Summary
Yanık hasarı ve enfeksiyonunun klinik senaryosunu taklit eden bir model, yanık araştırmalarını ilerletmek için gereklidir. Mevcut protokol, insanlardakiyle karşılaştırılabilir basit ve tekrarlanabilir bir sıçan yanığı enfeksiyon modeli göstermektedir. Bu, yeni topikal antibiyotik tedavileri geliştirmek için yanık ve yanık sonrası enfeksiyonların incelenmesini kolaylaştırır.
Abstract
Yanık indüksiyon metodolojileri sıçan modellerinde tutarsız bir şekilde tanımlanmıştır. Klinik senaryoyu temsil eden tek tip bir yanık yara modeli, tekrarlanabilir yanık araştırması yapmak için gereklidir. Mevcut protokol, sıçanlarda ~% 20 toplam vücut yüzey alanı (TBSA) tam kalınlıkta yanıklar oluşturmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem tanımlamaktadır. Burada, yanık yaralanmasını indüklemek için sıçan derisi yüzeyine bir su banyosunda 97 ° C'de ısıtılan22.89 cm2 (5.4 cm çapında) bakır çubuk uygulanmıştır. Yüksek ısı iletkenliğine sahip bir bakır çubuk, tam kalınlıkta bir yanık oluşturmak için ısıyı cilt dokusunda daha derine dağıtabildi. Histoloji analizi, dermisin ve deri altı dokusunun tam kalınlık derecesine pıhtılaştırıcı hasar veren zayıflatılmış epidermisi gösterir. Ek olarak, bu model immün disregülasyon ve bakteriyel enfeksiyonlar gibi yanık yaralanmasını takiben hastanede yatan yanık hastalarında gözlenen klinik durumları temsil etmektedir. Model, hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakteriler tarafından sistemik bakteriyel enfeksiyonu özetleyebilir. Sonuç olarak, bu yazıda, yanık yarası ve enfeksiyonlar için yeni topikal antibiyotik ilaçların geliştirilmesinde önemli yarar sağlayan, immün disregülasyon ve bakteriyel enfeksiyonlar da dahil olmak üzere klinik durumları taklit eden, öğrenmesi kolay ve sağlam bir sıçan yanığı modeli sunulmaktadır.
Introduction
Yanık yaralanmaları travmanın en yıkıcı biçimleri arasındadır ve ölüm oranları özel yanık merkezlerinde bile %12'ye ulaşmaktadır 1,2,3. Son zamanlarda yayınlanan raporlara göre, Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda ~ 486.000 yanık hastası tıbbi bakıma ihtiyaç duyuyor ve yaklaşık 3.500 ölüm 1,2,3,4,5,6. Yanık yaralanması, hastaların bağışıklık sistemi için büyük bir zorluk oluşturur ve iyileşmesi yavaş olan önemli bir açık yara oluşturur ve onları nozokomiyal, fırsatçı bakterilerle kutanöz, pulmoner ve sistemik kolonizasyona duyarlı hale getirir. Bakteriyel enfeksiyon ile birlikte immün disregülasyon yanık hastalarında artmış morbidite ve mortalite ile ilişkilidir7.
Bir hayvan yanığı ve enfeksiyon modeli, deri hasarı ve yanık travması ile ilişkili immün baskılanmayı takiben bakteriyel enfeksiyonların patogenezini incelemek için gereklidir. Bu tür modeller, yanık hastalarında bakteriyel enfeksiyonların tedavisi için yeni yöntemlerin tasarlanmasını ve değerlendirilmesini sağlar. Sıçanlar ve insanlar, daha önce belgelenen benzer cilt fizyolojik ve patolojik özelliklerini paylaşırlar8. Ek olarak, sıçanların boyutu daha küçüktür, bu da onları daha büyük hayvan modellerinden daha kolay, daha uygun fiyatlı ve tedarik edilmesi ve bakımı daha kolay hale getirir.
Bu özellikler, sıçanları yanıkları ve enfeksiyonları incelemek için ideal bir model hayvan yapar9. Ne yazık ki, yanık indüksiyonu tekniği tutarsızdır ve genellikle minimal olarak tanımlanmıştır 10,11,12,13,14. Mevcut protokol, klinik senaryoyu simüle eden ve bağışıklık baskılanmasını ve bakteriyel enfeksiyonu değerlendirmek için kullanılabilecek bir sıçan modelinde tutarlı bir tam kalınlıkta yanık hasarı oluşturmak için basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir prosedür geliştirmek üzere tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, Kuzey Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve belirlenen yönergelere uygun olarak yürütüldü. Deneyler için 7-9 haftalık erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanları (250-300 g) kullanıldı. Tüm hayvanlar, yiyecek ve su ad libitumuna serbest erişim ile 12 saat: 12 saat açık-karanlık döngüsünde barındırıldı. Çalışmaya başlamadan önce her zaman kurumsal veterinerinizle birlikte analjezik bir plan hakkında çalışın.
1. Sıçanları yanık yaralanması için hazırlama
- Hayvanları yanıktan 24 saat önce yanık yaralanmasına hazırlayın.
- Sıçanı, solunum yavaşlayana kadar bir indüksiyon odasında% 100 oksijende% 5 izofluran ile 5 dakika (akış hızı: 2 L / dak) anestezi yapın.
- Sıçan derinlemesine uyuşturulduktan sonra (tüm uzuvlarda ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermez), sıçanı yüzüstü pozisyonda bir ısıtma yastığına doğru hareket ettirin ve izofluranı bir burun konisinden bakım için oksijende% 1.5'e düşürün.
- Anesteziden sonra ve işlem sırasında korneanın kurumasını önlemek için, pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak her iki gözün kornealarına göz kayganlaştırıcısı uygulayın.
- Sıçanın sırt bölgesini elektrikli bir makas makinesi kullanarak tıraş edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve omuz bıçaklarından kuyruğun tabanına kadar büyük bir dikdörtgen halinde mümkün olduğunca fazla kılı çıkarın (Şekil 2A).
- Gevşek tüyleri silmek için tıraş edilen bölgeyi tuzlu suya batırılmış bir mendille temizleyin. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak tıraş edilen bölgeye epilasyon losyonu uygulayın ve ~ 3 dakika bekletin.
NOT: Referans alınan epilasyon losyonunun 3 dakikadan fazla uygulanması ciltte kırmızı döküntülere neden olacaktır. - Losyonu çıkarmak ve cilt tahrişini önlemek için bölgeyi iki kez ıslak gazlı bez süngerle silin.
- İzofluranı kapatın, burun konisini çıkarın ve sıçanı kurtarma kafesine yerleştirin.
NOT: Kurtarma kafesine bir ısıtma yastığı yerleştirin. - Ertesi günün yanık prosedürü için kurtarılan hayvanı temiz bir muhafaza kafesine aktarın (sıçanın anesteziden iyileşmesi ~ 10-15 dakika sürebilir).
2. Sıçanlarda yanık yaralanmasına neden olmak
- Yanma gününde, su banyosu sıcaklığını 97 ° C'ye ayarlayın ve dört bakır çubuğun tümünü yerleştirin (her biri 420 g; Şekil 1) Çubukların düzgün bir şekilde ısınmasına izin vermek için yanma deneyinden 1 saat önce su banyosunda.
NOT: Çubuklar suya batırılmalıdır. Deneyden önce bir termometre kullanarak dijital sıcaklık göstergesinin doğruluğunu kontrol edin. - Bölüm 1'de belirtildiği gibi sıçanı anestezi altına alın.
- Sıçan tüm uzuvlarda ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermediğinde, bakım için oksijende% 1.5 izofluran ile eğilimli bir konumda bir ısıtma yastığına yerleştirin (Şekil 2A).
- Ağrı yönetimi için intraperitoneal (i.p.) yoldan morfin ( 20 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin6.
- Su banyosundaki suyun sıcaklığını kontrol edin. Zamanlayıcıyı ayarlayın ve ısıya dayanıklı eldivenleri giyin.
- Su banyosundan ısıtılmış bir bakır çubuğu çıkarın ve yanığı indüklemek için sıçanın dorsum bölgesine 7 s dokunun.
NOT: Isı kaybını en aza indirmek için su banyosu ile hayvan arasında minimum bir mesafe (10-15 cm) tutun ve yanığı indüklerken çubuklara baskı uygulamayın (yani, temas yerçekimi ile korunmalıdır). - Yanık bölgesi başına bir çubuk kullanarak, yaklaşık% 20 TBSA tam temaslı yanık üretmek için birbiri ardına dört yanık uygulayın (Şekil 2B).
- Yanıktan sonra, laktasyonlu Ringer çözeltisinin (0.1 mL / g vücut ağırlığı) i.p. enjeksiyonu ile hayvanı yeniden canlandırın.
NOT: Sıçanları canlandırmak için vücut ısısı ayarlı laktasyonlu bir zil çözeltisi kullanın. - İzofluranı kapatın, burun konisini çıkarın ve sıçanı iyileşme için ısı paspasının üzerine yerleştirin.
3. Bakteriyel inokulum ve enfeksiyonun hazırlanması
- Pseudomonas aeruginosa PAO1 ve Staphylococcus aureu'nunATCC25923'ün dondurulmuş örneğini, yanık deneyinden 2 gün önce Muller Hinton Agar (MHA) plakalarına çizin.
- Ertesi gün, plakadan tek bir yetişkin bakteri kolonisi seçin ve bir aşılama döngüsü kullanarak, plakadan hafifçe kazıyın. Daha sonra, 10 mL Muller Hinton Suyu (MHB) ve kültürü bir inkübatör çalkalayıcıda 37 ° C'de gece boyunca aşılamak için kültür tüpüne yerleştirin.
- Yanık ve enfeksiyon gününde, kültürü 5 dakika boyunca 4.000 × g'de santrifüj yapın. Pelet normal salin (% 0.9 NaCl çözeltisi) ile yıkayın.
- Bakteriyel peleti tuzlu suda yeniden askıya alın ve 0.1 OD 600nm'ye kadar seyreltin (600 nm'de optik yoğunluk). Bu bakteriyel süspansiyonun 200 μL'sini alarak ve istenen 2 × 107 CFU / mL'lik bakteriyel inokulumu elde etmek için 800 μL salin ile karıştırarak bakteriyel inokülumu seyreltin.
- Önceki adımda hazırlanan 50 μL P. aeruginosa veya S. aureu'nun inokülumunu(enfeksiyon dozu 1 × 106 CFU) yanıktan 15 dakika sonra anestezi altına alın, yanık yarasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde deri altından 29 G'lık bir iğne kullanarak enjekte edin.
- Yanık yarasını enfekte ettikten sonra, sıçanı iyileşme için ısıtma yastığına yerleştirin. Hayvan iyileştikten sonra (~ 15-20 dakika), temiz bir kafeste saklayın.
NOT: Yanık yaralanmasından sonra, kafes başına bir sıçan barındırın. Kolay çiğneme için su ıslak yiyecek peletleri kullanın ve kolay erişim için kafes zeminine yerleştirin. - Ağrı yönetimi için kafesteki su şişelerini morfin çivili suyla (0.4 mg / mL) doldurun.
NOT: Oral Morfin, insan yanığı hastalarındaki klinik durumu yansıtır. Bu çalışma, birçok kez veteriner personeline danıştıktan sonra bu deneyleri insan yanığı hastalarıyla karşılaştırılabilir tutmak için oral morfin kullanmıştır. Deney boyunca içme ve kilo günlükleri tutuldu. Tüm prosedürler sırasında aynı içme sistemini kullanın. Buprenorfin gibi diğer analjezikler, kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına göre deri altından / intraperitoneal olarak uygulanabilir. - İzleme kontrol listesini doldurun ve deney boyunca hayvanları sıkıntı veya hastalık açısından yakından izleyin.
4. Yanık yaralanmasının değerlendirilmesi
- Yanık yaralanmasından hemen sonra deri yanığı yaralanmasını morfolojik olarak renk ve marj açısından değerlendirin.
- Yanık yarasının yapısını ve epitel boşluğunu görselleştirmek için yanmış cildi hematoksilin ve eozin (H&E) ile lekeleyin15 (numune işleme için bkz. adım 5.6).
5. Sıçan örneklerinin sonradan işlenmesi ve bakteri sayımı
- Sıçanı aşırı dozda anestezi ile yanma sonrası 24, 48 ve 72 saatte ötenazileştirin.
- Kardiyak ponksiyon yoluyla sıçanlardan kan örnekleri alın ve bunları mini bir toplama tüpünde toplayın.
- Yanık indüksiyonunun konakçı bağışıklık sistemi üzerindeki etkisini belirlemek için kan örneklerinden tam kan sayımlarını analiz edin.
- Ötanazi sırasında cilt, deri altı dokusu, kas, akciğer ve dalak toplayın.
NOT: H&E boyama için cildin bir kısmını (~1 cm × 1 cm; ~200-300 mg ağırlığında) ve bakteriyel numaralandırma için başka bir kısmını saklayın. - Dokuları 10 mL'lik bir toplama tüpünde toplayın ve bakteri sayımı için buz üzerinde normal saline yerleştirin.
- Doku ağırlığını normal salin ile normalleştirin ve bir doku homojenizatörü kullanarak numuneleri homojenleştirin (bkz.
- Doku homojenatlarını normal salinle seri olarak seyreltin.
- P. aeruginosa ile enfekte sıçanlardan toplanan örnekler için setrimidli agar plakaları üzerindeki her doku örneğinin seyreltilmemiş homojenatının plakası ve her doku örneğinin tüm seyreltimlerinin plakaları 100 μL'dir.
NOT: S. aureus ile enfekte olmuş sıçanlardan toplanan numuneleri kaplamak için mannitol agar plakaları kullanın. - Plakaları 37 ° C'de bir inkübatörde 16-18 saat boyunca inkübe edin.
- Ertesi gün, plakalardaki bakteri kolonilerini sayın, CFU / mL sayısını elde etmek için seyreltme oranıyla çarpın ve CFU / g dokusunu hesaplamak için dokunun ağırlığı ile normalleştirin.
- Farklı organlardaki bakteri sayımlarını farklı örnekleme zaman noktalarında çizmek için veri analiz yazılımı kullanın.
- Yara yapısını ve epitel boşluğunu görselleştirmek için yanmış cildin H&E boyamasını gerçekleştirin.
- Makas ve dişli forseps kullanarak, yanık bölgesinden 1 cm x 1 cm'lik bir cilt yamasını kesin ve oda sıcaklığında 48 saat boyunca bir fiksatif (% 10 nötr tamponlu formalin, NBF) içine daldırın.
NOT: Tüm dokuların fiksatif içine tamamen daldırıldığından emin olmak için kabı döndürün, fiksatif hacmi doku hacminin 30 katıdır. - Cilt dokusunu oda sıcaklığında 72 saat boyunca% 70 (v / v) etanol ile dehidre edin.
- Bölümleri kesmek ve H&E 15 ile lekelemek için kurumuş numuneleri parafin bloklardaişleyin.
- 40x objektif kullanarak lekeli slaytları bir slayt tarayıcıda dijital olarak görüntüleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Taranan görüntüyü yazılım kullanarak analiz edin (analiz için görüntünün işlenmesi için Ek Dosya 1'e bakın; Malzeme Tablosu'na bakın).
- Epidermis, dermis, deri altı dokusu ve iskelet kasının durumunu değerlendirmek için lekeli cilt bölümünün tüm alanlarını inceleyin.
- Makas ve dişli forseps kullanarak, yanık bölgesinden 1 cm x 1 cm'lik bir cilt yamasını kesin ve oda sıcaklığında 48 saat boyunca bir fiksatif (% 10 nötr tamponlu formalin, NBF) içine daldırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol oldukça tekrarlanabilir ve sıçanlarda üçüncü derece, tam kalınlıkta yanık hasarı ile sonuçlanmıştır. Yanık indüksiyonundan sonra yanık yarası mumsu beyaz görünür (Şekil 2B). Yanık yaralanmasının rengi, 72 saatlik yanma sonrası boyunca beyazdan kahverengiye değişmiştir (Şekil 2B-E).
Histolojik analiz, tam kalınlıkta bir yanığı doğruladı (derinlik > 24 saat yanma sonrası 2.61 mm; Şekil 3B). Bozulmamış yanık olmayan deri ile karşılaştırıldığında, yanık hayvanlardan alınan deri örnekleri, yanık yaralanmasından sonra 24, 48 ve 72 saat boyunca tüm katmanlarda yaralanma kanıtı göstermiştir (Şekil 3). Ek olarak, histolojik analiz epidermal tabakanın tamamen tahrip olduğunu ve deri altı yağ ve iskelet kası tutulumu ile dermisin tam kalınlığında hasar olduğunu gösterdi (Şekil 3B).
Bakteriyel klirensi değerlendirmek için, P. aeruginosa ve S. aureus ile enfeksiyonu takiben 24, 48 ve 72 saatte çeşitli dokular toplandı. Tüm yanık hasarlı sıçanlar için enfeksiyon bölgesinden bakteri geri kazanıldı (Şekil 4A, B). Ayrıca, yanık sıçanlarının derisinden geri kazanılan bakteri sayısı, enfeksiyon sonrası 24 saat içinde P. aeruginosa için ilk inokulumdan daha azken, yanma ve enfeksiyon sonrası 48 ve 72 saat sonra elde edilen doku örnekleri bakteri yükünde bir artış göstermiştir (Şekil 4A). Buna karşılık, derideki S. aureus için tüm zaman noktalarında başlangıçtaki inokuluma kıyasla 2 log10'luk bir artış gözlenmiştir (Şekil 4B). Bu, S. aureus'un sadece yanık hasarının neden olduğu immünosupresyon nedeniyle değil, dokulardaki aktif replikasyonu nedeniyle enfeksiyon oluşturabildiğini düşündürmektedir.
Bakteriyel yayılımı incelemek için cildin farklı katmanları (yani deri altı dokusu, kaslar ve distal organlar) da analiz edildi. Subkutan doku ve kaslar akciğer ve dalaktan daha yüksek bakteri yükü gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu veriler yanık sıçanlarının sırasıyla P. aeruginosa (Şekil 4A) veya S. aureus (Şekil 4B) ile yara aşılamasını takiben 24 saat veya 48 saat sistemik bir enfeksiyon geliştirdiğini göstermektedir. Tam kan sayımı da başlangıçta ve 72 saat yanma sonrası yaralanmada bir hematoloji analizörü (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak elde edildi. Toplam beyaz kan hücresi sayıları zamanla azaldı ve bağışıklık baskılanmasını gösterdi. Nötrofil sayıları yanıktan sonra azaldı, ancak enfeksiyonu takiben 72 saatte başlangıç çizgisine göre arttı (Tablo 1). Bununla birlikte, yanık ve enfeksiyondan sonra kırmızı kan hücresi ve trombosit sayımlarında artışlar gözlendi ve bu da sistemik inflamasyonu gösterdi.
Resim 1: Yanık indüksiyonunu uygulamak için kullanılan bakır çubuk. Özel yapım çubuğun ağırlığı, 5,4 cm çapında ve 6,4 cm yüksekliğinde 420 g'dır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yanık indüksiyonundan önce ve sonra sıçan dorsal tarafının makroskopik görünümü . (A) tıraştan sonra sıçan dorsumu, (B) yanık yaralanmasından hemen sonra, (C) yanık sonrası 24 saat, (D) yanık sonrası 48 saat ve (E) 72 saat yanık sonrası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Her yanık şiddeti seviyesi için H&E lekeli kesitlerin temsili görüntüleri. (A) Sahte sıçan derisinin histolojisi, epidermis, dermis ve deri altı doku katmanları arasında açık bir ayrım göstermektedir. (B) Deri histolojisi 24 saat yanık sonrası derinliğe sahip dermisin ve deri altı dokusunun tam kalınlığında pıhtılaştırıcı hasarla zayıflamış epidermisi gösterir ve maksimum yanık derinliği >2.61 mm. (C) Yanık sonrası 48 saatte, maksimum yanık derinliği 2.35 mm ve (D) 72 saat yanık sonrası maksimum yanık derinliği 2.20 mm idi. Görüntüler 40x büyütmede tarandı. Ölçek çubukları = 500 μm (A-D). Kısaltma: H & E = hematoksilin ve eozin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yanık yarası enfeksiyonundan sonra farklı organlardaki bakteri yükünün miktarı. Sıçanlar, yanık yaralanmasından 15 dakika sonra deri altı enjeksiyonları yoluyla bakterilerin 6 log CFU'su ile enfekte edildi. Sistemik hastalığın ilerlemesini belirlemek için deri, deri altı doku, kas, akciğer ve dalak enfeksiyondan 24, 48 ve 72 saat sonra toplandı. Her zaman noktasında üç sıçan kullanıldı. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01, (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Kısaltma: CFU = koloni oluşturan birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hücre türü | Temel (ortalama ± SD) | 72 sa Enfekte Olmadı (SD ortalama ±) | 72 saat-Enfekte (ortalama ± SD) |
| Beyaz Kan Hücreleri (109/L) | 16,9 ± 4,9 | 7.1 ± 2.0 | 6,50 ± 5,5 |
| Nötrofil (109/L); (%) | 4.0 ± 1.1; (24.3 ± 2.8) | 1,4 ± 0,4; (20.2 ± 5.7) | 1.88 ± 1.0; (35.0 ± 12.4) |
| Lenfositler (109/L); (%) | 11.6 ± 4.1; (68.5 ± 1.7) | 4.8 ± 1.7; (66.5 ± 7.6) | 3,54 ± 3,9; (46.4 ± 17.0) |
| Monositler (109/L); (%) | 0,9 ± 0,3; (5.4 ± 1.5) | 0,8 ± 0,2; (11.5 ± 1.6) | 1.0 ± 0.6; (17.3 ± 5.5) |
| Kırmızı kan hücreleri (1012/L) | 7.5 ± 0.3 | 7.1 ± 0.8 | 10,0 ± 1,1 |
| Hemoglobin (g/dL) | 14.3 ± 0.7 | 13.4 ± 1.0 | 18.6 ± 2.0 |
| Trombositler (109/L) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45,6 ± 3,0 | 39,9 ± 3,7 | 55,7 ± 8,2 |
Tablo 1: Yanık oluşumu ve enfeksiyonu öncesi ve sonrası hematoloji parametreleri. Kısaltma: HCT = hematokrit.
Ek Dosya 1: Aperio ImageScope'ta H&E görüntülerini analiz etme adımları. Kısaltma: H & E = hematoksilin ve eozin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yanık yaralanmasının patofizyolojisini incelemek için çeşitli yanık modelleri sunulmuştur 8,12,16,17. Bu çalışmada, hastalarda enfekte bir yanık travmasını simüle etmek için tam kalınlıkta bir yanığı indüklemek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirmek için bir sıçan modeli kullandık. İnsan koşullarını taklit etmek için hayvan modeli olarak sıçanın seçimi, maliyet dengesine, kullanım kolaylığına, tekrarlanabilirliğe ve verilerin güvenilirliğine dayanmaktadır. Burada kullanılan sıçan modelinin diğerlerine göre birçok avantajı vardır: kullanımı kolaydır ve literatür genelinde karşılaştırmalara izin veren en yaygın kullanılan yanık modelidir. Sıçan deneysel ortamda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, sıçan ve insan bütünlükleri histolojik olarak aynı değildir18,19. Sıçanın bütünlüğü, panniculus adiposus olarak bilinen yağlı bir tabaka olan deriden oluşur ve bu tabakanın altında, beyaz yağ dokusu ve panniculus karnosus olarak bilinen bir tabaka oluşturan düz kas ile ilişkili gevşek bağ dokusunun bir kılıfı bulunur. İkinci katman, insan bütünlüğünün çoğunda yoktur. Bu önemlidir, çünkü düz kas hücreleri hızlı ve bol yara kasılmasını teşvik eder20. Ek olarak, sıçanların yara iyileşme mekanizmalarının insanlarınkinden önemli ölçüde farklı olduğu belirtilmelidir8. Bu nedenle, araştırmacılar bu makalede açıklanan protokolün sonuçlarını yorumlarken bunu akılda tutmalıdır. Bununla birlikte, sıçan modelinin lokalize yanık yaralanmalarını ve yanık sonrası sepsisi incelemek için faydası tartışılmaz ve klinik olarak güvenilir ve aktarılabilir bol miktarda veri üretmiştir21. Ek olarak, sıçanlar diğer küçük hayvanlara kıyasla daha fazla yüzey alanına sahiptir, bu da nispeten daha büyük yanık yaralarının indüksiyonuna izin verir ve bu da klinik olarak ilgili yanık çalışmaları için iyi bir model haline getirir.
Kaynar su16, ısıtılmış pirinç çubuk 22, ısıtılmış alüminyum şablon17, paslanmaz çelik çubukların üzerine yerleştirilmiş sabit sıcaklıkta bir sıcak plaka23 ve vücut yüzeyinin% 45'inden fazlasının haşlanması dahil olmak üzere farklı yanma indüksiyonu yöntemleri yayınlanmıştır24. İdeal bir deneysel protokol, boyut ve derinlik bakımından tutarlı yanık yaraları elde etme kapasitesine sahip olacaktır. Bu çalışmada, 97 °C'de suda ısıtılan 420 g bakır çubuklar, yanığı indüklemek için ısıyı doğrudan iletkenlik yoluyla aktarmak için kullanılmıştır. Yanık indüksiyonu sırasında, çubuklar herhangi bir dış basınç uygulanmadan doğrudan cilt yüzeyine dokundu, çünkü katı bir yapıdan cilt yüzeyine termal enerji iletkenliği, kullanılan basınca değil, sıcaklık gradyanı 25'e ve katı yapı ile cilt arasındaki mesafeye17,25 bağlıdır. Metal seçimini belirleyen faktörler arasında termal iletkenlik ve pas ve korozyona karşı direnç yeteneği vardı.
Bakır, sırasıyla 16 W / mK, 225 W / mK ve 109 W / mK ile paslanmaz çelik, alüminyum veya pirinç ile karşılaştırıldığında yüksek bir ısı iletkenliğine (398 W / mK; W'nin Watt cinsinden ısı, m metre cinsinden alan, K, K, kelvin cinsinden sıcaklıktır)sahiptir. Yüksek ısı iletkenliğine sahip metal çubuklar, ısı enerjisini cilt dokularına düşük ısı iletkenlikli çubuklardan daha hızlı dağıtır ve aynı maruz kalma süresi içinde daha derin bir yanma seviyesine neden olur. Ek olarak, çubuğun boyutu ve ağırlığı,farelerde 7,26,27 yanık modelinden allometrik olarak ölçeklendirildi ve yaklaşık% 20'lik bir TBSA yanığına neden oldu. Sıçanda benzer bir ~%20-%30 TBSA yanığını indüklemek için 1,9 cm çapında bir çubuk (dört uygulamadan sonra farede toplam yanma alanı 11,3cm2'dir) 5,4 cm çapa (dört uygulamadan sonra bir sıçanda toplam yanık alanı 91,6cm2'dir) ölçeklendirilmiştir (220 g'lık bir sıçanın TBSA'sı 356,0 cm 2'dir)28, sıçanın TBSA'sının fareden 6 kat daha büyük olduğu göz önüne alındığında (20 g'lık bir farenin TBSA'sı 61,2cm2'dir)29. Sonuçlar, bu yöntemin tam kalınlıkta yanığa neden olduğunu açıkça göstermektedir ve histolojik analiz, yanma sonrası farklı zaman noktalarında normal ve yanmış cilt dokuları arasında mükemmel kontrast olduğunu göstermiştir (Şekil 3). Bu model aynı zamanda yanık yaralanması30,31 sonrası hastalarda gözlenen immün baskılamayı da yakalayabildi (Tablo 1).
Bakteriyel enfeksiyonlar yanık hastalarının iyileşme sürecini tehlikeye atan önemli bir tehdittir ve sıklıkla yanık yaralanmaları sonrası morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. Benzer koşulları simüle etmek için, sıçan P. aeruginosa veya S. aureus ile yanık yaralanmasının ardından enfekte oldu. Başlangıçta, bakterilerin topikal uygulamasını denedik, ancak yanık yüzeyinin mumsu görünümü bakteriyel inokulumun emilimini engelledi. Bu model aynı zamanda akciğer ve dalaktan geri kazanılan bakteriyel yük ile görüldüğü gibi yanık bölgesinin bakteriyel enfeksiyonunu takiben sistemik hastalık progresyonunu özetleyebildi (Şekil 4). Sonuç olarak, insan yanık yaralanmalarında gözlenen özelliklerin çoğunu sergileyen tam kalınlıkta yanıklar oluşturmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem gösterdik. Bu protokol, enfekte yanık yaralarının tedavisi için çok çeşitli yeni topikal terapötiklerin incelenmesine yardımcı olabilir. Bu model, farklı yara örtülerini değerlendirmek için uygun maliyetli bir model olarak da kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, hayvanların sağlanması ve bakımı için Kuzey Carolina Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Bölümü'ne teşekkür eder. Lauren Ralph ve Mia Evangelista'ya Patoloji Hizmetleri Çekirdeği'nde, doku kesitleme ve görüntüleme de dahil olmak üzere Histopatoloji / Dijital Patoloji ile ilgili uzman teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Savunma Bakanlığı'ndan bir araştırma hibesi ile desteklenmiştir (Ödül numarası W81XWH-20-1-0500, GR ve TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
