Biology

मच्छरों और अन्य एक्टोथर्म की तापमान वरीयता का निर्धारण

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64356

Amirah Haziqah-Rashid¹, Kinga Stobierska¹, Lorna Glenn¹, Soeren Metelmann^1,2, Ken Sherlock³, Ewa Chrostek¹, Marcus S. C. Blagrove¹

¹Department of Evolution, Ecology, and Behavior, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences, University of Liverpool, ²COVID-19 Outbreak Surveillance Team, UK Health Security Agency, ³Department of Livestock and One Health, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences, University of Liverpool

Summary

कीटों के पास एक इष्टतम पर्यावरणीय तापमान सीमा होती है जिसे वे भीतर रहना चाहते हैं, और कई बाहरी और आंतरिक कारक इस वरीयता को बदल सकते हैं। यहां, हम तापमान विकल्प का अध्ययन करने के लिए एक लागत प्रभावी और सरल विधि का वर्णन करते हैं, जो कीड़ों को स्वतंत्र रूप से अपने प्राकृतिक व्यवहार प्रदर्शित करने की अनुमति देता है।

Abstract

अधिकांश कीड़ों और अन्य एक्टोथर्म में अपेक्षाकृत संकीर्ण इष्टतम तापमान खिड़की होती है, और उनके ऑप्टिमा से विचलन उनकी फिटनेस, साथ ही अन्य विशेषताओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। नतीजतन, ऐसे कई एक्टोथर्म अपनी इष्टतम तापमान सीमा की तलाश करते हैं। यद्यपि मच्छरों और अन्य कीड़ों की तापमान वरीयताओं का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, पारंपरिक प्रयोगात्मक सेटअप एक अत्यधिक संलग्न स्थान में एल्यूमीनियम की सतह पर तापमान ढाल का उपयोग करके किया जाता है। कुछ मामलों में, यह उपकरण कई प्राकृतिक व्यवहारों को प्रतिबंधित करता है, जैसे कि उड़ान, जो वरीयता चयन में महत्वपूर्ण हो सकता है।

इस अध्ययन का उद्देश्य उड़ान के लिए पर्याप्त जगह के साथ दो-कक्ष उपकरण का उपयोग करके हवा के तापमान के लिए कीट वरीयता का निरीक्षण करना है। दो कक्षों में स्वतंत्र तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर होते हैं, जिनमें से प्रत्येक में एक बड़ा एपर्चर होता है। इनक्यूबेटर एक छोटे ऐक्रेलिक पुल का उपयोग करके इन एपर्चर से जुड़े होते हैं। इनक्यूबेटरों के अंदर दो जालीदार पिंजरे हैं, जो एपर्चर और पुल के माध्यम से जुड़े हुए हैं, जिससे कीड़े विभिन्न परिस्थितियों के बीच स्वतंत्र रूप से उड़ सकते हैं। ऐक्रेलिक पुल दो इनक्यूबेटरों के बीच तापमान ढाल के रूप में भी कार्य करता है।

पिंजरे में विशाल क्षेत्र और आसान निर्माण के कारण, इस विधि का उपयोग किसी भी छोटे एक्टोथर्म और / या किसी भी हेरफेर का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो संवेदी अंग हेरफेर, आहार, आंत वनस्पतियों और जैव सुरक्षा स्तर 1 या 2 (बीएसएल 1 या 2) पर एंडोसिम्बियोनेट उपस्थिति सहित तापमान वरीयता को बदल सकता है। इसके अतिरिक्त, बीएसएल 3 में आगे की रोकथाम (जैसे, जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर) का उपयोग करके रोगज़नक़ संक्रमण के अध्ययन के लिए उपकरण का उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

जीव केवल अपनी थर्मल सहिष्णुता सीमा के भीतर रह सकते हैं और प्रजनन कर सकते हैं। जैसा कि मौसम बदलने और ग्लोबल वार्मिंग के कारण पर्यावरणीय तापमान भिन्न होता है, प्रजातियों को अपने अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए तदनुसार अनुकूलन और प्रतिक्रिया करनी चाहिए। इसमें एक्टोथर्म शामिल हैं, जहां शरीर का तापमान पर्यावरण के साथ संतुलन में है^। इसलिए, प्रत्येक कीट की अपनी इष्टतम पर्यावरणीय तापमान सीमा होती है जिसे वे² के भीतर रहना चाहते हैं।

तापमान उन महत्वपूर्ण कारकों में से एक है जिसका उपयोग^{कीटों के} वितरण और सीमा की भविष्यवाणी करने के लिए किया जाता है ^3,4,5, रोगज़नक़-कीट संबंधों ^6,7 का अवलोकन करना और एक्टोथर्म की फिटनेस पर बाहरी कारकों का प्रभाव जैसे कि उनके वयस्क जीवनकाल, प्रजनन क्षमता और भोजन दर ^8,9।

पिछले अध्ययनों ने विभिन्न सेटअपों के साथ एक्टोथर्म के पसंदीदा तापमान की जांच की है। सबसे आम तापमान ढाल बनाने के लिए ठंडे या गर्म पानी के स्नान¹⁰, एक बर्फ स्नान और प्रोग्राम करने योग्य हीटर तत्व¹¹, ठंडी और गर्म^{प्लेटों 12,13}, थर्मल नियामक ^{प्लेटों} ^14,15, या एक गर्मी पैक और आइस पैक¹⁶ के साथ एक बड़े एल्यूमीनियम ब्लॉक का उपयोग करना है। इसके अतिरिक्त, अन्य अध्ययनों ने चयनित बैक्टीरिया¹⁷ के विकास का अध्ययन करने के लिए एक तापमान ढाल इनक्यूबेटर का भी उपयोग किया है और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर^18,19 की थर्मल वरीयता का निरीक्षण करने के लिए थर्मोइलेक्ट्रिक डिवाइस (सिरों पर गर्म और ठंडा) पर एक एल्यूमीनियम रॉड लगाई है।

हालांकि, यहां प्रस्तावित वैकल्पिक पद्धति में कुछ कीट अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण फायदे हैं। सबसे पहले, अन्य समाधानों को एल्यूमीनियम शीट, कीड़ों के लिए ऐक्रेलिक कक्षों का निर्माण, और अक्सर एक कैमरा सेटअप और विशेषज्ञ सॉफ्टवेयर सहित बुनियादी सामग्रियों के साथ स्क्रैच से पूर्ण निर्माण की आवश्यकता होती है; यह स्थापित करने के लिए महंगा और समय लेने वाला हो सकता है। दूसरे, कई वैकल्पिक उपकरण एक सतह पर तापमान ढाल (हवा के तापमान के विपरीत) पर भरोसा करते हैं। नतीजतन, जिस कक्ष में कीड़ों का अध्ययन किया जाता है वह अक्सर बहुत संकीर्ण होता है (उदाहरण के लिए, केवल 2 सेमी चौड़ाई और 1 सेमी गहराई¹⁶ के साथ 24 सेमी लंबे ग्रेडिएंट), जो प्राकृतिक व्यवहार को रोक सकता है, जैसे कि उड़ान, जो कीटों की सामान्य गतिशीलता के लिए आवश्यक हैं और इसलिए पसंदीदा तापमान का चयन करने में अनिवार्य हैं। कुछ अध्ययन हवा के तापमान को मापते हैं; हालांकि, पसंद के स्कोरिंग में अभी भी पिंजरों में स्वतंत्र रूप से उड़ने वाले कीड़ों के विपरीत पेल्टियर तत्वों पर उतरने वाले मच्छरों की संख्या^की गिनती शामिल है।

इस अध्ययन में, हम एक सरल सेटअप का वर्णन करते हैं, जो न्यूनतम संशोधित मानक उपकरणों का उपयोग करता है और कीड़ों को एक मानक आकार के कॉलोनी रखरखाव पिंजरे में अपेक्षाकृत निर्बाध रूप से उड़ान भरने और नेविगेट करने के लिए पर्याप्त जगह प्रदान करता है। इसके अलावा, एक ढाल पर भरोसा करने के बजाय, प्रोटोकॉल लगातार आंतरिक तापमान के दो अपेक्षाकृत बड़े आकार के वर्गों का उपयोग करता है, जिससे कीड़ों को उनके पसंदीदा तापमान और एक साधारण बाइनरी स्कोरिंग पर प्राकृतिक घूमने की अनुमति मिलती है। इसलिए, यहां वर्णित उपकरण और प्रोटोकॉल कम प्रतिरोधी और अधिक यथार्थवादी सेटिंग में मच्छर के तापमान वरीयता का अध्ययन करने का कम लागत और सरल साधन प्रदान करते हैं।

प्रोटोकॉल में दो-कक्ष उपकरण सेटअप के बाद प्रयोग से पहले कीड़ों की तैयारी शामिल है। आगे के कदमों में तापमान की पसंद और परिणामों के स्कोरिंग की अनुमति देने के लिए उपकरण में कीड़े रखना शामिल है। यहां विधि के एक उदाहरण के लिए, हमने कीड़ों के इष्टतम (मानक पालन) तापमान, एडीज एजिप्टी के लिए 27 डिग्री सेल्सियस, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, और कीड़ों की दोनों प्रजातियों के लिए क्रमशः 30 डिग्री सेल्सियस और 28 डिग्री सेल्सियस का उच्च विकर्ष तापमान चुना। एक पसंदीदा कक्ष का चयन करने के लिए कीड़ों को 30 मिनट दिए जाते हैं। यह समय पर्याप्त पाया गया, और लंबी अवधि ने परिणामों को नहीं बदला; हालांकि, आवश्यकतानुसार प्रजातियों / तापमान / अन्य चर के आधार पर इसे बढ़ाया जा सकता है।

Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल बीएसएल 1 या 2 के लिए लिखा गया है; बीएसएल 3 काम के लिए, कक्षा 3 बायोसेफ्टी कैबिनेट (दस्ताने बॉक्स) के अंदर पूरे प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करें।

1. कीट तैयार करना

12 सेमी आस्तीन के उद्घाटन के साथ दो खाली मच्छर पिंजरे (17.5 सेमी x 17.5 सेमी x 17.5 सेमी) तैयार करें (चित्र 1)। प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले, सुनिश्चित करें कि मच्छर पिंजरों में कोई छेद या अन्य नुकसान नहीं है।
एक यांत्रिक एस्पिरेटर (संग्रह कक्ष के साथ एक साधारण पूटर) का उपयोग करके, प्रयोग के बाद आसान हैंडलिंग और निपटान के लिए 30 कीड़ों (जैसे, एडीज एजिप्टी मच्छर; यहां, उद्भव के 3-5 दिनों बाद मादाओं का उपयोग किया गया था) को एक अलग पिंजरे में स्थानांतरित करें।
नोट: प्रति प्रयोग कुल 30 कीड़ों का सुझाव दिया जाता है क्योंकि मच्छर के भागने के उच्च जोखिम के बिना प्रबंधन और गिनती करना आसान है। प्रयोग के उद्देश्य को फिट करने के लिए उपयोग किए गए कीड़ों की संख्या को समायोजित किया जा सकता है।

2. दो-कक्ष उपकरण सेटअप

इनक्यूबेटर निर्माता के निर्देशों के अनुसार, इनक्यूबेटरों को वांछित तापमान पर सेट करें।
इनक्यूबेटरों को विशिष्ट तापमान पर गर्म करने और स्थिर करने की अनुमति दें, जो 25-30 डिग्री सेल्सियस की सीमा में तापमान के लिए <30 मिनट है। तापमान जांच के साथ इनक्यूबेटर में हवा के तापमान की जांच करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि इनक्यूबेटर इच्छित तापमान पर स्थापित है।
प्रत्येक इनक्यूबेटर में एक खाली मच्छर पिंजरा रखें (चित्रा 2 ए)।
इनक्यूबेटर के सामने के छेद के माध्यम से पिंजरे की आस्तीन को खिलाएं। डक्ट टेप के साथ एक खुला कवर (फ्लैप) तैयार करें और इसे ऐक्रेलिक ट्यूब (चित्रा 2 बी) में छेद पर रखें।
इनक्यूबेटर छेद के शीर्ष पर एक पिंजरे की आस्तीन में ऐक्रेलिक ट्यूब डालें। ट्यूब का व्यास इनक्यूबेटरों के सामने के छेद से बड़ा होता है ताकि यह छेद को पूरी तरह से कवर कर सके।
रबर बैंड या पुन: प्रयोज्य केबल टाई (चित्रा 2 सी) के साथ ट्यूब के चारों ओर आस्तीन के जाल को कसें। सुनिश्चित करें कि ऐक्रेलिक ट्यूब ढीली नहीं है और थीक्यूबेटरों के बीच झूल रही है; यदि ऐसा है, तो पिंजरे और रबर बैंड के बीच अतिरिक्त सामग्री को हटाने के लिए पिंजरे की आस्तीन खींचें।
दोनों इनक्यूबेटरों को एक दूसरे के सामने रखें और दूसरे इनक्यूबेटर की आस्तीन के साथ चरण 2.5 और 2.6 दोहराएं। दोनों पिंजरे अब ऐक्रेलिक ट्यूब (चित्रा 2 डी) के माध्यम से सुरक्षित रूप से जुड़े हुए हैं।

3. मच्छर सम्मिलन

मच्छर सम्मिलन के लिए डक्ट टेप फ्लैप खोलें। छेद में एक फ़नल रखें। कीड़ों को फ़नल में खाली करें जिसे ऐक्रेलिक ट्यूब में रखा गया है।
नोट: यदि वांछित / आवश्यक है: मच्छरों के लिए, फ़नल₂₁ में रखने से पहले सभी मच्छरों को बाहर निकालने के लिए सीओ² पेन का उपयोग करें; ड्रोसोफिला के लिए,^{कीड़ों} को नीचे गिराने के लिए बर्फ का उपयोग करें।
फ़नल निकालें और ट्यूब में छेद को डक्ट टेप फ्लैप के साथ कवर करें। पसंदीदा कक्ष का चयन करने के लिए कीड़ों के लिए 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
नोट: यदि सीओ₂ या बर्फ का उपयोग किया गया था, तो कुछ मिनटों के बाद कीड़ों को जगाने के लिए ट्यूब ब्रिज को हल्के से टैप करें।

4. मच्छरों की गिनती

30 मिनट के बाद, नेत्रहीन निरीक्षण करें और लिखें कि पुल (ऐक्रेलिक ट्यूब) में कितने कीड़े पाए गए थे।
पुल में कीड़ों को इनक्यूबेटर के दोनों ओर टैप / उड़ाएं। बाद में कीड़ों की कुल संख्या से कटौती करने के लिए रिकॉर्ड करें।
नोट: पुल में सीओ₂ जारी करके तंत्र में सभी 30 कीड़ों को बाहर निकालें (सभी कीड़ों के लिए सीओ₂ का उपयोग करें क्योंकि बर्फ पिंजरों में कीड़ों को नीचे नहीं गिराएगा)। इसके अलावा, पुल में कीड़ों की संख्या पर ध्यान दें जो इनक्यूबेटर के दोनों ओर उड़ते हैं।
दोनों तरफ ऐक्रेलिक ट्यूब से आस्तीन को पिंच करें और बंद करें, पिंजरों को बंद करने के लिए जल्दी से एक गाँठ के साथ बांधें, और यह सुनिश्चित करें कि रबर बैंड अभी भी बरकरार है ताकि किसी भी कीड़े को भागने से रोका जा सके।
इनक्यूबेटर से पिंजरों को हटा दें, और प्रत्येक पिंजरे में कीड़ों को नेत्रहीन रूप से गिनें (यदि आवश्यक हो तो पुल से कीड़ों की संख्या में कटौती करें)।
दूसरे पिंजरे के साथ चरण 4.4 दोहराएं। सुनिश्चित करें कि दो इनक्यूबेटरों और पुल से संख्या 30 तक बढ़ जाती है (या उपयोग किए गए कीड़ों की संख्या, यदि अलग हो)।
यदि संख्याएं चरण 1.2 में उपयोग किए गए कीड़ों की कुल संख्या में नहीं जुड़ती हैं, तो पिंजरे आस्तीन में शेष कीड़ों की तलाश करें।

5. प्रतिकृति

प्रयोग करते समय, संभावित बाहरी पूर्वाग्रहों, जैसे प्रकाश दिशा, परिवेश गंध आदि का हिसाब रखना सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, पिंजरों, इनक्यूबेटर अभिविन्यास और प्रतिकृति के बीच संयोजन को उलटकर।

Representative Results

इस प्रयोगात्मक सेटअप की प्रभावकारिता और प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए, चार प्रतिकृतियों में दोनों इनक्यूबेटरों में समान तापमान के साथ 30 मच्छरों का परीक्षण किया गया था (चित्रा 3)। जब दोनों कक्षों को 27 डिग्री सेल्सियस के मच्छर इष्टतम तापमान पर सेट किया गया था, तो कक्ष वरीयता (पी = 0.342; पी = 0.342) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। विलकॉक्सन ने रैंक परीक्षण पर हस्ताक्षर किए)। हालांकि, जब एक कक्ष को 27 डिग्री सेल्सियस के आकर्षक इष्टतम तापमान पर सेट किया गया था और दूसरे कक्ष को 30 डिग्री सेल्सियस के उप-इष्टतम तापमान पर सेट किया गया था, तो मच्छरों ने लगातार अपने ऑप्टिमा (पी = 0.029) की ओर सक्रिय प्राथमिकता का प्रदर्शन किया। विलकॉक्सन ने रैंक परीक्षण पर हस्ताक्षर किए; 27 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस के लिए क्रमशः 78.2% और 21.8% का औसत मूल्य)। हमने ड्रोसोफिला का उपयोग करके एक और एक्टोथर्म मॉडल के साथ प्रयोज्यता निर्धारित करने के लिए भी परीक्षण किया और इसी तरह के परिणाम देखे गए।

पिंजरों के भीतर तापमान एकरूपता
चित्रा 4 दो-कक्ष तंत्र की तापमान एकरूपता को दर्शाता है। एक बार इकट्ठा होने के बाद, दोनों पक्षों को 27 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया था और यहां दिए गए निर्देशों के अनुसार बराबर करने की अनुमति दी गई थी। इनक्यूबेटर और पुल के सभी हिस्से केंद्रीय तापमान के 0.4 डिग्री सेल्सियस के भीतर हैं, एक कोने के लिए (लगातार) को छोड़कर। ध्यान दें, कि सामने का निचला बाएं हाथ का कोना (जैसा कि सामने से देखा जाता है) 27 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस दोनों पर एक सुसंगत गर्म स्थान है। यह संभवतः इनक्यूबेटर नियंत्रणों के इलेक्ट्रॉनिक्स के कारण है, जो इनक्यूबेटर के उस खंड के ठीक नीचे स्थित है, बजाय प्रदर्शन किए गए जोड़तोड़ के; इसलिए, यह संभवतः इनक्यूबेटर मॉडल-विशिष्ट है। यह दर्शाता है कि इनक्यूबेटर में हेरफेर और जोड़ का तापमान एकरूपता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, पुल का तापमान दो कक्षों के बीच मध्यवर्ती था, यह सुनिश्चित करते हुए कि कीड़े एक तापमान गर्त के साथ सामना नहीं करते हैं जिसे उन्हें उड़ना होगा।

चित्र 1: मच्छर पिंजरे का विवरण। मच्छर पिंजरे (17.5 सेमी x 17.5 सेमी x 17.5 सेमी) 12 सेमी आस्तीन के उद्घाटन के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2: सेटअप के दौरान उपकरण के चित्र और आरेख। (A) इनक्यूबेटर में रखा खाली कीट पिंजरा। (बी) डक्ट टेप से बने एक खुले कवर (फ्लैप) के साथ ऐक्रेलिक ट्यूब। (सी) योजनाबद्ध आरेख के साथ सेटअप का साइड व्यू। आस्तीन की जाली को रबर बैंड के साथ ऐक्रेलिक ट्यूब के चारों ओर कस दिया गया था। इन प्रयोगों के लिए, 3-5 दिन पुराने, मैटेड, मादा एजिप्टी मच्छरों का उपयोग किया गया था। (डी) पूर्ण सेटअप। एक दूसरे के सामने दो इनक्यूबेटर एक ऐक्रेलिक ट्यूब से जुड़े होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 3: कीड़ों में तापमान वरीयता। निर्देशों के अनुसार दो-कक्ष उपकरण को इकट्ठा किया गया था। प्रोटोकॉल के अनुसार कीड़ों को डाला गया और अपने पसंदीदा कक्ष (तापमान) का चयन करने के लिए 30 मिनट के लिए छोड़ दिया गया और फिर गिना गया। काले अंक व्यक्तिगत प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और नीला माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) दोनों इनक्यूबेटरों को एक ही तापमान (27 डिग्री सेल्सियस) पर सेट किया गया था और एई एजिप्टी की तापमान वरीयता देखी गई थी। (बी) इनक्यूबेटरों को अलग-अलग तापमान (27 डिग्री सेल्सियस बनाम 30 डिग्री सेल्सियस) और एई की तापमान वरीयता पर सेट किया गया था । एजिप्टी देखी गई। (ग) इनक्यूबेटरों को अलग-अलग तापमानों (25 डिग्री सेल्सियस बनाम 28 डिग्री सेल्सियस) पर सेट किया गया था और डी मेलानोगास्टर की तापमान वरीयता देखी गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: कक्षों और पुल के भीतर तापमान एकरूपता। जैसा कि वर्णित है, दो इनक्यूबेटर, दो पिंजरे और पुल को निर्देशों के अनुसार इकट्ठा किया गया था। तापमान को इनक्यूबेटरों पर 27 डिग्री सेल्सियस और केंद्र में 30 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित किया गया था। पिंजरे के केंद्र, इनक्यूबेटर के सभी आठ कोनों और पुल के अंदर तापमान को मापने के लिए एक तापमान जांच का उपयोग किया गया था। मापा गया तापमान यहां दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

अध्ययन में मच्छरों में तापमान वरीयता का निरीक्षण करने के लिए एक नई विधि का वर्णन किया गया है। इस विधि में, मच्छरों को एक ट्यूब में छोड़ा जाता है जो स्वतंत्र रूप से नियंत्रणीय तापमान के साथ दो इनक्यूबेटरों से जुड़ा होता है। इस तरह, मच्छरों को अपने प्राकृतिक व्यवहार और इस पसंद को व्यक्त करने के तंत्र को बाधित किए बिना दो तापमानों के बीच स्वतंत्र रूप से चयन करने की अनुमति है (जैसे, उड़ान)।

हमारे पहले प्रतिनिधि प्रयोग ने दोनों कक्षों में 27 डिग्री सेल्सियस के मच्छर इष्टतम तापमान का उपयोग किया। इस प्रयोग की पुनरावृत्ति के दौरान, मच्छरों को पूरे 30 मिनट के लिए दोनों पिंजरों के बीच स्वतंत्र रूप से उड़ते हुए देखा गया था, और सभी प्रतिकृतियों में, दोनों कक्षों में से प्रत्येक में लगभग समान संख्या थी। इसने मच्छरों को अपने प्राकृतिक व्यवहार (उड़ान) का प्रदर्शन करते हुए पिंजरों के बीच स्वतंत्र रूप से चयन करने की क्षमता की अनुमति देने के प्रयोगात्मक इरादे की पुष्टि की। इसके विपरीत, दूसरे प्रतिनिधि प्रयोग ने एक कक्ष में 27 डिग्री सेल्सियस के आकर्षक इष्टतम तापमान और एक उप-इष्टतम का उपयोग किया और इसलिए दूसरे कक्ष में 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान को पीछे हटा दिया। जैसा कि अपेक्षित था, मच्छरों ने लगातार उच्च महत्व पर इष्टतम तापमान कक्ष का चयन किया, तब भी जब हमने पूर्वाग्रह से बचने के लिए इनक्यूबेटरों को स्वैप किया।

हमने एक अलग कीट, डी मेलानोगास्टर (फल मक्खियों) के लिए सेटअप का भी परीक्षण किया, जो एक और एक्टोथर्म मॉडल जीव का प्रतिनिधित्व करता है। मेलानोगास्टर, 25 डिग्री सेल्सियस के इष्टतम तापमान पर एक कक्ष सेट किया गया था, और दूसरे को 3 डिग्री सेल्सियस, 28 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया था। मच्छरों के समान, फल मक्खियों ने भी अपने इष्टतम तापमान का पक्ष लिया और गर्म कक्ष से परहेज किया। यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल एक्टोथर्म की एक श्रृंखला के लिए उपयुक्त है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों का विवरण
प्रोटोकॉल में मुख्य महत्वपूर्ण कदम कीट हैंडलिंग है, क्योंकि यह कीड़ों के भागने की संभावना उत्पन्न करता है। इसे यह निर्धारित करके रोका जा सकता है कि उपयोग किए गए पिंजरों में भागने के लिए पर्याप्त छेद नहीं हैं, कि पुल पर जाल आस्तीन को सुरक्षित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रबर बैंड / केबल टाई तंग हैं, और पुल पर कीट सम्मिलन छेद के लिए कवर सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है और सील किया गया है।

यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि कीड़े प्रयोग से पहले या बाद में बच न जाएं, खासकर जब कीड़ों को डाउनस्ट्रीम प्रयोग के लिए या बाद में विभिन्न तापमान विकल्पों के लिए समय बिंदुओं की आवश्यकता होती है। यह कीड़ों को ऐक्रेलिक पुल में रखने से पहले एनेस्थेटाइज करके (मच्छरों के लिए ड्रोसोफिला और सीओ₂ के लिए बर्फ का उपयोग करके) और गणना से पहले_{प्रयोगों}के बाद कीड़ों को मारने के लिए पुल में सीओ 2 जारी करके किया जा सकता है। सीओ₂का उपयोग मच्छरों के लिए आदर्श है क्योंकि यह व्यवहार परिणामों को प्रभावित नहीं^{करेगा}। मक्खियों में, सीओ₂के संपर्क में आने से उनके उड़ान व्यवहार²³ में बदलाव हो सकता है, इसलिए बर्फ²² का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

सटीक परिणामों के लिए प्रयोग से पहले और बाद में कीड़ों की संख्या को सुनिश्चित करने के लिए कीड़ों की गिनती भी एक महत्वपूर्ण कदम है। ऐसा करने के लिए, हम पुल में स्थित कीड़ों को मारने के लिए प्रयोग पूरा होने के बाद सीओ₂पेन के उपयोग की सलाह देते हैं। यह कीड़ों को कक्ष के दोनों ओर ले जाने में मदद करेगा, इसलिए भागने वालों की संख्या कम हो जाएगी। हम प्रोटोकॉल में यह भी उजागर करते हैं कि पिंजरे के पृथक्करण के दौरान पिंजरों की आस्तीन में कीड़े पकड़े जा सकते हैं; इसलिए, सुनिश्चित करें कि गिनती के दौरान इनकी अच्छी तरह से जांच की जाए।

तकनीक के संभावित संशोधन और समस्या निवारण
इस तकनीक के साथ मुख्य कठिनाई पिंजरे आस्तीन का लचीला जाल है जिसके परिणामस्वरूप अंतराल या छिपने के स्थान होते हैं और इसलिए कीट बच जाते हैं या फंस जाते हैं। तकनीक में सुधार के लिए, यदि आवश्यक हो, तो कुछ संभावित संशोधन हैं। हम यह सुनिश्चित करने के लिए दो या दो से अधिक रबर बैंड का उपयोग करने का सुझाव देते हैं कि पुल को कीड़ों के लिए कोई संभावित जगह छोड़े बिना कक्षों के बीच ठीक से सुरक्षित किया जाता है (ढीला जाल कीड़ों के लिए छिपने की जगह बनाता है)। हम उपकरण को इकट्ठा करते समय चरण 2.6 में वर्णित जाल आस्तीन को तना हुआ खींचने के लिए विशेष देखभाल की सलाह देते हैं।

छोटे फॉर्म फैक्टर इनक्यूबेटरआमतौर पर केवल गर्म होते हैं (यानी, कोई सक्रिय शीतलन नहीं होता है), जैसा कि यहां उपयोग किए जाने वाले इनक्यूबेटरों के लिए मामला था। नतीजतन, परिवेश के कमरे के तापमान के आसपास या नीचे के तापमान का उपयोग करने के लिए प्रयोग को ठंडे कमरे में करने की आवश्यकता होगी ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इनक्यूबेटरों के लिए निर्धारित तापमान वांछित रूप से कम हो जाएगा।

इसके अलावा, इस सेटअप का उपयोग बीएसएल 3 के लिए भी किया जा सकता है, जहां एक वर्ग तीन बायोसेफ्टी कैबिनेट (दस्ताने बॉक्स) की आवश्यकता होती है। इस मामले में, दस्ताने बॉक्स को पूरे तंत्र को फिट करने के लिए पर्याप्त बड़ा होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोग एक दस्ताने बॉक्स में प्रयोगों के लिए आदर्श है क्योंकि आवश्यक सब कुछ दस्ताने बॉक्स के भीतर निहित होगा और, महत्वपूर्ण बात यह है कि कीड़ों के भागने की संभावना न्यूनतम है।

अंत में, पिंजरों में कीड़ों को प्रभावित किए बिना बाहरी प्रकाश या आर्द्रता स्रोत जोड़ने के लिए इनक्यूबेटरों में पर्याप्त जगह है। कीट प्रजातियों या प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, 1 सेमी मोटाई वाला एक एलईडी लैंप आसानी से एक या दोनों इनक्यूबेटरों के अंदर पिंजरे के शीर्ष पर रखा जा सकता है। दोनों को प्रकाश प्रदान करना और तापमान विकल्प प्रदान करना कुछ फोटोसेंसिटिव प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए एक अधिक यथार्थवादी प्रोटोकॉल हो सकता है, या केवल एक कक्ष को प्रकाश (या आर्द्रता) प्रदान करना प्रकाश / आर्द्रता विकल्प का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल में एक संभावित संशोधन है।

दोहरी पसंद तापमान वरीयता परख के संदर्भ में इस तकनीक के लाभ
यहां वर्णित विधि पिछले^{अध्ययनों 10,13,14,16} में वर्णित पारंपरिक तापमान ढाल विधि ^का विकल्प प्रस्तुत करती ^है। इनमें से अधिकांश अध्ययनों में, थर्मल ढाल के साथ एक बड़े क्षैतिज एल्यूमीनियम ब्लॉक का उपयोग किया जाता है, जबकि इस ढाल को उत्पन्न करने का तंत्र भिन्न होता है, जिसमें हीटिंग / कूलिंग ब्लॉक, पानी के स्नान आदि शामिल हैं। इन उदाहरणों में, एल्यूमीनियम ब्लॉक की सतह पर तापमान ढाल का उत्पादन होता है (पिंजरे में हवा के तापमान के बजाय)। नतीजतन, अधिकांश (लेकिन सभी नहीं) वैकल्पिक तकनीकें इस प्रोटोकॉल से अधिक कीटों की उड़ान क्षमता को प्रतिबंधित करती हैं। यहां, कीड़े पिंजरों के बीच अपेक्षाकृत स्वतंत्र रूप से उड़ सकते हैं, जिससे पसंद में प्राकृतिक व्यवहार की अधिक यथार्थवादी अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है। उदाहरण के लिए, बड़े कीड़ों के लिए, बड़े पिंजरों और इनक्यूबेटरों का उपयोग करके इस प्रयोगात्मक उपकरण को स्केल-अप करना भी संभव होगा।

प्राकृतिक व्यवहार लाभ के अलावा, हम दो कक्षों के भीतर बहुत अधिक तापमान एकरूपता भी प्रदर्शित करते हैं, जिससे सरल स्कोरिंग और दो बड़े एकल तापमान कक्षों का स्पष्ट चयन संभव हो जाता है। इस तरह के एक द्विआधारी बड़े कक्ष डिजाइन का उपयोग डेटा में शोर को कम कर सकता है, जहां, उदाहरण के लिए एक ढाल उपकरण पर, कीड़ों का कोई भी आकस्मिक आंदोलन ढाल पर स्थिति को बदल देगा और इसलिए उनकी कथित तापमान वरीयता।

यहां वर्णित तकनीक भी बहुत सरल और कम लागत वाली है। इस तकनीक को तापमान निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता नहीं है (यानी, एक पानी स्नान¹⁰ और / या एक गर्म प्लेट 11,12,13,14,15), कट ऐक्रेलिक ट्यूब और ड्रिल किए गए छेद ^के अलावा कोई विशेषज्ञ उपकरण नहीं, और कोई कैमरा^18,19 या परिष्कृत सॉफ्टवेयर¹⁹ नहीं है। विश्लेषण के लिए। अन्य तकनीकों में उपयोग किए जाने वाले ऐसे घटक महंगे हो सकते हैं और / या प्रयोगशुरू करने के लिए महत्वपूर्ण विशेषज्ञता और परीक्षण की आवश्यकता होती है।

इस तकनीक को विभिन्न उपकरणों के साथ भी दोहराया जा सकता है जो बाहरी बिजली की आपूर्ति नहीं होने पर बैटरी का उपयोग करते हैं, जिससे सिस्टम क्षेत्र में प्रयोगों का संचालन करने के लिए आदर्श हो जाता है। इसके अलावा, प्रयोगशाला या क्षेत्र में अन्य द्विआधारी विकल्प वरीयता स्थितियों, जैसे प्रकाश बनाम अंधेरे, उच्च / निम्न आर्द्रता आदि का अध्ययन करने के लिए एक ही उपकरण को थोड़ा संशोधित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में पूर्ण आकार का उपकरण तापमान ढाल सेटअप की तुलना में काफी छोटा है, जिससे बीएसएल 3 दस्तानेबॉक्स के अंदर एक आसान फिट की अनुमति मिलती है जैसा कि ऊपर वर्णित है। इसके अलावा, कीड़ों को रखना आसान है, क्योंकि उन्हें प्रयोग के अंत में सीओ₂ के साथ खटखटाया जा सकता है, और पुल से अलग होने के बाद पिंजरों को जल्दी से फिर से सील किया जा सकता है। ये रोकथाम लाभ बीएसएल 3 काम के लिए आदर्श हैं।

हालांकि हम स्वीकार करते हैं कि हमारा तंत्र केवल एक ढाल के साथ एक मुक्त विकल्प के बजाय द्विआधारी निर्णय की अनुमति देता है, जो आवेदन के आधार पर, इष्टतम तापमान की पहचान करने के लिए अतिरिक्त रन की आवश्यकता हो सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एएचआर मजलिस अमाना रकायत (एमएआरए) से वित्त पोषण समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic tube (Bridge)	Perspex	900 mm OD	Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm
Carbon dioxide (CO₂) inflator	Peaken	B08HM2BDDB	Any CO₂pen will work
Digital Incubator (×2)	VWR	VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384)	Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage.
Mechanical aspirator (for mosquitoes)	Watkins and Doncaster	E710	Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm.
Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects)	BugDorm	BD4S1515	Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon
Plastic funnel			Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm
Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects)	Watkins and Doncaster	E714	Manual/mouth aspirated
Rubber band or Reusable cable tie			Either, depending on preference.
Temperature probe	Eidyer	B07J4T1VQZ	Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe