Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הגברת אות טירמיד להכתמה אימונופלואורסצנטית של זרחון תלוי ZBP1 של RIPK3 ו- MLKL לאחר זיהום HSV-1 בתאים אנושיים

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

הגברת אות טירמיד במהלך צביעה אימונופלואורסצנטית מאפשרת זיהוי רגיש של RIPK3 ו-MLKL שעברו זרחון במהלך נקרופטוזיס הנגרם על-ידי ZBP1 לאחר זיהום ב-HSV-1.

Abstract

קולטן קינאז/ת'רונין קינאז 3 (RIPK3) והסובסטרט שלו, השושלת המעורבת קינאז דמוית תחום (MLKL) הם מווסתים קריטיים של נקרופטוזיס, צורה דלקתית של מוות תאי עם פונקציות אנטי-ויראליות חשובות. אוטופוספורילציה של RIPK3 משרה זרחון והפעלה של חלבון התליין יוצר הנקבוביות של נקרופטוזיס MLKL. סחר ואוליגומריזציה של MLKL זרחני בקרום התא גורם לתזה של התא, האופיינית למוות תאי נקרופטוטי. חיישן חומצות הגרעין ZBP1 מופעל על ידי קשירה ל-RNA דו-גדילי (Z-RNA) בצורת Z שמאלית לאחר זיהום בנגיפי RNA ו-DNA. הפעלת ZBP1 מגבילה את ההדבקה בנגיף על ידי גרימת מוות תאי מוסדר, כולל נקרופטוזיס, של תאים מארחים נגועים. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית מאפשרת הדמיה של שלבי איתות שונים במורד הזרם של נקרופטוזיס בתיווך ZBP1 על בסיס לכל תא. עם זאת, הרגישות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, המשתמשת בנוגדנים ספציפיים לפוספו הזמינים באופן מסחרי נגד RIPK3 ו-MLKL אנושיים, מונעת הדמיה ניתנת לשחזור של סמנים אלה. כאן אנו מתארים הליך צביעה אופטימלי עבור RIPK3 זרחני (S227) ו-MLKL (S358) אנושיים בתאי HT-29 אנושיים הנגועים בנגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1). הכללת שלב הגברת אות טירמיד (TSA) בפרוטוקול הכתם האימונופלואורסצנטי מאפשרת זיהוי ספציפי של S227 זרחני RIPK3. יתר על כן, TSA מגביר מאוד את הרגישות של זיהוי של S358 זרחני MLKL. יחד, שיטה זו מאפשרת הדמיה של שני אירועי איתות קריטיים אלה במהלך אינדוקציה של נקרופטוזיס המושרה על ידי ZBP1.

Introduction

סרין/תראונין חלבון קינאז 3 (RIPK3) ושושלת מעורבת קינאז דמוית תחום (MLKL) הם הרגולטורים המרכזיים של מוות תאי נקרופטוטי 1,2. נקרופטוזיס היא צורה ליטית ודלקתית של מוות תאי מווסת המעורבת בחסינות אנטי-ויראלית ובדלקת אוטומטית. נקרופטוזיס של תאים נגועים בנגיף מכבה מיד את שכפול הנגיף. תזה תאית בעקבות אינדוקציה של נקרופטוזיס משחררת גם דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק, המעוררים חסינות אנטי-ויראלית 3,4. נקרופטוזה מופעלת על ידי הפעלה של RIPK3 בעקבות אינטראקציות בתיווך מוטיב אינטראקציה הומוטיפית של RIP (RHIM) עם אחת משלוש מולקולות מפעילות במעלה הזרם: RIPK1 (על מעורבות קולטן TNF 1 [TNFR1]), אינטרפרון-β המכילים מתאם המכיל תחום TIR (TRIF; על מעורבות קולטן דמוי אגרה 3 ו-4), או חיישן חומצות הגרעין האנטי-ויראליות Z-DNA קושר חלבון 1 (ZBP1)1,2 . איתות נקרופטוזיס ממשיך בסדרה של אירועי זרחון המתחילים באוטופוספורילציה של RIPK3. האוטו-פוספורילציה של RIPK3 אנושי בסרין (S)227 בתוך תחום הקינאז שלו היא תנאי מוקדם לנקרופטוזיס בכך שהיא מאפשרת את האינטראקציה עם MLKL והיא משמשת בדרך כלל כסמן ביוכימי להפעלת RIPK3 אנושי ולמוות תאי נקרופטוטי 1,5. לאחר ההפעלה, RIPK3 פוספורילטים את לולאת ההפעלה של MLKL בתראונין (T)357 ו-S3581. זה גורם לשינוי בקונפורמציה של MLKL, וכתוצאה מכך לחשיפה של תחום צרור ארבעת הסלילים N-terminal. לאחר מכן MLKL אוליגומרית ועוברת לקרום התא, שם היא יוצרת נקבובית דרך החדרת ארבעת צרורות הסליל החשופים לדו-שכבת השומנים, מה שמוביל בסופו של דבר למוות תאי 2,6.

ZBP1 הוא חיישן חומצות גרעין אנטי-ויראליות המזהה חומצות גרעין שמאליות בצורת Z, כולל RNA דו-גדילי בקונפורמציה Z (Z-RNA). קשירת Z-RNA מתרחשת באמצעות שני תחומי Zα הממוקמים במסוף N של ZBP1. Z-RNA המצטבר במהלך הידבקות בנגיף ה-RNA והדנ"א נחשב כמעורב ישירות ב-ZBP1 7,8. ZBP1 מופעל מגייס את RIPK3 דרך ה-RHIMs המרכזיים שלו וגורם למוות תאי מווסת, כולל נקרופטוזיס 9,10. וירוסים אימצו מנגנוני בריחה רבים כדי לנטרל נקרופטוזיס של תאים מארחים המושרה על-ידי ZBP111. לדוגמה, נגיף ההרפס סימפלקס 1 (HSV-1) ריבונוקלאוטיד רדוקטאז תת-יחידה 1, המכונה ICP6 ומקודד על ידי UL39, מכיל RHIM במסוף N שלו שמפריע להפעלת RIPK3 בתיווך ZBP1 בתאים אנושיים12,13,14,15. ZBP1 לא רק מגביל שכפול נגיפי, אלא שמחקרים בעכברים הראו כי הפעלת ZBP1 גורמת למחלות דלקתיות וממריצה חסינות לסרטן 16,17,18,19,20,21. פרוטוקולים המזהים אירועי איתות המתרחשים במהלך נקרופטוזיס המושרה על-ידי ZBP1 בתאים אנושיים הם, לפיכך, בעלי ערך להערכת תפקידו של ZBP1 בתהליכים אלה.

הגברה של אות טירמיד (TSA), המכונה גם תצהיר מדווח מזורז (CARD), פותחה כדי לשפר את גבול הגילוי ואת יחס האות לרעש בבדיקות חיסוניות מבוססות נוגדנים. במהלך TSA, כל נוגדן ראשוני יכול לשמש כדי לזהות את האנטיגן של עניין. חזרת פרוקסידאז (HRP), יחד עם נוגדן משני, מזרז את ההצטברות המקומית של רדיקלים טירמידים ביוטינילטים בנוכחות מי חמצן. רדיקלים ביוטין-טירמיד פעילים אלה מגיבים עם שאריות טירוזין פרוקסימליות ליצירת קשרים קוולנטיים. מצעים פוטנציאליים של טירמיד-ביוטין כוללים את האנטיגן עצמו, את הנוגדנים הראשוניים והמשניים ואת החלבונים השכנים. לכן, בעוד TSA משפר באופן משמעותי את הרגישות של הבדיקה, חלק מהרזולוציה המרחבית שלה הולכת לאיבוד. בשלב אחרון, מולקולות ביוטין מזוהות באמצעות סטרפטווידין עם תווית פלואורסצנטית. תגובת HRP מפקידה מולקולות טירמיד-ביוטין רבות על האנטיגן המעניין או בסמוך לו. זה מגדיל מאוד את מספר אתרי הקישור של סטרפטאבידין-פלואורוכרום, ובכך מגביר מאוד את הרגישות של הבדיקה (איור 1). לחלופין, ניתן להצמיד טירמיד ישירות לפלואורוכרום, ובכך לבטל את הצורך בפלואורופורים מצומדים לסטרפטאווידין. אימונוהיסטוכימיה של חלבונים והכלאה של דנ"א/רנ"א באתרו היו בין השיטות הראשונות שבהן נעשה שימוש ב-TSA כדי לשפר את עוצמות האות22,23. לאחרונה, TSA שולבה עם ציטומטריה של זרימה תוך תאית24 וספקטרומטריית מסה25.

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי RIPK3 אנושי זרחני 227 (p-RIPK3 [S227]) ו-MLKL אנושי זרחני (p-MLKL [S358]) עם הפעלת ZBP1 על ידי זיהום HSV-1 באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. אנו משתמשים בקו תאי אדנוקרצינומה אנושיים רגישים לנקרופטוזיס HT-29 שהועתקו כדי לבטא ביציבות ZBP1 אנושי. תאים אלה היו נגועים בזן HSV-1 המבטא חלבון ICP6 מוטנטי (HSV-1ICP6 mutRHIM) שבו ארבע חומצות אמינו מרכזיות בתוך ה-RHIM הנגיפי (VQCG) הוחלפו באלנינים (AAAA), ובכך ה-ICP6 לא הצליח לחסום נקרופטוזיס בתיווך ZBP113,14,15. כדי להתגבר על הבעיה של יחס אות לרעש הנמוך של הנוגדנים הזמינים כיום באופן מסחרי המכוונים נגד p-RIPK3 ו-p-MLKL באימונוסטינינג26, אנו מבצעים שלב הגברת אות טירמיד (TSA) (איור 1), אשר מביא לזיהוי חזק של p-RIPK3 אנושי (S227) ומשפר את רגישות הגילוי של p-MLKL אנושי (S358) בסדר גודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת טירמיד ביוטינילציה

  1. הכינו טירמיד שעבר ביוטינילציה החל מביוטין-טירמיד. כדי ליצור תמיסת מלאי של 10 mM, יש להמיס 3.6 מ"ג ביוטין-טירמיד ב-1 מ"ל של DMSO. יש לאחסן את המוצר המומס בטמפרטורה של 20°C- כדי לשמור על האיכות.

2. שמירה על תאי HT-29 בתרבית

הערה: ZBP1-ביטוי HT-29 נוצרו על ידי התמרה עם lentivector27 קידוד ZBP1 אנושי.

  1. שמור על תאי HT-29 המבטאים ZBP1 במדיום 5A של McCoy בתוספת L-גלוטמין, נתרן-פירובט ו-10% סרום בקר עוברי (מעתה ואילך המכונה מדיום מלא) ושמור באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. באופן אידיאלי, השתמש בתאים של מספר מעבר נמוך (פחות מ -10). השאירו את התאים להתאושש לפחות 5 ימים לאחר מחזור ההפשרה לפני תחילת הניסוי.
  2. כדי לנתק את התאים מבקבוק התרבית, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, הוסף את הכמות המתאימה של טריפסין / EDTA (0.05% טריפסין ו 0.032% EDTA, בהתאמה, מחומם מראש ל 37 °C) לתאים (2 מ"ל עבור בקבוק T75, 3 מ"ל עבור בקבוק T175).
  3. דגירה של התאים עם טריפסין/EDTA למשך עד 10 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הקש על הבקבוקון ובדוק חזותית אם התאים מנותקים מהבקבוקון באמצעות מיקרוסקופ עם הגדלה אובייקטיבית של 4x-20x.
  4. אם התאים אינם מנותקים לחלוטין, דגירה במשך 5 דקות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מנותקים, עצרו את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 6 מ"ל של מדיום מלא לבקבוקון.
  5. אסוף את מתלה התא בצינור 15 מ"ל. לספור את התאים באמצעות כתם כחול טריפאן כדי להעריך את הכדאיות; מומלץ דילול של 1:5. המשך בניסוי רק אם הכדאיות של התאים עולה על 90%.

3. התחלת הניסוי, זריעה וגירוי של התאים

  1. זרע 90,000 תאי HT-29 המבטאים ZBP1 במדיום מלא בצלחת באר בגודל 1 ס"מ"ר המאפשרת מיקרוסקופיה מתקדמת. השתמש בנפח סופי של 200 μL לכל באר.
  2. דגירה של התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. קח בחשבון כי כמה בארות נוספות צריך להיות זורע עבור בקרות צביעה, אשר מוסבר בפירוט רב יותר בשלב 5.6.
  3. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%-80%, מוסיפים לתאים גירוי הגורם לנקרופטוזיס. כאן, התאים הודבקוב-HSV-1 ICP6 mutRHIM (ריבוי זיהום [MOI] של 5, המוגדר כיחידות יוצרות פלאק (pfu) חלקי מספר התאים; ה-pfu כומת באמצעות בדיקת רובד על תאי Vero) במשך 6 שעות, 8 שעות או 10 שעות.
  4. כבקרה חיובית על אינדוקציה של נקרופטוזיס, עוררו את התאים במשך 4 שעות עם קוקטייל מעורר נקרופטוזיס המכיל 30 ננוגרם/מ"ל TNF, 20 מיקרומטר של מעכב הפאן-קספאז zVAD-fmk, ו-5 מיקרומטר של ה-SMAC המימטי BV6.
  5. כבקרה שלילית על צביעת p-RIPK3 (S227), כלול GSK'840 (1 μM) כדי לעכב את פעילות קינאז RIPK3 ולמנוע אוטופוספורילציה של S227. באופן אידיאלי, להוסיף את המעכב במצב לא מטופל ולאחר גירוי נקרופטוזיס. ניתן להוסיף את המעכב בו זמנית עם זיהום ויראלי.
  6. הכינו את הגירויים במדיום מלא, שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. השתמש בנפח סופי של 200 μL לכל באר עבור כל הגירויים.

4. תיקון התאים

  1. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 200 μL של 1x PBS. לאחר מכן, הוסיפו 150 μL של 4% PFA (שכבר שיווי משקל בטמפרטורת החדר) לתאים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    הערה: אם אתה משתמש בתאים המתנתקים בקלות, ניתן למטב את קיבוע התאים באופן הבא. הסר 100 μL של בינוני מן הבאר, כך נפח של 100 μL נשאר על הצלחת. יש להוסיף 100 μL של 4% PFA לתאים. לדגור על התאים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש להסיר את המדיום/מקבע מהבארות ולהחליף ב-150 מיקרון ליטר של 4% PFA. דגירה של התאים למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח קיבוע מלא של התאים.
  2. לאחר קיבוע, להסיר את 4% PFA ולשטוף את התאים 3x עם 200 μL של 1x PBS. ניתן לאחסן את הדגימות בעודף (>200 μL) של PBS אחד ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עד להמשך העיבוד.

5. חלחול וכתמים ראשוניים

  1. הסר את ה- PBS והוסף 100 μL של מאגר חלחול (0.5% Triton X-100 ב- PBS). לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  2. הסר את מאגר permeabilization, ולאחר מכן, לשטוף את הבארות עם 100 μL של מאגר לשטוף (0.1% Triton X-100 ב PBS). דגירה של תא ההדמיה עם חיץ שטיפה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה מוטה (20-30 תנועות נדנדה לדקה).
  3. כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים ראשוניים, יש להוסיף 100 μL של מדיום חוסם ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לחלופין, ניתן להחליף שלב חסימה זה בחסימה עם 3% BSA, 0.1% Triton-X-100 ב- PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו את הבארות פי 3 עם 100 מיקרון ליטר של מאגר כביסה (0.1% טריטון X-100 ב-PBS). יש לדגום את שלבי הכביסה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה נוטה.
  5. לאחר הסרת מאגר הכביסה, מוסיפים את הנוגדנים העיקריים לתא ההדמיה ודוגרים לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השתמש בנפח סופי של 100 μL כדי לכסות את הבאר. במהלך הדגירה במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אין להניח את תא ההדמיה על שייקר מעבדה נוטה.
    הערה: Anti p-MLKL (S358; דילול: 1:200) ואנטי-p-RIPK3 (S227; דילול: 1:200) חולקים ארנב כמין מארח ולכן לא צריך להיות משולב בבאר אחת. כדי לנטר את הזיהום הנגיפי, שלבו נוגדן ראשוני מול חלבון נגיפי לבחירתכם עם p-MLKL (S358) או p-RIPK3 (S227). כאן, התאים היו נגועים בזיהום HSV-1 ואחריו מכתים ICP0 (דילול: 1:50, מינים מארחים: עכבר).
  6. קחו בחשבון את בקרות הצביעה הדרושות בשלב זה. כלול תמיד מצב ללא נוגדנים ראשוני כדי לדמיין את הרקע הפוטנציאלי של שלב ההגברה של TSA כדי לקבוע את סף המיסוך (ראה שלב 9).
    הערה: במקרה של פרוטוקול צביעה משותפת (למשל, שילוב של p-MLKL [S358] או p-RIPK3 [S227] עם נוגדן כנגד חלבון נגיפי) השתמש גם בכתמים בודדים. השימוש בכתמים בודדים חשוב לתיקון אות דימום פוטנציאלי בערוצי הדמיה אחרים.

6. הגברת אות טירמיד (TSA)

  1. הסירו את תערובת הנוגדנים העיקרית ושטפו בארות פי 3 עם 100 מיקרון של מאגר כביסה (0.1% Triton X-100 ב-PBS). יש לדגום את שלבי הכביסה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה נוטה.
  2. הסר את מאגר הכביסה והוסף 100 μL של נוגדן משני עם תווית HRP המזהה את המין של נוגדן ראשוני שיש להגדיל. כדי להגביר את האות p-RIPK3 (S227) או p-MLKL (S358), יש להוסיף 100 μL של אנטי-ארנב-HRP ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה נוטה.
    הערה: רק p-MLKL (S358) או p-RIPK3 (S227) יוגברו. צביעה של חלבון ויראלי תמחיש בשיטת צביעה עקיפה סטנדרטית.
  3. לאחר מכן, לשטוף את הבארות 3x עם 100 μL של מאגר לשטוף (0.1% Triton X-100 ב PBS). יש לדגום את שלבי הכביסה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה נוטה.
  4. בשלבים הבאים, הוסף את הטירמיד הביוטינילי לצלחת המיקרוסקופית. באמצעות קבוצת HRP המצומדת לנוגדנים המשניים, התגובה האנזימטית תגרום להיווצרות רדיקלים טירמידיים בסמיכות למטרה העיקרית (כאן, p-MLKL [S358] או p-RIPK3 [S227]).
  5. כדי להפעיל את הפעילות האנזימטית של HRP, הוסף מצע מחמצן יחד עם טירמיד ביוטינילציה. כדי להשיג זאת, השלימו את מאגר ה-TSA (0.1 M חומצה בורית [pH 8.5]) עם 0.03 M H2 O2; באופן ספציפי, קח 5 מ"ל של מאגר TSA והוסף 5 μL של 30% H 2O2.
  6. כעת, דללו את הביוטין-טירמיד במאגר TSA בתוספתH 2 O2הנע בין 1:1,000 ל-1:20,000.
    הערה: יש למטב את מקדם הדילול של הביוטין-טירמיד לכל אצווה.
  7. מוציאים את חיץ הכביסה מהבארות ומוסיפים ביוטין-טירמיד מדולל לבארות לנפח סופי של 100 μL. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על שייקר מעבדה נוטה.
  8. לאחר מכן, לשטוף את הבארות 3x עם 100 μL של מאגר לשטוף (0.1% Triton X-100 ב PBS). יש לדגום את שלבי הכביסה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה נוטה.

7. פלואורופורים

הערה: מאחר שהאות של הנוגדן העיקרי מומר לקבוצת ביוטין, p-MLKL (S358) ו-p-RIPK3 (S227) מוצגים באופן חזותי באמצעות סטרפטאבידין המוצמד לפלואורופור (פלואורופור 568, דילול: 1:500). בנוסף, הגרעינים מוכתמים ב-DAPI (5 מיקרוגרם/מ"ל). אם חלבון נגיפי כלול בפרוטוקול הצביעה, כלול נוגדן משני מתאים המסומן פלואורסצנטי כנגד המין המארח של הנוגדן העיקרי שלך. בתוצאות המייצגות, נעשה שימוש בעכבר נגד ICP0. כנוגדן משני עז נגד עכבר שהוצמד לפלואורופור 633 (דילול: 1:1,000) נכלל.

  1. הכינו את תערובת הצביעה במאגר כביסה (0.1% Triton X-100 ב-PBS) המכיל את הנוגדנים והכתמים שהוזכרו לעיל. מוציאים את חיץ הכביסה, מוסיפים 100 מיקרו-ליטר של תערובת כתמים ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת על שייקר מעבדה נוטה. שמור על תא ההדמיה מוגן מפני אור משלב זה ואילך.
  2. לאחר מכן, לשטוף את הבארות 2x עם מאגר לשטוף (0.1% Triton X-100 ב PBS). יש לדגום את שלבי הכביסה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה נוטה.
  3. לבסוף, לשטוף את הבארות 2x עם 1x PBS. אחסן את הדגימות בעודף (> 200 μL) של 1x PBS עד להדמיה. לחלופין, טבלו את הדגימות במדיום הרכבה כדי לשמר את הכתמים. תא ההדמיה מוכן כעת להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי.

8. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

  1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ואת הלייזרים לפחות 10 דקות לפני ההדמיה.
  2. השתמש במטרת טבילה לרגישות. רצוי, השתמש בהגדלה אובייקטיבית של 40x או 63x. לפני ההדמיה, נקו את מטרות הטבילה עם מנקה עדשות באמצעות כדורי צמר גפן מתאימים. מטרות מלוכלכות (למשל, בגלל אבק) עלולות לגרום לתמונות באיכות נמוכה יותר.
  3. שים כמות עודפת של שמן בתחתית תא ההדמיה. בנוסף, הוסיפו טיפת שמן על מטרת הבחירה.
  4. שים את תא ההדמיה על המיקרוסקופ. מצא את שדה המיקוד באמצעות צביעת DAPI או באמצעות הדמיית שדה בהיר. במידת הצורך, הסתובבו בתא ההדמיה כדי להבטיח פיזור תקין של שמן הטבילה.
  5. הגדר את מסלולי ההדמיה הדרושים במיקרוסקופ. בהתאם למיקרוסקופ, השלבים הבאים עשויים להשתנות (טבלה 1).
    הערה: בעת הגדרת מסלולי ההדמיה, תכנת את המסלולים כך שהכתם הגרעיני יימדד אחרון. לייזר 405 ננומטר עשוי לתרום photobleaching, ובכך, אובדן של אות ספציפי בכל הערוצים.
  6. כדי לנתח תא שלם לנוכחות של p-RIPK3 (S227) או p-MLKL (S358), מדוד z-stacks המשתרעים על פני גובה התא. כאן, ערימות z היו עשויות מ-40 פרוסות כל 0.16 מיקרומטר, והתוצאה הייתה טווח של 6.22 מיקרומטר.

מסלול לייזר מפצל קרן מסנן
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) 561 MBS -405 + BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
גן ויראלי: ICP0 633 MBS -405 + BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
גרעין: DAPI 405 MBS -405 + BP 420-480 + BP 495-550
מק"ב 488/561/633

טבלה 1: מסלולי הדמיה להדמיה של תאים.

9. ניתוח וכימות נתונים

  1. העלה את התמונות המיקרוסקופיות לתוכנה. השתמש במיקוד המורחב כדי להציג באופן חזותי את כל המידע של z-stack בתמונה דו-ממדית.
  2. לאחר מכן, לתכנת את פרוטוקול הניתוח על מנת לחלץ את המידע הבא: מספר התאים בכל תמונה, סכום הווקסלים המציגים p-RIPK3 (S227)+ או p-MLKL (S358)+ מכתים. ווקסל מייצג נפח תלת-ממדי, המוגדר כשווה ערך תלת-ממדי לפיקסל.
  3. כדי לכמת את מספר התאים בכל תמונה, פלח את הגרעין. כדי להפחית את הרעש בתוצאות הסגמנטציה, הוסף מגבלת גודל לסגמנטציה (>100 μm³). מספר הגרעינים המקוטעים מייצג את מספר התאים בתמונה.
  4. כדי לכמת את הכמות של p-RIPK3 (S227)+ או p-MLKL (S358)+ voxels, תכנת פילוח מבוסס סף. הגדר את הסף כך שלא ייקלט אות בתמונות ללא נוגדן ראשי (NP).
  5. התאם עוד יותר את הסף באמצעות התמונות ממצב דמה לא מטופל. כדי להבטיח זיהוי רגיש של עליית האות עקב גירוי נקרופטוזיס, הגבל את האיסוף של p-RIPK3 (S227)+ או p-MLKL (S358)+ voxels בתנאים מדומים על ידי הגדרת סף גבוה יותר. בדוק תמיד את פרוטוקול הניתוח המתוכנת במספר תמונות ממצב דמה וזיהום ויראלי הגורם לנקרופטוזיס.
  6. הפעל את הניתוח על כל ערכות התמונות. ייצא את כימות הווקסל ופילוח הגרעין בקובץ .txt לעיבוד נוסף בתוכנת גיליון אלקטרוני.
  7. צור טבלת ציר של הנתונים המציגה את שם התמונה, כימות הגרעין וסכום הווקסלים שזוהו.
  8. לאחר מכן, לחלק את סכום voxels חיובי על ידי ספירת התאים בתמונה. התוצאה היא ערך יחסי של ווקסלים חיוביים לכל תא. כדי להמחיש את הגדלת הקיפול, חלק את הערך היחסי של p-RIPK3 (S227)+ או p-MLKL (S358)+ voxels לכל תא בחציון של המצב הלא מטופל (דמה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזיהוי האימונופלואורסצנטי של זרחון MLKL ובמיוחד זרחון RIPK3 בתאים אנושיים הוא מאתגר מבחינה טכנית26. אנו מציגים כאן פרוטוקול צביעה משופר עבור p-RIPK3 אנושי (S227) ו- p-MLKL (S358) עם הפעלת ZBP1. הפרוטוקול כולל שלב TSA לשיפור גבול הזיהוי והרגישות של האותות הפלואורסצנטיים. כדי לאמת את השיטה, בוצעה השוואה זה לצד זה של האימונופלואורסצנציה בתיווך TSA עם צביעה פלואורסצנטית עקיפה סטנדרטית הן של p-RIPK3 (S227) והן של p-MLKL (S358).

תאי HT-29 המבטאים ZBP1 אנושי הודבקו במשך 9 שעות בזן מוטנטי HSV-1 של ICP6 RHIM (HSV-1 ICP6 mutRHIM) כדי לגרום לנקרופטוזיס בתיווך ZBP1 ולזרחון RIPK3. זןHSV-1 ICP6 mutRHIM נושא מוטציה של VQCG ל-AAAA בתוך ה-ICP6 RHIM ואינו מסוגל לחסום את איתות הנקרופטוזיס במורד הזרם של ZBP114,15. כפי שדווח קודםלכן 26, אימונופלואורסצנציה עקיפה סטנדרטית לא הייתה רגישה מספיק כדי לדמיין זרחון RIPK3 S227 עם הנוגדן הזמין כיום באופן מסחרי, אפילו כאשר עוצמת הלייזר של המיקרוסקופ הקונפוקלי הוגדלה ל-30% (איור 2A). לעומת זאת, הכללת שלב TSA אפשרה זיהוי חזק של p-RIPK3 (S227) בציטוזול של תאים הנגועיםב-HSV-1 ICP6 mutRHIM. אות p-RIPK3 (S227) הגיע לרוויה כאשר עוצמת הלייזר נקבעה על 2% (איור 2A). כימות תמונות z-stack תלת-ממדיות (ראו שלב 9) הראה עלייה של בערך פי 20 במספר הווקסלים שהיו חיוביים עבור p-RIPK3 (S227)ב-HSV-1 ICP6 mutRHIM-נגוע על תאים שטופלו באופן מדומה (איור 2B). השמטת הנוגדן העיקרי נגד p-RIPK3 (S227) מפרוטוקול הצביעה בתיווך TSA כבקרה ללא ראשית (NP) לא הניבה אות הניתן לזיהוי. כדי לדמיין תאים נגועים ב-HSV-1 ICP6mutRHIM, הדגימות הוכתמו במשותף בנוגדן ראשוני שכוון נגד החלבון הנגיפי המוקדם המיידי ICP0 (איור 2A). אות p-RIPK3 (S227) נמוך אך ניתן לזיהוי היה נוכח בתאים שטופלו בדמה, אשר עשוי לייצג את האוטופוספורילציה המכוננת של RIPK3 אנושי באתרזה 5 (ראו דיון). בהתאם לדו"ח הקודם28, ה-RHIM של ICP6 אינו מסוגל לחסום באופן מלא את הזרחון RIPK3 S227, מכיוון שזיהינו הכתמה מוגברת של p-RIPK3 (S227) של תאים הנגועים ב-HSV-1 פראי (HSV-1WT; איור 2A,B). כדי לאמת עוד יותר את הספציפיות של אות p-RIPK3 (S227), התאים טופלו במעכב קינאז RIPK3 GSK'840 לפני ההדבקה. GSK'840 נקשר לתחום הקינאז של RIPK3, מונע את פעילותו ובכך מעכב את האוטופוספורילציהשלו 29. GSK'840 מנע זרחון RIPK3 ב-S227 עם הפעלת ZBP1 (איור 2A,B), ואישר את הספציפיות של שיטת הזיהוי p-RIPK3 (S227) בתיווך TSA.

כדי לעקוב אחר זרחון MLKL, סמן שלב סופי לנקרופטוזיס, תאי HT-29 המבטאים ZBP1 היו נגועים ב-HSV-1 ICP6 mutRHIM במשך 8 שעות ו -10 שעות. התאים הוכתמו בנוגדן נגד S358 זרחני MLKL (p-MLKL [S358]) באמצעות TSA. התאים שטופלו באופן מדומה הראו צביעה ציטוזולית נמוכה ומנוקבת במקצת של p-MLKL (S358), בעוד שהכתמה חזקה של p-MLKL זוהתה בגרעין הציטוזול. ובממברנת הפלזמה בתאים שהיו נגועיםב-HSV-1 ICP6 mutRHIM (איור 3A). יתר על כן, האות p-MLKL (S358) נצפה באשכולות. זה עולה בקנה אחד עם הפונקציות יוצרות הנקבוביות של אוליגומרים MLKL זרחניים פעילים בקרום התא וטרנסלוקציה גרעינית שדווחה לאחרונה עם זיהום שפעת A 1,2,6,30. כבקרת צביעה חיובית של p-MLKL (S358), גירינו תאי HT-29 המבטאים ZBP1 עם שילוב של TNF, ה-BV6 המחקה של SMAC ומעכב הפאן-קספאז zVAD-fmk כדי לגרום לנקרופטוזיס בתיווך TNFR1 (איור 3A). השמטת הנוגדן העיקרי נגד p-MLKL (S358) מפרוטוקול הצביעה בתיווך TSA כבקרה ראשונית לא הניבה אות הניתן לזיהוי.

לאחר מכן, ביצענו השוואה זה לצד זה של הכתמה אימונופלואורסצנטית p-MLKL (S358) עם ובלי TSA. תאי HT-29 המבטאים ZBP1 הודבקו במשך 9 שעותבמוט HSV-1 ICP6. בעוד שעוצמת לייזר של 40% נדרשה כדי לזהות אות p-MLKL (S358) ספציפי בתאים הנגועים באמצעות אימונופלואורסצנציה עקיפה סטנדרטית, הדגימות שטופלו ב-TSA כבר הגיעו לאותות רוויים בעוצמת לייזר של 6% מבלי להגדיל את כתמי הרקע בדגימות שטופלו באופן מדומה (איור 3B). יתר על כן, כימות תמונות z-stack תלת-ממדיות הראה עלייה של יותר מפי 10 במספר הווקסלים שהיו חיוביים עבור p-MLKL (S358) בעת שימוש ב- TSA בהשוואה לאימונופלואורסצנציה עקיפה סטנדרטית. זה מראה כי TSA משפר הן את סף הזיהוי והן את הרגישות עבור p-MLKL (S358; איור 3C).

לבסוף, כדי לאמת את פרוטוקול האימונופלואורסצנציה בתיווך TSA עבור גירויים נגיפיים אחרים התלויים בנקרופטוזיס התלויים ב-ZBP1, הדבקנו תאי HT-29 המבטאים ZBP1 בזן PR8 של נגיף שפעת A (IAV) במשך 9 שעות. ואכן, TSA איפשר זיהוי חזק של p-RIPK3 (S227) ו-p-MLKL (S358), מה שמעיד על כך שהתאים האלה עוברים נקרופטוזיס (איור 4A-D).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול TSA. התאים נזרעים ומגורה בצלחת טובה, התואמת למיקרוסקופיה מתקדמת. לאחר מכן, הדגימות קבועות ב-4% PFA, מחדירות וחסומות כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים ראשוניים. על מנת להמחיש זרחון RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) ו-MLKL (p-MLKL [S358]), נוגדנים ספציפיים המזהים את אתרי הזרחון המרכזיים הללו מודגרים בן לילה על תא ההדמיה. לאחר מכן, נוגדן משני, יחד עם סוס צנון peroxidase (HRP), הוא הוסיף. קבוצת HRP זו מאפשרת הפעלה של טירמיד שעבר ביוטינילציה בנוכחות H 2 O2. לאחר מכן, הביוטין-טירמיד הפעיל מתחבר באופן קוולנטי לשאריות טירוזין בסמיכות לנוגדן המשני המסומן ב-HRP. אלה כוללים טירוזינים על חלבונים מעניינים - במקרה זה p-RIPK3 או p-MLKL, כפי שצוין באיור - ואלה של חלבונים שכנים ועל נוגדנים ראשוניים ומשניים עצמם (לא מוצג). שלב זה של הגברת אות הטירמיד מגביר מאוד את הרגישות של פרוטוקול הצביעה. בשלב אחרון מוסיפים סטרפטאבידין המוצמד לקבוצה פלואורסצנטית כדי להמחיש את המולקולות הביוטיניליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2:HSV-1 ICP6 mutRHIM משרה זרחון תלוי ZBP1 של RIPK3 אנושי ב-S227. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי HT-29 אנושיים המבטאים ZBP1, המשווה בין צביעת TSA לפרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי עקיף סטנדרטי (ללא TSA) עבור p-RIPK3 (S227). הדגימות המדומות והנגועות בנגיף (HSV-1WT או HSV-1ICP6 mutRHIM [MOI = 5]) דוגרו במשך 9 שעות. כבקרה שלילית, נכלל מעכב קינאז RIPK3 GSK'840 (1 μM). לא ראשוני (NP) מכתים בקרה של תאים נגועים HSV-1ICP6 mutRHIM (MOI = 5) במשך 9 שעות שבו הן נוגדנים אנטי-p-RIPK3 (S227) ו- ICP0 הושמטו נכלל. עוצמת הלייזר הדרושה לזיהוי אות p-RIPK3 (S227) הספציפי מסומנת בתמונות. ICP0 שימש להכתמת התאים הנגועים בנגיף, ו-DAPI שימש להכתמת הגרעין. פסי הסולם הם 10 מיקרומטר. (B) כימות יחסי של p-RIPK3 (S227)+ ווקסלים באמצעות פרוטוקול צביעת TSA. כל נקודה מייצגת תמונה, והפס האדום מייצג את החציון. ערכי ספירת ווקסל מוצגים ביחס לחציון של ספירת ווקסל של תמונות במצב דמה. הסטטיסטיקה נעשתה באמצעות ANOVA חד כיווני עם השוואות מרובות באמצעות תיקון Tukey. עמ' > 0.05 (נ.ש.), עמ'≤ 0.05 (*), עמ'≤ 0.01 (**). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3:HSV-1 ICP6 mutRHIM משרה זרחון תלוי ZBP1 של MLKL אנושי ב-S358. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי HT-29 אנושיים המבטאים ZBP1. התאים טופלו בלעג או הודבקוב-HSV-1 ICP6 mutRHIM (MOI = 5) במשך 8 שעות ו-10 שעות. TSA שימש לזיהוי p-MLKL (S358). ICP0 שימש להכתמת התאים הנגועים בנגיף, ו-DAPI שימש להכתמת הגרעין. מוצגת בקרה ללא צביעה ראשונית (NP) של תאים שנדבקו במשך 10 שעות ב-HSV-1 ICP6 mutRHIM (MOI = 5) שבו הושמט האנטי-p-MLKL הראשוני (S358). כבקרה חיובית, התאים היו מגורה במשך 4 שעות עם TNF של 30 ננוגרם/מ"ל, 5 μM BV6 ו-20 μM ZVAD-fmk, אשר גורם לנקרופטוזיס באמצעות TNFR1. פסי הסולם הם 10 מיקרומטר. (B) תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי HT-29 אנושיים המבטאים ZBP1, המשווה בין צביעת TSA לפרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי עקיף סטנדרטי (ללא TSA) עבור p-MLKL (S358). התאים טופלו בלעג או הודבקוב-HSV-1 ICP6 mutRHIM (MOI = 5) במשך 9 שעות. בקרת צביעת NP של תאים נגועים ב- HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) במשך 9 שעות שבהן הושמטו נוגדני האנטי-p-MLKL (S358) ו- ICP0 העיקריים. עוצמת הלייזר הדרושה לזיהוי אות p-MLKL (S358) הספציפי מסומנת בתמונות. (C) כימות יחסי של p-MLKL (S358)+ voxels באמצעות התקן (ללא TSA) ופרוטוקול צביעת TSA. כל נקודה מייצגת תמונה, והפס האדום מייצג את החציון. ערכי ספירת הווקסל מוצגים ביחס לחציון של ספירת הווקסל של תמונות במצב המדומה. הסטטיסטיקה נעשתה באמצעות ANOVA חד כיווני עם השוואות מרובות באמצעות תיקון Tukey. p > 0.05 (n.s.), p ≤ 0.0001 (****). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: נגיף שפעת A גורם לזרחון תלוי ZBP1 של RIPK3 ו-MLKL אנושיים. (A,C) תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי HT-29 אנושיים המבטאים ZBP1. התאים טופלו בלעג או הודבקו בנגיף שפעת A (IAV), זן PR8 (MOI = 4) במשך 9 שעות והוכתמו עבור p-RIPK3 (S227; A) או p-MLKL (S358; ג) שימוש בפרוטוקול TSA. פסי קנה המידה הם 10 מיקרומטר. (B,D) כימות יחסי של p-RIPK3 (S227)+ (B) או p-MLKL (S358; ד) ווקסלים. כל נקודה ב- (B,D) מייצגת תמונה, והפס האדום מייצג את החציון. ערכי ספירת הווקסל מוצגים ביחס לחציון של ספירת הווקסל של תמונות במצב המדומה. הסטטיסטיקה נעשתה באמצעות מבחן מאן-וויטני. p≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי זה מתאר את השימוש בהגברת אותות טירמיד (TSA) כדי להגביר את הרגישות לאירועי איתות של מסלול האיתות הנקרופטוטי האנושי שקשה לזהותם, כולל זרחון של RIPK3 ו- MLKL26. הכללת שלב TSA משפרת באופן משמעותי את סף הזיהוי של p-RIPK3 (S227) ו- p-MLKL (S358) ומגבירה את הרגישות של מאמץ p-MLKL (S358). TSA חשף אות p-RIPK3 (S227) שכבר קיים בדגימות שטופלו במדומה. בתאים אנושיים, האוטופוספורילציה של RIPK3 ב-S227 היא תנאי מוקדם להפעלת נקרופטוזיס בכך שהיא מאפשרת אינטראקציה יציבה עם MLKL. תהליך זה כבר מתרחש ברמות הבסיסיות ומביא להיווצרות דימר p-RIPK3 (S227)/MLKL לא פעיל יציב לפני אינדוקציה של נקרופטוזיס 2,5,31. באופן דומה, הנוגדן נגד p-RIPK3 ששימש במחקר זה מזהה גם p-RIPK3 (S227) בתאים לא מטופלים על ידי כתםמערבי 26.

הזרחון של MLKL על ידי RIPK3 בתוך לולאת ההפעלה, ב-T357 וב-S358, גורם לדיסוציאציה של קומפלקס p-RIPK3 (S227)/MLKL הלא פעיל וגורם לשינוי קונפורמציה לפיו MLKL חושף את תחום צרור ארבעת הסליל N-terminal שלו. לאחר מכן p-MLKL מופעל אוליגומרים ועובר לקרום התא, שם הוא מחדיר את ארבעת צרורות הסליל שלו לתוך דו-שכבת השומנים, וכתוצאה מכך תזה של התא 1,2,6. באמצעות פרוטוקול אימונופלואורסצנציה זה של TSA, זיהינו עלייה חזקה בזרחון S358 MLKL במהלך נקרופטוזיס המושרה על-ידי ZBP1. p-MLKL (S358) התקבץ בתוך הציטוזול ובממברנת הפלזמה ונמצא גם בתוך הגרעין לאחר הפעלת ZBP1. ואכן, דווח כי ZBP1 מעורר הפרעה בתיווך MLKL של קרום הגרעין בהקשר של זיהום IAV 8,30. יש לציין, עם זאת, כי TSA לא רק מפקיד ביוטין-טירמיד על האנטיגן המעניין ועל הנוגדנים הראשוניים/משניים, אלא גם על חלבונים שכנים. לכן, TSA אינו מתאים באופן אידיאלי להסיק מידע על לוקליזציה תת-תאית מדויקת של החלבונים שזוהו, ואיננו ממליצים על TSA למחקרי קו-לוקליזציה.

מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים של הקפאה משפיעים על יציבות הטירמיד הביוטינילציה. כדי למנוע ירידה ברגישות האות, אנו ממליצים לאליקוט את הטירמיד ולהשתמש באליקוט טרי לכל ניסוי. יש לנקוט משנה זהירות עם הבדלים בין אצווה לאצווה במלאי הביוטין-טירמיד. אם הריכוז הסופי של ביוטין-טירמיד גבוה מדי, רקע לא ספציפי של הגברת TSA יסתיר את האות הספציפי. כדי לשלוט בכך, אנו ממליצים לבצע טיטרציה של כל אצווה חדשה של ביוטין-טירמיד ולכלול בקרת צביעה ראשונית ללא צביעה ראשונית שבה הנוגדן העיקרי מושמט.

בפרוטוקול שהוצג, TSA הוגבל למטרה אחת. הגילוי של RIPK3 ו-MLKL שעברו זרחון לא שולב באותו כתם, שכן שני הנוגדנים העיקריים גודלו באותו המין. ניתן להתאים את הפרוטוקול לזיהוי אותות מוגברים מרובים של TSA (לדוגמה, p-RIPK3 [S227] ו-p-MLKL [S358]) בתוך אותה דגימה באמצעות מולטיפלקס אימונופלואורסצנטיTSA 32,33. לבסוף, הגברה בתיווך TSA עבור מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית יכולה לשמש לזיהוי סמנים ביולוגיים של מסלולי איתות אחרים עם יחסי אות לרעש גרועים שדווחו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לליבת ההדמיה הביולוגית VIB על האימון, התמיכה והגישה לפארק המכשירים. J.N. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקרן המחקר פלנדריה (FWO). המחקר בקבוצת J.M. נתמך על ידי מענק אודיסאוס השני (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), מענק מחקר זוטר (G031022N) מקרן המחקר פלנדריה (FWO), מענק הוכחת היתכנות לחוקר צעיר של CRIG, ועל ידי אוניברסיטת גנט. המחקר בקבוצת P.V. נתמך על ידי EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), מענקי מחקר בכירים של FWO (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 אטלנטיס, הקרן נגד סרטן (F/2016/865, F/2020/1505), קונסורציום CRIG ו-GIGG ו-VIB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 188
הגברת אות טירמיד להכתמה אימונופלואורסצנטית של זרחון תלוי ZBP1 של RIPK3 ו- MLKL לאחר זיהום HSV-1 בתאים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nemegeer, J., Lemeire, K.,… More

Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter