Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

İmmünofloresan boyama sırasında tiramid sinyal amplifikasyonu, HSV-1 enfeksiyonundan sonra ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin hassas tespitini sağlar.

Abstract

Kinaz Reseptörü ile etkileşime giren serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve substrat karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), önemli antiviral fonksiyonlara sahip hücre ölümünün enflamatuar bir formu olan nekroptozun kritik düzenleyicileridir. RIPK3'ün otofosforilasyonu, fosforilasyonu ve nekroptoz MLKL'nin gözenek oluşturan cellat proteininin aktivasyonunu indükler. Fosforile MLKL'nin hücre zarında ticareti ve oligomerizasyonu, nekrototik hücre ölümünün karakteristiği olan hücre lizisi ile sonuçlanır. Nükleik asit sensörü ZBP1, RNA ve DNA virüsleri ile enfeksiyondan sonra solak Z formundaki çift sarmallı RNA'YA (Z-RNA) BAĞLANARAK AKTIVE EDILIR. ZBP1 aktivasyonu, enfekte konakçı hücrelerin nekroptozu da dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükleyerek virüs enfeksiyonunu kısıtlar. İmmünofloresan mikroskopi, ZBP1 aracılı nekroptozun aşağı yönünde farklı sinyal basamaklarının hücre bazında görselleştirilmesine izin verir. Bununla birlikte, standart floresan mikroskobunun, insan RIPK3 ve MLKL'ye karşı mevcut ticari olarak temin edilebilen fosfo-spesifik antikorları kullanan duyarlılığı, bu belirteçlerin tekrarlanabilir görüntülenmesini engellemektedir. Burada, herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ile enfekte olmuş insan HT-29 hücrelerinde serin (S) fosforile edilmiş RIPK3 (S227) ve MLKL (S358) için optimize edilmiş bir boyama prosedürünü açıklıyoruz. İmmünofloresan boyama protokolüne bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımının dahil edilmesi, S227 fosforile RIPK3'ün spesifik olarak tespit edilmesini sağlar. Dahası, TSA, S358 fosforile MLKL'nin tespitinin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır. Birlikte, bu yöntem ZBP1 kaynaklı nekroptozun indüksiyonu sırasında bu iki kritik sinyal olayının görselleştirilmesini sağlar.

Introduction

Reseptör etkileşen serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), nekrototik hücre ölümünün merkezi düzenleyicileridir 1,2. Nekrotoz, antiviral bağışıklık ve otoinflamasyonda rol oynayan düzenlenmiş hücre ölümünün litik ve enflamatuar bir şeklidir. Virüs bulaşmış hücrelerin nekroptozu derhal virüs replikasyonunu durdurur. Nekrotoz indüksiyonunu takiben hücre lizisi, antiviral bağışıklığı uyaran hasarla ilişkili moleküler paternleri de serbest bırakır 3,4. Nekrotoz, üç yukarı akış aktive edici molekülden biriyle RIP homotipik etkileşim motifi (RHIM) aracılı etkileşimleri takiben RIPK3'ün aktivasyonu ile başlatılır: RIPK1 (TNF reseptörü 1 [TNFR1] katılımı üzerine), TIR etki alanı içeren adaptörü indükleyen interferon-β (TRIF; Toll benzeri reseptör 3 ve 4 etkileşimi üzerine) veya antiviral nükleik asit sensörü Z-DNA bağlayıcı protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekrotoz sinyalizasyonu, RIPK3'ün otofosforilasyonu ile başlayan bir dizi fosforilasyon olayından geçer. İnsan RIPK3'ün kinaz alanı içindeki serin (S) 227'de otofosforilasyonu, MLKL ile etkileşimi sağlayarak nekroptoz için bir ön koşuldur ve yaygın olarak insan RIPK3 aktivasyonu ve nekroptotik hücre ölümü için biyokimyasal bir belirteç olarak kullanılır 1,5. Aktive edildikten sonra, RIPK3, MLKL'nin aktivasyon döngüsünü treonin (T) 357 ve S3581'de fosforile eder. Bu, MLKL konformasyonunda bir değişikliğe neden olur ve N-terminal dört sarmal demet alanının maruz kalmasına neden olur. MLKL daha sonra oligomerize olur ve hücre zarına gider, burada lipit çift katmanına maruz kalan dört sarmal demetinin yerleştirilmesiyle bir gözenek oluşturur ve sonunda hücre ölümüne yol açar 2,6.

ZBP1, Z-konformasyonunda (Z-RNA) çift sarmallı RNA da dahil olmak üzere solak Z-formu nükleik asitleri tanıyan bir antiviral nükleik asit sensörüdür. Z-RNA bağlanması, ZBP1'in N-terminusunda konumlandırılmış iki Zα-alanı aracılığıyla gerçekleşir. RNA ve DNA virüs enfeksiyonu sırasında biriken Z-RNA'nın ZBP1 7,8'i doğrudan etkilediği düşünülmektedir. Aktif ZBP1, merkezi RHIM'leri aracılığıyla RIPK3'ü işe alır ve nekroptoz 9,10 dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükler. Virüsler, ZBP1 ile indüklenen konakçı hücre nekroptozuna karşı koymak için çok sayıda kaçış mekanizması benimsemiştir11. Örneğin, ICP6 olarak bilinen ve UL39 tarafından kodlanan herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ribonükleotid redüktaz alt birimi 1, RHIM'i insan hücrelerinde ZBP1 aracılı RIPK3 aktivasyonuna müdahale eden N-terminusunda barındırır12,13,14,15. ZBP1 sadece viral replikasyonu kısıtlamakla kalmaz, aynı zamanda fare çalışmaları ZBP1 aktivasyonunun enflamatuar hastalıklara neden olduğunu ve kanser bağışıklığını uyardığını göstermiştir 16,17,18,19,20,21. Bu nedenle, insan hücrelerinde ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında meydana gelen sinyal olaylarını tespit eden protokoller, ZBP1'in bu süreçlerdeki rolünü değerlendirmek için değerlidir.

Katalizörlü muhabir birikimi (CARD) olarak da adlandırılan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA), antikor bazlı immünotahlillerde algılama sınırını ve sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için geliştirilmiştir. TSA sırasında, ilgilenilen antijeni tespit etmek için herhangi bir primer antikor kullanılabilir. Yaban turpu peroksidaz (HRP), ikincil bir antikorla birleştiğinde, hidrojen peroksit varlığında biyotinile tiramid radikallerinin lokal birikimini katalize eder. Bu aktive biyotin-tiramid radikalleri daha sonra kovalent bağlar oluşturmak için proksimal tirozin kalıntıları ile reaksiyona girer. Potansiyel tiramid-biyotin substratları antijenin kendisini, birincil ve ikincil antikorları ve komşu proteinleri içerir. Böylece, TSA tahlilin hassasiyetini önemli ölçüde artırırken, mekansal çözünürlüğünün bir kısmı kaybolur. Son bir adımda, biyotin molekülleri floresan olarak etiketlenmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. HRP reaksiyonu, ilgilenilen antijenin üzerinde veya yakınında birçok tiramid-biyotin molekülü biriktirir. Bu, streptavidin-florokrom bağlanma bölgelerinin sayısını büyük ölçüde arttırır, böylece tahlilin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır (Şekil 1). Alternatif olarak, tiramid doğrudan bir florokroma bağlanabilir ve streptavidin-kuplajlı floroforlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Protein immünohistokimyası ve DNA / RNA in situ hibridizasyonu, TSA'nın sinyal yoğunluklarını iyileştirmek için kullanıldığı ilk yöntemler arasındaydı22,23. Daha yakın zamanlarda, TSA hücre içi akış sitometrisi24 ve kütle spektrometrisi25 ile birleştirilmiştir.

Burada, immünofloresan mikroskobu kullanılarak HSV-1 enfeksiyonu ile ZBP1'in aktivasyonu üzerine serin 227 fosforile insan RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) ve fosforile insan MLKL'sini (p-MLKL [S358]) tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan ZBP1'i kararlı bir şekilde eksprese etmek için dönüştürülen nekropotoza duyarlı HT-29 insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı kullanıyoruz. Bu hücreler, viral RHIM (VQCG) içindeki dört çekirdek amino asidin alaninler (AAAA) ile değiştirildiği mutant bir ICP6 proteinini (HSV-1 ICP6mutRHIM) eksprese eden bir HSV-1 suşu ile enfekte oldu, böylece ICP6, ZBP1 aracılı nekroptoz 13,14,15'i bloke edemez hale getirdi. İmmün boyama26'da p-RIPK3 ve p-MLKL'ye karşı halihazırda piyasada bulunan antikorların düşük sinyal-gürültü oranı sorununun üstesinden gelmek için, insan p-RIPK3'ün (S227) sağlam bir şekilde algılanmasıyla sonuçlanan ve insan p-MLKL'nin (S358) algılama hassasiyetini bir büyüklük sırasına göre artıran bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımı (Şekil 1) gerçekleştiriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Biyotinillenmiş tiramid hazırlanması

  1. Biotin-tiramidden başlayarak biyotinile tiramid hazırlayın. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için, 1 mL DMSO içinde 3.6 mg biyotin-tiramid çözün. Kaliteyi korumak için çözünmüş ürünü -20 ° C'de alikotlarda saklayın.

2. HT-29 hücrelerinin kültürde tutulması

NOT: ZBP1-eksprese HT-29, insan ZBP1'i kodlayan bir lentivektör27 ile transdüksiyonla üretilmiştir.

  1. ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini McCoy'un 5A ortamında L-glutamin, sodyum-piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (bundan böyle tam ortam olarak anılacaktır) ile desteklenmiş olarak tutun ve% 5 karbondioksit ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutun. İdeal olarak, düşük bir geçiş sayısına sahip hücreler kullanın (10'dan az). Deney başlamadan önce çözülme döngüsünden sonra hücreleri en az 5 gün iyileşmeye bırakın.
  2. Hücreleri kültür şişesinden ayırmak için, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere uygun miktarda tripsin / EDTA (sırasıyla% 0.05 tripsin ve% 0.032 EDTA, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin (T75 şişesi için 2 mL, T175 şişe için 3 mL).
  3. Tripsin/EDTA içeren hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 10 dakikaya kadar inkübe edin. Daha sonra, şişeye dokunun ve hücrelerin 4x-20x objektif büyütmeli bir mikroskop kullanarak şişeden ayrılıp ayrılmadığını görsel olarak kontrol edin.
  4. Hücreler tamamen ayrılmamışsa, 37 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, şişeye 6 mL tam ortam ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
  5. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Canlılığı değerlendirmek için tripan mavisi bir leke kullanarak hücreleri sayın; 1:5 seyreltme önerilir. Sadece hücrelerin yaşayabilirliği% 90'ı aşarsa deneye devam edin.

3. Deneye başlamak, tohumlama ve hücrelerin uyarılması

  1. Tohum 90.000 ZBP1-eksprese HT-29 hücreleri tam ortamda, 1 cm² yüzey alanı kuyu plakasında üst düzey mikroskopiye izin verir. Kuyu başına 200 μL'lik bir uç hacim kullanın.
  2. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Boyama kontrolleri için bazı ekstra kuyucukların tohumlanması gerektiğini göz önünde bulundurun, bu da adım 5.6'da daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
  3. Hücreler% 70 -% 80 akıcılığa ulaştığında, hücrelere nekroptoza neden olan bir uyaran ekleyin. Burada, hücreler HSV-1 ICP6mutRHIM (plak oluşturan birimler (pfu) olarak tanımlanan 5'in enfeksiyon çokluğu [MOI], hücre sayısına bölünür; pfu, Vero hücreleri üzerinde bir plak testi kullanılarak ölçüldü) 6 saat, 8 saat veya 10 saat boyunca enfekte edildi.
  4. Nekrotoz indüksiyonu için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 30 ng / mL TNF, 20 μM pan-kaspaz inhibitörü zVAD-fmk ve SMAC mimetik BV6'nın 5 μM'sini içeren nekroptozise neden olan bir kokteyl ile 4 saat boyunca uyarın.
  5. P-RIPK3 (S227) boyaması için negatif bir kontrol olarak, RIPK3 kinaz aktivitesini inhibe etmek ve S227'nin otofosforilasyonunu önlemek için GSK'840 (1 μM) ekleyin. İdeal olarak, inhibitörü tedavi edilmemiş bir durumda ve nekrotoz stimülasyonundan sonra ekleyin. İnhibitör, viral enfeksiyonla aynı anda eklenebilir.
  6. Stimülasyonları tam ortamda, önceden 37 ° C'ye ısıtılmış olarak hazırlayın. Tüm stimülasyonlar için kuyu başına 200 μL'lik bir uç hacim kullanın.

4. Hücrelerin sabitlenmesi

  1. Ortamı çıkarın ve hücreleri 200 μL 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere 150 μL% 4 PFA (oda sıcaklığında zaten dengelenmiş) ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: Kolayca ayrılan hücreler kullanıyorsanız, hücrelerin sabitlenmesi aşağıdaki gibi optimize edilebilir. Kuyudan 100 μL ortam çıkarın, böylece plakada 100 μL'lik bir hacim kalır. Hücrelere 100 μL% 4 PFA ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı / fiksatifi kuyucuklardan çıkarın ve% 4 PFA'nın 150 μL'si ile değiştirin. Hücrelerin tamamen sabitlenmesini sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin.
  2. Fiksasyondan sonra,% 4 PFA'yı çıkarın ve hücreleri 200 μL 1x PBS ile 3x yıkayın. Numuneler, bir sonraki işleme kadar gece boyunca 4 °C'de 1x PBS'nin üzerinde (>200 μL) saklanabilir.

5. Permeabilizasyon ve primer boyama

  1. PBS'yi çıkarın ve 100 μL geçirgenlik tamponu ekleyin (PBS'de %0,5 Triton X-100). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Geçirgenlik tamponunu çıkarın ve daha sonra kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Görüntüleme odasını yıkama tamponu ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında (dakikada 20-30 sallanma hareketi) inkübe edin.
  3. Birincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, 100 μL bloke edici ortam ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. Alternatif olarak, bu engelleme adımı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 3 BSA,% 0.1 Triton-X-100 ile bloke edilerek değiştirilebilir.
  4. Kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3x yıkayın (PBS'de %0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, birincil antikorları görüntüleme odasına ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kuyuyu örtmek için 100 μL'lik bir uç hacim kullanın. 4°C'de gece boyunca inkübasyon sırasında, görüntüleme odasını eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısına yerleştirmeyin.
    NOT: Anti p-MLKL (S358; seyreltme: 1:200) ve anti-p-RIPK3 (S227; seyreltme: 1:200) tavşanı konakçı bir tür olarak paylaşır ve bu nedenle tek bir kuyuda birleştirilmemelidir. Viral enfeksiyonu izlemek için, birincil bir antikoru tercih edilen bir viral proteine karşı p-MLKL (S358) veya p-RIPK3 (S227) ile birleştirin. Burada, hücrelere HSV-1 enfeksiyonu ve ardından ICP0 boyama (seyreltme: 1:50, konakçı tür: fare) bulaştı.
  6. Bu noktada gerekli boyama kontrollerini göz önünde bulundurun. Maskeleme eşiğini ayarlamak üzere TSA amplifikasyon adımının potansiyel arka planını görselleştirmek için her zaman birincil antikor yok durumu ekleyin (bkz. adım 9).
    NOT: Bir ko-boyama protokolü durumunda (örneğin, p-MLKL [S358] veya p-RIPK3 [S227] 'yi viral bir proteine karşı bir antikor ile birleştirmek) tek lekeler de kullanın. Tek lekelerin kullanılması, diğer görüntüleme kanallarındaki potansiyel kanama sinyalini düzeltmek için önemlidir.

6. Tiramit sinyal amplifikasyonu (TSA)

  1. Birincil antikor karışımını çıkarın ve kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3 kat yıkayın (PBS'de %0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Yıkama tamponunu çıkarın ve çoğaltılması gereken birincil antikor türlerini tanıyan 100 μL HRP etiketli ikincil antikor ekleyin. p-RIPK3 (S227) veya p-MLKL (S358) sinyalini yükseltmek için, 100 μL anti-tavşan-HRP ekleyin ve yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Yalnızca p-MLKL (S358) veya p-RIPK3 (S227) güçlendirilecektir. Bir viral proteinin boyanması, standart bir dolaylı boyama yöntemi kullanılarak görselleştirilecektir.
  3. Daha sonra, kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3 kat yıkayın (PBS'de% 0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Sonraki adımlarda, biyotinile tiramidi mikroskobik plakaya ekleyin. İkincil antikorlara bağlı HRP grubunu kullanarak, enzimatik reaksiyon birincil hedefe yakın bir yerde tiramid radikallerinin oluşumunu tetikleyecektir (burada, p-MLKL [S358] veya p-RIPK3 [S227]).
  5. HRP'nin enzimatik aktivitesini aktive etmek için, biyotinile tiramid ile birlikte oksitleyici bir substrat ekleyin. Bunu başarmak için, TSA tamponunu (0,1 M borik asit [pH 8,5]) 0,03 M H2 O 2iledestekleyin; spesifik olarak, 5 mL TSA tamponu alın ve% 30 H2 O2'den5 μL ekleyin.
  6. Şimdi, biyotin-tiramidinH2O2 takviyeli TSA tamponunda 1:1.000 ila 1:20.000 arasında seyreltin.
    NOT: Biotin-tiramidin seyreltme faktörünün parti başına optimize edilmesi gerekir.
  7. Yıkama tamponunu kuyucuklardan çıkarın ve seyreltilmiş biyotin-tiramid kuyucuklara 100 μL'lik bir son hacme kadar ekleyin.
  8. Daha sonra, kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3x yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.

7. Floroforlar

NOT: Birincil antikorun sinyali bir biyotin grubuna dönüştürüldüğünden, p-MLKL (S358) ve p-RIPK3 (S227), bir florofora bağlanmış streptavidin kullanılarak görselleştirilir (florofor 568, seyreltme: 1:500). Ek olarak, çekirdekler DAPI (5 μg / mL) ile boyanır. Boyama protokolüne bir viral protein dahil edilmişse, birincil antikorunuzun konakçı türlerine karşı uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ekleyin. Temsili sonuçlarda, bir fare anti-ICP0 kullanıldı. Sekonder bir antikor olarak keçi anti-faresi florofor 633 (seyreltme: 1:1.000) ile birleşmiştir.

  1. Boyama karışımını yukarıda belirtilen antikorları ve lekeleri içeren yıkama tamponunda (PBS'de% 0.1 Triton X-100) yapın. Yıkama tamponunu çıkarın, 100 μL boyama karışımı ekleyin ve yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Bu adımdan itibaren görüntüleme odasını ışıktan koruyun.
  2. Daha sonra, kuyucukları 2x yıkama tamponu ile yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Son olarak, kuyucukları 1x PBS ile 2x durulayın. Numuneleri görüntülemeye kadar 1x PBS'den fazla (> 200 μL) saklayın. Alternatif olarak, lekelenmeyi korumak için numuneleri montaj ortamına batırın. Görüntüleme odası artık konfokal mikroskopta görselleştirilmeye hazırdır.

8. Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleme

  1. Görüntülemeden en az 10 dakika önce konfokal mikroskop ve lazerleri açın.
  2. Hassasiyet için bir daldırma hedefi kullanın. Tercihen, 40x veya 63x objektif büyütme kullanın. Görüntülemeden önce, daldırma hedeflerini uygun pamuk topları kullanarak lens temizleyici ile temizleyin. Kirli hedefler (örneğin, toz nedeniyle) daha düşük kaliteli görüntülere neden olabilir.
  3. Görüntüleme odasının altına fazla miktarda yağ koyun. Ek olarak, seçim hedefine bir damla yağ ekleyin.
  4. Görüntüleme odasını mikroskop üzerine koyun. DAPI boyama veya parlak alan görüntüleme kullanarak odak alanını bulun. Gerekirse, daldırma yağının düzgün yayılmasını sağlamak için görüntüleme odasının etrafında hareket edin.
  5. Mikroskopta gerekli görüntüleme izlerini ayarlayın. Mikroskopa bağlı olarak, aşağıdaki adımlar değişebilir (Tablo 1).
    NOT: Görüntüleme izlerini kurarken, izleri nükleer lekelenmenin en son ölçüleceği şekilde programlayın. 405 nm lazer, fotobeyazlatmaya ve dolayısıyla tüm kanallarda spesifik sinyal kaybına katkıda bulunabilir.
  6. Tam bir hücreyi p-RIPK3 (S227) veya p-MLKL (S358) varlığına göre analiz etmek için, hücrenin yüksekliğini kapsayan z-yığınlarını ölçün. Burada, z-yığınları her 0.16 μm'de bir 40 dilimden yapıldı ve bu da 6.22 μm'lik bir aralıkla sonuçlandı.

İz Lazer Kiriş ayırıcı Filtre
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) 561 MBS -405 + BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Viral Gen: ICP0 633 MBS -405 + BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Çekirdek: DAPI 405 MBS -405 + BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tablo 1: Hücre görselleştirme için görüntüleme izleri.

9. Veri analizi ve nicelleştirme

  1. Mikroskobik görüntüleri yazılıma yükleyin. Z-yığınının tüm bilgilerini 2B görüntüde görselleştirmek için genişletilmiş odağı kullanın.
  2. Ardından, aşağıdaki bilgileri çıkarmak için analiz protokolünü programlayın: görüntü başına hücre sayısı, p-RIPK3 (S227) + veya p-MLKL (S358) + boyamasını gösteren voksellerin toplamı. Voksel, bir pikselin üç boyutlu eşdeğeri olarak tanımlanan üç boyutlu bir hacmi temsil eder.
  3. Görüntü başına hücre sayısını ölçmek için çekirdeği bölümlere ayırın. Segmentasyon sonuçlarındaki gürültüyü azaltmak için, segmentasyona bir boyut sınırlaması ekleyin (>100 μm³). Bölümlenmiş çekirdek sayısı, görüntüdeki hücre sayısını temsil eder.
  4. p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)+ voksel miktarını ölçmek için eşik tabanlı bir segmentasyon programlayın. Eşiği, birincil antikor yok (NP) görüntülerinde sinyal alınmayacak şekilde ayarlayın.
  5. Tedavi edilmemiş sahte durumdan görüntüleri kullanarak eşiği daha da uyarlayın. Nekrotoz stimülasyonu nedeniyle sinyal artışının hassas bir şekilde algılanmasını sağlamak için, daha yüksek bir eşik ayarlayarak sahte koşullarda p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)+ voksellerin alınmasını sınırlayın. Programlanmış analiz protokolünü her zaman sahte durumdan ve nekroptoza neden olan viral enfeksiyondan birkaç görüntüde kontrol edin.
  6. Analizi tüm görüntü kümelerinde çalıştırın. Voksel nicelemesini ve çekirdek segmentasyonunu elektronik tablo yazılımında daha fazla işlem için .txt bir dosyada dışa aktarın.
  7. Görüntü adını, çekirdek miktarını ve algılanan voksellerin toplamını gösteren verilerin bir pivot tablosunu yapın.
  8. Ardından, pozitif voksellerin toplamını görüntüdeki hücrelerin sayısına bölün. Bu, hücre başına pozitif voksellerin göreceli bir değeri ile sonuçlanır. Katlama artışını görselleştirmek için, hücre başına p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)+ voksellerin göreli değerini, işlenmemiş durumun medyanına (alay) bölün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnsan hücrelerinde MLKL fosforilasyonunun ve özellikle RIPK3 fosforilasyonunun immünofloresan tespiti teknik olarak zordur26. Burada ZBP1'in aktivasyonu üzerine insan p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) için geliştirilmiş bir boyama protokolü sunuyoruz. Protokol, floresan sinyallerinin algılama sınırını ve hassasiyetini artırmak için bir TSA adımı içerir. Yöntemi doğrulamak için, TSA aracılı immünofloresansın hem p-RIPK3 (S227) hem de p-MLKL'nin (S358) standart dolaylı floresan boyaması ile yan yana karşılaştırması yapılmıştır.

İnsan ZBP1'i eksprese eden HT-29 hücreleri, ZBP1 aracılı nekroptoz ve RIPK3 fosforilasyonunu indüklemek için 9 saat boyunca bir ICP6 RHIM mutant HSV-1 suşu (HSV-1 ICP6mutRHIM) ile enfekte edildi. HSV-1 ICP6mutRHIM suşu, ICP6 RHIM içindeki AAAA mutasyonuna bir VQCG taşır ve ZBP1 14,15'in aşağı yönünde sinyal veren nekropotozu bloke edemez. Daha önce bildirilen26 gibi, standart dolaylı immünofloresan, konfokal mikroskobun lazer gücü% 30'a yükseltilmiş olsa bile, RIPK3 S227 fosforilasyonunu mevcut ticari olarak temin edilebilen antikor ile görselleştirmek için yeterince hassas değildi (Şekil 2A). Buna karşılık, bir TSA adımının dahil edilmesi, HSV-1 ICP6mutRHIM ile enfekte olmuş hücrelerin sitozolünde p-RIPK3'ün (S227) sağlam bir şekilde tespit edilmesini sağlamıştır. P-RIPK3 (S227) sinyali, lazer gücü %2 olarak ayarlandığında doygunluğa ulaştı (Şekil 2A). Üç boyutlu z-yığını görüntülerinin nicelleştirilmesi (bkz. adım 9), HSV-1 ICP6mutRHIM-enfekte olmuş p-RIPK3 (S227) için pozitif olan voksel sayısında yaklaşık 20 kat artış göstermiştir (Şekil 2B). TSA aracılı boyama protokolünden primer anti-p-RIPK3 (S227) antikorunun primer (NP) kontrol olmaması saptanabilir bir sinyal vermedi. HSV-1 ICP6mutRHIM ile enfekte olmuş hücreleri görselleştirmek için, örnekler hemen erken viral protein ICP0'a karşı yönlendirilmiş birincil bir antikor ile birlikte boyandı (Şekil 2A). Alaycı muamele görmüş hücrelerde düşük fakat saptanabilir bir p-RIPK3 (S227) sinyali mevcuttu, bu da bu bölgedeki insan RIPK3'ün kurucu otofosforilasyonunu temsil edebilir5 (tartışmaya bakınız). Önceki bir rapor28'e uygun olarak, ICP6'nın RHIM'i, vahşi tip HSV-1 (HSV-1WT; Şekil 2A,B). P-RIPK3 (S227) sinyalinin özgüllüğünü daha da doğrulamak için, hücreler enfeksiyondan önce RIPK3 kinaz inhibitörü GSK'840 ile tedavi edildi. GSK'840, RIPK3'ün kinaz alanına bağlanır, aktivitesini önler ve böylece otofosforilasyonunu inhibe eder29. GSK'840, ZBP1 aktivasyonu üzerine S227'de RIPK3 fosforilasyonunu önledi (Şekil 2A, B), TSA aracılı p-RIPK3 (S227) tespit yönteminin özgüllüğünü doğruladı.

Nekroptoz için bir son aşama belirteci olan MLKL fosforilasyonunu takip etmek için, ZBP1 eksprese eden HT-29 hücreleri, 8 saat ve 10 saat boyunca HSV-1 ICP6mutRHIM ile enfekte edildi. Hücreler, TSA kullanılarak S358 fosforile MLKL'ye (p-MLKL [S358]) karşı bir antikor ile boyandı. Alaycı muamele görmüş hücreler, p-MLKL'nin (S358) düşük ve biraz noktasal sitozolik boyanmasını gösterirken, sitosol, çekirdekte güçlü p-MLKL boyaması tespit edildi. ve HSV-1 ICP6mutRHIM ile enfekte olmuş hücrelerdeki plazma zarında (Şekil 3A). Ayrıca, p-MLKL (S358) sinyali kümelerde gözlenmiştir. Bu, hücre zarındaki aktif fosforile MLKL oligomerlerinin gözenek oluşturma fonksiyonları ve influenza A enfeksiyonu 1,2,6,30 üzerine yakın zamanda bildirilen nükleer translokasyonu ile uyumludur. Pozitif bir p-MLKL (S358) boyama kontrolü olarak, TNFR1 aracılı nekroptozu indüklemek için TNF, SMAC mimetik BV6 ve pan-kaspaz inhibitörü zVAD-fmk'nin bir kombinasyonu ile ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini uyardık (Şekil 3A). TSA aracılı boyama protokolünden primer anti-p-MLKL (S358) antikorunun birincil kontrol olmadığı için çıkarılması saptanabilir bir sinyal vermedi.

Daha sonra, TSA ile ve TSA olmadan p-MLKL (S358) immünofloresan boyamasının yan yana karşılaştırmasını yaptık. ZBP1 eksprese eden HT-29 hücreleri, HSV-1 ICP6mutRHIM ile 9 saat boyunca enfekte edildi. Standart dolaylı immünofloresans kullanarak enfekte hücrelerde spesifik bir p-MLKL (S358) sinyalini tespit etmek için% 40'lık bir lazer gücüne ihtiyaç duyulurken, TSA ile tedavi edilen numuneler, alay ile muamele edilmiş numunelerde arka plan boyamasını arttırmadan% 6'lık bir lazer gücünde doygunluk sinyallerine ulaşmıştır (Şekil 3B). Ayrıca, üç boyutlu z-yığını görüntülerinin nicelleştirilmesi, standart dolaylı immünofloresansa kıyasla TSA kullanıldığında p-MLKL (S358) için pozitif olan voksel sayısında 10 kattan fazla bir artış göstermiştir. Bu, TSA'nın p-MLKL için hem algılama eşiğini hem de hassasiyeti geliştirdiğini göstermektedir (S358; Şekil 3C).

Son olarak, diğer ZBP1 bağımlı nekrotoz viral uyaranları için TSA aracılı immünofloresan protokolünü doğrulamak için, ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini 9 saat boyunca influenza A virüsü (IAV) PR8 suşu ile enfekteettik. Gerçekten de, TSA, nekrotoz geçiren bu hücrelerin göstergesi olan p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL'nin (S358) sağlam bir şekilde tespit edilmesine izin verdi (Şekil 4A-D).

Figure 1
Şekil 1: TSA protokolünün şematik gösterimi. Hücreler, üst düzey mikroskopi ile uyumlu bir kuyu plakasında tohumlanır ve uyarılır. Daha sonra, numuneler %4 PFA'da sabitlenir, primer antikorların spesifik olarak bağlanmasını önlemek için geçirgenleştirilir ve bloke edilir. Fosforile RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) ve MLKL'yi (p-MLKL [S358]) görselleştirmek için, bu anahtar fosforilasyon bölgelerini tanıyan spesifik antikorlar görüntüleme odasında gece boyunca inkübe edilir. Daha sonra, bir at turpu peroksidazına (HRP) bağlanmış ikincil bir antikor eklenir. Bu HRP grubu,H2 O2varlığında biyotinile tiramidin aktivasyonunu sağlar. Daha sonra, aktif biyotin-tiramid kovalent olarak HRP etiketli ikincil antikorun yakınında tirozin kalıntılarına çiftleşir. Bunlar, ilgilenilen proteinler üzerindeki tirozinleri içerir - bu durumda p-RIPK3 veya p-MLKL, şekilde belirtildiği gibi - ve komşu proteinlerin ve birincil ve ikincil antikorların kendileri (gösterilmemiştir). Bu tiramid sinyal amplifikasyon adımı, boyama protokolünün hassasiyetini büyük ölçüde arttırır. Son bir adımda, biyotinillenmiş molekülleri görselleştirmek için bir floresan grubuna bağlanmış streptavidin eklenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: HSV-1 ICP6mutRHIM, S227'de insan RIPK3'ün ZBP1'e bağımlı fosforilasyonunu indükler. (A) İnsan ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri, TSA boyamasını p-RIPK3 (S227) için standart bir dolaylı (TSA yok) immünofloresan boyama protokolü ile karşılaştırır. Alaycı ve virüs bulaşmış örnekler (HSV-1WT veya HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) 9 saat boyunca inkübe edildi. Negatif kontrol olarak, RIPK3 kinaz inhibitörü GSK'840 (1 μM) dahil edildi. HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) ile enfekte olmuş hücrelerin 9 saat boyunca hem birincil anti-p-RIPK3 (S227) hem de ICP0 antikorlarının ihmal edildiği primer (NP) boyama kontrolü dahil değildir. Belirli p-RIPK3 (S227) sinyalini algılamak için gereken lazer gücü görüntülerde belirtilmiştir. ICP0, virüs bulaşmış hücreleri boyamak için kullanıldı ve DAPI, çekirdeği boyamak için kullanıldı. Ölçek çubukları 10 μm'dir. (B) TSA BOYAMA protokolünü kullanarak p-RIPK3 (S227) + voksellerin göreceli niceliği. Her nokta bir görüntüyü, kırmızı çubuk ise medyanı temsil eder. Voksel sayım değerleri, sahte durumdaki görüntülerin voksel sayısının medyanına göre sunulur. İstatistikler, Tukey düzeltmesi kullanılarak çoklu karşılaştırmalarla tek yönlü bir ANOVA kullanılarak yapıldı. p > 0,05 (n.s.), s≤ 0,05 (*), p≤ 0,01 (**). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: HSV-1 ICP6mutRHIM, S358'de insan MLKL'sinin ZBP1'e bağımlı fosforilasyonunu indükler. (A) İnsan ZBP1-eksprese eden HT-29 hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri. Hücreler ya sahte tedavi edildi ya da 8 saat ve 10 saat boyunca HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) ile enfekte edildi. ICP0, virüs bulaşmış hücreleri boyamak için kullanıldı ve DAPI, çekirdeği boyamak için kullanıldı. HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) ile 10 saat boyunca enfekte olan hücrelerin primer (NP) boyama kontrolünün yapılmadığı ve primer anti-p-MLKL'nin (S358) ihmal edildiği gösterilmiştir. Pozitif bir kontrol olarak, hücreler TNFR1 yoluyla nekroptozu indükleyen 30 ng / mL TNF, 5 μM BV6 ve 20 μM ZVAD-fmk ile 4 saat boyunca uyarıldı. Ölçek çubukları 10 μm'dir. (B) İnsan ZBP1-eksprese HT-29 hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri, TSA boyamasını p-MLKL (S358) için standart bir dolaylı (TSA yok) immünofloresan boyama protokolü ile karşılaştırır. Hücreler ya sahte tedavi edildi ya da 9 saat boyunca HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) ile enfekte edildi. HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) ile enfekte olmuş hücrelerin 9 saat boyunca primer anti-p-MLKL (S358) ve ICP0 antikorlarının atlandığı NP boyama kontrolü dahil edilmiştir. Belirli p-MLKL (S358) sinyalini tespit etmek için gereken lazer gücü görüntülerde belirtilmiştir. (C) Standart (TSA yok) ve TSA boyama protokolü kullanılarak p-MLKL (S358) + voksellerin göreceli niceliği. Her nokta bir görüntüyü, kırmızı çubuk ise medyanı temsil eder. Voksel sayısı değerleri, sahte durumdaki görüntülerin voksel sayısının medyanına göre sunulur. İstatistikler, Tukey düzeltmesi kullanılarak çoklu karşılaştırmalarla tek yönlü bir ANOVA kullanılarak yapıldı. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İnfluenza A virüsü, insan RIPK3 ve MLKL'nin ZBP1'e bağımlı fosforilasyonunu indükler. (A, C) İnsan ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri. Hücreler ya sahte tedavi edildi ya da 9 saat boyunca influenza A virüsü (IAV), PR8 suşu (MOI = 4) ile enfekte edildi ve p-RIPK3 (S227; A) veya p-MLKL (S358; C) TSA protokolünü kullanmak. Ölçek çubukları 10 μm'dir. (B,D) p-RIPK3 (S227)+ (B) veya p-MLKL'nin (S358; D) vokseller. (B,D) içindeki her nokta bir görüntüyü, kırmızı çubuk ise medyanı temsil eder. Voksel sayısı değerleri, sahte durumdaki görüntülerin voksel sayısının medyanına göre sunulur. İstatistikler bir Mann-Whitney testi kullanılarak yapıldı. p≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu immünofloresan boyama protokolü, RIPK3 ve MLKL26'nın fosforilasyonu da dahil olmak üzere tespit edilmesi zor olan insan nekroptotik sinyal yolunun sinyal olaylarına duyarlılığı artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonunun (TSA) kullanımını açıklar. Bir TSA adımının dahil edilmesi, p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) algılama eşiğini önemli ölçüde iyileştirir ve p-MLKL (S358) gerilmesinin hassasiyetini artırır. TSA, alaycı muamele görmüş numunelerde zaten mevcut olan bir p-RIPK3 (S227) sinyali ortaya çıkardı. İnsan hücrelerinde, S3'teki RIPK227'nin otofosforilasyonu, MLKL ile stabil bir etkileşim sağlayarak nekroptoz aktivasyonu için bir ön koşuldur. Bu işlem zaten bazal seviyelerde meydana gelir ve nekrotoz indüksiyonu 2,5,31'den önce stabil inaktif bir p-RIPK3 (S227) / MLKL dimer oluşumu ile sonuçlanır. Benzer şekilde, bu çalışmada kullanılan anti-p-RIPK3 antikoru, tedavi edilmemiş hücrelerde p-RIPK3'ü (S227) batı lekelemesi26 ile de tespit eder.

MLKL'nin aktivasyon döngüsü içinde, T357 ve S358'de RIPK3 tarafından fosforilasyonu, inaktif p-RIPK3 (S227) / MLKL kompleksinin ayrışmasına neden olur ve MLKL'nin N-terminal dört sarmal demet alanını açığa çıkardığı konformasyonel bir değişime neden olur. Aktive edilen p-MLKL daha sonra oligomerize olur ve dört sarmal demetini lipit çift katmanına yerleştirdiği hücre zarına gider ve hücre lizisi 1,2,6 ile sonuçlanır. Bu TSA immünofloresan protokolünü kullanarak, ZBP1 kaynaklı nekroptozis sırasında S358 MLKL fosforilasyonunda güçlü bir artış tespit ettik. p-MLKL (S358) sitosol içinde ve plazma zarında kümelenir ve ZBP1 aktivasyonu üzerine çekirdek içinde de bulunur. Gerçekten de, ZBP1'in IAV enfeksiyonu 8,30 bağlamında nükleer membranın MLKL aracılı pertürbasyonunu uyardığı bildirilmiştir. Bununla birlikte, TSA'nın sadece biyotin-tiramid ile ilgilenilen antijen ve birincil / ikincil antikorlar üzerinde değil, aynı zamanda komşu proteinler üzerinde de biriktiği belirtilmelidir. Bu nedenle TSA, tespit edilen proteinlerin kesin hücre altı lokalizasyonu hakkında bilgi çıkarmak için ideal değildir ve birlikte lokalizasyon çalışmaları için TSA'yı önermiyoruz.

Tekrarlanan donma-çözülme döngüleri, biyotinile tiramidin stabilitesini etkiler. Sinyal duyarlılığında bir azalmayı önlemek için, tiramid aliquot ve her deney için taze bir aliquot kullanmanızı öneririz. Biotin-tiramid stoklarındaki partiden partiye farklılıklar konusunda dikkatli olunmalıdır. Biotin-tiramidin son konsantrasyonu çok yüksekse, TSA amplifikasyonunun spesifik olmayan arka planı spesifik sinyali maskeleyecektir. Bunu kontrol etmek için, her yeni biyotin-tiramid partisinin titre edilmesini ve birincil antikorun atlandığı birincil boyama kontrolü içermemesini öneririz.

Sunulan protokolde TSA tek bir hedefle sınırlıydı. Fosforile RIPK3 ve MLKL'nin tespiti, aynı tipte her iki primer antikor da yetiştirildiği için aynı boyamada birleştirilmedi. Protokol, multipleks immünofloresan TSA 32,33 kullanılarak aynı numune içinde birden fazla TSA güçlendirilmiş sinyali (örneğin, p-RIPK3 [S227] ve p-MLKL [S358]) tespit etmek için uyarlanabilir. Son olarak, immünofloresan mikroskobu için TSA aracılı amplifikasyon, bildirilen zayıf sinyal-gürültü oranlarına sahip diğer sinyal yolaklarının biyobelirteçlerinin tanınması için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

VIB Bioimaging Core'a eğitim, destek ve cihaz parkına erişim için teşekkür ederiz. J.N., Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) doktora bursu ile desteklenmektedir. J.M. grubundaki araştırmalar, bir Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) bir junior research grant (G031022N), bir CRIG genç araştırmacı kavram kanıtı hibesi ve Ghent Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. P.V. grubundaki araştırmalar EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO kıdemli araştırma hibeleri (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Kansere Karşı Vakıf (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG ve GIGG konsorsiyumları ve VIB tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 188
İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nemegeer, J., Lemeire, K.,… More

Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter