Summary
Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) tilbyr et alternativ til å bruke dyr til preklinisk kardiotoksisitetsscreening. En begrensning for den utbredte adopsjonen av hiPSC-CMs i preklinisk toksisitetsscreening er den umodne, fosterlignende fenotypen til cellene. Her presenteres protokoller for robust og rask modning av hiPSC-CM.
Abstract
Humane induserte stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) brukes til å erstatte og redusere avhengigheten av dyr og dyreceller for preklinisk kardiotoksisitetstesting. I todimensjonale monolagsformater rekapitulerer hiPSC-CMs strukturen og funksjonen til de voksne menneskelige hjertemuskelcellene når de dyrkes på en optimal ekstracellulær matrise (ECM). En human perinatal stamcelleavledet ECM (modningsinduserende ekstracellulær matriks-MECM) modner hiPSC-CM-strukturen, funksjonen og metabolsk tilstand i 7 dager etter plating.
Modne hiPSC-CM monolayers responderer også som forventet på klinisk relevante medikamenter, med kjent risiko for å forårsake arytmier og kardiotoksisitet. Modningen av hiPSC-CM monolayers var et hinder for den utbredte adopsjonen av disse verdifulle cellene for regulatorisk vitenskap og sikkerhetsscreening, til nå. Denne artikkelen presenterer validerte metoder for plettering, modning og høy gjennomstrømning, funksjonell fenotyping av hiPSC-CM elektrofysiologisk og kontraktil funksjon. Disse metodene gjelder for kommersielt tilgjengelige rensede kardiomyocytter, så vel som stamcelleavledede kardiomyocytter generert internt ved hjelp av svært effektive, kammerspesifikke differensieringsprotokoller.
Elektrofysiologisk funksjon med høy gjennomstrømning måles ved hjelp av enten spenningsfølsomme fargestoffer (VSD; utslipp: 488 nm), kalsiumfølsomme fluoroforer (CSF) eller genetisk kodede kalsiumsensorer (GCaMP6). En optisk kartleggingsenhet med høy gjennomstrømning brukes til optiske opptak av hver funksjonsparameter, og tilpasset dedikert programvare brukes til elektrofysiologisk dataanalyse. MECM-protokoller brukes til medisineringsscreening ved bruk av et positivt inotropt (isoprenalin) og humant Ether-a-go-go-relatert gen (hERG) kanalspesifikke blokkere. Disse ressursene vil gjøre det mulig for andre etterforskere å utnytte modne hiPSC-CMs for høy gjennomstrømning, preklinisk kardiotoksisitetsscreening, hjertemedisineffektivitetstesting og kardiovaskulær forskning.
Introduction
Humane induserte pluripotente stamcellederiverte kardiomyocytter (hiPSC-CM) er validert på internasjonal skala, og er tilgjengelige for in vitro kardiotoksisitetsscreening1. Svært rene hiPSC-CM-er kan genereres i nesten ubegrenset antall, kryopreserveres og tines. Ved replating gjenoppliver de også og begynner å trekke seg sammen med en rytme som minner om menneskets hjerte 2,3. Bemerkelsesverdig, individuelle hiPSC-CMs par til hverandre og danner funksjonell syncyti som slår som et enkelt vev. I dag er hiPSCs rutinemessig avledet fra pasientens blodprøver, slik at enhver person kan representeres ved hjelp av in vitro hiPSC-CM kardiotoksisitetsscreeningsanalyser 4,5. Dette skaper muligheten til å utføre "Clinical Trials in a Dish", med betydelig representasjon fra ulike populasjoner6.
En kritisk fordel i forhold til eksisterende kardiotoksisitetsscreeningsmetoder for dyre- og dyreceller er at hiPSC-CMs bruker hele det menneskelige genomet og tilbyr et in vitro-system med genetiske likheter med menneskets hjerte. Dette er spesielt attraktivt for farmakogenomikk og personlig medisin - bruk av hiPSC-CMs for medisinering og annen terapiutvikling antas å gi mer nøyaktige, presise og sikre medisineringsresepter. Faktisk har todimensjonale (2D) hiPSC-CM monolagsanalyser vist seg å være prediktive for kardiotoksisitet av medisiner, ved bruk av et panel av klinisk brukte medisiner med kjent risiko for å forårsake arytmier 1,7,8,9. Til tross for det enorme potensialet til hiPSC-CMs og løftet om å effektivisere og gjøre legemiddelutvikling billigere, har det vært en motvilje mot å bruke disse nye analysene10,11,12.
Hittil er en stor begrensning av utbredt adopsjon og aksept av hiPSC-CM screeninganalyser deres umodne, fosterlignende utseende, så vel som deres funksjon. Det kritiske spørsmålet om hiPSC-CM modning har blitt gjennomgått og debattert i den vitenskapelige litteraturen ad nauseum13,14,15,16. På samme måte har mange tilnærminger blitt brukt for å fremme hiPSC-CM-modning, inkludert ekstracellulær matrise (ECM) manipulasjoner i 2D monolayers og utviklingen av 3D-konstruerte hjertevev (EHTs)17,18. For øyeblikket er det en utbredt oppfatning at bruken av 3D EHT-er vil gi overlegen modning i forhold til 2D monolayer-baserte tilnærminger. Imidlertid gir 2D monolayers en høyere effektivitet av celleutnyttelse og økt suksess i plating sammenlignet med 3D EHT-er; 3D EHT-er bruker større antall celler, og krever ofte inkludering av andre celletyper som kan forvirre resultater. Derfor er fokuset i denne artikkelen på å bruke en enkel metode for å modne hiPSC-CMs dyrket som 2D monolayers av elektrisk og mekanisk koblede celler.
Avansert hiPSC-CM-modning kan oppnås i 2D monolayers ved bruk av en ECM. 2D-monolagene av hiPSC-CMs kan modnes ved hjelp av et mykt, fleksibelt polydimetylsiloksandeksel, belagt med kjellermembranmatrise utskilt av en Engelbreth-Holm-Swarm-musesarkomcelle (mus ECM). I 2016 viste rapporter at hiPSC-CMs dyrket på denne myke ECM-tilstanden modnet funksjonelt, og viste aksjonspotensielle ledningshastigheter nær voksne hjerteverdier (~ 50 cm / s) 18. Videre viste disse modne hiPSC-CMene mange andre elektrofysiologiske egenskaper som minner om det voksne hjertet, inkludert hyperpolarisert hvilemembranpotensial og ekspresjon av Kir2.1. Mer nylig identifiserte rapporter et humant perinatalt stamcelleavledet ECM-belegg som fremmer strukturell modning av 2D hiPSC-CMs19. Her presenteres brukervennlige metoder for strukturelt modne 2D hiPSC-CM monolayers for bruk i elektrofysiologiske skjermer med høy gjennomstrømning. Videre tilbyr vi validering av et optisk kartleggingsinstrument for automatisert innsamling og analyse av 2D hiPSC-CM monolags elektrofysiologisk funksjon, ved bruk av spenningsfølsomme fargestoffer (VSD) og kalsiumfølsomme sonder og proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSC-bruk i denne protokollen ble godkjent av University of Michigan HPSCRO Committee (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Se materialfortegnelsen for en liste over materialer og utstyr. Se tabell 1 for medier og deres komposisjoner.
1. Tining og plating av kommersielt tilgjengelige kryopreserverte hiPSC-CMs for modning på en modningsinduserende ekstracellulær matriks (MECM)
- Varm alle reagensene til romtemperatur og rehydrer MECM-platene med Hanks balanserte saltløsning (HBSS) eller fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder kalsium og magnesium, i 1 time før kardiomyocyttbelegg (200 μL buffer per brønn på en 96-brønnsplate).
- Vask MECM-platene 2x med HBSS eller PBS som inneholder kalsium og magnesium i 1 time før kardiomyocyttbelegg (200 μL buffer per brønn på en 96-brønnsplate) og hold brønnene hydrert.
- Forbered et vannbad på 37 °C.
- Fjern kardiomyocytrørene fra tanken med flytende nitrogen, overfør rørene til tørris, og åpne rørhettene litt for å frigjøre trykk.
MERK: Å slippe trykk i rørene er ekstremt viktig! Hvis for mye trykk bygger inne i rørene, kan de eksplodere. - Forsegle slangehettene igjen og legg dem i vannbadet for å tine i 4 minutter.
MERK: La dem tine helt, for å unngå celleskader på grunn av delvis tining. - Etter at cellene tiner, spray rørene med 70% etanol før åpning. Overfør cellene til 15 ml koniske rør med en 1 ml pipette. Drypp sakte 8 ml pletteringsmedium, rør hver gang 1 ml tilsettes, slik at cellene kan tilpasse seg endringer i osmolaritet.
- Vask kryovialet med 1 ml pletteringsmedium med en 1 ml glasspipette. Drypp deretter vasken sakte ned i det koniske røret på 15 ml.
- Sentrifuger rørene ved ~300 × g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml pletteringsmedium. Fjern en alikot og utfør levende celletelling med et hemocytometer. Tilsett ekstra pletteringsmedium for å oppnå 7,5 × 105 celler/ml.
MERK: Omtrent 10 ml cellesuspensjon er nødvendig for å forberede 96 brønner. - Dispenser 100 μL cellesuspensjon per brønn av en MECM-belagt 96-brønnsplate ved hjelp av en flerkanalspipett.
MERK: Sørg for å unngå celleutfelling og oppnå jevn celletetthet i alle brønner under plating. - Inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO 2 i2 dager før du skifter medium til vedlikeholdsmedium (200 μL/brønn). Bytt vedlikeholdsmedium på dag 5 etter tining. Utfør EP-analyser på dag 7 eller senere, som beskrevet tidligere 8,9. Bytt medium annenhver dag når du velger å utvide cellekulturen.
2. hiPSC hjerterettet differensiering og hiPSC-CM-rensing
- Varm 1x kommersielt tilgjengelig etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning, HBSS uten kalsium og magnesium (HBSS-), og 6-brønnsplater belagt med løselig kjellermembranmatrise utskilt av en Engelbreth-Holm-Swarm mussarkomcelle (mus ECM) til romtemperatur.
- Merk de differensierte koloniene ved fasekontrastmikroskopi og aspirat/ablat. Vask hver brønn med 1 ml HBSS--. Utfør to vasker i brønner som inneholder >10 differensieringspunkter.
- Aspirer HBSS - og tilsett 1 ml EDTA-løsning til hver brønn. Inkuber platene i opptil 5 minutter ved 37 °C. Sjekk platene etter 3 min og se etter gjennomsiktige hvite, synlige kolonier.
- Aspirer EDTA-løsningen og tilsett 1 ml til en enkelt brønn. Fjern cellene med 2 ml hissc-medium ved å pipetere suspensjonen opp og ned gjentatte ganger ved hjelp av en 10 ml glasspipette for å løsne alle stamceller fra brønnen, og overfør cellesuspensjonen til et oppsamlingsrør. Gjenta aspirasjonen og løsne med etterfølgende brønner.
MERK: Fjern kolonier som er vanskelige å løfte med spissen av glasspipetten. - Tell stamceller og juster volumet til plate 8,0 × 105 celler / brønn. Dyrk cellene på hiPSC-medium (2 ml / brønn) til stamcellene når 90% konfluens (denne gangen refereres fra nå av som D0).
- Klargjør 2 ml basalt differensieringsmedium tilsatt 4 μM CHIR99021.
- På D0, vask hver brønn av en 6-brønns plate av stamceller med 1 ml HBSS per brønn. Erstatt HBSS med basalt differensieringsmedium supplert med 4 μM CHIR99021.
- På D1, gjør ingenting.
- På D2, lag basal differensieringsmedium supplert med 4 μM IWP4.
- Erstatt mediet med 2 ml IWP4-supplert basal differensieringsmedium per brønn.
- På D3, gjør ingenting for en ventrikkel-spesifikk differensiering. For en atriespesifikk differensiering, aspirer mediet og tilsett 2 ml basalmedium supplert med 4 μM IWP4 og 1 μM retinsyreoppløsning (RA) per brønn.
- På D4, aspirer mediet og tilsett 2 ml basalmedium per brønn for ventrikulær differensiering. For en atriedifferensiering, aspirer mediet og tilsett 2 ml basalmedium supplert med 1 μM RA-oppløsning per brønn.
- På D5, gjør ingenting.
- På D6, aspirer mediet og tilsett 2 ml basalmedium per brønn (for både atriell og ventrikulær differensiering).
- På D7, gjør ingenting.
- På D8, aspirer mediet og tilsett 2 ml kardiomyositt vedlikeholdsmedium. Bytt medium annenhver dag til celleseparasjon, eller følg en kronisk legemiddeleksponeringsplan.
3. hiPSC-CM rensing via MACS (magnetisk-aktivert cellesortering)
- Aspirer cellekulturmediet og vask hver brønn med 1 ml HBSS--. Dissosiere cellene ved å tilsette 1 ml 0,25% trypsin / EDTA og inkubere ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 minutter. Resuspendere og singularisere cellene i hver brønn med 2 ml pletteringsmedium for å inaktivere trypsin / EDTA.
- Samle cellene fra de seks brønnene i et 50 ml konisk rør med en 70 μm sil. Vask deretter silen med 3 ml pletteringsmedium. Tell cellene.
- Sentrifuger suspensjonen ved ~300 × g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og vask cellene med 20 ml iskald MACS separasjonsbuffer. Deretter sentrifugerer du igjen ved ~300 × g i 5 minutter.
- Resuspender pelleten i 80 μL kald MACS separasjonsbuffer per 5 × 106 celler. Tilsett 20 μL kald ikke-kardiomyocyttuttømmingscocktail (menneske) per 5 × 106 celler. Bland cellesuspensjonen forsiktig og rug på is i 10 minutter.
- Vask prøven ved å tilsette 4 ml kald MACS separasjonsbuffer per 5 × 106 celler. Sentrifuge prøven ved ~300 × g i 5 minutter og aspirer supernatanten.
- Resuspender pelleten i 80 μL kald MACS separasjonsbuffer per 5 × 106 celler. Tilsett 20 μL kalde anti-biotinmikroperler per 5 × 106 celler. Bland cellesuspensjonen forsiktig og rug i 10 minutter på is.
- Mens prøvene ruger, plasser de positive uttømmingskolonnene (utstyrt med 30 μm pre-separasjonsfiltre) på MACS-separatoren, og plasser de merkede 15 ml oppsamlingsrørene under kolonnene. En kolonne er nødvendig for hver 5 × 106 celler.
- Prime hver kolonne med 3 ml kald MACS separasjonsbuffer. Bland den antistoffbehandlede cellesuspensjonen med 2 ml MACS separasjonsbuffer per 5 × 106 celler, og legg til kolonnen.
MERK: Ikke sentrifuge! Sentrifugering på dette trinnet har skadelige effekter på kardiomyocytutbyttet. - Legg til 2 ml MACS separasjonsbuffer til hver kolonne, og samle gjennomstrømningen til 12 ml gjennomstrømningskardiomyocyttsuspensjon er samlet.
MERK: La aldri kolonnene tørke helt. - Sentrifuger kardiomyocyttene ved ~300 × g i 5 minutter, kast supernatanten og suspender kardiomyocyttene i 1 ml pletteringsmedium.
- Telle cellene for å bestemme konsentrasjonen, juster volumet til ønsket såtetthet og plate cellene. Plate de rensede kardiomyocyttene på MECM 96-brønnplatene, som beskrevet ovenfor i trinn 1.9-1.11 (7.5 × 105 celler/brønn).
4. Optisk kartlegging ved hjelp av spenningsfølsomme fargestoffer (VSD) og kalsiumfølsomme fluoroforer (CSF)
- Forbered riktig mengde VSD i HBSS med kalsium og magnesium, ved å tilsette 1 μL VSD-fargestoff per ml HBSS og 10 μL lastadjuvans per ml HBSS.
MERK: Vanligvis krever en 96-brønnsplate 10 ml VSD-løsning. - Alternativt kan du tilberede HBSS med kalsium og magnesium supplert med 5 μM CSF. Aspirer kardiomyocytt vedlikeholdsmediet og erstatt med 100 μL VSD eller CSF per brønn på en 96-brønnsplate. Inkuber cellene i 30 minutter i cellekulturinkubatoren.
- Fjern fargestoffene og erstatt med analysemedium eller HBSS. Likevekt ved 37 °C for innsamling av baseline data optisk kartlegging med en optisk kartleggingsenhet med høy gjennomstrømning.
- Behandle cellene med medikamenter for akutt eksponeringstesting, eller kartlegg cellene som ble kronisk utsatt for legemidler av interesse.
- For kardiotoksisitetstesting i 96-brønnplater, bruk fire doser av en forbindelse med minst seks brønner per dose. Bruk doser som varierer nedenfra og over den effektive terapeutiske plasmakonsentrasjonen, inkludert en dose av den klinisk effektive terapeutiske plasmakonsentrasjonen.
- Fortynn legemidlene i dimetylsulfoksid, oppbevar dem som stamløsninger ved -20 °C, og fortynn dem deretter i HBSS til ønskede konsentrasjoner.
- Foreta elektrofysiologiske målinger ved baseline før legemiddelpåføring, som beskrevet i avsnitt 5. Når stoffene er påført, gjør elektrofysiologiske opptak minst 30 minutter senere for kroniske studier. Se avsnittene nedenfor for optiske tilordningsdatainnsamlings- og analyseprosedyrer.
5. Optisk kartlegging ved hjelp av genetisk kodet kalsiumindikator (GECI)
- Plate kommersielt tilgjengelige eller MACS-rensede hiPSC-CMs, som beskrevet ovenfor, ved bruk av MECM-belagte 96-brønnsplater for å lage modne hiPSC-CMs. For å danne konfluente monolag, plate 7,5 × 104 CM per brønn på hver 96-brønnsplate. Bruk plating medium.
- Etter 48 timer i pletteringsmedium, bytt til kardiomyositt vedlikeholdsmedium.
- På dag 4 etter tining og replating, tilsett rekombinant adenovirus for å uttrykke GCaMP6m (AdGCaMP6m) til celler ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI) = 5. Legg til viruset ved hjelp av CM-analysemedium.
MERK: Her ble eksperimenter med GCaMP6m utført i iCell2 kardiomyocytter fra en kommersiell leverandør. - På dag 5, fjern adGCaMP6m medium og erstatt med fersk RPMI + B27 (kardiomyocytt vedlikeholdsmedium).
- På dag 7, observer CMs ved hjelp av mikroskopi eller optisk kartlegging imager, for å visualisere spontane sammentrekninger og tilsvarende kalsiumtransienter.
- På dag 7 eller senere, for medisinering screening, direkte overføre 96-brønnplater av modne hiPSC-CM monolayers uttrykker GCaMP6m direkte til optisk kartlegging imager fra inkubatoren for baseline datainnsamling.
- Etter elektrofysiologisk datainnsamling, returner platene til CMs til vevskulturinkubatoren, for målinger på et etterfølgende tidspunkt.
- Etter baseline registreringer, bruk medisinene, bruk minst fire doser av hver medisinering og minst seks brønner per dose. Equilibrer medisinene på cellene i minst 30 minutter før datainnsamling. Varm opp brønntemperaturen til ~37 °C før og under datainnsamlingen.
- Etter baselineopptak av en hel plate, tilsett isoproterenol (500 nM) til hver brønn for å muliggjøre robuste legemiddelresponsdata. Kvantifiser effekten av isoproterenol på monolags slaghastighet, kontraksjonsamplitude (kalsiumforbigående amplitude) og kalsiumforbigående varighet (se figur 6), som beskrevet i avsnitt 5.
6. Innsamling av optiske kartdata og analyse
- Kontroller at kameraet, transilluminatoren og platevarmeren for den optiske tilordningsenheten er slått på.
- Åpne anskaffelsesprogramvaren og bestem filsparingsstedet.
- Åpne den fremre skuffen og plasser platen på platevarmeren.
- Skaff deg en mørk ramme ved å klikke på Dark Frame-knappen .
- Velg Varighet (10–30 s) og bildefrekvens for anskaffelse (f.eks. 100 bps, 250 b/s for høyere midlertidig oppløsning), og klikk på Start anskaffelse.
- Åpne analyseprogrammet, og i kategorien Importer/filtrer velger du enten Bla gjennom etter en enkeltfil eller Flere side ved side for å rekonstruere en plate.
- Velg Parametermodus (APD eller CaTD), angi Avstand per bildepunkt, og bruk brønnveiviseren til å bestemme brønnenes plassering i bildet. Klikk Behandle lagring for å gå til neste fane.
- Åpne fanen ROI (interesseområder) og velg å tegne avkastningen manuelt, automatisk eller ikke bruk avkastning i det hele tatt, som deretter vil vurdere hele brønnen for analyse. Etter at avkastningen er valgt, klikker du på Prosess/Lagre-knappen for å gå til neste trinn. Merk av for Skjul brønner og Vis bare filtrerte bokser for å visualisere avkastningen.
- Åpne kategorien Analyse, og velg hver brønn eller avkastning øverst til høyre på skjermen for å bekrefte nøyaktigheten av automatisk taktdeteksjon. Legg til eller fjern Beats fra sporene ved å trykke på Add Beat/ Save Beats, eller ved å velge en Individual Beat og trykke på Delete på tastaturet.
- Du kan eventuelt bruke funksjonen Gjennomsnittlige varmekart til å lage varmekart over valgte parametere for platen.
- Klikk på Time-Space Plot-knappen i kategorien Analyse for å visualisere data for hver brønn eller avkastningen. Etter å ha forsikret deg om at beatdeteksjonen er nøyaktig, fortsett til Eksport kategorien og velg Filformat. Trykk på Eksporter , og opprett en mappe som dataene skal eksporteres til. Fortsett å åpne datafiler og kjør den valgte statistiske analyserutinen.
MERK: .xlxs-filer foretrekkes da alle parametrene eksporteres i en enkelt fil; Andre formater (.csv eller .tsv) genererer én fil per parameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
hiPSC-CM modning karakterisert ved fasekontrast og immunfluorescerende konfokal avbildning
Tidslinjen for ECM-mediert modning av kommersielt tilgjengelige hiPSC-CMer ved bruk av MECM-belagte 96-brønnsplater er presentert i figur 1A. Disse dataene samles inn ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kardiomyocytter som ankommer laboratoriet som kryopreserverte hetteglass med celler. Hvert hetteglass inneholder >5 × 106 levedyktige kardiomyocytter. Cellene er ~ 98% rene og grundig testet for kvalitetskontroll (analysesertifikat følger med hvert hetteglass). Det høye antallet CM-er gjør det mulig å tine og plating CM-ene på forskjellige ECM-kombinasjoner ved å bruke samme batch av celler. I figur 1 er hiPSC-CM belagt på enten mus ECM- eller MECM-belagte plater. HiPSC-CM-ene som er belagt på MECM-modne og blir strukturelt forskjellige fra det samme partiet av hiPSC-CM-er som er replisert på musens ECM. Nemlig, modne celler blir stavformede, mens umodne celler beholder en sirkulær form. Dette kan ses ved fasekontrastavbildning og ved farging av hjertemyofilamentene (figur 1B; troponin I [TnI], rød). En mer omfattende validering av den strukturelle modningen av hiPSC-CMs er presentert i figur 2. Et stort synsfelt (20x objektiv) av CMs farget med α-aktininantistoff viser den typiske formen på cellene dyrket på hver ECM-tilstand. α-aktinin er et kritisk strukturelt protein arrangert med regelmessig avstand i hjertemyofilamentene. I samsvar med TnI-fargingen i figur 1 indikerer α-aktininfargingen ytterligere modningen av hiPSC-CM dyrket på MECM. I tillegg til å fremme en stavformet moden fenotype, induserer MECM også større sarkomerorganisasjon (60x bilder). Mitokondrieinnhold og aktivitet er også forskjellig mellom celler dyrket på musens ECM og MECM (figur 2B). Foster-umoden hiPSC-CM mitokondrieinnhold er begrenset til det perinukleære rommet, med lite mitokondrier som finnes i cytosolen. I motsetning til dette er modent hiPSC-CMs mitokondrieinnhold fordelt over hele cellen. Mitokondriell vurdering bruker en etablert protokoll19.
hiPSC hjerterettet differensiering og spesifikasjon av hjertekammer
Her følger en protokoll for egenproduksjon og modning av rensede, kammerspesifikke hiPSC-CM-er (figur 3A). Dette er basert på en tidligere publisert rapport20. Presentert er detaljerte prosedyrer for hiPSC-CM rensing ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig, magnetaktivert cellesorteringssett (MACS). Vi validerte nylig bruken av MACS-rensing og viste fordelene ved å bruke MACS sammenlignet med metabolsk-basert hiPSC-CM-rensing; Vanligvis forventes hiPSC-CM-renhet over 95%21. Det er viktig å påpeke at hvis det opprinnelige CM-innholdet er <50%, kan MACS-rensing bare nå ~ 85%. I disse tilfellene kan CM-anrikning være nødvendig etter uttømming av ikke-CMs. Hvis det opprinnelige CM-innholdet fra differensiering er >50%, kan uttømming av ikke-CM fra cellepopulasjonen ved bruk av MACS-settet oppnå renhet >95%; i dette tilfellet er ytterligere anrikning eller positivt utvalg av CM ikke nødvendig. De kammerspesifikke hiPSC-CMene kan også modnes ved hjelp av MECM-belagte 96-brønnsplater, som beskrevet ovenfor og vist i figur 1 og figur 2. Det bør forventes at de atriespesifikke cellene (hiPSC-ACM) har signifikant raskere spontan slagfrekvens og kortere aksjonspotensialvarighet 80 (APD80) enn de ventrikulære spesifikke cellene (hiPSC-VCM). Dette er typiske elektrofysiologiske data for aksjonspotensialer registrert med VSD og det optiske kartleggingssystemet (figur 3B-D).
Elektrofysiologisk optisk kartlegging med høy gjennomstrømning i hjertet
Vitenskapelig strenghet økes dramatisk for enhver analyse hvis den kan utføres på en høy gjennomstrømningsmåte. Kardiotoksisitetsscreeningsdata er presentert i figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7, som viser elektrofysiologisk screening med høy gjennomstrømning ved bruk av modne hiPSC-CM monolag i en 96-brønnsplate. Varmekart for hele plater for parametere som APD80 (figur 4A) avslører reproduserbarheten til en gitt parameter i en plate fra brønn til brønn. Videre gir varmekart med hele platen en rask undersøkelse av eventuelle avvik i datasettet. For eksempel, i brønn E4 av platen presentert i figur 4A, er det klart at denne brønnen har en mye større APD80-verdi, indikert ved at brønnen ser gul ut, mens de andre brønnene er indigoblå. Typiske aksjonspotensialer for modne 2D hiPSC-CM monolag (figur 4B) minner om aksjonspotensialets morfologi hos voksne kardiomyocytter isolert og testet i kultur. Videre vises en typisk aksjonspotensiell spontan rytme i figur 4C. Dataene i figur 4C er et tidsromplott av rad A, kolonne 1-12. Den hvite linjen over platekartet i figur 4A viser dette. Hvert lyse fluorescerende glimt over tid i hver brønn representerer en enkelt spontan aktivering. Figur 5 og figur 6 viser nytten av å bruke GCaMP6m genetisk kodet kalsiumindikator (GECI) for å måle intracellulære kalsiumtransienter; Figur 6 viser også forventet respons på isoproterenol – den klassiske hjertepositive inotropen. Som respons på isoproterenol forårsaker aktivering av β1-adrenerge reseptorer positiv kronotropi (figur 6A), positiv inotropi (figur 6B) og positiv lusitropi (figur 6C). Disse responsene på isoproterenol indikerer signifikant modning av hiPSC-CM β1-adrenerge reseptorer og intracellulære signalkaskader.
I figur 7 er hiPSC-CM-respons på humane Ether-a-go-go-relaterte genblokkere (hERG) vist ved bruk av GCaMP6m kalsiumfluorescens for å overvåke rytme og tjene som en surrogatmarkør for kontraktilitet. E-4031 er en hERG-spesifikk kanalblokker, som bremser den spontane slaghastigheten og øker kalsiumforbigående varighet (CaTD80) og triangulering (CaT-triangulering). Figur 7A viser påvisning av tidlige etterdepolariseringer forårsaket av E-4031 hERG-kanalblokaden. Andre hERG-kanalblokkere, inkludert domperidon, vandetanib og sotalol, ble også testet, og resultatene er vist i figur 7E-G. Disse forbindelsene og dosene ble valgt basert på den nylige hiPSC-CM-valideringsstudien 1,7,9.
Figur 1: Tidslinje for rask modning av kommersielt tilgjengelige eller andrekildekryopreserverte hiPSC-CMer . (A) Tinte kardiomyocytter suspendert i pletteringsmedium påføres MECM på dag 0. På dag 2 erstattes mediet med vedlikeholdsmedium, og det brukte mediet skiftes på dag 5. Celler dyrkes i ytterligere 2 dager, og på dag 7 kan den modne syncytien til hiPSC-CM lastes med opptaksløsning for nedstrøms applikasjoner eller dyrkes i lengre perioder. (B) Kontrastfase av syncyti av kardiomyocytter belagt på musen ECM eller MECM viser at kardiomyocytter belagt på musens ECM har større sirkularitet sammenlignet med kardiomyocytter belagt på MECM; Videre indikerer immunfarging for TnI at kardiomyocytter belagt på musens ECM beholder en radial symmetrimorfologi og uorganiserte sarkomerer i motsetning til dolichomorfe og velstrukturerte hiPSC-CMer belagt på MECM. Skalastenger = 100 μm (B, øvre); 50 μm (B, lavere). Forkortelser: hiPSC-CMs = humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter; ECM = ekstracellulær matrise; MECM = modningsinduserende ECM; 96wp = 96-brønn plate; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TnI = troponin I. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammenligning av sarkomerorganisering av hiPSC-CM belagt på mus ECM eller MECM. (A) ECM-dyrkede hiPSC-CM-er immunfarget mot α-aktinin indikerer radial morfologi, med en lavere tetthet av sarkomerer spredt gjennom kardiomyocytten i motsetning til hiPSC-CM fra samme batch belagt på matrisen og presenterer stavformet morfologi (20x). (60x) Observasjon av hiPSC-CMs med konfokal mikroskopi viser at hiPSC-CMs dyrket på en mus ECM har radial symmetrimorfologi, med en tettere perimetral fordeling av sarkomerer og en lav tetthet av radiale sarkomerer i motsetning til hiPSC-CMs fra samme batch som ble dyrket på MECM. De presenterer en homogen fordeling av sarkomerer organisert langs cellens lengre akse. Skalastenger = 100 μm (øvre); 50 μm (lavere). (B) Farging av hiPSC-CM dyrket på mus ECM eller MECM med et mitokondriefargestoff som flekker mitokondrier med høyt transmembranpotensial, viser en lavere intensitet av farging i kardiomyocytter dyrket på mus ECM i forhold til MECM. Videre har hiPSC-CM dyrket på MECM mitokondrier homogent fordelt i kardiomyocyttene, i motsetning til hiPSC-CM dyrket på musens ECM som presenterer en perinukleær akkumulering av mitokondrier. Skalastenger = 200 μm. Forkortelser: hiPSC-CMs = humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter; ECM = ekstracellulær matrise; MECM = modningsinduserende ECM; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Produksjon av kammerspesifikke kardiomyocytter. (A) Protokoller for produksjon av kammerspesifikke kardiomyocytter deler identisk Wnt-signalveimanipulasjon, med thr-stimulering av Wnt-signalering ved hemming av GSK3 fra dag 0 til 2, og hemming av denne banen mellom dag 2 og 4. Kammerspesifikasjon oppnås med aktivering av retinsyrebanen og Wnt-signalmanipulering mellom dag 3 og 6. (B) Som et resultat av kammerspesifikasjon presenterer atriekardiomyocytter en raskere frekvens av spontan depolarisering sammenlignet med ventrikulære kardiomyocytter. (C) Ventrikulære hiPSC-CMs har langsommere taktfrekvenser sammenlignet med atrielle hiPSC-CMs; Derfor er aksjonspotensialets varighet ved 80% av repolariseringen kortere i hiPSC-ACM sammenlignet med hiPSC-VCMs. Forkortelser: hiPSC-CMs = humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter; hiPSC-ACM = atrielle humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter; hiPSC-VCM = ventrikulære humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Optisk kartlegging tatt med en optisk kartleggingsenhet og analysert med Pulse. (A) Eksempel på et varmekart for helhetlig observasjon av parametere vurdert i en 96-brønns plate etter filmfiltrering og bestemmelse av regioner av interesse i 96-brønnsplater, kartlagt med den optiske kartleggingsenheten. I dette eksemplet et APD80% varmekart som indikerer en avvikende brønn (E4) og brønner som ikke klarte å produsere data (brønn H3, 4 og 5). (B) Videre tillater det brukervennlige grensesnittet enkel plotting av gjennomsnittlig handlingspotensialmorfologi fra de valgte brønnene. (C) Ytterligere datavisualiseringsverktøy er tilgjengelige; I dette eksemplet viser et tidsromplott generert fra den horisontale linjen som krysser brønnene på rad A (panel A) aktivering over en horisontal del av hver brønn (hvit linje over rad A) over en periode på 10 s. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tidslinje for kartlegging av intracellulære kalsiumforbigående forandringer med genetisk kodet kalsiumindikator. På dag 4 etter registrering av kommersielt tilgjengelige kardiomyocytter i en MECM-belagt 96-brønnsplate, som angitt i figur 1A, bør cellene transduseres med 5 MOI virus i CM-analysemedium over natten. Mediet erstattes med CDI vedlikeholdsmedium frem til dag 6, og endres til CDI vedlikeholdsmedium uten fenolrødt mellom dag 7 og 11 for å muliggjøre rask eller kontinuerlig overvåking av intracellulære kalsiumforbigående forandringer med Nautilus. (B) hiPSC-CMtransdusert med AdGCaMP6f vurdert med optisk kartlegging på dag 7, 9 og 10 etter tining indikerer tilstedeværelse av stabile, intracellulære kalsiummedierte fluorescensendringer, som muliggjør daglig optisk kartlegging av samme plate over lengre tid uten behov for ny påføring av kalsiumfølsomme fargestoffer. Forkortelser: GECI = genetisk kodet kalsiumindikator; CM = kardiomyocytt; MOI = mangfold av infeksjon; 96wp = 96-brønn plate; BSA = bovint serumalbumin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Rask og enkel utnyttelse av varmekart for visuell sammenligning av data innhentet fra moden funksjonell syncyti av hiPSC-CMs med Nautilus og analysert med Pulse. (A) hiPSC-CMs behandlet med isoproterenol viser en økning i slagfrekvens, som observert ved inspeksjon av varmekart og bekreftet med paret t-test. (B) Tilsvarende viser kartlegging av celler før og etter isoproterenolbehandling den inotrope effekten av β-adrenerg stimulering ved visuell sammenligning av varmekart og med paret t-test. (C) Til slutt viser bruk av varmekart for visuell sammenligning av data lusitropi, en annen kanonisk effekt av β-adrenerg stimulering, bekreftet med paret t-test (p < 0,0001). Fravær av sirkel indikerer svikt i datainnsamling/analyse for den spesifikke brønnen. Forkortelser: hiPSC-CMs = humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter; ISO = isoproterenol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Validering av GECI kardiotoksisitetsscreeninganalyse ved bruk av hERG-kanalblokkere. (A) Representative spontane kalsiumfluksspor fra baselinebrønner i HBSS og i nærvær av 500 nM E-4031. (VG Nett) Kvantifisering av baseline og +E-4031 effekter på henholdsvis takthastighet, kalsiumforbigående varighet 80 (CaTD80) og kalsiumforbigående triangulering (CaT-triangulering). *,** betegner betydelig forskjell; uparret t-test; p < 0,01; n = 8 i hver gruppe. (E) GECI-påvisning av en annen hERG-blokker, domperidon. (F) GECI-påvisning av hERG-blokk indusert av vandetanib. (G) GECI-påvisning av hERG-blokk ved høy dose sotalol. Forkortelser: GECI = genetisk kodet kalsiumindikator; hERG = humant Ether-a-go-go-relatert gen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Media og deres komposisjoner Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes flere forskjellige tilnærminger til in vitro kardiotoksisitetsscreening ved bruk av hiPSC-CM. En nylig "Best Practices" -artikkel om bruk av hiPSC-CMs presenterte de forskjellige in vitro-analysene , deres primære avlesninger, og viktigere, hver analyses granularitet for å kvantifisere human hjerteelektrofysiologisk funksjon20. I tillegg til å bruke membranpiercingelektroder, leveres det mest direkte målet på human hjerteelektrofysiologisk funksjon av VSD-er. VSD-analyseavlesninger muliggjør direkte visualisering og kvantifisering av kritiske elektrofysiologiske parametere, inkludert aksjonspotensiell varighet, aksjonspotensiell forplantningshastighet, handlingspotensial oppslag, handlingspotensiell triangulering, slagfrekvens, beatregularitet og handlingspotensial varighetsheterogeniteter. På samme måte tilbyr kalsiumfølsomme sonder informasjon om hiPSC-CM monolagrytme, hastighet og hendelsesvarighet. hiPSC-CM kalsiumtransientmålinger gjort med fluorescerende prober gir også informasjon om kontraktiliteten og kontraktilstyrken til hver sammentrekning. Denne artikkelen gir metoder for bruk av modne hiPSC-CMs (96-brønnsplater) i VSD- og kalsiumtransientmålingsanalyser med høy gjennomstrømning. I tillegg til metoder for optisk kartlegging presenteres programvare for EP-dataanalyse med høy gjennomstrømning.
Metodene som er skissert her er et betydelig fremskritt for kardiotoksisitetsscreening og regulatoriske vitenskapsfelt. Her har vi presentert metoder for rask modning og elektrofysiologisk registrering av 2D hiPSC-CM monolayers i high-throughput screeningplater (96-brønnsplater). Rask modning ved hjelp av en MECM (7 dager) vist her er et stort fremskritt i forhold til tidligere tilnærminger som krever modning for å skje over 30-100 dager22,23. Sammenlignet med andre ECM-er, som krever manuell påføring for hvert eksperiment, er MECM-plater forhåndsbelagt med ECM og ankommer laboratoriet klar til bruk. Dette aspektet av MECM gjør det enklere å bruke, mindre variabelt og mer effektivt enn å bruke andre ECM-belegg. Det er viktig at denne tilnærmingen kan brukes til både kryopreserverte, kommersielt tilgjengelige hiPSC-CM-er og "hjemmelagde" hiPSC-CM-er, som kan være kammerspesifikke. På grunn av den distinkte, stavformede strukturen til modne hiPSC-CM (figur 1 og figur 2) er det viktig å påpeke at et større antall celler er nødvendig for konfluent monolagsdannelse her, sammenlignet med protokoller som bruker andre ECM-er. Spesielt når vi bruker mus ECM (celler har en kontinuerlig spredende pannekakefenotype), plater vi 50.000 hiPSC-CMs per brønn, men når vi bruker MECM, plater vi 75.000 hiPSC-CMs per brønn. Antall CMs per brønn kan også reduseres hvis cellene skal brukes til enkeltcelleanalyse, for eksempel patch clamp eller annen avbildningsteknikk som krever enkeltceller.
Kommersielt tilgjengelige hiPSC-CMs gir fordeler for regulatorisk vitenskap på grunn av den omfattende karakteriseringen av disse cellene av Food and Drug Administration (FDA) -ledede internasjonale innsats. Imidlertid er de kommersielt tilgjengelige cellene en blanding av nodale, atrielle og ventrikulære hiPSC-CMer, som gir svært relevant toksisitetsinformasjon, men mangler kammerspesifikke egenskaper som etterligner det menneskelige hjerte. Kammerspesifikke hiPSC-CM gjenskaper de velkjente elektrofysiologiske forskjellene mellom atrie- og ventrikulære kardiomyocytter, og gir en in vitro-analyse for utvikling av kammerspesifikke antiarytmiske terapier (figur 3B-D). For eksempel kan atrieflimmerspesifikke medisiner nå testes og utvikles ved hjelp av hiPSC-ACM monolayers belagt i 96-brønnsplater for robust og streng datainnsamling. På samme måte, når screening for å avgjøre om en forbindelse forårsaker Torsades de Pointes (TdP), en høyrisiko ventrikulær arytmi, er det optimalt å ikke ha atrielle og nodale celler som "forurenser" ventrikulære hjertemonolag. Derfor, selv om den FDA-ledede hiPSC-CM-valideringsinnsatsen hittil har fokusert på å bruke kommersielt tilgjengelige CMs, er det sannsynlig at fremtidige regulatoriske vitenskapelige anbefalinger vil vende seg til bruk av kammerspesifikke celler for å gjøre toksisitetsscreeningen enda mer prediktiv for den menneskelige hjertetilstanden. Metodene som er skissert her er basert på tidligere rapporter, og gir en robust tilnærming for generering av kammerspesifikke kardiomyocytter avledet fra pluripotente stamceller21.
En stor forskjell mellom disse protokollene og de som vanligvis brukes i feltet er renselsesmetoden som brukes. De fleste laboratorier som genererer hiPSC-CM i sine egne laboratorier, er avhengige av metabolsk mediert utvalg av kardiomyocytter22. Her er vi avhengige av å bruke MACS til å rense hiPSC-CMs, ved hjelp av en klinisk godkjent cellebehandlingsmetode som produserer CMs med sunnere fenotyper23. Den metabolske utfordringstilnærmingen er effektiv, men bruker en medieformulering som simulerer myokardiskemi24. Ved bruk av MACS-rensing av hiPSC-CMs, er det viktig å utnytte ikke-CM-uttømmingscocktailen, som retter seg mot ikke-CMs for magnetisk uttømming fra cellepopulasjonen. Bruk av ikke-CM-uttømmingsmetoden minimerer skjærspenningen som CM-ene opplever i magnetkolonnen, og foretrekkes fremfor direkte magnetisk merking av CM-populasjonen. Bruk av MACS-rensing av kammerspesifikke celler vil gjøre det mulig for andre laboratorier å generere sunne CMs for forskning og toksisitetstesting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TJH er konsulent og vitenskapelig rådgiver for StemBioSys, Inc. TB er ansatt i StemBioSys, Inc. AMR og JC er tidligere konsulenter for StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR og JC er aksjonærer i StemBioSys, Inc.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av NIH-stipendene HL148068-04 og R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K.
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
