instrumenten voor het ontleden van teelballen: stompe tang, fijne tang en kleine ontleedschaar; F) positie van vissen voor teelballendissectie; (G) Lateraal zicht op inwendige organen; (H) Verwijder de teelballen door het opzetstuk aan beide uiteinden met een fijne tang te snijden. Schaalbalk: 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Sperma analyse met CASA systeem

  1. Het CASA-systeem (SCA Evolution) moet volgens de handleiding worden ingesteld met een microscoop met behulp van een groenfilter en 10x objectief met fasecontrast.
  2. Bereid wegwerpschuifjes van 20 μm door voorverwarmen op een verwarmingsplaat of in een incubator die is ingesteld op 27 °C gedurende ten minste 5 minuten.
  3. Open de spermaanalysesoftware en selecteer de beweeglijkheidsmodule.
  4. Stel de configuratie voor de medaka in zoals weergegeven in figuur 2B.
  5. Plaats een voorbewarmde wegwerpschuif van 20 μm telkamer onder de microscoop op een verwarmd podium dat is ingesteld op 27 °C.
  6. Pipetteer het monster in de kamer op de dia totdat het de kamer vult zonder overvulling. Veeg overtollige monsters voorzichtig weg van de ingang van de kamer met een katoenen punt of veeg voorzichtig af om zwevende cellen te voorkomen.
  7. Selecteer Analyseren om het monster onder de microscoop te bekijken.
    OPMERKING: Als het microscooppictogram rood is, moet de microscoopverlichting worden aangepast zodat het programma sperma nauwkeurig kan volgen. Pas de helderheid van de microscoop aan, zodat de staartbeweging van het sperma duidelijk te zien is. Het pictogram moet blauw zijn.
  8. Zorg ervoor dat de microscoop gefocust is en selecteer opnieuw Analyseren om het sperma in het veld op te nemen. Verplaats de dia zodat een nieuw gebied van het voorbeeld zich in het frame bevindt en herhaal dit om vast te leggen voor 3-5 verschillende gezichtsvelden. Vermijd velden met luchtbellen, celmassa's of artefacten.
  9. Selecteer Resultaten om de resultaten te bekijken.
    OPMERKING: Als de velden op de resultatenpagina rood zijn omlijnd, volgt u de aanwijzingen van het systeem om de velden te verwijderen die te veel variëren in concentratie of beweeglijkheid.
  10. Dubbelklik op een veld om de resultaten voor het individuele veld te bekijken of om handmatig te controleren op verkeerd gelabelde of niet-gevolgde spermatozoa. Klik met de rechtermuisknop op individuele spermatozoa om de beweeglijkheid opnieuw te labelen, indien nodig (figuur 2A).

Figure 2
Figuur 2: SCA Evolution software screenshot. (A) Sperma tracking resultaten voor één veld. Bekijk veldgegevens aan de rechterkant en dubbelklik op spermatozoa om individuele gegevens te bekijken; (B) Resultatenoverzicht voor alle velden met configuratiemenu geopend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Soort verkregen gegevens
Spermamotiliteitsanalyse van de SCA Evolution-software biedt gegevens over beweeglijkheid (percentage beweeglijk en immotiel sperma), evenals progressiviteit (percentage progressief en niet-progressief sperma) en snelheid (percentage snel, gemiddeld en langzaam bewegend sperma). Het combineert ook progressiviteit en snelheid (snel progressief, gemiddeld progressief, niet-progressief). Deze labels zijn gebaseerd op metingen (figuur 3A) en berekeningen (fig. 3B) van spermatozoonbeweging, die door het programma wordt verstrekt (aanvullende tabel 1). Voor medaka werden de volgende drempels aangepast aan de aanbevolen zebravisparameters op basis van eerdere literatuur 19,34,35 en de verdeling van medaka-gegevens van 18 individuen. Motiliteit is gebaseerd op kromlijnige snelheid (VCL) met immole < 10 μm/s ≤ langzame < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < snel. Sperma wordt als progressief beschouwd als de straightness index (STR) > 68% ligt.

SCA Evolution berekent ook de concentratie van sperma indien het volume van het monster en de verdunning wordt verstrekt. Hoewel de abdominale massagemethode nuttig is voor het visualiseren van de kleuring en het bevestigen van de aanwezigheid van de milt, is het verzamelde volume te klein om nauwkeurig te worden gemeten. Als het miltvolume wordt verbeterd door opfokomstandigheden of met behulp van een andere stam en kan worden gemeten, kan het programma worden gebruikt om de concentratie te berekenen. De relatieve concentratie kan echter ook worden berekend om vis of behandelingsgroepen te vergelijken voor monsters die door teelballesdissectie zijn genomen, zolang de hele testis wordt ontleed en verdund in hetzelfde vloeistofvolume.

Figure 3
Figuur 3: Analyse van de beweging van het spermatozoon. (A) De door het CASA-systeem geregistreerde gegevens omvatten kromlijnige snelheid (VCL, snelheid berekend met behulp van de afstand langs het werkelijke pad), gemiddelde padsnelheid (VAP, snelheid berekend met behulp van de afstand van het gemiddelde pad), rechte lijnsnelheid (VSL, snelheid berekend met behulp van de afstand tussen het begin en het einde van het spermaspoor); amplitude van laterale hoofdverplaatsing (ALH, grootte van laterale verplaatsing van een spermakop over zijn gemiddelde pad), beat cross-frequentie (BCF, snelheid waarmee het kromlijnige pad het gemiddelde pad kruist); (B) Berekende waarden uit het CASA-systeem omvatten rechtheidsindex (STR, lineariteit van het gemiddelde pad), lineariteitsindex (LIN, lineariteit van het kromlijnige pad) en wiebel (WOB, oscillatie van het werkelijke pad over het gemiddelde pad). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Evaluatie van de beweeglijkheid van het sperma: verschillende activerende oplossingen
Verrassend genoeg was sperma bemonsterd door zowel buikmassage als dissectie van teelballen immotiel in aquariumwater (16 mOsmol / kg) (figuur 4A) en in aquariumwater aangepast met NaCl-oplossing tot 34 mOsmol / kg. Er was ook geen beweeglijkheid in gedeïoniseerd water (-1 mOsmol / kg), of gedeïoniseerd water aangepast aan 23 mOsmol / kg. Sperma was beweeglijk in HBSS (287 mOsmol/kg) (figuur 4B), evenals in HBSS verdund met gedeïoniseerd water tot 36 mOsmol/kg en 113 mOsmol/kg, hoewel de procentuele beweeglijkheid significant was verminderd bij 36 mOsmol/kg (figuur 4C).

Figure 4
Figuur 4: Motiliteit door osmolaliteit van activerende oplossing. Sperma bemonsterd door dissectie van teelballen in (A) aquariumwater (16 mOsmol/kg) en (B) niet-gecorrigeerd HBSS (287 mOsmol/kg). Gele cirkels labelen immoleel sperma en gekleurde lijnen geven spermabeweging aan: rood (snel progressief), groen (medium progressief), blauw (niet-progressief). Schaalbalk: 100 μm. (C)Beweeglijkheid van het sperma met HBSS bij 36, 113 en 287 mOsmol/kg H2O. Voor 36 en 113 is n = 4 met twee vissen per monster. Voor 287, n = 9 met twee vissen gepoold per monster. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een ANOVA met Tukey post-hoc test en significante verschillen worden aangegeven door verschillende letters. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Bemonsteringsmethoden: Buikmassage versus dissectie van teelballen
Sperma bemonsterd door dissectie van teelballen is significant beweeglijker in vergelijking met buikmassagemonsters van dezelfde vis (figuur 5A). Van het beweeglijke sperma is een hoger percentage ook progressief en gemiddeld of snel bewegend. In sperma bemonsterd door buikmassage, zijn meer beweeglijke sperma langzaam bewegend en niet-progressief (figuur 5B-C). Er kunnen echter verschillende resultaten worden verkregen door een andere stam medaka (CAB) of alternatieve opfokomstandigheden te gebruiken (aanvullende tabel 2).

Figure 5
Figuur 5: Buikmassage versus teelballendissectie. Percentage (A) immole en beweeglijk sperma bemonsterd door buikmassage of teelballendissectie. Percentage beweeglijk sperma dat (B) niet-progressief en progressief sperma is, en (C) langzaam, gemiddeld en snel bewegend. Alle spermamonsters werden geactiveerd in HBSS (287 mOsmol/kg H2O). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een Mann-Whitney U-test en significante verschillen worden aangegeven met sterretjes. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, n = 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Motiliteitsduur volgens bewaarconditie
Sperma bemonsterd door dissectie van teelballen en gehandhaafd op 27 °C had een vermindering van 50% in motiliteit in de eerste 30 minuten na activering. Na 2,5 uur was minder dan 5% van het sperma beweeglijk. Bij opslag bij 4 °C was de beweeglijkheid in de eerste 30 minuten met slechts 14% verminderd en duurde het 5 uur om een vermindering van 50% te zien ten opzichte van de initiële beweeglijkheid. IJs had een vergelijkbaar uitdijend effect, maar was minder effectief, met een vermindering van de beweeglijkheid met 26% in de eerste 30 minuten (figuur 6A). De progressiviteit daalde ook met 52% in de eerste 30 minuten op ijs, vergeleken met 65% bij 27 °C en 33% bij 4 °C (figuur 6B). Zowel op ijs als bij 4 °C bewoog sommige zaadcellen (<3%) nog 42 uur na activering.

Figure 6
Figuur 6: Levensduur van het sperma volgens de opslagconditie. Percentage (A) beweeglijkheid en (B) progressiviteit in de loop van de tijd voor monsters geactiveerd met HBSS (287 mOsmol/kg H2O) en bewaard bij 27 °C, 4 °C of op ijs. De gegevenspunten zijn gemiddeld ± SEM, n = ≥4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Belang van de milieu- en woonomstandigheden
Mannetjes die samen met vrouwtjes werden gehuisvest, werden 's ochtends bemonsterd door teelballendissectie voordat ze de kans kregen om te spawnen (voordat de lichten aangingen) of nadat de lichten aangingen en vrouwtjes in de tank eieren hadden. Er was geen significant verschil in beweeglijkheid van het sperma. Mannetjes die een maand zonder vrouwtjes werden gehuisvest, werden ook bemonsterd, en hoewel er een trend was van hogere beweeglijkheid, was het verschil ook niet significant (figuur 7).

Toen CAB-stam medaka echter gedurende ten minste een maand in een andere faciliteit werd grootgebracht met mannetjes gescheiden van vrouwtjes, waren de vissen groter en werd 5-7 μL milt verzameld door buikmassage. Monsters verzameld van vijf vissen door buikmassage hadden een beweeglijkheid van 68,34% wanneer geactiveerd met 300 mOsmol / kg HBSS. Wanneer het in dezelfde omstandigheden werd gehouden, maar met vrouwtjes, was het volume van milt verzameld ongeveer 2 μL en de gemiddelde beweeglijkheid was 46,2% van drie mannen (aanvullende tabel 2).

Figure 7
Figuur 7. Effect van omgevingscondities op de beweeglijkheid van het sperma. Procentuele beweeglijkheid van sperma bemonsterd vóór (n = 5) en na (n = 4) spawning van mannetjes die samen met vrouwtjes werden gehuisvest, en sperma van mannetjes gehuisvest zonder vrouwtjes (n = 6). Alle monsters werden bemonsterd door dissectie van teelballen en geactiveerd met HBSS (287 mOsmol/kg H2O). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van t-tests en de verschillen waren niet significant. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM met cirkels die individuele vissen vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Gemiddelde snelheids- en bewegingsberekeningen voor sperma bemonsterd door buikmassage en teelballendissectie (n = 9). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Spermaanalysegegevens van CAB-stam (ook wel Carbio genoemd) medaka gekweekt bij INRAE in Rennes, Frankrijk. Alle monsters werden geactiveerd in 300 mOsmol/kg HBSS. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Osmolaliteit is een belangrijke factor bij de activering van vissperma36,37. Over het algemeen zijn sperma immotielen in de teelballen en worden ze beweeglijk in media die hyperosmotisch zijn ten opzichte van zaadvloeistof voor zeevissen, en hypo-osmotisch ten opzichte van zaadvloeistof voor zoetwatervissen37. Net als bloed is zaadplasma in zoetwatervissen doorgaans lager dan dat van zeevissen (ongeveer 300 mOsmol/kg vergeleken met 400 mOsmol/kg)22,37. Zo wordt vissperma meestal geactiveerd bij contact met het water waarin ze leven, en dit water dient als het beste en meest biologische activeringsmedium voor sperma-analyse. Medaka-sperma bemonsterd door buikmassage en teelballendissectie was echter niet beweeglijk in aquariumwater (figuur 4A) in Hd-rR- of CAB-stam medaka die in twee verschillende laboratoria werd grootgebracht. Bovendien was de beweeglijkheid hoger in 287 mOsmol/kg HBSS dan in 36 mOsmol/kg HBSS (figuur 4C), wat ongebruikelijk is voor een zoetwatervis.

De meeste eerdere studies met spermaanalyse in medaka gebruikten HBSS 28,29,38 of Yamamoto-oplossing18,19 als activerende mediums voor medaka-sperma zonder osmolaliteit te bespreken. Hoewel HBSS een goed activerend medium is voor medaka-sperma, kan variatie in osmolaliteit de beweeglijkheid beïnvloeden. Het is daarom essentieel voor spermaanalysestudies om de osmolaliteit van hun activerende oplossing te onthullen voor vergelijking tussen experimenten. Een studie die de ideale osmolaliteit van activerend medium onderzocht, wees uit dat medaka-sperma beweeglijk is in gedeïoniseerd water (25 mOsmol / kg) en HBSS met osmolaliteitswaarden < 686 mOsmol / kg, met de hoogste beweeglijkheid tussen 25 en 227 mOsmol / kg17. In de huidige studie was sperma echter ook niet beweeglijk in gedeïoniseerd water. Als euryhalienvis zijn medaka zeer aanpasbaar aan verschillende omgevingen en kunnen ze zelfs leven en zich voortplanten in zout water39, dus het is mogelijk dat verschillende kweekomstandigheden verantwoordelijk zijn voor deze discrepantie. Interessant is dat geen andere studies hebben gemeld dat medaka-spermamotiliteit in aquariumwater (of vergelijkbaar, zoals verouderd kraanwater) is getest, hoewel het het standaard spermaactiveringsmedium is voor zoetwatervissen.

Een mogelijke verklaring voor deze atypische spermaactivatie in medaka is interactie met de eierstokvloeistof. Terwijl vissperma meestal wordt geactiveerd in het omringende water, verhoogt of verlengt eierstokvocht de duur van de beweeglijkheid van het sperma bij veel soorten40,41. Hoewel medaka zoetwatervissen extern bemesten, brengt hun paaigedrag, waaronder het omwikkelen en trillen van vinnen, ze in veel dichter bij elkaar dan uitgezonden spawners23. Aangezien de osmolaliteit van eierstokvloeistof in zoetwatervissen (ongeveer 300 mOsmol/kg) dicht bij HBSS40 ligt, is het mogelijk dat vloeistof die door het vrouwtje wordt afgegeven het sperma activeert, niet het aquariumwater. Aangezien de osmolaliteit van zaad- en eierstokplasma vergelijkbaar zijn, is het mogelijk dat de ionische samenstelling van medaka ovariële vloeistof een belangrijke rol speelt40,42. De rol van eierstokvloeistof en ionen bij het activeren van medaka-sperma rechtvaardigt verder onderzoek.

In eerdere studies is medaka-sperma alleen verzameld door ontleed teelballen 17,28,29,30 te verpletteren of door buikmassage om de milt direct uit te drukken in activerend medium 18,19,20; er zijn geen studies die gegevens hebben gerapporteerd met sperma verzameld door buikmassage in een capillaire buis, hoewel het een gangbare praktijk is bij zebravissen en andere teleostvissen 33,43,44. Deze methode is ook haalbaar in medaka. Milt is gemakkelijk te visualiseren in de capillaire buis, en hoewel het volume te klein is om nauwkeurig te worden gemeten, maakt deze methode bevestiging van succesvolle verzameling en analyse van kleur mogelijk als een snelle indicator van kwaliteit32. Het vermijden van fecale besmetting is ook gemakkelijker met verzameling in een capillaire buis in vergelijking met in medium. Hoewel spermamonsters verzameld door teelballendissectie een betere beweeglijkheid hebben in medaka dan monsters verzameld door buikmassage (figuur 5) en dus de voorkeur hebben voor experimenten waarbij de vis kan worden geofferd, is buikmassage een minimaal invasieve procedure die geen euthanasie vereist en kan worden herhaald in dezelfde vis. Daarom is het nuttig voor experimenten die dezelfde vis in de loop van de tijd volgen. Ook bevatten monsters verzameld met buikmassage alleen volwassen cellen die vrijkomen met zaadplasma44, terwijl monsters van teelballendissectie onrijpe zaadcellen en ander puin kunnen bevatten. Het CASA-systeem geeft rekening met ronde cellen en puin die groter zijn dan het maximale gebied, maar als deze parameter te hoog is ingesteld, kunnen de beweeglijkheidsresultaten worden beïnvloed.

Vanwege de lage hoeveelheid sperma verzameld met de abdominale massagetechniek in deze medaka, was het onmogelijk om het spermavolume in het capillair nauwkeurig te meten en dus om spermaconcentraties te berekenen met behulp van reguliere benaderingen. Voor monsters die door teelballendissectie worden genomen, kan echter, door het volume van het activeringsmedium consistent te houden en de teelballen te wegen, een relatieve concentratie worden berekend op basis van de spermaconcentratie die door het CASA-systeem wordt gegeven om te vergelijken tussen individuen of behandelingsgroepen. Naast kwaliteitsanalyse is relatieve concentratie ook nuttig voor het bepalen van optimale monsterverdunningen voor cryopreservatie. Als het volume dat door buikmassage wordt verzameld, wordt verbeterd door opfokomstandigheden of met behulp van een andere stam, kan het volume worden berekend door de hoogte van de milt in de capillaire buis te meten en in het programma te worden ingevoerd om de concentratie te berekenen. In deze gevallen, waarin meerdere microliter kan worden verkregen, kan de beweeglijkheid hoger zijn door buikmassage dan de dissectie van de teelballen (aanvullende tabel 2). Wanneer lage volumes worden verzameld, zijn de monsters gevoeliger voor verontreiniging, wat de beweeglijkheid kan beïnvloeden, hoewel deze effecten consistent lijken te zijn wanneer de volumes vergelijkbaar zijn, zodat er nog steeds vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen behandelingsgroepen. Er mogen echter geen vergelijkingen worden gemaakt tussen monsters die sterk variëren in volume of kleuring van milt.

Het lage volume milt verkregen uit medaka met behulp van buikmassage kan een beperking zijn voor experimenten die een groot volume milt vereisen. In dergelijke gevallen kan dissectie van teelballen de voorkeur hebben, zoals blijkt uit een onderzoek dat milt van zebravis en groene zwaardstaart verzamelde door zowel dissectie als massage, maar alleen door dissectie in medaka vanwege laag volume30. Teelballendissectie is om dezelfde reden meestal beter voor vergelijkingen met andere soorten. Het beperkte volume door buikmassage in vergelijking met andere vissen van vergelijkbare grootte kan te wijten zijn aan kleinere teelballen (1,9 ± 0,6 mg in medaka vergeleken met 7,0 ± 2,5 mg in zebravis45) en minder geproduceerd sperma (2,0 ± 0,4 x 106 zaadcellen / mg teelballen in medaka vergeleken met 7,7 ± 2,0 x 106 zaadcellen / mg testikels in zebravis46), of aan andere onbekende biologische factoren die de techniek beperken, zoals gesuggereerd in broederij-gekweekte Afrikaanse meerval47. Het verschil kan fysiologisch zijn, afhankelijk van stam of omgevingsomstandigheden, of anatomisch, omdat medaka-teelballen in tegenstelling tot zebravissen meer mediaal zijn gefuseerd en zich meer mediaal bevinden, en daarom moeilijker toegankelijk kunnen zijn door buikmassage, hoewel er ook andere vissen zijn met gefuseerde teelballen.

Voor sommige soorten, zoals zebravissen, is het het beste om sperma te bemonsteren voordat de vissen de kans krijgen om 's ochtends48 te paaien of om mannetjes de avond ervoor in individuele tanks te isoleren om paaien32 te voorkomen. Met Hd-rR medaka uit deze studie hadden omgevingsomstandigheden zoals timing van bemonstering (voor of na het paaien) en huisvestingsomstandigheden (met of zonder vrouwtjes gedurende 1 maand) geen significant effect op de beweeglijkheid van het sperma (figuur 7). Het is mogelijk dat een grotere steekproefomvang of het isoleren van mannetjes van vrouwtjes voor een langere periode een hogere hoeveelheid sperma en / of beweeglijkheid kan opleveren. In CAB-stam medaka van een andere faciliteit werd een vergelijkbare trend gezien met een betere spermakwaliteit en -volume van mannetjes die alleen werden gehuisvest in vergelijking met mannetjes die bij vrouwtjes waren gehuisvest (te weinig vissen werden getest om statistische conclusies te trekken). Het was ook mogelijk met deze vissen om relatief hoge volumes milt te verzamelen door buikmassage (aanvullende tabel 2), hoewel zeer kleine volumes milt werden verkregen met behulp van Hd-rR-stam medaka, en anderen hebben ook kleine volumes gemeld door dezelfde techniek in CAB-stam medaka30. Of deze verschillen echter te wijten zijn aan de stam (die een commerciële stam is in plaats van inteelt) of aan opfokverschillen (er zijn er veel tussen faciliteiten), blijft onduidelijk. In deze vissen konden verschillende microliter milt worden verzameld, wat de besmetting beperkt en de kwaliteit verbetert. Maar voor experimenten waarbij het belangrijk is om samen te leven met beide geslachten, lijkt het niet nodig om ze te scheiden om resultaten te behalen. Het lijkt ook niet nodig om mannetjes te bemonsteren op een tijdstip voordat ze paaien.

Hoewel verdere studies nodig zijn om precies te bepalen hoe medaka-sperma verschilt afhankelijk van populatie- en omgevingsfactoren, moeten de stam- en opfokomstandigheden niettemin in overweging worden genomen bij het ontwerpen van de experimentele opstelling, en voorzichtigheid is geboden bij het vergelijken tussen populaties die verschillende hoeveelheden sperma produceren. Als grotere volumes milt worden verkregen, moet de verdunning van de activerende oplossing worden aangepast (bijv. 1:60, hoewel de voorkeursconcentratie kan variëren met het CASA-systeem). Evenzo, als de ontleedde teelballen veel groter zijn dan normaal (2 mg) als gevolg van de stam of opfokomstandigheden, moet de verdunning worden verhoogd, zodat het CASA-programma alle zaadcellen nauwkeurig kan labelen.

Methoden voor spermaanalyse variëren sterk voor medaka en zijn vaak subjectief, waardoor resultaten moeilijk te vergelijken zijn tussen studies. Een studie waarin subjectieve en objectieve methoden werden vergeleken die worden gebruikt door technici met verschillende niveaus van expertise, wees uit dat zeer ervaren technici de beweeglijkheid van het sperma van vissen kunnen schatten binnen 10 procentpunten van de gegevens die worden verstrekt door een CASA-motiliteitsprogramma, terwijl technici met gemiddelde en lage ervaring de CASA-motiliteitswaarden overschatten met amplitudes tot 30 procentpunten21 . Een gebrek aan standaardisatie voor de parameters die de beweeglijkheid in medaka bepalen, kan echter ook variatie veroorzaken tussen degenen die meer objectieve methoden gebruiken. Bijvoorbeeld, een studie die sperma registreerde met 33 frames per seconde (fps), 30 frames analyseerde en beschouwde dat sperma sneller dan 2 μm / s beweeglijk bewoog, had een gemiddelde snelheid van ongeveer 60 μm / s en beweeglijkheid van ongeveer 70% voor hun controlevis18. Een andere studie met hetzelfde protocol had een gemiddelde snelheid van 40 μm / s voor controlesperma en een percentage beweeglijkheid van meer dan 80% 19. Een andere groep, die 200 frames bij 47 fps analyseerde, had een gemiddelde VCL van meer dan 100 um / s voor controlevissen, maar een gemiddelde beweeglijkheid onder de 50%. Ze maakten niet bekend welke parameters de beweeglijkheid bepaalden. Dus in dit protocol wordt computerondersteunde spermaanalysesoftware gebruikt om sperma objectief, snel en betrouwbaar te analyseren op basis van een reeks parameters die zijn aangepast aan de kenmerken van medaka-sperma. Omdat het van cruciaal belang is dat motiliteitsparameters consistent zijn voor vergelijkingen tussen laboratoria, is de volledige configuratie die in deze studie wordt gebruikt beschikbaar (figuur 2B), zodat dit protocol betrouwbaar kan worden gerepliceerd in een ander laboratorium door verschillende onderzoekers.

Teleost-vissen vertonen een grote diversiteit aan spermakenmerken, dus hoewel dit protocol aanvankelijk werd getest met behulp van de aanbevolen zebravisparameters voor de SCA Evolution-software, was het duidelijk dat de parameters moesten worden aangepast voor het medaka-sperma met lagere snelheid en een langere levensduur. Dus, zebravisparameters werden aangepast aan medaka met behulp van literatuur van medaka en andere soorten die vergelijkbare spermakenmerkenrapporteerden 19,34,35 en selecteerden de drempels die het beste passen bij de verdeling van 17.580 geanalyseerde spermasporen van 18 personen. Motiliteit is gebaseerd op kromlijnige snelheid (VCL) met immole < 10 μm/s ≤ langzame < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < snel. Sperma wordt als progressief beschouwd als de straightness index (STR) > 68% ligt. De drempel die de beweeglijkheid definieert, werd op 10 μm/s gehouden in plaats van 2 μm/s, zoals gebruikt in sommige literatuur 18,19, omdat veel sperma zonder flagellaire beweging met deze instelling ten onrechte als beweeglijk werd bestempeld. Andere vissoorten met spermakoppen van vergelijkbare grootte (~ 2 μm) gebruikten ook 10 μm / s om beweeglijk sperma35,43 te definiëren. Het maximale gebied werd verminderd van de zebravisinstelling van 90 μm2 tot 20 μm2, zodat groot cellulair puin van teelballendissectie zou worden genegeerd.

De duur van de beweeglijkheid lijkt afhankelijk te zijn van de hoeveelheid ATP die voorafgaand aan de activering is opgeslagen, omdat flagellaire beweging een snel energieverbruik vereist. Waarschijnlijk als gevolg van deze snelle uitputting, is er een correlatie tussen sperma met hoge initiële snelheid en een kortere duur van motiliteit49. Hoewel een osmotische schok meestal nodig is om vissperma te activeren, kan dit ook leiden tot membraanschade tijdens de motiliteitsperiode, wat ook van invloed kan zijn op de levensduur. Dit effect is kritischer bij zoetwatersoorten49, wat kan verklaren waarom mariene spermacellen in staat zijn tot een langere motiliteitsduur (gemiddeld ongeveer 550 s vergeleken met ongeveer 150 s voor zoetwatersoorten), ondanks het vertonen van een vergelijkbare gemiddelde snelheid en beweeglijkheid als zoetwatersperma14,22. Motiliteitsduur langer dan 30 minuten is niet gebruikelijk, maar het is gemeld bij verschillende mariene soorten22,49. Ondanks dat het een zoetwatervis is, passen de resultaten met medaka in het profiel van sperma dat een lagere snelheid en langere duur heeft van mariene soorten. Dit kan verband houden met de activering in medium vergelijkbaar met seminaal plasma - zonder een osmotische shock lijdt medaka-sperma waarschijnlijk geen membraanschade vergelijkbaar met andere zoetwatervissen.

Een niet-activerende oplossing en zeer snelle, consistent getimede analyse na activering is vaak nodig voor analyse van sperma dat slechts minutenlang beweeglijk is. De beweeglijkheid van het medaka-sperma duurt echter van nature enkele uren en een hogere beweeglijkheid kan worden behouden door opslag bij 4 °C of op ijs (figuur 6). Voor experimenten waarbij onmiddellijke analyse niet mogelijk is, kan het protocol dus worden gewijzigd, zodat bijvoorbeeld teelballen een uur lang in de activerende oplossing op ijs worden opgeslagen, zolang de verzameltijd wordt geregistreerd zodat de analyse consistent kan blijven. Voor optimale resultaten is onmiddellijke analyse echter nog steeds de beste optie. Hoewel de beweeglijkheid nog steeds afneemt, omdat het geleidelijk is, worden de resultaten minder beïnvloed door kleine verschillen in de tijd van analyse na activering. Toch is het belangrijk om zowel de opslagtemperatuur van monsters als het tijdstip van analyse na activering te rapporteren, zodat gegevens kunnen worden vergeleken en gereproduceerd.

Het is ook typisch erg belangrijk bij vissen om besmetting van milt met urine tijdens het nemen van monsters te voorkomen, omdat dit de osmolaliteit kan veranderen en het sperma voortijdig kan activeren16,50. Dit is echter minder een probleem bij medaka (vanwege de langere duur van de beweeglijkheid) en bij dit protocol, omdat het monster onmiddellijk in het activeringsmedium wordt geplaatst. Lage volumes milt zijn gevoelig voor urinebesmetting, dus enige verkleuring kan worden verwacht met buikmassage van medaka wanneer lage volumes worden verkregen. Als dit echter consistent is in de populatie, kunnen er nog steeds vergelijkingen worden gemaakt tussen behandelingsgroepen. Voorzichtigheid is geboden bij het vergelijken van populaties van medaka die variëren in het volume of de kleuring van milt.

Omdat de resultaten van spermaanalyses erg afhankelijk zijn van de gebruikte methoden, zijn gedetailleerde en betrouwbare methoden die gemakkelijk in verschillende laboratoria kunnen worden herhaald, nuttig. Het is ook van vitaal belang voor papers om details over hun methoden bekend te maken om herhaalbaarheid mogelijk te maken. Omdat medaka steeds vaker wordt gebruikt als model voor reproductieonderzoek, ontbreekt de hoeveelheid informatie over de beoordeling van de spermakwaliteit. De twee verschillende methoden die in dit artikel worden beschreven voor spermabemonstering kunnen gunstig zijn voor verschillende experimenten. Teelballendissectie levert meestal sperma met een hogere beweeglijkheid op en maakt relatieve concentratieberekeningen mogelijk, terwijl buikmassage herhaaldelijk op dezelfde vis kan worden gedaan en een meer pure, biologische weergave is van een paaigebeurtenis. Dit manuscript biedt daarom de parameters voor CASA, een betrouwbare, objectieve techniek die voldoende gegevens biedt over spermabewegingen, waaronder beweeglijkheid, progressiviteit, snelheid en andere kinematische parameters. Deze protocollen zullen dus nuttig zijn voor een verscheidenheid aan studies in medaka, waaronder toxicologie, ecologie, voortplanting en fysiologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk is gefinancierd door de Noorse University of Life Sciences en het Amerikaanse Fulbright-programma. De auteurs willen Anthony Peltier en Lourdes Carreon G Tan van NMBU bedanken voor het onderhoud van visfaciliteiten en Guillaume Gourmelin van de ISC LPGP bij INRAE (Frankrijk) voor het bieden van vis- en laboratoriumruimte om deze methoden verder te testen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Tags

Biologie Nummer 188 geslachtsklieren sperma milt testis medaka vis voortplanting casa
Spermaverzameling en computerondersteunde spermaanalyse in het Teleost-model Japanse Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. … More

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter