Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Высокопроизводительный скрининг кардиотоксичности с использованием зрелых монослоев кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64364
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

Summary

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), предлагают альтернативу использованию животных для доклинического скрининга кардиотоксичности. Ограничением для широкого внедрения hiPSC-CM в доклиническом скрининге токсичности является незрелый, эмбрионоподобный фенотип клеток. Здесь представлены протоколы для надежного и быстрого созревания hiPSC-CM.

Abstract

Кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC-CM), используются для замены и снижения зависимости от животных и клеток животных для доклинических испытаний на кардиотоксичность. В двумерных монослойных форматах hiPSC-CM повторяют структуру и функцию клеток сердечной мышцы взрослого человека при культивировании на оптимальном внеклеточном матриксе (ECM). ECM, полученный из перинатальных стволовых клеток человека (индуцирующий созревание внеклеточный матрикс-MECM-MECM), созревает структуру, функцию и метаболическое состояние hiPSC-CM через 7 дней после нанесения покрытия.

Зрелые монослои hiPSC-CM также реагируют, как и ожидалось, на клинически значимые лекарства с известным риском возникновения аритмий и кардиотоксичности. Созревание монослоев hiPSC-CM до сих пор было препятствием для широкого внедрения этих ценных клеток для нормативной науки и скрининга безопасности. В этой статье представлены валидированные методы нанесения покрытия, созревания и высокопроизводительного функционального фенотипирования электрофизиологической и сократительной функции hiPSC-CM. Эти методы применимы к коммерчески доступным очищенным кардиомиоцитам, а также к кардиомиоцитам, полученным из стволовых клеток, полученным собственными силами с использованием высокоэффективных протоколов камерно-специфической дифференцировки.

Высокопроизводительная электрофизиологическая функция измеряется с помощью чувствительных к напряжению красителей (VSD; излучение: 488 нм), кальций-чувствительных флуорофоров (CSF) или генетически кодируемых кальциевых датчиков (GCaMP6). Для оптической записи каждого функционального параметра используется высокопроизводительное оптическое картографическое устройство, а для анализа электрофизиологических данных используется специальное программное обеспечение. Протоколы MECM применяются для скрининга лекарств с использованием положительного инотропа (изопреналин) и блокаторов канала, связанных с эфиром (hERG) человека. Эти ресурсы позволят другим исследователям успешно использовать зрелые hiPSC-CM для высокопроизводительного доклинического скрининга кардиотоксичности, тестирования эффективности сердечных препаратов и сердечно-сосудистых исследований.

Introduction

Индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-CM), были валидированы в международном масштабе и доступны дляскрининга кардиотоксичности in vitro1. Высокочистые hiPSC-CM могут генерироваться практически в неограниченном количестве, криоконсервироваться и размораживаться. После перекладывания они также реанимируются и начинают сокращаться с ритмом, напоминающим человеческое сердце 2,3. Примечательно, что отдельные hiPSC-CM соединяются друг с другом и образуют функциональные синцитии, которые бьются как единая ткань. В настоящее время ИПСК обычно получают из образцов крови пациентов, поэтому любой человек может быть представлен с помощью скрининговых анализов кардиотоксичности hiPSC-CM in vitro 4,5. Это создает возможность для проведения «клинических испытаний в блюде» со значительным представительством различных групп населения6.

Одним из важнейших преимуществ по сравнению с существующими подходами к скринингу кардиотоксичности клеток животных и животных является то, что hiPSC-CM используют полный геном человека и предлагают систему in vitro с генетическим сходством с человеческим сердцем. Это особенно привлекательно для фармакогеномики и персонализированной медицины - прогнозируется, что использование hiPSC-CM для разработки лекарств и других методов лечения обеспечит более точные, точные и безопасные назначения лекарств. Действительно, двумерные (2D) монослойные анализы hiPSC-CM доказали свою эффективность прогнозирования кардиотоксичности лекарств с использованием панели клинически используемых лекарств с известным риском возникновения аритмий 1,7,8,9. Несмотря на огромный потенциал hiPSC-CM и обещание упростить и удешевить разработку лекарств, существует нежелание использовать эти новые анализы10,11,12.

До сих пор одним из основных ограничений широкого внедрения и принятия скрининговых анализов hiPSC-CM является их незрелый, похожий на плод внешний вид, а также их функция. Критический вопрос созревания hiPSC-CM был рассмотрен и обсужден в научной литературе до тошноты13,14,15,16. Аналогичным образом, для стимулирования созревания hiPSC-CM было использовано множество подходов, включая манипуляции с внеклеточным матриксом (ECM) в 2D-монослоях и разработку 3D-инженерных тканей сердца (EHT)17,18. В настоящее время широко распространено мнение, что использование 3D EHT обеспечит превосходное созревание по сравнению с подходами на основе 2D монослоя. Однако 2D-монослои обеспечивают более высокую эффективность использования ячеек и больший успех в нанесении покрытия по сравнению с 3D-EHT; 3D EHT используют большее количество клеток и часто требуют включения других типов клеток, которые могут исказить результаты. Поэтому в этой статье основное внимание уделяется использованию простого метода созревания hiPSC-CM, культивируемых в виде 2D-монослоев электрически и механически связанных клеток.

Усовершенствованное созревание hiPSC-CM может быть достигнуто в 2D-монослоях с помощью ECM. 2D-монослои hiPSC-CM могут созревать с использованием мягкого, гибкого полидиметилсилоксанового покровного стекла, покрытого матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши). В 2016 году отчеты показали, что hiPSC-CM, культивируемые в этом мягком состоянии ECM, функционально созревают, демонстрируя скорости проводимости потенциала действия вблизи значений сердца взрослого человека (~ 50 см / с)18. Кроме того, эти зрелые hiPSC-CM проявляли многие другие электрофизиологические характеристики, напоминающие сердце взрослого человека, включая гиперполяризованный мембранный потенциал покоя и экспрессию Kir2.1. Совсем недавно в отчетах было идентифицировано покрытие ECM, полученное из перинатальных стволовых клеток человека, которое способствует структурному созреванию 2D hiPSC-CMs19. Здесь представлены простые в использовании методы структурно зрелых 2D-монослоев hiPSC-CM для использования в высокопроизводительных электрофизиологических экранах. Кроме того, мы проводим валидацию оптического картографического прибора для автоматического сбора и анализа 2D монослойной электрофизиологической функции hiPSC-CM с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и чувствительных к кальцию зондов и белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование hiPSC в этом протоколе было одобрено комитетом HPSCRO Мичиганского университета (Комитет по надзору за плюрипотентными стволовыми клетками человека). Список материалов и оборудования см. в таблице материалов . В таблице 1 приведены носители и их составы.

1. Размораживание и покрытие коммерчески доступных криоконсервированных hiPSC-CM для созревания на индуцирующем созревание внеклеточном матриксе (MECM)

  1. Нагрейте все реагенты до комнатной температуры и регидратируйте планшеты MECM сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS) или фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), содержащим кальций и магний, в течение 1 часа до покрытия кардиомиоцитов (200 мкл буфера на лунку 96-луночного планшета).
  2. Промойте планшеты MECM 2 раза HBSS или PBS, содержащими кальций и магний, в течение 1 часа перед кардиомиоцитами (200 мкл буфера на лунку 96-луночной пластины) и держите лунки гидратированными.
  3. Приготовьте водяную баню с температурой 37 °C.
  4. Извлеките кардиомиоцитарные пробирки из резервуара с жидким азотом, перенесите пробирки на сухой лед и слегка приоткройте крышки пробирок, чтобы сбросить давление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сброс давления в трубках чрезвычайно важен! Если внутри труб будет слишком большое давление, они могут взорваться.
  5. Закройте крышки тюбиков и поместите их на водяную баню, чтобы они оттаяли на 4 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте им полностью оттаять, чтобы избежать повреждения клеток из-за частичного оттаивания.
  6. После того, как клетки оттают, опрыскайте пробирки 70% этанолом перед открытием. Перенесите клетки в конические пробирки объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1 мл. Медленно капайте 8 мл гальванической среды, перемешивая пробирку каждый раз, когда добавляется 1 мл, чтобы клетки могли приспособиться к изменениям осмолярности.
    1. Промойте криовиал 1 мл гальванической среды с помощью стеклянной пипетки объемом 1 мл. Затем медленно капните жидкость в коническую трубку объемом 15 мл.
  7. Центрифугируют пробирки при ~300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл гальванической среды. Удалите аликвоту и проведите подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра. Добавьте дополнительную гальваническую среду для получения 7,5 × 10,5 клеток/мл .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 10 мл клеточной суспензии требуется для подготовки 96 лунок.
  8. Дозируйте 100 мкл клеточной суспензии на лунку 96-луночной пластины с покрытием MECM с помощью многоканальной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы избегаете осаждения ячеек и добиваетесь равномерной плотности ячеек во всех лунках во время нанесения покрытия.
  9. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO 2 в течение2 дней перед сменой среды на поддерживающую среду (200 мкл / лунка). Замените поддерживающую среду на 5-й день после размораживания. Выполняйте анализы ЭП на 7-й день или позже, как описано ранее8,9. Меняйте среду через день, выбирая расширение клеточной культуры.

2. hiPSC-направленная кардиальная дифференцировка и очистка hiPSC-CM

  1. Теплый 1x коммерчески доступный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), HBSS без кальция и магния (HBSS--) и 6-луночные пластины, покрытые солюбилизированным матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши) до комнатной температуры.
  2. Отметьте дифференцированные колонии с помощью фазово-контрастной микроскопии и аспирата/аблята. Хорошо промойте каждый из них 1 мл HBSS--. Проведите две промывки в лунках, содержащих >10 пятен дифференциации.
  3. Аспирируйте HBSS и добавьте 1 мл раствора ЭДТА в каждую лунку. Выдерживайте пластины до 5 минут при 37 °C. Проверьте пластины через 3 минуты и найдите полупрозрачные белые видимые колонии.
  4. Аспирируйте раствор ЭДТА и добавьте 1 мл в одну лунку. Вытесните клетки с 2 мл среды hiPSC, многократно пипетируя суспензию вверх и вниз, используя стеклянную пипетку объемом 10 мл, чтобы отделить все стволовые клетки от лунки и перенести клеточную суспензию в пробирку для сбора. Повторяют аспирацию и выбивание с последующими лунками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вытесните трудно поднимаемые колонии кончиком стеклянной пипетки.
  5. Подсчитайте стволовые клетки и отрегулируйте объем до пластины 8,0 × 105 клеток / лунка. Культивируйте клетки на среде hiPSC (2 мл / лунка) до тех пор, пока стволовые клетки не достигнут 90% слияния (это время отныне называется D0).
  6. Приготовьте 2 мл среды для базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ CHIR99021.
  7. На D0 промойте каждую лунку 6-луночной пластины стволовых клеток 1 мл HBSS на лунку. Замените HBSS средой базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ CHIR99021.
  8. На D1 ничего не делать.
  9. На D2 готовят среду для базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ IWP4.
  10. Замените среду 2 мл среды для базальной дифференцировки с добавлением IWP4 на лунку.
  11. На D3 ничего не делать для желудочково-специфической дифференцировки. Для предсердно-специфической дифференцировки аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды с добавлением 4 мкМ раствора IWP4 и 1 мкМ ретиноевой кислоты (РА) на лунку.
  12. На D4 аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды в лунку для дифференцировки желудочков. Для дифференцировки предсердий аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды с добавлением 1 мкМ раствора РА на лунку.
  13. На D5 ничего не делать.
  14. На D6 аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды на лунку (как для предсердной, так и для желудочковой дифференцировки).
  15. На D7 ничего не делать.
  16. На D8 аспирируйте среду и добавьте 2 мл поддерживающей среды кардиомиоцитов. Меняйте среду через день до разделения клеток или следуйте плану воздействия хронического препарата.

3. Очистка hiPSC-CM с помощью MACS (магнитно-активируемая сортировка клеток)

  1. Аспирируйте питательную среду для клеток и хорошо промойте каждую из них 1 мл HBSS--. Диссоциируют клетки, добавляя 1 мл 0,25% трипсина / ЭДТА и инкубируя при 37 ° C, 5% CO2 в течение 10 мин. Ресуспендируют и сингуляризируют клетки в каждой лунке 2 мл гальванической среды для инактивации трипсина / ЭДТА.
  2. Соберите клетки из шести лунок в коническую пробирку объемом 50 мл с сетчатым фильтром 70 мкм. Затем промойте сетчатый фильтр 3 мл гальванической среды. Посчитайте ячейки.
  3. Центрифугу суспензии при ~300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и промойте клетки 20 мл ледяного разделительного буфера MACS. Затем снова центрифугу при ~300 × г в течение 5 мин.
  4. Ресуспендируют гранулу в 80 мкл холодного разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 ячеек. Добавьте 20 мкл холодного коктейля истощения некардиомиоцитов (человеческого) на 5 × 106 клеток. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и выдержите на льду в течение 10 минут.
  5. Промойте образец, добавив 4 мл холодного разделительного буфера MACS на 5 × 106 клеток. Центрифугируют образец при ~300 × г в течение 5 мин и аспирируют надосадочную жидкость.
  6. Ресуспендируют гранулу в 80 мкл холодного разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 ячеек. Добавьте 20 мкл холодных антибиотиновых микрогранул на 5 × 106 клеток. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и выдержите 10 мин на льду.
  7. Во время инкубации образцов поместите колонки положительного истощения (оснащенные фильтрами предварительного разделения 30 мкм) на сепаратор MACS и поместите маркированные пробирки для сбора объемом 15 мл под колонки. Один столбец нужен на каждые 5 × 106 ячеек.
  8. Заправьте каждую колонку 3 мл холодного разделительного буфера MACS. Смешайте клеточную суспензию, обработанную антителами, с 2 мл разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 клеток и добавьте в колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не центрифуга! Центрифугирование на этом этапе оказывает пагубное влияние на выход кардиомиоцитов.
  9. Добавьте 2 мл разделительного буфера MACS в каждую колонку и собирайте проточный буфер до тех пор, пока не будет собрано 12 мл проточной суспензии кардиомиоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не допускайте полного высыхания колонн.
  10. Центрифугируйте кардиомиоциты при ~ 300 × г в течение 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте кардиомиоциты в 1 мл гальванической среды.
  11. Подсчитайте ячейки, чтобы определить концентрацию, отрегулируйте объем до желаемой плотности посева и наклейте ячейки. Нанесите очищенные кардиомиоциты на 96-луночные планшеты MECM, как описано выше на этапах 1.9-1.11 (7,5 × 105 клеток/лунка).

4. Оптическое картирование с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и кальций-чувствительных флуорофоров (CSF)

  1. Приготовьте соответствующее количество VSD в HBSS с кальцием и магнием, добавив 1 мкл красителя VSD на мл HBSS и 10 мкл загрузочного адъюванта на мл HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для 96-луночного планшета требуется 10 мл раствора VSD.
  2. В качестве альтернативы можно приготовить HBSS с кальцием и магнием с добавлением 5 мкМ спинномозговой жидкости. Аспирируйте поддерживающую среду кардиомиоцитов и замените 100 мкл VSD или CSF на лунку 96-луночного планшета. Инкубируют клетки в течение 30 мин в инкубаторе клеточных культур.
  3. Удалите красители и замените их проанализирующей средой или HBSS. Уравновешивание при 37 °C для получения базовых данных оптического картографирования с помощью высокопроизводительного оптического картографического устройства.
  4. Обработайте клетки препаратами для тестирования на острое воздействие или сопоставьте клетки, которые подвергались хроническому воздействию интересующих лекарств.
  5. Для тестирования кардиотоксичности на 96-луночных планшетах используйте четыре дозы соединения, по крайней мере, с шестью лунками на дозу. Используйте дозы в диапазоне от ниже до выше эффективной терапевтической концентрации в плазме, включая дозу клинической эффективной терапевтической концентрации в плазме.
  6. Разбавьте препараты в диметилсульфоксиде, храните их в виде исходных растворов при -20 °C, а затем разбавьте их в HBSS до желаемых концентраций.
  7. Перед применением лекарственного средства проведите базовые электрофизиологические измерения, как описано в разделе 5. После того, как препараты были применены, сделайте электрофизиологические записи не менее чем через 30 минут для хронических исследований. Процедуры сбора и анализа данных оптического картографирования см. в следующих разделах.

5. Оптическое картирование с использованием генетически кодируемого кальциевого индикатора (GECI)

  1. Пластины, коммерчески доступные или очищенные MACS-hiPSC-CM, как описано выше, с использованием 96-луночных пластин с покрытием MECM для изготовления зрелых hiPSC-CM. Для формирования сливающихся монопластов плита 7,5 × 104 СМ на скважину каждой 96-луночной плиты. Используйте гальваническую среду.
  2. Через 48 ч в гальванической среде переключитесь на поддерживающую среду кардиомиоцитов.
  3. На 4-й день после размораживания и повторного окрашивания добавьте рекомбинантный аденовирус для экспрессии GCaMP6m (AdGCaMP6m) в клетки при кратности инфекции (MOI) = 5. Добавьте вирус с помощью среды для анализа CM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперименты с использованием GCaMP6m были проведены в кардиомиоцитах iCell2 от коммерческого поставщика.
  4. На 5-й день удалите носитель adGCaMP6m и замените его свежим RPMI+B27 (поддерживающая среда кардиомиоцитов).
  5. На 7-й день наблюдайте за КМ с помощью микроскопии или оптического картографа, чтобы визуализировать спонтанные сокращения и соответствующие переходные процессы кальция.
  6. На 7-й день или позже, для скрининга лекарств, непосредственно перенесите 96-луночные планшеты зрелых монослоев hiPSC-CM, экспрессирующих GCaMP6m, в оптический картографирующий тепловизор из инкубатора для сбора исходных данных.
  7. После сбора данных электрофизиологии верните планшеты КМ в инкубатор для культивирования тканей для измерений в последующий момент времени.
  8. После исходных записей применяйте лекарства, используя не менее четырех доз каждого лекарства и не менее шести лунок на дозу. Уравновешивайте лекарства на клетках в течение не менее 30 минут до сбора данных. Нагрейте температуру скважины до ~37 °C до и во время сбора данных.
  9. После базовой регистрации всей пластины добавьте изопротеренол (500 нМ) в каждую лунку, чтобы получить надежные данные об ответе на лекарство. Количественно оцените влияние изопротеренола на частоту биения монослоя, амплитуду сжатия (эмплитуду переходного процесса кальция) и продолжительность переходного процесса кальция (см. рис. 6), как описано в разделе 5.

6. Сбор и анализ данных оптического картографирования

  1. Убедитесь, что камера оптического картографического устройства, трансиллюминатор и нагреватель пластин включены.
  2. Откройте программное обеспечение для сбора данных и определите место сохранения файла.
  3. Откройте передний ящик и установите тарелку на нагреватель.
  4. Получите темную рамку, нажав кнопку « Темная рамка ».
  5. Выберите «Продолжительность (10–30 с)» и «Частота кадров съемки» (например, 100 кадров в секунду; 250 кадров в секунду для более высокого временного разрешения) и нажмите «Начать съемку».
  6. Откройте аналитическое программное обеспечение и на вкладке « Импорт/фильтр » выберите « Обзор одного файла» или « Несколько плиток », чтобы восстановить пластину.
  7. Выберите «Режим параметров» (APD или CaTD), введите «Расстояние на пиксель» и используйте мастер скважин для определения местоположения скважин на изображении. Нажмите кнопку Process Save (Сохранить процесс), чтобы перейти на следующую вкладку.
  8. Откройте вкладку ROI (области интереса) и выберите, чтобы нарисовать ROI вручную, автоматически или вообще не использовать ROI, что затем рассмотрит весь колодец для анализа. После того, как рентабельность инвестиций будет выбрана, нажмите кнопку «Обработать/Сохранить», чтобы перейти к следующему шагу. Установите флажки «Скрыть колодцы» и «Показывать только отфильтрованные», чтобы визуализировать рентабельность инвестиций.
  9. Откройте вкладку «Анализ » и в правом верхнем углу экрана выберите каждую скважину или ROI , чтобы подтвердить точность автоматического обнаружения ударов. Добавьте или удалите биты из трассировок, нажав «Добавить бит» / «Сохранить биты» или выбрав отдельный бит и нажав клавишу «Delete » на клавиатуре.
  10. При желании используйте функцию «Средние тепловые карты » для создания тепловых карт выбранных параметров для пластины.
  11. Нажмите кнопку «Пространственно-временной график» на вкладке «Анализ», чтобы визуализировать данные для каждой скважины или окупаемости инвестиций. Убедившись, что определение биений точно, перейдите на вкладку «Экспорт» и выберите «Формат файла». Нажмите «Экспорт» и создайте папку для экспортируемых данных. Перейдите к открытию файлов данных и запустите выбранную процедуру статистического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы .xlxs предпочтительнее, так как все параметры экспортируются в один файл; Другие форматы (.csv или .tsv) генерируют один файл для каждого параметра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Созревание hiPSC-CM, характеризующееся фазовым контрастом и иммунофлюоресцентной конфокальной визуализацией
График ECM-опосредованного созревания коммерчески доступных hiPSC-CM с использованием 96-луночных планшетов с покрытием MECM представлен на рисунке 1A. Эти данные собираются с использованием коммерчески доступных кардиомиоцитов, которые поступают в лабораторию в виде криоконсервированных флаконов с клетками. Каждый флакон содержит >5 ×10,6 жизнеспособных кардиомиоцитов. Клетки имеют чистоту ~ 98% и тщательно протестированы для контроля качества (сертификат анализа прилагается к каждому флакону). Большое количество CM позволяет размораживать и наносить CM на различные комбинации ECM, используя одну и ту же партию ячеек. На рисунке 1 hiPSC-CM нанесены на пластины с покрытием ECM или MECM мыши. hiPSC-CM, нанесенные на MECM, созревают и структурно отличаются от той же партии hiPSC-CM, нанесенных на ECM мыши. А именно, зрелые клетки приобретают палочковидную форму, в то время как незрелые клетки сохраняют круглую форму. Это можно увидеть при фазово-контрастной визуализации и при окрашивании миофиламентов сердца (рис. 1B; тропонин I [TnI], красный). Более обширная проверка структурного созревания hiPSC-CM представлена на рисунке 2. Большое поле зрения (20-кратный объектив) КМ, окрашенных антителом α-актинина, показывает типичную форму клеток, культивируемых при каждом состоянии ECM. α-актинин является критическим структурным белком, расположенным с регулярным интервалом в миофиламентах сердца. В соответствии с окрашиванием TnI на рисунке 1, окрашивание α-актинина дополнительно указывает на созревание hiPSC-CM, культивируемых на MECM. Помимо развития паловидного зрелого фенотипа, MECM также индуцирует большую организацию саркомера (60-кратные изображения). Содержание и активность митохондрий также различаются между клетками, культивируемыми на ECM мыши и MECM (рис. 2B). Незрелое митохондриальное содержимое hiPSC-CM плода ограничено перинуклеарным пространством, при этом в цитозоле обнаруживается мало митохондрий. Напротив, зрелое митохондриальное содержимое hiPSC-CMs распределяется по всей клетке. Для оценки митохондрий используется установленный протокол19.

Дифференцировка hiPSC и спецификация сердечной камеры
Здесь приведен протокол для собственного производства и созревания очищенных камерных hiPSC-CM (рис. 3A). Это основано на ранее опубликованном отчете20. Представлены подробные процедуры очистки hiPSC-CM с использованием коммерчески доступного набора для сортировки клеток, активируемого магнитом (MACS). Недавно мы проверили использование очистки MACS и показали преимущества использования MACS по сравнению с очисткой hiPSC-CM на основе метаболизма; как правило, чистота hiPSC-CM выше 95% ожидается21. Важно отметить, что если исходное содержание CM составляет <50%, очистка MACS может достигать только ~ 85%. В этих случаях может потребоваться обогащение КМ после истощения не-КМ. Если исходное содержание КМ от дифференцировки составляет >50%, истощение не-КМ из клеточной популяции с использованием набора MACS может достичь чистоты >95%; в этом случае дальнейшее обогащение или положительный отбор КМ не нужны. Специфичные для камеры hiPSC-CM также могут созревать с использованием 96-луночных пластин с покрытием MECM, как описано выше и показано на рисунках 1 и 2. Следует ожидать, что предсердные специфические клетки (hiPSC-ACM) имеют значительно более высокую частоту спонтанных ударов и более короткую продолжительность потенциала действия 80 (APD80), чем желудочково-специфические клетки (hiPSC-VCM). Это типичные электрофизиологические данные о потенциалах действия, регистрируемых с помощью VSD и системы оптического картирования (рис. 3B-D).

Высокопроизводительное электрофизиологическое оптическое картирование сердца
Научная строгость резко возрастает для любого анализа, если он может быть выполнен с высокой пропускной способностью. Данные скрининга кардиотоксичности представлены на рисунках 4, 5, 6 и 7, где показан высокопроизводительный электрофизиологический скрининг с использованием зрелых монослоев hiPSC-CM в 96-луночном планшете. Тепловые карты всей пластины для таких параметров, как APD80 (рис. 4A), показывают воспроизводимость заданного параметра в пределах пластины от скважины к скважине. Кроме того, цельные тепловые карты обеспечивают быстрое изучение любых выбросов в наборе данных. Например, в скважине E4 пластины, представленной на рисунке 4A, ясно, что эта скважина имеет гораздо большее значение APD80, на что указывает желтая лунка, в то время как другие скважины индиго-синие. Типичные потенциалы действия зрелых монослоев 2D hiPSC-CM (рис. 4B) напоминают морфологию потенциала действия кардиомиоцитов взрослого человека, выделенных и протестированных в культуре. Кроме того, типичный спонтанный ритм потенциала действия показан на рисунке 4C. Данные на рисунке 4C представляют собой пространственно-временной график строки A, столбцы 1-12. Это показано белой линией на карте плит на рисунке 4A. Каждая яркая флуоресцентная вспышка с течением времени в каждой лунке представляет собой одну спонтанную активацию. На рисунках 5 и 6 показана полезность использования генетически кодируемого кальциевого индикатора GCaMP6m (GECI) для измерения внутриклеточных кальциевых переходных процессов; На рисунке 6 также показан ожидаемый ответ на изопротеренол - классический сердечный положительный инотроп. В ответ на изопротеренол активация β1-адренорецепторов вызывает положительную хронотропию (рис. 6А), положительную инотропию (рис. 6В) и положительную лузитропию (рис. 6В). Эти реакции на изопротеренол указывают на значительное созревание β1-адреноловых рецепторов hiPSC-CM и внутриклеточных сигнальных каскадов.

На рисунке 7 показан ответ hiPSC-CM на блокаторы каналов человеческого гена, связанного с эфиром (hERG), с использованием флуоресценции кальция GCaMP6m для мониторинга ритма и использования в качестве суррогатного маркера сократимости. E-4031 является блокатором каналов, специфичным для hERG, который замедляет скорость спонтанного биения и увеличивает продолжительность переходного процесса кальция (CaTD80) и триангуляции (триангуляция CaT). На рисунке 7A показано обнаружение ранних постдеполяризаций, вызванных блокадой канала Е-4031 hERG. Другие блокаторы каналов hERG, включая домперидон, вандетаниб и соталол, также были протестированы, и результаты показаны на рисунке 7E-G. Эти соединения и дозы были выбраны на основе недавнего валидационного исследования hiPSC-CM 1,7,9.

Figure 1
Рисунок 1: График быстрого созревания коммерчески доступных или криоконсервированных hiPSC-CM из других источников . (A) Размороженные кардиомиоциты, взвешенные в гальванической среде, наносят на MECM на 0-й день. На 2-й день среда заменяется поддерживающей средой, а отработанная среда заменяется на 5-й день. Клетки культивируют в течение дополнительных 2 дней, а на 7-й день зрелые синцитии hiPSC-CM могут быть загружены записывающим раствором для последующих применений или культивированы в течение более длительных периодов времени. (B) Контрастная фаза синцитии кардиомиоцитов, нанесенных на ECM мыши или MECM, показывает, что кардиомиоциты, нанесенные на ECM мыши, имеют большую цикличность по сравнению с кардиомиоцитами, нанесенными на MECM; кроме того, иммуноокрашивание на TnI указывает на то, что кардиомиоциты, нанесенные на ECM мыши, сохраняют морфологию радиальной симметрии и дезорганизованные саркомеры в отличие от долихоморфных и хорошо структурированных hiPSC-CM, нанесенных на MECM. Масштабные линейки = 100 мкм (B, верхний); 50 мкм (B, ниже). Сокращения: hiPSC-CMs = индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из стволовых клеток; ECM = внеклеточный матрикс; MECM = ECM, индуцирующий созревание; 96wp = 96-луночная пластина; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; TnI = тропонин I. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сравнение саркомерной организации hiPSC-CM, нанесенных на ECM мыши или MECM. (A) Культивируемые на ECM мыши hiPSC-CM, иммуноокрашенные против α-актинина, указывают на радиальную морфологию с более низкой плотностью саркомеров, диспергированных через кардиомиоциты, в отличие от hiPSC-CM из той же партии, нанесенных на матрицу и имеющих палочковидную морфологию (20x). (60x) Наблюдение hiPSC-CM с помощью конфокальной микроскопии показывает, что hiPSC-CM, культивируемые на ECM мыши, имеют морфологию радиальной симметрии с более плотным периметральным распределением саркомеров и низкой плотностью радиальных саркомеров в отличие от hiPSC-CM из той же партии, которые культивировались на MECM. Они представляют собой однородное распределение саркомеров, организованных вдоль более длинной оси клеток. Масштабные линейки = 100 мкм (верхние); 50 мкм (ниже). (B) Окрашивание hiPSC-CM, культивируемых на ECM мыши или MECM, митохондриальным красителем, который окрашивает митохондрии с высоким трансмембранным потенциалом, показывает более низкую интенсивность окрашивания в кардиомиоцитах, культивируемых на ECM мыши, по сравнению с MECM. Кроме того, hiPSC-CM, культивируемые на MECM, имеют митохондрии, однородно распределенные в кардиомиоцитах, в отличие от hiPSC-CM, культивируемых на ECM мыши, которые представляют собой перинуклеарное накопление митохондрий. Масштабные линейки = 200 мкм. Сокращения: hiPSC-CMs = индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из стволовых клеток; ECM = внеклеточный матрикс; MECM = ECM, индуцирующий созревание; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Продуцирование камероспецифических кардиомиоцитов. (A) Протоколы производства камерно-специфических кардиомиоцитов имеют идентичные манипуляции с сигнальным путем Wnt со стимуляцией передачи сигналов Wnt путем ингибирования GSK3 с 0 по 2 день и ингибированием этого пути между 2 и 4 днями. Спецификация камеры достигается активацией пути ретиноевой кислоты и манипуляциями с сигнализацией Wnt между 3 и 6 днями. (B) В результате спецификации камеры кардиомиоциты предсердий демонстрируют более высокую скорость спонтанной деполяризации по сравнению с желудочковыми кардиомиоцитами. (C) желудочковые hiPSC-CM имеют более медленную частоту ударов по сравнению с предсердными hiPSC-CM; следовательно, продолжительность потенциала действия при 80% реполяризации короче у hiPSC-ACM по сравнению с hiPSC-VCM. Сокращения: hiPSC-CMs = индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из стволовых клеток; hiPSC-ACM = индуцированные предсердием человеческие плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток; hiPSC-VCM = желудочковые кардиомиоциты человека, индуцированные плюрипотентными стволовыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Оптическое картирование, полученное с помощью оптического картографического устройства и проанализированное с помощью Pulse. (А) Пример тепловой карты для целостного наблюдения параметров, оцененных на 96-луночном планшете после кинофильтрации, и определения областей, представляющих интерес на 96-луночных планшетах, картографированных с помощью оптического картографического устройства. В этом примере тепловая карта APD80%, которая указывает на выбросную скважину (E4) и скважины, которые не смогли получить данные (скважины H3, 4 и 5). (B) Кроме того, удобный интерфейс позволяет легко строить графики средней морфологии потенциала действия из выбранных скважин. c) наличие дополнительных средств визуализации данных; в этом примере пространственно-временной график, построенный из горизонтальной линии, пересекающей скважины в ряду A (панель A), показывает активацию на горизонтальном участке каждой скважины (белая линия через ряд A) в течение 10 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Временная шкала для картирования внутриклеточных переходных изменений кальция с помощью генетически кодируемого кальциевого индикатора. На 4-й день после нанесения коммерчески доступных кардиомиоцитов на 96-луночную пластину с покрытием MECM, как показано на рисунке 1A, клетки должны быть трансдуцированы 5 MOI вируса в среде анализа CM в течение ночи. Среда заменяется поддерживающей средой CDI до 6-го дня и заменяется на поддерживающую среду CDI без фенол-красного между 7 и 11 днями, чтобы обеспечить быстрый или непрерывный мониторинг внутриклеточных переходных изменений кальция с помощью Nautilus. (B) hiPSC-CMstransduced с AdGCaMP6f, оцененный с помощью оптического картирования на 7, 9 и 10-й день после оттаивания, указывает на наличие стабильных внутриклеточных кальций-опосредованных изменений флуоресценции, которые позволяют ежедневно проводить оптическое картирование одной и той же пластины в течение длительного периода времени без необходимости повторного нанесения чувствительных к кальцию красителей. Сокращения: GECI = генетически кодируемый индикатор кальция; СМ = кардиомиоцит; MOI = множественность заражения; 96wp = 96-луночная пластина; BSA = бычий сывороточный альбумин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Быстрое и простое использование тепловых карт для визуального сравнения данных, полученных из зрелых функциональных синцитий hiPSC-CM с Nautilus и проанализированных с помощью Pulse. (A) hiPSC-CM, обработанные изопротеренолом, демонстрируют увеличение частоты биений, что наблюдается при проверке тепловых карт и подтверждается парным t-критерием. (B) Аналогичным образом, картирование клеток до и после обработки изопротеренолом показывает инотропный эффект β-адренергической стимуляции путем визуального сравнения тепловых карт и с парным t-критерием. (C) Наконец, использование тепловых карт для визуального сравнения данных показывает лузитропию, еще один канонический эффект β-адренергической стимуляции, подтвержденный парным t-критерием (p < 0,0001). Отсутствие круга указывает на сбой в сборе/анализе данных для этой конкретной скважины. Сокращения: hiPSC-CMs = индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из стволовых клеток; ISO = изопротеренол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Валидация скринингового анализа кардиотоксичности GECI с использованием блокаторов каналов hERG. (А) Репрезентативные спонтанные следы потока кальция из исходных лунок в HBSS и в присутствии 500 нМ E-4031. (Б-Д) Количественная оценка влияния исходного уровня и +E-4031 на частоту ударов, продолжительность переходного процесса кальция 80 (CaTD80) и триангуляцию переходных процессов кальция (триангуляция CaT) соответственно. *,** обозначает существенную разницу; непарный Т-критерий; р < 0,01; n = 8 в каждой группе. (E) Обнаружение GECI другого блокатора hERG, домперидона. (F) Обнаружение блоком hERG, индуцированным вандетанибом, с помощью GECI. (G) Обнаружение блокировки hERG с помощью высокой дозы соталола. Сокращения: GECI = генетически кодируемый индикатор кальция; hERG = ген, связанный с Ether-a-go-go человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Носители и их составы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует несколько различных подходов к скринингу кардиотоксичности in vitro с использованием hiPSC-CM. В недавнем документе «Передовая практика» по использованию hiPSC-CM были представлены различные анализы in vitro , их первичные показания и, что важно, детализация каждого анализа для количественной оценки электрофизиологической функции сердца человека20. В дополнение к использованию прокалывающих мембрану электродов, наиболее прямое измерение электрофизиологической функции сердца человека обеспечивается ДМЖП. Показания анализа ДМЖП позволяют напрямую визуализировать и количественно определять критические электрофизиологические параметры, включая продолжительность потенциала действия, скорость распространения потенциала действия, подъем потенциала действия, триангуляцию потенциала действия, частоту ударов, регулярность ударов и неоднородности продолжительности потенциала действия. Точно так же чувствительные к кальцию зонды предлагают информацию о ритме, скорости и продолжительности событий монослоя hiPSC-CM. Измерения переходных процессов кальция hiPSC-CM, выполненные с использованием флуоресцентных зондов, также предоставляют информацию о сократительной способности и сократительной силе каждого сокращения. В данной работе представлены методы использования зрелых hiPSC-CM (96-луночных планшетов) в высокопроизводительных анализах измерения ДМЖП и кальция. Помимо методов оптического картографирования, представлено программное обеспечение для высокопроизводительного анализа данных ЭП.

Методы, изложенные здесь, являются значительным шагом вперед в области скрининга кардиотоксичности и регуляторной науки. Здесь мы представили методы быстрого созревания и электрофизиологической регистрации монослоев 2D hiPSC-CM в высокопроизводительных скрининговых пластинах (96-луночные планшеты). Быстрое созревание с использованием MECM (7 дней), показанное здесь, является значительным шагом вперед по сравнению с предыдущими подходами, требующими, чтобы созревание происходило в течение 30-100 дней22,23. По сравнению с другими ЭБМ, которые требуют ручного применения для каждого эксперимента, пластины MECM предварительно покрываются ECM и поступают в лабораторию готовыми к использованию. Этот аспект MECM делает его более простым в использовании, менее изменчивым и более эффективным, чем использование других покрытий ECM. Важно отметить, что этот подход может быть использован как для криоконсервированных, коммерчески доступных hiPSC-CM, так и для «самодельных» hiPSC-CM, которые могут быть специфичными для камеры. Из-за отчетливой палочковидной структуры зрелых hiPSC-CM (рис. 1 и рис. 2) важно отметить, что для образования сливающегося монослоя здесь требуется большее количество клеток по сравнению с протоколами, использующими другие ECM. Примечательно, что при использовании ECM мыши (клетки имеют непрерывно распространяющийся фенотип блина) мы наносим 50 000 hiPSC-CM на лунку, но при использовании MECM мы наносим 75 000 hiPSC-CM на лунку. Количество КМ на лунку также может быть уменьшено, если клетки будут использоваться для анализа отдельных клеток, таких как пластырный зажим или любой другой метод визуализации, требующий одиночных клеток.

Коммерчески доступные hiPSC-CM предлагают преимущества для регуляторной науки из-за обширной характеристики этих клеток международными усилиями под руководством Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). Тем не менее, коммерчески доступные клетки представляют собой смесь узловых, предсердных и желудочковых hiPSC-CM, которые предоставляют очень важную информацию о токсичности, но не имеют специфических для камеры функций, которые имитируют сердце человека. Камерно-специфические hiPSC-CM воссоздают хорошо известные электрофизиологические различия между предсердными и желудочковыми кардиомиоцитами и обеспечивают анализ in vitro для разработки камерно-специфической антиаритмической терапии (рис. 3B-D). Например, лекарства, специфичные для фибрилляции предсердий, теперь могут быть протестированы и разработаны с использованием монослоев hiPSC-ACM, покрытых 96-луночными планшетами, для надежного и тщательного сбора данных. Аналогичным образом, при скрининге, чтобы определить, вызывает ли соединение Torsades de Pointes (TdP), желудочковую аритмию высокого риска, оптимально не иметь предсердных и узловых клеток, «загрязняющих» монослои желудочков сердца. Таким образом, несмотря на то, что усилия FDA по валидации hiPSC-CM на сегодняшний день были сосредоточены на использовании коммерчески доступных CM, вполне вероятно, что будущие рекомендации по регулированию будут обращены к использованию камерно-специфических клеток, чтобы сделать скрининг токсичности еще более прогностическим состоянием сердца человека. Методы, изложенные здесь, основаны на предыдущих отчетах и обеспечивают надежный подход к генерации камерно-специфических кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток21.

Основное различие между этими протоколами и теми, которые обычно используются в полевых условиях, заключается в используемом подходе к очистке. Большинство лабораторий, которые генерируют hiPSC-CM в своих собственных лабораториях, полагаются на метаболически опосредованный отбор кардиомиоцитов22. Здесь мы полагаемся на использование MACS для очистки hiPSC-CM, используя клинически одобренный подход к клеточной обработке, который производит CM с более здоровыми фенотипами23. Метаболический подход эффективен, но использует среднюю формулировку, которая имитирует ишемию миокарда24. При использовании очистки MACS hiPSC-CM важно использовать коктейль истощения без CM, который нацелен на не-CM для магнитного истощения из популяции клеток. Использование подхода, не связанного с истощением КМ, сводит к минимуму напряжение сдвига, которое испытывают КМ в магнитном столбе, и является предпочтительным по сравнению с прямой магнитной маркировкой популяции КМ. Использование очистки камерных клеток MACS позволит другим лабораториям создавать здоровые CM для исследований и тестирования токсичности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

TJH является консультантом и научным советником StemBioSys, Inc. TB является сотрудником StemBioSys, Inc. AMR и JC являются бывшими консультантами StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR и JC являются акционерами StemBioSys, Inc.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIH HL148068-04 и R44ES027703-02 (TJH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin EDTA Gibco 25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) Millipore Sigma A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) Millipore Sigma H4034
AdGCaMP6m Vector biolabs 1909
Albumin human Sigma A9731-1G
alpha actinin antibody ThermoFisher MA1-22863
B27 Gibco 17504-044
Blebbistatin Sigma B0560
CalBryte 520AM AAT Bioquest 20650
CELLvo MatrixPlus 96wp StemBiosys N/A https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021 LC Laboratories c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite) ThermoFisher A1896701 For adenovirus transduction
DAPI ThermoFisher 62248
DMEM:F12 Gibco 11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135-500ML
FluoVolt ThermoFisher F10488
HBSS Gibco 14025-092
iCell CM maintenance media FUJIFILM/Cellular Dynamics M1003
iCell2 CMs FUJIFILM 1434
Incucyte Zoom  Sartorius
iPS DF19-9-11T.H WiCell
Isoproterenol MilliporeSigma CAS-51-30-9
IWP4 Tocris 5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960-5g
L-glutamine Gibco A2916801
LS columns Miltenyii Biotec 130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) Miltenyii Biotec 130-091-221
Matrigel Corning 354234
MitoTracker Red ThermoFisher M7512
Nautilus HTS Optical Mapping  CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope Nikon
nonessential amino acids Gibco 11140-050
pre-separation filter Miltenyii Biotec 130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human Miltenyii Biotec 130-110-188
Pulse CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet) Miltenyii Biotec 130-091-051
Retinoic acid Sigma R2625
RPMI 1640  Gibco 11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) Gibco 22400-089
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyii Biotec 130-107-086
TnI antibody (pan TnI) Millipore Sigma MAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) Gibco 15040-066
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
β-mercaptoethanol Gibco 21985023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193
Высокопроизводительный скрининг кардиотоксичности с использованием зрелых монослоев кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monteiro da Rocha, A., Allan, A.,… More

Monteiro da Rocha, A., Allan, A., Block, T., Creech, J., Herron, T. J. High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers. J. Vis. Exp. (193), e64364, doi:10.3791/64364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter