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Biology

आहार लिपिड अवशोषण और काइलोमाइक्रोन स्राव के विवो कैनेटीक्स में मात्रा निर्धारित करने के लिए चूहों में बहते मेसेन्टेरिक लिम्फ का अलगाव

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में इंट्राडोडेनल पोषक तत्व ों के इंजेक्शन के जवाब में बहने वाली आंतों के लसीका को अलग करने के लिए एक विस्तृत सर्जिकल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह विभिन्न प्रयोगात्मक पोषक तत्वों के जवाब में कुल आंतों के लिपिड अवशोषण और काइलोमाइक्रोन संश्लेषण और स्राव के शारीरिक निर्धारण की अनुमति देता है।

Abstract

आंतों के लिपोप्रोटीन, विशेष रूप से ट्राइग्लिसराइड युक्त काइलोमाइक्रोन, चयापचय, सूजन और हृदय रोगों का एक प्रमुख चालक हैं। हालांकि, आंतों के लिपोप्रोटीन को अलग करना विवो में बहुत मुश्किल है क्योंकि वे पहले छोटी आंत से मेसेंटेरिक लसीका में स्रावित होते हैं। काइलोमाइक्रोन युक्त लसीका तब वक्ष वाहिनी से उप-लेवियन नस में खाली हो जाता है ताकि भोजन के घटकों को हृदय, फेफड़ों और अंततः, पूरे शरीर के परिसंचरण तक पहुंचाया जा सके। भोले काइलोमाइक्रोन को रक्त से अलग करना असंभव है क्योंकि काइलोमाइक्रोन ट्राइग्लिसराइड परिसंचरण में लिपोप्रोटीन लाइपेस और अन्य लिपोप्रोटीन रिसेप्टर्स के साथ बातचीत पर तुरंत हाइड्रोलिसिस से गुजरता है। इसलिए, चूहों में बोलमैन एट अल द्वारा वर्णित मूल 2-दिवसीय लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया का उपयोग ऐतिहासिक रूप से वक्ष शिरा में प्रवेश से पहले ताजा मेसेंटेरिक लिम्फ को अलग करने के लिए किया गया है। पिछले 45 वर्षों से पैट्रिक त्सो की प्रयोगशाला द्वारा उस प्रोटोकॉल में सुधार और पेशेवरीकरण किया गया है, जिससे इन महत्वपूर्ण लिपोप्रोटीन और आंत से स्राव के विश्लेषण की अनुमति मिलती है। त्सो लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया को अब अपडेट किया गया है और पहली बार यहां नेत्रहीन रूप से प्रस्तुत किया गया है। यह संशोधित प्रक्रिया ग्रहणी आहार ट्यूब स्थापित करने, मेसेंटेरिक लिम्फ वाहिनी को नष्ट करने और सचेत चूहों में भोजन के बाद लिम्फ एकत्र करने के लिए एक एकल-दिवसीय शल्य चिकित्सा तकनीक है। इन नई तकनीकों के प्रमुख लाभों में चूहों से लिम्फ एकत्र करने की क्षमता शामिल है (जो आनुवंशिक माउस मॉडल की शक्ति का दोहन करता है); ग्रहणी जलसेक ट्यूब और लिम्फ कैनुला के आरोपण के दौरान चूहों के लिए कम संज्ञाहरण समय; पूरे भोजन और पोस्ट-प्रांडियल अवधि के दौरान लगातार लिम्फ का नमूना लेने की क्षमता; रक्त में उनके कमजोर पड़ने और एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस से पहले हार्मोन और साइटोकिन्स को मात्रात्मक रूप से मापने की क्षमता; और आंतों के लिपोप्रोटीन को अलग करने के लिए बड़ी मात्रा में लिम्फ एकत्र करने की क्षमता। यह तकनीक आहार पोषक तत्व अवशोषण, आंतों के लिपोप्रोटीन संश्लेषण और काइलोमाइक्रोन स्राव को सीधे और मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

मेसेंटेरिक लसीका प्रणाली का शारीरिक महत्व
मेसेंटेरिक लसीका को ~ 300 ईसा पूर्व से किसी न किसी रूप में वर्णित किया गया है जब हेरोफिलोस ने यकृत पोर्टल प्रणाली और आंतों में सभी "अवशोषक नसों" का वर्णन किया 1,2,3,4,5। इस प्रारंभिक विवरण के बाद 1,700 से अधिक वर्षों के लिए, आंतों के लसीका की एक परिभाषितविशेषता भोजन के तुरंत बाद मेसेंटेरिक लिम्फ में दूधिया तरल पदार्थ की उपस्थिति थी। अब यह ज्ञात है कि दूधिया, काइलोमाइक्रोन युक्त लिम्फ ("चिलोस" लिम्फ) पोर्टल नस और यकृत में नहीं निकलता है, बल्कि इसके बजाय सिस्टर्ना काइली के माध्यम से वक्ष वाहिनी में यात्रा करता है और अंततः, बाएं सबक्लेवियन नस 6 पर रक्त में शामिलहो जाता है। इस शारीरिक व्यवस्था के कारण, चिलोस लिम्फ पहले शरीर के बाकी हिस्सों के माध्यम से घूमने से पहले हृदय और फेफड़ों के माध्यम से यात्रा करता है। इसका मतलब यह है कि हृदय और फेफड़ों को मेसेंटेरिक लिम्फ7 में स्राव पर "पहला पास" मिलता है।

मेसेंटेरिक लसीका की एक प्रमुख भूमिका छोटी आंत 8,9,10 से आहार लिपिड का परिवहन है। शारीरिक रूप से, काइलोमाइक्रोन, आंतों की प्रतिरक्षा कोशिकाएं 11,12,13,14, आंत हार्मोन 15,16,17,18, एंटीजन 19,20,21, गैर-काइलोमाइक्रोन लिपोफिलिक यौगिक 22,23 , और अतिरिक्त तरल पदार्थ एंटरोसाइट तहखाने झिल्ली को अंतर्निहित लैक्टियल्स में प्रवेश करता है और फिर लसीका केशिकाओं के माध्यम से मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में केंद्रित होता है। मेटाबोलाइट्स, एंटीजन, पर्यावरणीय संदूषक, पोषक तत्व और सिग्नलिंग अणुओं सहित कई अज्ञात मेसेंटेरिक लसीका घटक होने की संभावना है।

मेसेंटेरिक लिम्फ के घटकों को व्यवस्थित रूप से पहचाना नहीं गया है, मोटे तौर पर मेसेंटेरिक लिम्फ को अलग करने की कठिनाई के कारण। मेसेंटेरिक लिम्फ तक पहुंचना हमेशा एक गंभीर चुनौती रही है क्योंकि लिम्फ नलिकाएं रंगहीन होती हैं, और फैटी भोजन के बाद जब वे चिलौस और दूधिया हो जाते हैं, तो मेसेंटेरिक लसीका में रंगहीन लसीका द्रव 6,8,9,10 होता है।

आंतों के लसीका को अलग करने के लिए वर्तमान और सामान्य तरीके
मेसेंटेरिक लिम्फ को मनुष्यों में एक्सेस नहीं किया जा सकता है (दुर्लभ और चरम परिस्थितियों को छोड़कर जहां गंभीर जीआई आघात हुआ है)24। विवो लिम्फ संग्रह शल्य चिकित्सा से जटिल और मांग है। मूल 2 दिवसीय लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया को बोलमैन एट अल .25 द्वारा वर्णित किया गया था और पिछले 45 वर्षों26,27 के लिए पैट्रिक त्सो की प्रयोगशाला द्वारा सुधार और पेशेवर बनाया गया है। लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया जांचकर्ताओं को 6 घंटे के ग्रहणी लिपिड जलसेक अवधि के दौरान सचेत जानवरों से बहते हुए लिम्फ को इकट्ठा करने की अनुमति देती है।

लिम्फ फिस्टुला मॉडल का उपयोग मुख्य रूप से चूहों में लिम्फ प्रवाह दर, ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल (या अन्य ग्रहणी-संक्रमित यौगिकों), काइलोमाइक्रोन संरचना और आंतों के हार्मोन सांद्रता को मापने के लिए किया गया है। कुछ हद तक, इस तकनीक का उपयोग चूहों में भी किया जा सकता है, हालांकि सर्जिकल अस्तित्व और लिम्फ की मात्रा पीड़ित है। मेसेंटेरिक लिम्फ नलिकाओं को देखने में कठिनाइयों के कारण, ऐतिहासिक तरीकों में मिनी-सूअर28, भेड़29, सूअर30, कुत्ते31 और चूहों17 जैसे बड़े जानवरों में मेसेंटेरिक लिम्फ शामिल हैं। इन बड़े मॉडलों के साथ काम करना संसाधन गहन है और नॉक-इन या नॉक-आउट मॉडल में अध्ययन की अनुमति नहीं देता है।

वैकल्पिक दृष्टिकोण का भी उपयोग किया गया है। काइलोमाइक्रोन को पोस्ट-प्रांडियल अवस्था में रक्त से अलग किया जा सकता है (हालांकि इन्हें प्लाज्मा लिपोप्रोटीन लाइपेस द्वारा आंशिक रूप से हाइड्रोलाइज्ड किया जाएगा) 32,33,34,35। थोरैसिक वाहिनी को भी कैनुला किया जा सकता है, हालांकि वहां एकत्र किए गए लिम्फ में मेसेंटेरिक लिम्फ और अतिरिक्त आंतों के लिम्फ जल निकासी26,36 का मिश्रण होता है। विट्रो में, कैको -2 कोशिकाएं फैटी एसिड उपचार के जवाब में एक काइलोमाइक्रोन जैसे कण का स्राव करती हैं, और इन कोशिकाओं को प्रासंगिक लसीका एंडोथेलियल या संवहनी कोशिकाओं37,38 के साथ सह-सुसंस्कृत किया जा सकता है। मानव और माउस आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को एपिकल लिपिड को संसाधित करने और काइलोमाइक्रोन 39,40,41,42 का स्राव करने के लिए दिखाया गया है। ये मॉडल अत्यधिक लाभप्रद हैं और छोटी आंतों के शरीर विज्ञान में यंत्रवत अंतर्दृष्टि को सक्षम करते हैं, लेकिन वे जटिलता, फिजियो-रासायनिक ग्रेडिएंट, या सीटू मेसेंटेरिक लसीका के गतिशील लिम्फ प्रवाह को दोहरा नहीं सकते हैं।

यहां प्रस्तुत 1 दिन माउस लिम्फ फिस्टुला मॉडल के लाभ
आंतों के लिपोप्रोटीन को अलग करने के इन अन्य तरीकों के संबंध में, त्सो लैब लिम्फ फिस्टुला तकनीक को पारंपरिक रूप से मेसेंटेरिक लिम्फ में आहार पोषक तत्वों के अवशोषण को मापने के लिए स्वर्ण-मानक तकनीक माना जाता है। विवो तकनीक में यह आहार लिपिड अवशोषण के प्रमुख शारीरिक पहलुओं को पकड़ने का लाभ है- अवशोषण अवधि में यौगिकों की गतिशील उपस्थिति, जिसके लिए ग्रहणी पोषक तत्वों के साथ जीवित जानवरों में बहने वाले मेसेंटेरिक लिम्फ के बार-बार नमूने की आवश्यकता होती है। यह सर्जिकल तकनीक रक्त के बजाय सीधे अपने शारीरिक डिब्बे में आंत हार्मोन और साइटोकिन्स को मापती है, जहां वे पतला और एंजाइमेटिक रूप से अवक्रमितहोते हैं।

यदि प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए लिपिड स्राव गतिशीलता या किसी भी हाइड्रोफोबिक जीआई यौगिक या दवा के गतिशील अवशोषण और चयापचय की समझ की आवश्यकता होती है, तो यह तकनीक न केवल उपयुक्त है, बल्कि एकमात्र दृष्टिकोण भी है जो समीपस्थ से डिस्टल आंत (पेट से बृहदान्त्र) और एपिकल से बेसोलेटरल सतह तक ल्यूमिनल सामग्री के आंदोलन को इंटरपोलेट करता है (एंटरोसाइट से लैक्टेल्स और पोर्टल परिसंचरण के माध्यम से ल्यूमिनल सामग्री)। चूंकि यह तकनीक इंट्राडोडेनल कैथेटर के माध्यम से पोषक तत्वों के ल्यूमिनल वितरण को नियोजित करती है, और क्योंकि बहने वाले मेसेन्टेरिक लिम्फ को मोड़ दिया जाता है और एकत्र किया जाता है, पूरा अवशोषण तंत्र प्रयोगात्मक नियंत्रण में है और इसका उपयोग गुणात्मक रूप से छोटे आंतों के अवशोषण प्रोफाइल का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

पहली बार यहां नेत्रहीन रूप से प्रस्तुत त्सो लैब लिम्फ फिस्टुला मॉडल का एक प्रमुख अपडेट है, जो (1) प्रयोगात्मक समय को 1 दिन के सर्जिकल आरोपण और प्रयोगात्मक संग्रह अवधि तक कम कर देता है; (2) माउस अस्तित्व और पशु कल्याण विचारों में सुधार; और (3) माउस आनुवंशिक मॉडल की शक्ति का दोहन करने के लिए चूहों में दृष्टिकोण की प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है। इस तकनीक को आंतों के स्राव, लिपोप्रोटीन, या आहार लिपिड अवशोषण के सभी प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए एक स्वर्ण मानक माना जाना चाहिए और लिपिड अवशोषण कैनेटीक्स और काइलोमाइक्रोन के उच्च निष्ठा निर्धारण के लिए सबसे अच्छी तकनीक है।

Protocol

सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय आंतरिक पशु देखभाल और उपयोग समिति [प्रोटोकॉल # 20047008] द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड का अनुपालन किया गया था। सी 57बीएल 6 / जे नर चूहों, 8-14 सप्ताह की उम्र, वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था। चूहों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। सभी चूहों को मानक चाउ और पानी तक पहुंच के साथ 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र पर रखा गया था।

1. जानवरों की तैयारी

  1. प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, चूहों को खिलाएं या उन्हें उपवास करने की अनुमति दें।
    नोट: रात भर उपवास अनावश्यक है जब तक कि पेट खाली होने की दर में अंतर के बारे में चिंताएं न हों।
  2. 5% आइसोफ्लुरेन गैस द्वारा संज्ञाहरण को प्रेरित करें और पूंछ और पैर की अंगुली की चुटकी द्वारा उचित एनेस्थेटाइजेशन सुनिश्चित करें। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, चूहों को 2% -3% आइसोफ्लुरेन गैस के साथ एक उचित एनेस्थेटिक प्लेन में रखें और उन्हें सर्जिकल प्लेटफॉर्म पर टेप के साथ रखें।
  3. चूहों को एक गर्म सर्जिकल प्लेटफॉर्म पर गर्म रखें जो गर्म पानी का उपयोग करता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

2. सर्जरी और प्रयोगात्मक डिजाइन

  1. आंखों पर पशु चिकित्सक मलहम लगाकर, पेट को शेविंग करके और सर्जिकल साइट पर एंटीसेप्टिक सर्जिकल स्क्रब ( सामग्री की तालिका देखें) लगाकर सर्जरी शुरू करें। यह चीरा को निष्फल करता है और मध्य रेखा चीरा के दौरान हवाई फर की पीढ़ी को कम करता है।
  2. बाँझ उपकरणों, ड्रेप्स, और आवश्यक अन्य उपकरणों और आपूर्ति का उपयोग करके एक बाँझ कार्य क्षेत्र बनाए रखें।
  3. 5 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर दर्द से राहत (यानी) के लिए कारप्रोफेन की पहली खुराक (सामग्री की तालिका देखें) इंजेक्ट करें।
  4. चिमटी से त्वचा को पकड़ें और छोटी कैंची से मध्य रेखा पेट का चीरा लगाएं। उरोस्थि की ओर काटें (ऊपर कभी नहीं) और इंगुइनल वसा में कटौती करें। फिर, कैंची का उपयोग करके मांसपेशियों की परत को अलग से काटें।
    नोट: उपयोग से पहले सभी उपकरणों को निष्फल करें।
  5. रिट्रैक्टर का उपयोग करके, पेरिटोनियल विसरा को रास्ते से बाहर ले जाएं जब तक कि लिम्फ वाहिनी दिखाई न दे।
  6. एक खारा-भिगोया हुआ क्यू-टिप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, यकृत को शरीर के ऊपरी-दाईं ओर और आंतों और पेट को जानवर के बाईं ओर ले जाएं।
  7. ग्रहणी को बाईं ओर फैलाएं ताकि बेहतर मेसेंटेरिक धमनी और आंतों के लिम्फ वाहिनी को उजागर किया जा सके।
  8. कैनुला टयूबिंग में एक कुंद सुई डालकर कैनुला टयूबिंग की 30-40 सेमी लंबाई तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके ट्यूब के माध्यम से हेपरिन (1,000 यू / एल) की थोड़ी मात्रा को फ्लश करें।
    नोट: लिम्फ प्रवाह को बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज संग्रह ट्यूबों में नीचे और बहने के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा सहायता प्रदान की जाती है। संग्रह बर्फ की बाल्टी सर्जिकल सेटअप के निकट कहां स्थित है, इसके आधार पर, कैनुला ट्यूबिंग की लंबाई को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  9. कैनुला टयूबिंग के सिरे पर बेवेल काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  10. छोटी आंत में इसकी उपस्थिति से लगभग 5 मिमी की दूरी पर लिम्फ वाहिनी में आईरिस कैंची (सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक उथला चीरा लगाएं।
  11. कैनुला ट्यूबिंग को महीन बल की एक जोड़ी के साथ पकड़ें और धीरे से नोक को नलिका में डालें।
    नोट: कैनुला को वाहिनी में बहुत दूर नहीं धकेलना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह लिम्फ प्रवाह को रोक सकता है जब वापस लिए गए अंगों को उनकी मूल स्थिति में वापस कर दिया जाता है।
  12. कैथेटर को सीवन के साथ बांधने से जुड़े जोड़तोड़ के लिए लिम्फ डक्ट बहुत नाजुक है। इसके बजाय, मेसेंटेरिक लिम्फ वाहिनी में लिम्फ कैनुला को गोंद करने के लिए साइनोएक्रिलेट गोंद ( सामग्री की तालिका देखें) की एक बूंद का उपयोग करें।
  13. दूधिया, सफेद लिम्फ (यदि पूर्व-सर्जरी जैतून का तेल गैवेज का उपयोग किया गया था) या स्पष्ट लिम्फ (यदि चूहों ने पूर्व-सर्जरी की है) की जांच करें जो लिम्फ फिस्टुला कैनुला के माध्यम से तुरंत बहना शुरू हो जाता है।
    नोट: जांचें कि लिम्फ कैनुला सफलतापूर्वक रखा गया है और लिम्फ बह रहा है; इंट्राडोडेनल कैनुला प्लेसमेंट के साथ जारी रखें।
  14. 18 ग्राम सुई का उपयोग करके, पेट के पाइलोरिक क्षेत्र के माध्यम से पाइलोरिक स्फिंक्टर के पीछे एक छेद को पंचर करें।
  15. पेट में उस छेद के माध्यम से डुओडेनल इन्फ्यूजन ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) को डुओडेनम में पाइलोरिक स्फिंक्टर से लगभग 1-2 मिमी तक डालें।
  16. रिसाव को रोकने के लिए पेट में सुई के साथ रेशम 5-0 सीवन ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके पर्स-स्ट्रिंग लिगेचर द्वारा सुरक्षित करें और रिसाव को रोकने के लिए साइनोएक्रिलेट गोंद की एक बूंद के साथ सील करें।
  17. 0.3 एमएल / घंटा पर 5% ग्लूकोज-0.9% खारा का इंट्राडोडेनल इन्फ्यूजन शुरू करें।
    नोट: शरीर के वजन में छोटे भिन्नता वाले चूहों का उपयोग करते समय जो लगभग 25 ग्राम (~ 8 सप्ताह की उम्र) हैं, ग्लूकोज / खारा का 0.3 एमएल / एच जलसेक उपयुक्त है। यदि चूहे नाटकीय रूप से बड़े हैं, तो शरीर के वजन और रक्त की मात्रा में परिवर्तन के लिए जलसेक दर को ऊपर की ओर समायोजित किया जाना चाहिए।
  18. शरीर की गुहा और सीवन (5-0) में अंगों को मांसपेशियों और त्वचा के ऊतकों को अलग-अलग बदलें।
    नोट: लिम्फ कैनुला और इंट्राडोडेनल फीडिंग ट्यूब दोनों को एक ही चीरा के माध्यम से बाहर निकाला जाता है। ट्यूबों को सीवन के साथ अलग करने के लिए कोई प्राथमिकता नहीं है और ट्यूबों के बाहरीकरण के कोण के लिए कोई प्राथमिकता नहीं है।
  19. सर्जरी के बाद लेकिन एनेस्थेटिक की वापसी से पहले, गतिशीलता को सीमित करने के लिए चूहों को धीरे से स्नूगल संयम ( सामग्री की तालिका देखें) में रखें।
    नोट: स्नूगल संयम चूहों को टांके और टयूबिंग पर चबाने के लिए सिर को पकड़ने या घुमाने से रोकता है।
  20. फिर, चूहों को कोमल रॉकिंग के साथ एक घूर्णन पर एक स्पष्ट प्लेक्सीग्लास बॉक्स में रखें, और कंटेनमेंट बॉक्स के किनारे पर तापमान-नियंत्रित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उभयचर / सरीसृप हीटिंग पैड का उपयोग करके गर्म करें। नियंत्रण बॉक्स के कोनों पर बाँझ विआयनीकृत पानी के कंटेनरों के रूप में आर्द्रीकरण भी प्रदान करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  21. आइसोफ्लुरेन वापस लेने से 30 मिनट पहले, चूहों को उनकी दूसरी दर्द राहत खुराक (बुप्रेनेक्स, 0.1 मिलीग्राम / किग्रा, यानी) का प्रशासन करें।
  22. प्रयोग के आधार पर, चूहों को 1 घंटे के लिए 0.3 एमएल / घंटा की दर से 5% ग्लूकोज -0.9% खारा का निरंतर इंट्राडोडेनल जलसेक प्रदान करें।
    नोट: 5% ग्लूकोज -0.9% खारा घोल फार्मेसी से एक बाँझ खारा बैग (मानव उपयोग के लिए, पीएच 7.4) और बाँझपन के लिए सख्त दिशानिर्देशों का पालन करते हुए 50% डेक्सट्रोज के मानव उपयोग के लिए एक बाँझ बोतल का उपयोग करके तैयार किया जाता है। घोल को ताजा बनाया जाना चाहिए और यदि खारा बैग या डेक्सट्रोज बोतल पर प्रदान की गई समाप्ति तिथियों से पहले छोड़ दिया जाता है।
  23. तालिका 1 में सूचीबद्ध लिपिड में से एक के साथ चूहों को एक इंट्राडोडेनल कैनुला के माध्यम से एक प्रयोगात्मक लिपिड के रूप में प्रशासित करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: चित्रा 1 में दिखाए गए सभी आंकड़ों के लिए, एसएमओएफलिपिड (20% लिपिड इंजेक्टेबल इमल्शन, यूएसपी, सामग्री की तालिका देखें) इंट्राडुओडेनल रूप से संक्रमित किया गया था। यह जलसेक प्री-और पोस्ट-इंट्राडोडेनल लिपिड बोलस दोनों लिम्फ वाहिनी के माध्यम से खोए हुए तरल पदार्थ को प्रतिस्थापित करता है और एक पूर्ण आवश्यकता है। चूहे अब एक प्रयोगात्मक लिपिड खुराक के साथ संक्रमित होने के लिए तैयार हैं।
  24. इंट्रा-डुओडेनल इन्फ्यूजन ट्यूब के माध्यम से 0.3 एमएल लिपिड इमल्शन बोलस (एसएमओएफलिपिड 20% लिपिड इंजेक्टेबल इमल्शन, यूएसपी) के क्लासिक लिपिड इन्फ्यूजन का प्रदर्शन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  25. इंट्राडोडेनल लिपिड के बोलस इन्फ्यूजन के बाद, प्रयोग के अंत तक लगातार 0.3 एमएल / घंटा पर जलसेक को 5% ग्लूकोज-0.9% खारा पर वापस स्विच करें।
  26. 60 मिनट के लिए पूर्व-वजन वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में लिम्फ के नमूने एकत्र करें और लिम्फ को बर्फ पर रखें। प्रत्येक 60 मिनट की अवधि में स्रावित होने वाले लिम्फ के वजन को स्थापित करने के लिए ट्यूबों को दूसरी बार तौलें।
    नोट: 0.3 एमएल लिपिड बोलस के बाद ~ 6 घंटे में प्रति माउस प्रति घंटे लगभग 50-300 μL लिम्फ एकत्र करने की उम्मीद है।
  27. लिपिड जलसेक के बाद लिम्फ 6 घंटे तक प्रवाहित हो सकता है। 6 घंटे के समय बिंदु पर, आइसोफ्लुरेन और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से चूहों को इच्छामृत्यु करें।
    नोट: प्रयोग के दौरान जानवरों की निगरानी के लिए एक सर्जन और / या लैब तकनीशियन मौजूद होना चाहिए। अवलोकन के दौरान, लसीका जल निकासी में थक्कों और पशु व्यवहार में परिवर्तन की तलाश करें जो दर्द / संकट का संकेत देते हैं। यदि प्रयोग के दौरान किसी भी बिंदु पर लिम्फ वाहिनी बंद हो जाती है, तो प्रयोग समाप्त हो जाता है, और जानवर को इच्छामृत्यु दी जाती है। जानवर को तकनीकी रूप से सर्जरी के बाद 24 घंटे तक जीवित रखा जा सकता है (आईएसीयूसी उत्तरजीविता सर्जरी नियमों के अनुसार)। हालांकि, जीवित रहने की दर समय के साथ कम हो जाती है, और 6 घंटे एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जीवित रहने की अवधि है जहां लिपिड अवशोषण अभी भी विवो फिजियोलॉजी की नकल करता है, और जानवर अस्तित्व के साथ संघर्ष नहीं कर रहा है।
  28. इच्छामृत्यु के बाद टर्मिनल ऊतक संग्रह करें (चरण 3.1)।
    नोट: सर्जरी के बाद 6-घंटे या 24-एच के लिए रखे गए चूहों में आहार लिपिड अवशोषण प्रोफाइल में अंतर हाल ही मेंपरीक्षण किया गया था। हमने पाया कि 24-एच प्रक्रिया पशु जीवित रहने की दर और लिम्फ में आहार लिपिड के भ्रमण को कम करती है। इन कारणों से, हम दृढ़ता से 6-एच दृष्टिकोण की सिफारिश करते हैं। यह अद्यतन सर्जिकल डिजाइन अनावश्यक पशु मृत्यु और पोस्टसर्जिकल अवधि में पशु संकट की संभावना को कम करता है। यह प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के लिए अमेरिकन एसोसिएशन के एक प्रमुख लक्ष्य का समर्थन करता है, जो पशु "प्रतिस्थापन, कमी, शोधन" है [रेफरी पीएमआईडी: 21595115]।

3. ल्यूमिनल सामग्री और म्यूकोसल ऊतक का संग्रह

  1. 6 घंटे लिपिड इन्फ्यूजन अवधि के अंत में, आइसोफ्लुरेन और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से चूहों का बलिदान करें। ल्यूमिनल सामग्री के रिसाव से बचने के लिए पेट, छोटी आंत और सीकुम के दोनों सिरों को 5-0 सीवन के साथ बांधें।
  2. पेट, सेकुम और बृहदान्त्र को इकट्ठा करें, और प्रत्येक को 15 एमएल ग्लास ट्यूब में रखें। छोटी आंत को तीन या चार खंडों में विभाजित करें, और खुले अनुदैर्ध्य रूप से काटने के बाद ऊतक को 2-3 एमएल ठंडे पीबीएस में धोकर ल्यूमिनल सामग्री एकत्र करें।
  3. आंतों के श्लेष्म को हटा दें जिसमें उपकला कोशिकाएं और संबद्ध लैमिना प्रोप्रिया शामिल हैं, प्रत्येक खंड को एक घुमावदार चिमटी के साथ 2-3 एमएल ठंडे पीबीएस में स्क्रैप करके मांसपेशियों की परत से हटा दें।
  4. ग्लास ट्यूबों में सभी ऊतकों, ल्यूमिनल और म्यूकोसल आइसोलेट्स और मांसपेशियों की परत रखें और प्रत्येक ट्यूब में 2: 1 वॉल्यूम / वॉल्यूम सीएचसीएल3: एमईओएच के 8 एमएल जोड़ें।
  5. फोल्च निष्कर्षण45 के बाद तरल सिंटिलेशन गिनती और / या ट्राइग्लिसराइड परख किट (सामग्री की तालिका देखें) द्वारा रेडियोधर्मिता और / या लिपिड सांद्रता निर्धारित करें।

4. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी)

  1. एक संशोधित फोल्च निष्कर्षण45 के माध्यम से ल्यूमिनल और म्यूकोसल आइसोलेट्स के कुल लिपिड निकालें।
  2. निकाले गए लिपिड को नाइट्रोजन बाष्पीकरणकर्ता के तहत विलायक में सुखाएं और फिर उन्हें टीएलसी सिलिका जेल प्लेट पर लोड करने से पहले सीएचसीएल3: एमईओएच के 2: 1 वॉल्यूम / वॉल्यूम में पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. पेट्रोलियम ईथर, एथिल ईथर और ग्लेशियल एसिटिक एसिड (25: 5: 1 वॉल्यूम / वॉल्यूम / वॉल्यूम) की विलायक प्रणाली का उपयोग करके लिपिड को अलग करें। मानकों सहित विभिन्न लिपिड के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए आयोडीन वाष्प का उपयोग करें।
  4. फॉस्फोलिपिड, डाइग्लिसराइड्स, फैटी एसिड, ट्राइग्लिसराइड्स और कोलेस्ट्रॉल एस्टर के अनुरूप टीएलसी प्लेट पर धब्बों को अलग-अलग सिंटिलेशन शीशियों में स्क्रिप करें, इससे पहले कि सिंटिलेशन तरल पदार्थ के 4 एमएल को जोड़ा जाए ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. डेटा को कुल बोलस लिपिड खुराक के प्रतिशत के रूप में या प्रत्येक नमूने के लिए पाए गए कुल लिपिड के एक अंश के रूप में व्यक्त करें।

5. काइलोमाइक्रोन अलगाव और लक्षण वर्णन

  1. 6 घंटे के पोस्ट-लिपिड बोलस (चरण 2.29) से संयुक्त लिम्फ नमूनों को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, 0.9% NaCl (300-500 μL) के साथ मिश्रित करें, और फिर 0.87% NaCl (300-500 μL) की उचित मात्रा के साथ सावधानीपूर्वक ओवरले करें।
    1. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ( सामग्री की तालिका देखें) 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 110,000 x g पर नमूने। पृथक काइलोमाइक्रोन युक्त शीर्ष अंश एकत्र करें और उन्हें एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए काइलोमाइक्रोन ट्राइग्लिसराइड, कोलेस्ट्रॉल और एपीओबी सांद्रता निर्धारित करें।
    1. ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल परख किट का उपयोग करके ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल सांद्रता निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. संक्षेप में, 96-वेल प्लेट में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 μL एंजाइम अभिकर्मक के साथ नमूने के 2 μL को इनक्यूबेट करें। ट्राइग्लिसराइड के लिए 500 एनएम और कोलेस्ट्रॉल के लिए 600 एनएम पर प्लेट रीडर का उपयोग करके प्लेट पढ़ें।
      नोट: सांद्रता की गणना के लिए मानकों और रिक्त स्थान का उपयोग किया गया था। एपीओबी सांद्रता माउस एपोबी एलिसा किट का उपयोग करके निर्धारित की गई थी ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. काइलोमाइक्रोन कण आकार निर्धारित करें।
    1. टीईएम इमेजिंग के लिए लगभग 40 मिलीग्राम / डीएल की ट्राइग्लिसराइड सांद्रता पर ताजा काइलोमाइक्रोन नमूनों का उपयोग करें। संक्षेप में, प्रत्येक नमूने के 5-10 μL को TEM ग्रिड पर रखें और सूखा दें।
    2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ ग्रिड की जांच करें और छवियों को कैप्चर करें। लिपोप्रोटीन कण आकार को मापें और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

Representative Results

चित्रा 2 मेसेंटेरिक लिम्फ में ट्राइग्लिसराइड स्राव और सबसे हालिया एन = 17 जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों में औसत लिम्फ प्रवाह दर को दर्शाता है जो यहां वर्णित एकल-दिवसीय लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया से गुजरते हैं। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, लिम्फ में ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता एसएमओएफलिपिड के 300 μL के इंट्राडोडेनल बोलस के जवाब में बढ़ जाती है। पीक ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता ~ 2-3 घंटे पोस्ट-बोलस पर पहुंच जाती है और 6 घंटे के समय (इच्छामृत्यु से तुरंत पहले) के माध्यम से लगातार कम हो जाती है। ट्राइग्लिसराइड स्राव के समानांतर, प्रयोग के अंत तक टाइम 0 बोलस इन्फ्यूजन से लिम्फ प्रवाह दर बढ़ जाती है (चित्रा 2 बी)।

इन परिणामों से पता चलता है कि मेसेन्टेरिक लिम्फ डक्ट और इंट्राडोडेनल कैनुला दोनों का सर्जिकल आरोपण हुआ है और एक सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधि है जिसके लिए अन्य लसीका सामग्री (हार्मोन, पेप्टाइड्स, पोषक तत्व) को बेंचमार्क किया जा सकता है। यदि बोलस इंट्राडोडेनल लिपिड के जवाब में लिम्फ में ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता में कोई बदलाव नहीं होता है, तो यह संकेत देता है कि सर्जरी ने छोटी आंत को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचाया है ताकि लिपिड अवशोषण क्षमता अनुपस्थित हो, या, पहले से अनफेनोटाइप आनुवंशिक मॉडल में, यह सुझाव देगा कि माउस में लिपिड अवशोषण में दोष है जो शारीरिक रूप से सार्थक है।

Figure 1
चित्रा 1: लिम्फ फिस्टुला माउस मॉडल के लिए प्रस्तावित समयरेखा। टी -4, टी -3, टी -2: डबल-कैनुलाशन में लगभग 2-4 घंटे लगते हैं, इसके बाद चूहों को रिकवरी कक्षों में रखा जाता है। टी -1: एक बार जब चूहे वसूली अवधि में होते हैं, तो उन्हें 5% ग्लूकोज -0.9% खारा का निरंतर ग्रहणी जलसेक प्राप्त होता है। टी 0: निरंतर इंट्राडोडेनल जलसेक को 5% ग्लूकोज -0.9% खारा से प्रयोगात्मक पोषक तत्वों के जलसेक में बदल दिया जाता है। टी 0-टी 6: चूहों को खारा या वैकल्पिक रूप से, निरंतर पोषक तत्वों में निरंतर इंट्राडोडेनल 5% ग्लूकोज प्राप्त होता है। इस अवधि के दौरान लिम्फ प्रति घंटा एकत्र किया जाता है। समापन बिंदु: चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है, और ऊतकों को एकत्र किया जा सकता है। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मेसेंटेरिक लिम्फ ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता और प्रवाह दर। जंगली प्रकार के चूहों को एक इंट्राडोडेनल फीडिंग ट्यूब और एक मेसेंटेरिक लिम्फ कैनुला के साथ फिट किया गया था। चूहों को लिपिड के 300 μL का बोलस जलसेक प्राप्त हुआ। लिम्फ को प्रति घंटा एलिकोट में 6 घंटे के लिए एकत्र किया गया था और बर्फ पर रखा गया था। (ए) लिम्फ ट्राइग्लिसराइड सामग्री लिम्फ के प्रत्येक प्रति घंटा एलिकोट में एक रासायनिक परख द्वारा निर्धारित की गई थी। (बी) बोलस जलसेक के बाद 6 घंटे में, लिम्फ प्रवाह को प्रति घंटे स्रावित लिम्फ के ग्राम के रूप में प्लॉट किया जाता है। बिंदु SEM ± साधन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लिपिड वितरण के तरीके सिफारिशें/अनुदेश
मिश्रित लिपिड इमल्शन बोलस इंट्रा-डुओडेनल इन्फ्यूजन ट्यूब के माध्यम से (ए) लिपोसिन III 20% लिपिड इंजेक्टेबल या (बी) एसएमओएफलिपिड 20% लिपिड इंजेक्टेबल इमल्शन, यूएसपी की 0.3 एमएल खुराक का उपयोग किया जा सकता है। ये इमल्सीफाइड लिपिड उपयोगी होते हैं क्योंकि उन्हें पहले से तैयार करने की आवश्यकता नहीं होती है, कमरे के तापमान पर तरल होते हैं, बाँझ होते हैं, और क्योंकि उनमें मुक्त फैटी एसिड, ट्राइग्लिसराइड, फॉस्फोलिपिड्स और सोडियम टॉरोकोलेट का "आसानी से पचने योग्य" मिश्रण होता है। यह चूहों के लिए एक अच्छा स्टार्टर इन्फ्यूजन है जिसमें अग्नाशय या पित्त संबंधी अक्षमताएं हो सकती हैं।
ट्राइग्लिसराइड बोलस 0.3 एमएल धीरे-धीरे गर्म जैतून का तेल (या शुद्ध ट्राइओलिन) एक तटस्थ लिपिड के रूप में जो असंतृप्त वसा, लार्ड (उच्च संतृप्त वसा सामग्री वाले आहार का प्रतिबिंबित) या नारियल तेल (उच्च मध्यम श्रृंखला ट्राइग्लिसराइड सामग्री वाले आहार का प्रतिबिंबित) से समृद्ध आहार को दर्शाता है, सभी इंट्रा-डुओडेनल इन्फ्यूजन ट्यूब या मौखिक गैवेज द्वारा दिया जा सकता है। यदि प्रयोगात्मक ट्राइग्लिसराइड संतृप्त है, तो इसे कमरे के तापमान पर तरल होने के लिए गर्म किया जाना चाहिए।
मिश्रित भोजन बोलस 0.075 ग्राम वसा (21.6%), 0.5 ग्राम कार्बोहाइड्रेट (64.0%), और 0.1125 ग्राम प्रोटीन (14.4%) युक्त फॉर्मूलेशन के साथ सुनिश्चित करें और कम वसा वाले मिश्रित भोजन को दर्शाता है, जिसे इंट्रा-डुओडेनल इन्फ्यूजन के माध्यम से प्रशासित किया जा सकता है।
रेडियोलेबल लिपिड बोलस 0.3एमएल जैतून के तेल में 3 एच-लेबल ग्लिसरॉल ट्राइओलेट और / या 1.0 μCi 14C-कोलेस्ट्रॉल इंट्रा-डुओडेनल इन्फ्यूजन के माध्यम से दिया जा सकता है। 14 सी-कोलेस्ट्रॉल: कोलेस्ट्रॉल-[4-14 सी] 55Ci / mmol की विशिष्ट गतिविधि और 0.1 mCi / mL की एकाग्रता के साथ। 3 H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) 60Ci/mmol की विशिष्ट गतिविधि और 1mCi/mL की एकाग्रता के साथ
निरंतर खुराक 0.3 एमएल / एच (0.3 एमएल कुल बोलस के बजाय) की दर से उपरोक्त प्रयोगात्मक पोषक तत्वों में से किसी का भी जलसेक, लिम्फ में ट्राइग्लिसराइड का एक स्थिर उत्पादन होगा। यह एक बोलस जलसेक से भिन्न होता है, जहां लिम्फ में ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता ~ 2-3 घंटे पर चरम पर होती है, और फिर ~ 6-8 घंटे पर बेसलाइन सांद्रता में वापस आ जाती है।

तालिका 1: लिपिड इन्फ्यूजन की तालिका।

Discussion

मूल 2 दिवसीय लिम्फ फिस्टुला प्रक्रिया को बोलमैन एट अल .25 द्वारा वर्णित किया गया था और पिछले 45 वर्षों से पैट्रिक त्सो की प्रयोगशाला द्वारा अभ्यास किया गया था। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल छोटी आंत के अद्वितीय चिलोस स्राव की पहचान, मात्रा और समझने के लिए इस क्लासिक, सोने-मानक विधि के साथ-साथ आहार पोषक तत्व अवशोषण और चयापचय, आंत हार्मोन और आंतों की प्रतिरक्षा की विवो गतिशीलता के लिए एक शक्तिशाली अतिरिक्त है।

इस मॉडल के फायदों में (1) अवशोषण, पाचन या स्राव के दौरान एक समय बिंदु पर स्थिर नमूनाकरण के बजाय फीडिंग और पोस्ट-प्रांडियल अवधि के दौरान मेसेंटेरिक लिम्फ का लगातार नमूना लेने की क्षमता शामिल है; (2) आंत हार्मोन और साइटोकिन्स का माप रक्त के बजाय सीधे उनके शारीरिक डिब्बे में होता है, जहां वे पतला और एंजाइमेटिक रूप से अवक्रमितहोते हैं 17,44; (3) लिपिड भोजन के अंतर्ग्रहण और मेसेंटेरिक लिम्फ में एंडोथेलियल लाइपेस की अनुपस्थिति के बाद छोटी आंत द्वारा स्रावित लिपोप्रोटीन को अलग करने, मात्रा निर्धारित करने और चिह्नित करने की क्षमता, जो काइलोमाइक्रोन ट्राइग्लिसराइड सांद्रता और देशी काइलोमाइक्रोन संरचना46,47 को संरक्षित करता है; (4) सीधे लिम्फ प्रवाह दर, ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल (या अन्य ग्रहणी-संक्रमित यौगिकों), काइलोमाइक्रोन संरचना और आंतों के हार्मोन सांद्रता के उत्पादन को मापने की क्षमता। अंत में, यह प्रोटोकॉल 6 घंटे की अवधि में हर घंटे >50 μL लिम्फ की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा एकत्र करने की अनुमति देता है। चूंकि तरल पदार्थ को इंट्रा-डुओडेनल खारा और ग्लूकोज जलसेक के साथ फिर से भर दिया जाता है, इसलिए लिम्फ फिस्टुला मॉडल को अन्य लिम्फ नमूना तकनीकों पर काफी सुधार हुआ है और इसके परिणामस्वरूप मेसेंटेरिक लिम्फ के स्थिर पूल के बजाय प्रवाह होता है। चूंकि मात्रा लिपिडोमिक, प्रोटिओमिक और मेटाबोलिक दृष्टिकोण के लिए एक प्रमुख बाधा है, यह एक प्रमुख ताकत है।

यहां वर्णित 1 दिवसीय माउस लिम्फ फिस्टुला प्रोटोकॉल में मूल लिम्फ फिस्टुला प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं, जिसमें सर्जरी के बाद उच्च जीवित रहने की दर के कारण पहले वर्णित 2 दिन के लिम्फ फिस्टुला प्रोटोकॉल 26,27 से कुल प्रयोगात्मक पशु संख्या में कमी शामिल है; समग्र प्रयोगात्मक समय में 2 दिनों से एक दिन तक की कमी; और, अंत में, चूहों के लिए वसूली अवधि में रात भर (>18 घंटे) की कमी, जहां सफलता का दर्द या खराब पोस्ट-सर्जिकल परिणाम हो सकते हैं, सर्जरी के बाद की अवधि में अधिक प्रबंधनीय ~ 6 घंटे।

इस 1 दिवसीय प्रोटोकॉल की एक विशेषता मानवीय विचारों और समापन बिंदुओं पर ध्यान केंद्रित करना है। इन्हें सर्वोच्च प्राथमिकता लेनी चाहिए: (1) जानवरों को इंट्राडोडेनल या आईवी प्रतिस्थापन तरल पदार्थ प्राप्त करना चाहिए; (2) उन्हें गर्म और जितना संभव हो उतना दर्द मुक्त रखा जाना चाहिए (पोस्ट-ऑपरेटिव बुप्रेनेक्स और / या कारप्रोफेन के साथ, प्रयोगात्मक डिजाइन और विरोधी भड़काऊ प्रभावों से बचने की आवश्यकता पर निर्भर करता है); (3) रक्तस्राव, झटकों, दस्त, या संकट के संकेत सभी मानवीय समापन बिंदु के लिए सम्मोहक कारण हैं। सख्त आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद आइसोफ्लुरेन एक अच्छा समापन बिंदु है। सर्जिकल जीवित रहने की दर एक दिन के लिए ~ 70% है (मूल 2 दिन की सर्जरी के लिए ~ 40% की तुलना में), लेकिन जांचकर्ताओं को संकट के संकेत पर प्रयोग को समाप्त करने में संकोच नहीं करना चाहिए। पशु संख्या की योजना बनाते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए।

इस तकनीक के समस्या निवारण के संदर्भ में, लिम्फ कैनुला का सफल प्लेसमेंट इस शल्य चिकित्सा प्रक्रिया में प्रमुख बाधा है। सर्जरी का अभ्यास करते समय, यह सर्जरी से लगभग 2 घंटे पहले माउस को 0.3 एमएल जैतून के तेल के साथ गैवेज करने में मदद करता है। यह मेसेंटेरिक लिम्फ डक्ट में काइलोमाइक्रोन के स्राव का कारण बनेगा, जिससे यह "दूधिया" और अधिक दृश्यमान दिखाई देगा। मेथिलीन ब्लू का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन अक्सर दूधिया लिम्फ वाहिनी की तुलना में कम स्पष्ट होता है। यदि लिम्फ कैनुला के प्लेसमेंट और गोंद के साथ इसके प्लेसमेंट के बाद मेसेंटेरिक लिम्फ सफलतापूर्वक कैनुला के माध्यम से एक संग्रह पोत में बह रहा है, तो कोई ग्रहणी जलसेक ट्यूब के प्लेसमेंट के साथ आगे बढ़ सकता है। कभी-कभी, लसीका लगातार प्रवाहित नहीं हो सकता है लेकिन जब जानवर को घूर्णन तालिका पर रखा जाता है तो फिर से बहना शुरू हो सकता है। गंभीर रूप से, लिम्फ ट्यूबिंग के भीतर थक्कों के लिए देखें। लिम्फ डक्ट पर बैकफ्लो दबाव को रोकने के लिए इन्हें ट्यूबों से बाहर मालिश की जानी चाहिए।

ट्राइग्लिसराइड स्राव और लिम्फ प्रवाह दर के अलावा, इस तकनीक का उपयोग निम्नलिखित लिपिड अवशोषण कैनेटीक्स और काइलोमाइक्रोन विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है:

काइलोमाइक्रोन स्राव 45,48,49
वसा युक्त भोजन के तुरंत बाद, प्लाज्मा ट्राइग्लिसराइड को प्रसारित करने में क्षणिक वृद्धि होती है। चूंकि ट्राइग्लिसराइड्स स्वाभाविक रूप से हाइड्रोफोबिक हैं, इसलिए उन्हें पहले रक्त50 में घुलनशील होने के लिए इमल्सीफाइड किया जाना चाहिए। छोटे आंतों के एंटरोसाइट्स इस भूमिका को पूरा करते हैं और आहार ट्राइग्लिसराइड को काइलोमाइक्रोन इमल्शनकणों में पैकेज करते हैं। काइलोमाइक्रोन में उनके कोर में कोलेस्ट्रॉल और आहार ट्राइग्लिसराइड होता है, जो फॉस्फोलिपिड्स और एपोलिपोप्रोटीन से घिरा होता है, जिसमें एपीओबी -48, एपीओए-आई, एपीओए-IV और एपीओसी -3 52,53,54,55 शामिल हैं। एपीओबी -48 आवश्यक संरचनात्मक प्रोटीन है, और अन्य एपोलिपोप्रोटीन में काइलोमाइक्रोन चयापचय और रक्त से निकासी के लिए आवश्यक विभिन्न कार्य हैं। काइलोमाइक्रोन की प्रमुख विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए, उनके ट्राइग्लिसराइड और एपोलिपोप्रोटीन सामग्री सहित, यहां दिखाए गए 1 दिन की लिम्फ फिस्टुला तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। काइलोमाइक्रोन स्राव दर संक्रमित 3एच-ट्राइग्लिसराइड का प्रतिशत है जो लिम्फ में स्रावित होता है और प्रति घंटा लिम्फ नमूनों की गिनती करके सिंटिलेशन द्वारा मापा जाता है। इसे विस्तृत काइलोमाइक्रोन लक्षण वर्णन 48,49,56,57,58 के साथ जोड़ा जा सकता है। प्रति घंटा लिम्फ नमूने को जोड़ा जा सकता है या अलग रखा जा सकता है। लिम्फ को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है, 0.9% एनएसीएल के साथ मिलाया जाता है, और फिर 0.87% एनएसीएल के 300-500 μL के साथ सावधानीपूर्वक ओवरलेड किया जाता है। नमूने तब 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 110,000 x g पर अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूज किए जाते हैं। पृथक काइलोमाइक्रोन युक्त शीर्ष अंशों को ट्राइग्लिसराइड परख किट का उपयोग करके ट्राइग्लिसराइड सांद्रता के लिए एकत्र और परीक्षण किया जाता है। संक्षेप में, काइलोमाइक्रोन (1: 10 तनुकरण) के 2 μL को 96-वेल प्लेट में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 μL एंजाइम अभिकर्मक के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। प्लेट को 500 एनएम पर एक प्लेट रीडर द्वारा पढ़ा जाता है, और ट्राइग्लिसराइड सांद्रता की गणना के लिए मानकों और रिक्त स्थान का उपयोग किया जाता है। काइलोमाइक्रोन आकार तब नकारात्मक धुंधलापन और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 14,29 द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल को एलिसा किट या वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा रासायनिक परख और एपोलिपोप्रोटीन सामग्री (एपीओबी -48, ए-आई, सी-2, सी-III) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

लिपिड अवशोषण की प्राथमिक साइट का निर्धारण48,59
3एच-ट्राइग्लिसराइड या रेडियो-लेबल मिश्रित भोजन के जलसेक के बाद 6 घंटे में ग्रहणी, जेजुनम और इलियम के ल्यूमिनल और एपिथेलियल सेल डिब्बों को अलग करके, सामग्री को यह निर्धारित करने के लिए निकाला जाता है कि 3एच-ट्राइग्लिसराइड का कितना हिस्सा उपकला कोशिका झिल्ली (सामान्य) में अवशोषित होता है या छोटी आंत48 की लंबाई के साथ लुमेन (असामान्य) में बरकरार रहता है। . ये अध्ययन विशेष रूप से प्रभावशाली हैं यदि जीआई गतिशीलता60,61,62 में संभावित अंतर हैं, यदि पित्त एसिड (लिपिड अवशोषण के दौरान अत्यधिक सक्रिय और स्वयं इलियम में पुन: अवशोषित) के बारे में एक परिकल्पना है) 63,64,65,66, या यदि चिंता है कि पोषक तत्व गलत शारीरिक स्थान (इलियम या यहां तक कि बृहदान्त्र) में अवशोषित हो रहे हैं। 68,69,70.

अवशोषक उपकला कोशिकाओं में 3 एच-ट्राइग्लिसराइड तस्करी के तंत्र की पहचान करना 48
यह आंतों के लुमेन में 3एच-ट्राइग्लिसराइड हाइड्रोलाइज्ड से 3एच-फ्री फैटी एसिड के प्रतिशत की गणना करके किया जाता है, म्यूकोसा में अवशोषित होता है, और काइलोमाइक्रोन के रूप में स्राव से पहले इंट्रासेल्युलर 3एच-ट्राइग्लिसराइड में फिर से एस्टरिफाइड होता है। स्राव दोषों का यह एक शक्तिशाली मार्कर है क्योंकि इसे इसके टूटने वाले उत्पादों में आहार ट्राइग्लिसराइड की गति और बाद में काइलोमाइक्रोन में पैकेजिंग दिखाने के लिए पता लगाया जा सकता है। फैटी एसिड अवशोषण मशीनरी (सीडी 36, एफएबीपी, एसीएसएल), पुन: एस्टरीफिकेशन मार्ग (एमजीएटी, डीजीएटी, एमटीटीपी, एपीओबी), और एपोलिपोप्रोटीन (एपीओसी -3, बी -48, सी -2, ए -1, ए -4) की एमआरएनए अभिव्यक्ति को आरटी-पीसीआर द्वारा आगे मात्रात्मक किया जा सकता है।

इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोग केवल आंत-अंग क्रॉसटॉक, चयापचय, प्रतिरक्षा, पोषक तत्व अवशोषण, पर्यावरणीय आहार संदूषक, या जीआई प्रणाली में भूमिका के साथ किसी अन्य बीमारी में रुचि से सीमित हैं। यह संभावना है कि महत्वपूर्ण मेसेंटेरिक लिम्फ सिस्टम तक पहुंचने में कठिनाई के कारण कई सम्मोहक प्रयोगों और परिकल्पनाओं को रोक दिया गया है, और इस विज़ुअलाइज़ किए गए प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस तकनीक को अधिक आसानी से उपलब्ध कराना है। काइलोमाइक्रोन और मेसेंटेरिक लिम्फ को अलग करना जिसमें वे शुरू में रहते हैं, पूरे शरीर के चयापचय को समझने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है; 1 दिन माउस लिम्फ फिस्टुला मॉडल इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली शारीरिक मॉडल है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इन अध्ययनों के समर्थन के लिए सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (पायलट और व्यवहार्यता पुरस्कार 1810, एबीके), रेनिन फाउंडेशन (सिनर्जी अवार्ड, पीआई जीजे रैंडोल्फ और को-आई एबीके), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर01डीके118239, आर03डीके116011 से एबीके) के लिए बेहद आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

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जीव विज्ञान अंक 189
आहार लिपिड अवशोषण और काइलोमाइक्रोन स्राव के विवो कैनेटीक्स में मात्रा निर्धारित करने के लिए चूहों <em>में</em> बहते मेसेन्टेरिक लिम्फ का अलगाव
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Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

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