Design af en bioreaktor til forbedring af dataindsamling og modellering af gennemstrømning af manipuleret hjertevæv

Summary

Tredimensionelle hjertevæv biomanipuleret ved hjælp af stamcelleafledte kardiomyocytter har vist sig som lovende modeller til at studere sundt og sygt humant myokardium in vitro , mens de rekapitulerer nøgleaspekter af den indfødte hjerteniche. Dette manuskript beskriver en protokol til fremstilling og analyse af højindhold konstrueret hjertevæv genereret fra humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter.

Abstract

Hjertesvigt er fortsat den største dødsårsag på verdensplan, hvilket skaber et presserende behov for bedre prækliniske modeller af det menneskelige hjerte. Vævsteknik er afgørende for grundvidenskabelig hjerteforskning; in vitro human cellekultur eliminerer forskellene mellem dyremodeller, mens et mere vævslignende 3D-miljø (f.eks. med ekstracellulær matrix og heterocellulær kobling) simulerer in vivo-forhold i højere grad end traditionel todimensionel kultur på petriskåle af plast. Hvert modelsystem kræver dog specialudstyr, for eksempel specialdesignede bioreaktorer og funktionelle vurderingsenheder. Derudover er disse protokoller ofte komplicerede, arbejdskrævende og plaget af svigt i det små, sarte væv.

Dette papir beskriver en proces til generering af et robust humant konstrueret hjertevæv (hECT) modelsystem ved hjælp af inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter til langsgående måling af vævsfunktion. Seks hECT'er med lineær strimmelgeometri dyrkes parallelt, hvor hver hECT suspenderes fra et par kraftfølende polydimethylsiloxan (PDMS) stolper fastgjort til PDMS-stativer. Hvert indlæg er dækket med en sort PDMS stabil post tracker (SPoT), en ny funktion, der forbedrer brugervenligheden, gennemstrømningen, vævsretention og datakvalitet. Formen giver mulighed for pålidelig optisk sporing af stolpeafbøjninger, hvilket giver forbedrede trækkraftsporinger med absolut aktiv og passiv spænding. Hættegeometrien eliminerer vævssvigt på grund af hECT'er, der glider af stolperne, og da de involverer et andet trin efter PDMS-rackfremstilling, kan SPoT'erne føjes til eksisterende PDMS postbaserede designs uden større ændringer i bioreaktorfremstillingsprocessen.

Systemet bruges til at demonstrere vigtigheden af at måle hECT-funktionen ved fysiologiske temperaturer og viser stabil vævsfunktion under dataindsamling. Sammenfattende beskriver vi et avanceret modelsystem, der gengiver vigtige fysiologiske forhold for at fremme biofidelitet, effektivitet og stringens af konstruerede hjertevæv til in vitro-applikationer .

Introduction

Konstruerede hjertevævsmodeller findes i en bred vifte af geometrier og konfigurationer til rekapitulering af forskellige aspekter af den oprindelige hjerteniche, der er vanskelige at opnå med traditionel todimensionel cellekultur. En af de mest almindelige konfigurationer er den lineære vævsstrimmel med fleksible ankre i hver ende for at inducere vævets selvsamling og give vævet en defineret forbelastning og en aflæsning af de resulterende trækkræfter ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,} 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Den genererede kraft kan bestemmes robust ved optisk sporing af vævsforkortelsen og ved hjælp af elastisk stråleteori til beregning af kraften fra de målte afbøjninger og fjederkonstanten for ankrene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Imidlertid er hjertevævsteknik stadig et udviklingsfelt, og der er stadig nogle udfordringer. Specialudstyr, såsom specialfremstillede bioreaktorer og funktionelle vurderingsenheder, kræves til hvert modelsystem 10,29,30,31. Størrelsen og kompleksiteten af mikromiljøet i disse konstruktioner er ofte begrænset af lav gennemstrømning på grund af arbejdskrævende protokoller, et stort antal celler og vævssvaghed. For at løse dette har nogle grupper henvendt sig til fremstilling af mikrovæv, der kun indeholder hundreder eller tusinder af celler for at lette analyser med høj kapacitet, der er nyttige til lægemiddelopdagelse. Denne reducerede skala komplicerer imidlertid den nøjagtige vurdering af funktion¹², eliminerer nøgleaspekter af den oprindelige hjerteniche (såsom næringsstof/iltdiffusionsgradienter og kompleks arkitektur³⁶) og begrænser mængden af materiale, der er tilgængeligt til efterfølgende molekylær og strukturel analyse (ofte kræver pooling af vævene). Tabel 1 opsummerer nogle af konfigurationerne af lineære vævsstrimmelmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Gruppe		Celler pr. væv	Væv pr. plade	Plade format		Forankring funktion		Funktionel dataindsamlingsmetode		Fælles mediebad?	Funktionel foranstaltning- ment in situ?
Yoshida (ECT)38		4 millioner dollars	6	Modificeret 6-brønds plade*		Kraft transducer		Måling af direkte kraft		Nej	Nej
Chan (hESC-CM-ECT)26		310 K	6	brugerdefineret 6-brønds skål		PDMS indlæg		Måling af direkte kraft		Ja	Nej
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 millioner dollars	6	brugerdefineret 6-brønds skål		PDMS-ledning		vævets form		Nej	Ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 K	8			polymer tråd		Trådform		Ja	Ja
Costa (enkelt hECT)1, 2		1-2 millioner dollars	4**	10 cm petriskål**		PDMS indlæg		Optisk afbøjning (kant-/objektsporing)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT)3–9		500 K-1 million	6	6 cm petriskål		PDMS indlæg		Optisk afbøjning (kant-/objektsporing)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT m/ SPoT)		1 million	6	6 cm petriskål		PDMS-indlæg med sorte hætter		optisk afbøjning (objektsporing)		Ja	Ja
Passier (EHT)17		245 K	36	12-brønds plade		PDMS-indlæg med sorte hætter		optisk afbøjning (objektsporing)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 million	12	6 cm petriskål		PDMS-indlæg med store bogstaver		Optisk afbøjning (kantdetektion)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic (Millisøjle)14		550 K	6	brugerdefineret 6-brønds skål		PDMS-indlæg med store bogstaver		optisk afbøjning (objektsporing); Billeddannelse af calcium		Nej	Ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 million	12	12-brønds plade		PDMS-indlæg med store bogstaver		optisk afbøjning (kantdetektion af efterbøjning); Billeddannelse af calcium		Nej	Ja
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 K	96	96-brønds plade		PDMS stolper med kroge		Optisk afbøjning (kantdetektion)		Nej	Ja
Murry23, 24		900 K	24	24-brønds plade		PDMS stolper med hætter, integreret magnet		magnetisk sensor		Nej	Ja
Riget (μTUG)11, 12, 25		Udefineret	156	156-brønd skål		PDMS stolper med hætter, integreret magnet		Optisk sporing (fluorescerende perle)		Ja	Ja

Tabel 1: Karakteristika for nogle lineære konstruerede hjertevævsmodeller i litteraturen. Lineært konstruerede hjertevævsmodeller varierer i størrelse, gennemstrømning, forankringsfunktionsdesign og facilitering af delte mellemstore bade samt kravene til et separat muskelbadsystem til funktionel karakterisering. * Forskerne brugte et kommercielt tilgængeligt konstrueret vævssystem baseret på dimensionerne af en standard 6-brøndplade. ** Et modulært system, hvor enkeltvævsbioreaktorer er forankret til enhver plastkulturskål i det ønskede antal og sted.

Dette papir beskriver den seneste protokol til fremstilling af vores etablerede model af lineært humant manipuleret hjertevæv (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 og metoder til vurdering af hECT's kontraktile funktion. Hver multivævsbioreaktor rummer op til seks hECT'er i et delt medium bad og består af to "rack" -stykker lavet af silikoneelastomerpolydimethylsiloxan (PDMS) monteret på en stiv polysulfon ramme. Hvert PDMS-rack indeholder seks fleksible integrerede kraftfølerstolper, der er 0,5 mm i diameter og 3,25 mm lange, og tilsammen giver to stativer seks par stolper, som hver rummer en hECT. Inversion af bioreaktoren hjælper med at overvinde enhver hindring for visualisering af hECT'erne nedenfra på grund af vandkondensering fra kulturmediet eller forvrængninger fra menisken i luft-væske-grænsefladen. Hver sammentrækning af en hECT forårsager afbøjning af de integrerede endestolper, og den optiske måling af afbøjningssignalet behandles til en kraft versus tidsregistrering, der repræsenterer den kontraktile funktion af hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Sammenlignet med de enkeltvævsbioreaktorer, der typisk anvendes til væv af denne størrelse, forbedrer multivævsdesignet den eksperimentelle gennemstrømning og muliggør undersøgelse af parakrin signalering mellem tilstødende væv med potentielt forskellig cellulær sammensætning. Dette system er blevet valideret i offentliggjorte undersøgelser, der beskriver anvendelser i sygdomsmodellering ^4,8, parakrin signalering ^6,7, heterocellulær kultur ^5,9 og terapeutisk screening ^7,9.

I dette system er hECT'erne designet til at være ca. 6 mm lange og 0,5 mm i diameter for at muliggøre robust optisk sporing af kraftmålinger med lav støj. Desuden er aspekter af vævskompleksitet såsom diffusionsgradienter og cellulær organisation afbalanceret med et håndterbart krav på 1 million celler pr. Væv. Med standard CCD-kamerateknologi genererer kræfter så svage som 1 μN (svarende til mindre end 5 μm efter afbøjning) et klart signal, hvilket sikrer, at selv ekstremt svag kontraktil funktion, som observeret med nogle hECT sygdomsmodeller, kan måles nøjagtigt. Dette letter også den detaljerede analyse af trækkraftkurven, hvilket muliggør analyse med højt indhold af op til 16 kontraktilitetsmålinger⁴¹, herunder udviklet kraft, sammentrækningshastigheder (+dF/dt) og afslapning (−dF/dt) og variation i slaghastighed.

Denne protokol begynder med instruktioner til fremstilling af bioreaktorkomponenterne. Der lægges særlig vægt på trinene til at maksimere hECT-udbyttet, reducere teknisk variabilitet i vævsfunktionen og optimere kvaliteten og dybden af vævsvurderingen. De fleste hjertevævstekniske undersøgelser rapporterer ikke om vævstab under fremstilling og langtidstestning, selvom det er en velkendt udfordring på området og reducerer gennemstrømningen og effektiviteten af undersøgelserne²⁷. De vævstekniske metoder, der er beskrevet her, er blevet raffineret gennem årene for at sikre tilbageholdelse af alle hECT'er i de fleste bioreaktorer (uanset hvordan PDMS-stativerne fremstilles). Imidlertid kan selv et tab på 5% -20% af væv påvirke den statistiske effekt betydeligt, især i mindre eksperimenter begrænset af antallet af kardiomyocytter til rådighed (f.eks. På grund af differentieringsudfordringer med nogle syge cellelinjer⁴ eller på grund af de høje omkostninger ved kommercielt købte kardiomyocytter) eller af behandlingstilstanden (f.eks. begrænset tilgængelighed eller høje omkostninger ved forskellige behandlingsforbindelser).

Denne protokol beskriver fremstillingen af stabile posttrackere (SPoTs), en ny funktion i PDMS-stativerne, der fungerer som hætter i enderne af de kraftfølende stolper, der holder hECT'erne²⁷. Det demonstreres, hvordan hættegeometrien reducerer hECT-tabet fra at falde eller trække stolperne af og dermed åbner nye muligheder for dyrkning af hECT'er med en større variation af stivheder og spændinger, som er udfordrende for kulturen på ikke-kappede stolper. Derudover giver SPoT'erne et objekt med høj kontrast for at forbedre den optiske sporing af hECT-sammentrækningen gennem en konsistent og veldefineret form²⁷. Dette efterfølges af en beskrivelse af dyrkning af humant inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) og kardiomyocytdifferentiering baseret på tidligere offentliggjorte protokoller ^3,42,43 og en forklaring af hECT-fabrikation, kultur og funktionelle målinger.

Denne artikel omhandler også behovet for at måle vævsfunktion ved fysiologisk temperatur. Humant myokardium (føtalt såvel som voksent sundt og sygt væv) samt hjertevæv fra en lang række dyrearter (herunder rotter, katte, mus, fritter og kaniner)^44,45 udviser en markant stigning i den frekvensmatchede trækkraft ved temperaturer på 28 °C-32 °C sammenlignet med fysiologisk temperatur - et fænomen kendt som hypotermisk inotropi^{45, 46}. Imidlertid forbliver temperaturens virkninger på konstrueret myokardievævsfunktion underundersøgt. Mange nyere konstruerede hjertevævsmodeller i litteraturen er designet til funktionelt at blive vurderet ved 37 °C for at tilnærme fysiologiske tilstande 13,14,37. Men så vidt vi ved, er de temperaturafhængige virkninger på den kraft, der genereres af manipuleret hjertevæv, ikke blevet systematisk undersøgt. Denne protokol beskriver et pacingelektrodedesign, der minimerer varmetab under test, samt giver mulighed for inkorporering af et isoleret varmeelement i opsætningen til funktionelle målinger, som kan opretholde hECT'erne ved fysiologisk temperatur uden at gå på kompromis med steriliteten²⁷. Vi rapporterer derefter nogle af de observerede effekter af temperatur på hECT-funktionen, herunder på den udviklede kraft, spontan slagfrekvens, +dF / dt og -dF / dt. Alt i alt indeholder dette papir de detaljer, der kræves for at fremstille dette multivævs kraftfølende bioreaktorsystem til fremstilling af humant manipuleret hjertevæv og til vurdering af deres kontraktile funktion, og der præsenteres et sæt data, der giver et sammenligningsgrundlag for målinger ved stuetemperatur og ved 37 °C²⁷.

Protocol

Denne protokol anvendte en afidentificeret iPSC-linje, SkiPS 31.3 (oprindeligt omprogrammeret ved hjælp af dermale fibroblaster fra en sund 45-årig mand)⁴⁷, og var således undtaget fra specifik godkendelse fra Institutional Review Board i overensstemmelse med institutionens retningslinjer for human forskningsetik. Udfør al celle- og hECT-manipulation under aseptiske forhold i et HEPA-filtreret biologisk sikkerhedskabinet i klasse II eller et laminært flowarbejdsbord. Alle ikke-sterile opløsninger steriliseres ved filtrering gennem et 0,22 μm filter, og alle celler og hECT'er opbevares i en inkubator ved 37 °C, 95 % relativ luftfugtighed og 5 % CO₂.

1. Fremstilling af bioreaktorer

1. Bioreaktorkomponenter og aluminium master cast fabrikation
   BEMÆRK: CAD-filer (Computer-aided design) findes i supplerende fil 1. Protokollen kan sættes på pause hvor som helst mellem disse trin. Det anbefales at hyre en professionel maskinarbejder til at fremstille masterformene beskrevet i dette afsnit, da der kræves høje tolerancer (≤5 μm) og en glat finish for nøjagtig postgeometri og for korrekt trykmontering af polysulfonrammerne på polytetrafluorethylen (PTFE) bundpladerne (sigter mod en tæt friktionspasform, men ikke for tæt).
   1. Brug en computer numerisk kontrol (CNC) mølle til at bearbejde bundpladen ud af PTFE i henhold til skemaerne i figur 1A. hECT'erne vil blive dannet i de seks jævnt fordelte brønde (hvide pile).
   2. Ved hjælp af en CNC-fræser bearbejdes polydimethylsiloxan (PDMS) racknegativ master støbt ud af aluminium i henhold til skemaerne i figur 1B med tre rammestøtter (grønne stjerner). Bor seks jævnt fordelte huller (magenta pilespidser) med en diameter på 0,5 mm for at skabe PDMS-stolperne.
   3. Brug en CNC-mølle til at bearbejde bioreaktorrammen ud af polysulfon i henhold til skemaerne i figur 1C. Rammestøtterne (grønne stjerner) svarer til rammestøtterne, der ses i rackstøbningen (figur 1B, grønne stjerner).
   4. Brug en CNC-fræser til at bearbejde aluminiumstøbningsholderen ud af aluminium i henhold til skemaerne i figur 1D. Hver åbning indeholder en trekantet hylde (orange trekant), der er 0,25 mm høj for at give et dødt rum for PDMS at strømme gennem hullerne i PDMS-rackafstøbningerne (figur 1B, magenta pilespidser).
2. Støbning af PDMS-stativet fra de negative aluminiumsmestre
   1. Brug en termoplastisk smeltet aflejringsmodellering 3D-printer til at udskrive to PDMS-rackstøbeapparatbeslag (supplerende fil 1). Brug følgende udskriftsindstillinger: en laghøjde på 0,1 mm, en væg-/bund-/toptykkelse på 1 mm, en udfyldningstæthed på 90 % med trekanter, en udskrivningstemperatur på 230 °C, en byggepladetemperatur på 70 °C og en rand til vedhæftning.
   2. Anbring fire negative hovedafstøbninger af aluminium i støbeholderen (figur 2AI), således at stolpehullerne flugter med det døde rum modsat trekanthylderne (se figur 1D). Pak apparatet ind i et rektangulært stykke 0,5 mm tykt silikonefolie (figur 2B, hvide pile) som en pakning for at forhindre lækage af væsken PDMS og klem det mellem to parallelle 3D-printede beslag ved hjælp af en skrueklemme.
   3. Tilsæt 0,5 ml PDMS-hærdningsmiddel til 5 ml PDMS-elastomerbase (1:10-forhold i henhold til producentens anvisninger) i en lav beholder, og bland kraftigt i 5 minutter. Afgas PDMS-blandingen i et vakuumkammer, og påfør et stærkt vakuum (0,1-1 kPa) i 20-60 minutter ved stuetemperatur, eller indtil boblerne forsvinder.
   4. Hæld PDMS-blandingen på støbeapparatet, overfyldning for at sikre fuld dækning af hver slot (figur 2AII). Hvis det ønskes, skal du tilføje små, farvede glasperler til kroppen af PDMS-stativerne (figur 2AII), modsat siden med stolperne (figur 2B), for den unikke identifikation af hvert PDMS-stativ. Sæt støbeapparatet tilbage i vakuumkammeret (sørg for, at det er vandret plant), og påfør et stærkt vakuum i mindst 12 timer. Lad PDMS hærde ved stuetemperatur i ca. 48 timer væk fra støv for at muliggøre fuldstændig hærdning og maksimal styrke af de sarte stolper. Undgå at bruge en ovn, da dette forvrider de 3D-printede komponenter.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
3. PDMS-rackfjernelse fra de negative masterstøbninger af aluminium
   1. Fjern klemmen, beslagene og silikonefolien fra støbeapparatet. Brug et barberblad i rustfrit stål til at trimme PDMS-filmen oven på støbeapparatet og rammestøtterne, og brug forsigtigt fingrene til at adskille PDMS-stativerne fra siderne af støbholderen. Indsæt et stumpet barberblad i rustfrit stål i det døde rum mellem støbningen og støbningsholderen, og lirk dem fra hinanden (figur 2CI, II), og sørg for, at PDMS, der fylder det døde rum, forbliver hos støbningsholderen (da dette er fastgjort til stolperne). Brug et skarpt blad i rustfrit stål til at skære de resterende PDMS-film væk og skære PDMS med dødt rum fra spidsen af stolperne (figur 2C III-V).
   2. KRITISK TRIN: Frigør PDMS-racket fra støbningen (figur 2D). Begynd med siden modsat stolperne, brug fingrene til langsomt at adskille PDMS-stativet fra støbningen, og arbejd på alternative sider, indtil stolperne er fri for masterafstøbningerne.
   3. Gentag det forrige trin, indtil alle PDMS-stativer og alle indlæg er frigjort. Brug et skarpt barberblad til at trimme eventuelle resterende overskydende PDMS væk fra stativerne. Resultatet er et PDMS-stativ (figur 2E) med seks intakte stolper (orange pilespidser) og farvede perler (blå pil) til identifikation.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
4. Stabil post tracker (SPoT) fabrikation
   1. Brug en termoplastisk smeltet aflejringsmodellering 3D-printer til at udskrive komponenterne i SPoT-støbeapparatet (supplerende fil 2 og figur 3AI, II). Brug følgende udskriftsindstillinger: en laghøjde på 0,1 mm, en væg-/bund-/toptykkelse på 1 mm, en udfyldningstæthed på 80 % med trekanter, en udskrivningstemperatur på 230 °C, en byggepladetemperatur på 70 °C og en rand til vedhæftning.
   2. Sørg for en sikker pressepasning mellem de 3D-printede stykker samt mellem PDMS-stativerne og den tregrenede jig, og bekræft, at PDMS-stativerne passer tæt sammen med stolperne, der lige når bunden af brøndene uden at blive bøjet. Trim/fil plasten, hvis det er nødvendigt.
   3. Tilsæt 0,5 ml sort PDMS del A til 0,5 ml del B (1:1 forhold i henhold til producentens anvisninger) til en lille vejebåd (eller en lignende lille, lav beholder), og bland grundigt, indtil den er ensartet i farven. Afgas den blandede sorte PDMS i et vakuumkammer under et stærkt vakuum i 20 min. Hæld det afgassede sorte PDMS på den 3D-printede base for at fylde hullerne, og bank for at sikre, at der ikke er bobler tilbage. Skrab så meget overskydende PDMS væk fra basen som muligt.
   4. Klik det tregrenede stykke på basen, og placer PDMS-stativerne i rillerne på den tregrenede jig (figur 3AII, turkis rektangel), og sørg for, at enderne af stolperne dypper ned i det sorte PDMS i de cirkulære brønde (figur 3B, C). Hærd den sorte PDMS ved stuetemperatur og beskyttet mod støv i 48 timer.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
   5. Skub det tregrenede stykke ud, hvilket minimerer spændingen på stolperne. Brug små pincet til at skrabe den tynde film af sort PDMS, der omgiver hver SPoT, væk; Indsæt derefter finspidsede bøjede pincet i SPoT-brønden for at frigøre den fra den 3D-printede base (figur 3D).
   6. Undersøg SPoT'erne (figur 3E), og trim eventuel resterende sort PDMS-film væk fra støbeprocessen, der ikke blev fjernet i trin 1.4.5, ved hjælp af en fin Vannas-saks. Sørg for, at de færdige stolper har den korrekte længde ved at montere PDMS-stativerne på polysulfonrammen og derefter skubbe dette på den sorte bundplade (figur 4A).
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
   7. Par PDMS-stativerne, og føj dem til rammen ved hjælp af rammefanerne (figur 4A). Autoklave i en pose med en PTFE-bundplade i mindst 30 minutters cyklus (<122 °C for at reducere vridning).

Figur 1: hECT-bioreaktorkomponenter. (A) Set ovenfra (venstre) og set fra siden (højre) af PTFE-bundpladen med seks jævnt fordelte brønde til dannelse af hECT (hvide pile). (B) Set fra siden (venstre) og set ovenfra (højre) af de negative masterafstøbninger af aluminium til PDMS-stativerne med seks jævnt fordelte stolper (magenta pilespidser) og tre huller til fastgørelse til bioreaktorrammen (grønne stjerner). (C) Set fra siden (venstre) og nederst (højre) af polysulfonrammerne til PDMS-stativerne med tre jævnt fordelte rammestøtter (grønne stjerner) svarende til rammestøtterne i PDMS-rackstøbningen (panel B). (D) Set ovenfra (øverst) og set fra siden (nederst) af aluminiumsstøbeholderen med fire åbninger til PDMS-rackstøbninger, hver med en 0,25 mm høj trekantet hylde (hylde længst til venstre fremhævet med orange). Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelser: hECT = humant manipuleret hjertevæv; Ø = diameter; PTFE = polytetrafluorethylen; PDMS = polydimethylsiloxan; R = radius. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Fremstilling af PDMS-stativerne. (A) CAD-gengivelser viser støbeapparatet skråt. (I) En negativ PDMS-rackmasterstøbning indsættes i hver af de fire åbninger på støbningsholderen med hullerne, der danner PDMS-stolperne (magenta pilespidser) placeret over det døde rum modsat den trekantede hylde (figur 1D, orange trekant). (II) PDMS hældes i hvert hulrum i den negative masterstøbning. (III) Farvede perler tilføjes til det uhærdede PDMS som et farvekodet identifikationssystem. (B) Foto, der viser det samlede PDMS-rackstøbeapparat, som er fastspændt på hver side med to 3D-printede beslag, der holdes på plads af en skrueklemme og viklet med 0,5 mm tykt silikonefolie (hvide pile) for at forsegle de fastspændte sider. De farvede perler er placeret, så de ikke dækker hullerne på 0,5 mm i diameter, der danner stolperne (magenta pilespidser). (C) Når PDMS er hærdet, fjernes støbningen fra støbningsholderen. (I) Et stumpt barberblad i rustfrit stål eller lignende tyndt metalværktøj indsættes mellem støbningen og støbeholderen for at lirke støbningen fra støbeholderen (II). (III) Filmen (turkisbeslag) dannet af PDMS, der strømmer gennem stolpernes huller, er fastgjort til stolpernes spidser og skal skæres væk ved hjælp af et skarpt blad (IV, V). (D) PDMS-stativet er adskilt fra støbningen. (E) Fotos, der viser skråt (øverst), side (midten) og nederst (nederst) af PDMS-stativet med en glasperle indlejret i kroppen til identifikation (blå pil). Spidserne af stolperne (orange pilespidser) er markeret med sort blæk. Skalastang = 1 cm. Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelser: CAD = computerstøttet design; PDMS = polydimethylsiloxan. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: SPoT-fabrikation. (A) CAD-gengivelser, der angiver nøgledimensioner af (I)-basen og (II) det tregrenede stykke SPoT-støbeophæng. Dimensionerne på de cirkulære SPoT-formularer (AI, sorte pile) er indstillet til 0,2 mm dyb x 1,2 mm i diameter, og hver indeholder den sorte PDMS for en individuel SPoT. Hylden på 11,1 mm x 27 mm, der ses øverst (AII, øverst, turkis rektangel), trykkes ned med 0,4 mm (som vist i sidebilledet nedenfor) for at holde PDMS-stativet på plads under hærdning. B) CAD-gengivelse, der viser enheden af SPoT-støbeapparatet. (C) Et foto af det samlede SPoT-støbeapparat. (D) Efter at PDMS er hærdet, glider den tregrenede jig ud under PDMS-stativerne, og SPoT'erne frigøres fra deres brønde ved hjælp af fine pincet. (E) Billeder af PDMS-racket uden (øverst) og med (nederst) SPoTs. Justeringer viser forstørrede visninger af indlæggene. Skalabjælker = 1 cm (E), 2,5 cm (zoomede billeder ind af E). Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelser: CAD = computerstøttet design; Ø = diameter; PDMS = polydimethylsiloxan; R = radius; SPoT = stabil post tracker. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Cellekultur

1. Dyrkning af iPSC'erne
   BEMÆRK: Forskellige cellelinjer kan kræve justeringer af passagefortynding og frekvens og/eller titrering af medieadditiverne.
   1. Overtræk en cellekulturbehandlet plade med 6 brønde med kvalificeret kældermembranmatrix (fortyndet i 1:1 Dulbeccos modificerede ørnemedium:Hams F12-næringsopløsning [DMEM/F12] i henhold til producentens anvisninger), og inkuber pladen ved 37 °C i mindst 30 minutter. Forbered 500 ml iPSC-dyrkningsmedium i overensstemmelse med producentens anvisninger, og tilsæt 5 ml penicillin-streptomycin (10.000 IE/ml til 10.000 μg/ml) stamopløsning.
   2. For at passere iPSC'erne skal du aspirere mediet fra brøndene og vaske hver brønd en gang med 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS). Der tilsættes 1 ml iPSC-dissociationsopløsning pr. hul, og der inkuberes i en laminær strømningshætte i 1 min.
   3. Opsug iPSC-dissociationsopløsningen, og inkuber cellerne ved 37 °C (uden medium) i 5 min. Der tilsættes 1 ml 2 μM thiazovivin i iPSC-substrat for at neutralisere iPSC-dissociationsopløsningen.
   4. Brug en 2 ml serologisk pipette til at adskille kolonierne i klumper på ca. 10 celler, og vask hvert hul med yderligere 1 ml 2 μM thiazovivin i iPSC-medium. Der tilsættes 2 ml cellesuspension til hvert hul i pladen, der for nylig er belagt med kældermembranmatrix (trin 2.1.1).
   5. Efter 24 timer fjernes mediet, og der tilsættes et frisk iPSC-medium (uden thiazovivin). For hver 48 timer tilføres iPSC'erne 2 ml iPSC-medium eller hver 72 timer med 4 ml medium. Omplade cellerne ved en 1: 6 fortynding til passage hver 3. dag, eller når de når 80% sammenløb.
      BEMÆRK: Forskellige cellelinjer kan kræve justering af fortyndings- og passagefrekvensen.
2. Kardiomyocyt differentiering
   1. Start differentieringen, når iPSC-monolagene er 80% -90% sammenflydende.
   2. Forbered differentieringsmediet ved at tilsætte 10 ml B27-tilskud uden insulin og 5 ml penicillin-streptomycinstamopløsning til 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI). Forbered kardiomyocytvedligeholdelsesmediet ved at tilsætte 10 ml B27-supplement og 5 ml penicillin-streptomycinstamopløsning til 500 ml RPMI 1640.
      BEMÆRK: Differentieringsmediet og kardiomyocytvedligeholdelsesmediet kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
   3. Dag 0: Cellerne vaskes med 1 ml DMEM/F12, og der tilsættes 2 ml 10 μM CHIR99021 og fortyndet kældermembranmatrix i differentieringsmedium.
   4. Dag 1: Efter 24 timer, eller når cellesammenløbet er reduceret til under 70%, vaskes cellerne med 1 ml DMEM / F12, tilsættes 2 ml differentieringsmedium og inkuberes i 48 timer.
   5. Dag 3-4: Vask cellerne med 1 ml DMEM/F12, og tilsæt 2 ml 5 μM IWR-1 i differentieringsmedium. Gentag på dag 4.
   6. Dag 5-6: Vask cellerne med 1 ml DMEM/F12, og tilsæt 2 ml differentieringsmedium. Gentag på dag 6.
   7. Dag 7-10: Vask cellerne med 1 ml DMEM/F12, og tilsæt 2 ml kardiomyocytvedligeholdelsesmedium. Gentag hver 24. time.
   8. Dag 11+: Udskift mediet med 4 ml frisk kardiomyocytvedligeholdelsesmedium hver 48-72 timer. Opsug og pipette langsomt for at undgå at beskadige de kraftigt bankende monolag.

3. hECT-kultur

1. Høstning af kardiomyocytter
   1. Høst kardiomyocytmonolagene til brug i hECT-fremstillingen 8-60 dage efter differentiering induktion. Forvent 2-5 millioner celler pr. Brønd.
      BEMÆRK: Hvis cellerne ikke er begyndt at slå på dag 10, er det usandsynligt, at differentieringen lykkes. Kraftigt slå monolag løsnes ofte efter 11-15 dage i differentieringen og komprimeres i tætte væv. Det anbefales at bruge eller omlægge sådanne celler på dette tidspunkt.
   2. Skyl hvert hul med kardiomyocytter 2x med 2 ml PBS. Tilsæt 1 ml stuetemperatur 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 °C i 5-10 minutter, indtil cellerne ser afrundede ud og løsnes ved let bankning af pladen.
   3. Tilsæt 1 ml 10% FBS i kardiomyocytvedligeholdelsesmedium til hvert hul for at neutralisere dissociationen. Rør forsigtigt monolagene ved hjælp af en 5 ml serologisk pipettespids, og overfør til et 50 ml konisk rør for at bryde pelleten op i klumper på 10-20 celler.
   4. Bland cellesuspensionen ved at invertere det koniske rør, før 10 μL celler overføres til 10 μL trypanblåt. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller eller glashemocytometer. Adskil cellesuspensionen korrekt, hvis ikke alle cellerne vil blive brugt, eller hvis nogle celler er afsat til flowcytometri.
      BEMÆRK: Supplerende celler (såsom fibroblaster) kan tilføjes på dette tidspunkt.
   5. Centrifuger cellerne ved 250 × g i 5 min. Der suges straks så meget supernatant som muligt uden at forstyrre cellepelletsen, og den opbevares på is. Arbejd hurtigt for at minimere den tid, cellerne bruger i pelleten.
2. hECT fabrikation
   1. Brug mængderne i tabel 2, og juster efter antallet af celler i pelleten, så hver hECT indeholder 1 million celler. Efter hvert trin blandes ved at pipettere langsomt for at undgå bobler.
      BEMÆRK: Udfør trin 3.2.2-3.2.3 afskærmet mod direkte lys, da nogle komponenter er lysfølsomme.
   2. Forbered en 2,9 g / ml type-1 kollagenopløsning i et 1,7 ml mikrorør ved at tilsætte 13,442 μL destilleret vand, 4,4 μL 10x PBS og 0,638 μL 1M NaOH. Tilsæt 25,52 μL 5 mg/ml kollagenstamopløsning, og bland langsomt.
   3. Forbered ekstracellulær matrixblanding (ECM-blanding fra tabel 2): Tilsæt 5,5 μL 0,2 N pH 9 HEPES-opløsning efterfulgt af 5,5 μL 10x MEM. Bland grundigt, indtil der observeres en ensartet lysegul til lyserød farve. Overfør 35,2 μL af ECM-blandingsopløsningen til cellepelleten, og tilsæt 4,4 μL kældermembranmatrix.
   4. Åbn den autoklaverede pose med bioreaktordele (trin 1.4.7, figur 4A). Mens du bærer handsker steriliseret med 70% ethanol, fjernes den sorte bundplade fra autoklaveposen og anbringes i en 60 mm skål med brøndene opad. 44 μL af celleblandingen pipetteres langsomt ind i hvert hul for at undgå at indføre bobler. Brug om nødvendigt pipetten til at fjerne eventuelle bobler, der blev indført ved pipettering eller er dannet på grund af PTFE's hydrofobicitet. HECT's volumen gendannes, således at væskens overflade flugter med brøndens læbe (figur 4BI).
   5. Don et frisk par steriliserede handsker, og fjern polysulfonrammen med PDMS-stativer fra autoklaveposen. Sænk rammen ned på bundpladen, så rammens ender passer ind i rillerne i enderne af bundpladen (figur 4BII, III). Undersøg bioreaktoren for at sikre, at stolperne alle er lige, og at rammen ikke vippes, før den placeres i en 60 mm skål.
   6. Tilsæt 1 ml 10% FBS i kardiomyocytvedligeholdelsesmediet til 60 mm skålen (pas på ikke at forstyrre hECT'erne) for at øge fugtigheden i skålen, når hECT'erne størkner. 60 mm skålen uden låg anbringes i en højprofil (20 mm høj) 100 mm skål, dækkes med et 100 mm opvaskelåg, og bioreaktoren sættes tilbage i 37 °C, 5 % CO₂ -inkubatoren, så kollagen kan danne en gel med cellerne i suspension.
   7. Efter 2 timer fjernes skålen fra inkubatoren. Tilsæt 13 ml 10% FBS i kardiomyocytvedligeholdelsesmediet, vip skålen for at tilskynde mediet til at flyde mellem PTFE-bundpladen og PDMS-stativerne.
   8. Undersøg bioreaktoren fra siden for at sikre, at der ikke fanges luftbobler mellem de hydrofobe overflader på PTFE-bundpladen og PDMS-stativerne, og returner skålen til inkubatoren. Hvis der er fanget luft, skal du vippe bioreaktoren ud af mediet for at lade boblen bryde og langsomt sænke den igen eller bruge en mikropipette med en gelpåfyldningsspids til at sive luften ud og passe på ikke at forstyrre stolperne.
3. Fjernelse af bundplade
   1. Undersøg hECT-komprimeringen gennem hullet i rammen. I løbet af 24-96 timer komprimeres hECT'erne og bliver mere uigennemsigtige (figur 4CI-III). Når der er et synligt mellemrum mellem hECT'erne og bundpladens væg (figur 4CII), skal du udføre to medieændringer med halv volumen for at ændre mediet til kardiomyocytvedligeholdelsesmediet uden FBS. Fjern bundpladen, når hECT'erne er komprimeret med mindst 30 % sammenlignet med den oprindelige diameter (figur 4CIII). Fyld 60 mm skålen indeholdende bioreaktoren med kardiomyocytvedligeholdelsesmedium, indtil væsken flugter med skålens læbe, og tilsæt 14 ml til en ny 60 mm skål.
   2. KRITISK TRIN: Mens du bærer sterile handsker, skal du vende bioreaktoren om i skålen, så bundpladen er på toppen (figur 4BIV). Undersøg for indespærrede luftbobler som i trin 3.2.8. Løft langsomt bundpladen, og hold den plan (figur 4BV).
   3. Hvis en hECT falder af under fjernelse af bundpladen, men forbliver i bundpladen, skal du bruge sterile buede fine pincet til at overføre hECT fra bundpladen til 60 mm skålen. Brug tangen til at guide enden af hECT til sin stolpe. Brug et andet par pincet til at holde stolpen stabil, og træk den gennem hullet i hECT. Gentag om nødvendigt for det andet indlæg.
   4. Når alle hECT'erne er fastgjort til stolperne, overføres rammen med hECT'erne til den nye 60 mm parabol, og rammen placeres med stolperne pegende nedad (figur 4BVI). Undersøg bioreaktoren for at sikre, at hECT'erne forbliver på deres poster lige proksimalt til SPoT'erne.
   5. Hvis en hECT er blevet skubbet af overfladespænding til bunden af dens stolper, stabiliseres rammen med et par sterile buede tang. Indsæt det andet par tang gennem spalten i rammen, og hold den lukket. Når spidsen af tangen er sænket ned forbi PDMS-stativerne, skal du dreje den, så den når stolpen, og bruge de lukkede spidser til forsigtigt at skubbe hECT mod enden af stolpen, indtil den hviler på SPoT (figur 4BVI, indsats).
4. hECT vedligeholdelse
   1. Udfør medieændringer med halv volumen med kardiomyocytvedligeholdelsesmedium hver 24-48 timer (efter 2 ugers dyrkning kan frekvensen reduceres til to gange om ugen.)
   2. Når hECT'erne viser klynger af spontane slag, typisk på dag 3, og koordinerede slag med synlig efterafbøjning på dag 5, skal du starte de funktionelle målinger og gentage så ofte som ønsket.
      BEMÆRK: hECT'er, der ikke er begyndt at slå koordineret på dag 7, vil sandsynligvis slet ikke gøre det.

Komponent			Volumen (μL)
destilleret H2O			13.442			2,9 mg/ml kollagenopløsning	"ECM-blanding"	endelig hECT-celleblanding
NaOH 1N			0.638
PBS 10x			4.4
5 mg/ml kollagen lager			25.52
0,2 N pH 9 HEPES			5.5
10x MEM			5.5
Volumen af ECM-blanding, der skal overføres til cellepellet			35.2
Volumen af Matrigel			4.4

Tabel 2: hECT-reagenser. Komponenterne skal tilføjes i den angivne rækkefølge og opbevares på is.

Figur 4: Bioreaktorsamling og hECT-fabrikation. (A) (I) To PDMS-stativer (venstre, lyseblå) monteret på polysulfonrammen (højre, solbrun). (II) PTFE-bundpladen (sort, venstre) passer derefter på rammen (højre), således at hvert par stolper passer ind i en brønd på bundpladen. (B) (I) Fireogfyrre mikroliter kardiomyocytsuspension i kollagenbaseret ekstracellulær matrix tilsættes til hver af de seks bundpladebrønde. (II,III) Rammen med PDMS-stativer er trykpasning på bundpladen. Efter 1-4 dage kan hECT'erne fjernes fra bundpladen. (IV) Først vendes bioreaktoren, før (V) bundpladen løftes af rammen. VI) Set fra siden af bioreaktoren med seks hECT. Indsats: forstørret visning, der viser hECT-positionen på stolperne i forhold til SPoT'erne (indsat). (C) CAD-gengivelse, der viser tre niveauer af hECT-komprimering ([I] lav, [II] medium og [III] høj) set gennem hullet i polysulfonrammen. Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelser: CAD = computerstøttet design; PDMS = polydimethylsiloxan; PTFE = polytetrafluorethylen; SPoT = stabil post tracker; hECT = humant manipuleret hjertevæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. hECT-pacingudstyr

1. Jakke til den opvarmede scene
   1. Brug en laserskæremaskine til at skære komponenterne i akrylisoleringskappen ud af en 0,635 cm tyk klar akrylplade (supplerende fil 3), en hver af figur 5A-D og to hver af figur 5E, F.
   2. Saml dele (B), (C), (D) og en af (E) fra figur 5, og bind sammen med akryllim som vist i figur 5GI. Fastgør toppanelet (figur 5GII), lad limen sætte sig i flere timer, og skub derefter det opvarmede trin ind i siden af jakken (figur 5GIII).
   3. Når jakken er på plads, skal du bruge tape til at fastgøre indsatserne mellem benene på den opvarmede scene og tilføje frontpanelet (figur 5GIV) for at afslutte samlingen (figur 5GV).
2. Fremstilling af grafitelektrode
   1. Skær 6,25 mm tykke, 25 mm brede grafitstænger ved hjælp af en båndsav i blokke, der er 35 mm lange; Skær derefter hver blok på langs i en buet linje, så hver elektrode er 13-16 mm høj i den ene ende og 8-10 mm høj i den anden ende. Bor to huller med en diameter på 0,7 mm i øverste hjørne (figur 6AI). Poler stykkerne med køkkenrulle og soniker i vand i 20 minutter for at fjerne grafitstøv. Sørg for, at elektroderne kiler sig ind mellem skålens vægge og den 25 mm brede bioreaktor for at sikre en ensartet afstand mellem elektroderne (figur 6AII).
   2. Træk en ståltråd med en diameter på 150 mm x 0,25 mm gennem hullerne i elektroderne, og bøj den, så den passer over kanten på 60 mm skålen og rundt om væggene på 100 mm skålen, så låget kan lukkes (figur 6AII).
   3. Elektroderne rengøres ved at lægge dem i blød i destilleret vand i 1-2 timer efter hver brug for at fjerne eventuelt absorberet medium, lade dem tørre natten over og derefter autoklave ved 132 °C i 30 minutter. Før målingerne påbegyndes, anbringes en elektrode på hver side af bioreaktoren (figur 6AII). Placer ledningerne, så 100 mm parabollåget kan lukkes, og returner bioreaktoren til inkubatoren for at balancere.

Figur 5: Akrylkappe til isolering af det opvarmede glastrin. CAD-billeder, der viser de vigtigste dimensioner af stykkerne af akryljakken designet til glasbordet. (A) Toppanelet har en huludskæring på 27 cm x 18,5 cm, så bioreaktorskålen kan sidde på varmeelementet. De orange rektangler i hjørnerne angiver den foreslåede placering af små afstandsstykker for at give plads mellem toppen af jakken og varmeelementet. (B) Det nederste stykke af jakken har to udskæringer, så benene på den opvarmede scene kan glide ind (grønne stjerner). (C&D) To sidepaneler passer under det øverste stykke. (D) Det venstre sidepanel indeholder en 3 cm x 0,3 cm udskæring (indsats) til sceneledningen. (E) Lange paneler passer på forsiden og bagsiden. (F) Indsatser tilføjes for at udfylde hullerne, når bordet er inde. (G) (I) Side- og bagpanelerne er fastgjort til det nederste stykke, og derefter (II) tilføjes toppanelet. (III) Glasbordet skubbes ind i kappen (magenta pile). (IV) Indsatserne er fastgjort mellem bordets ben, og bagsiden passer til åbningen for at lukke kassen. (V) Den færdige jakkesamling. Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelser: CAD = computerstøttet design; R = radius; Ø = diameter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Dataindsamling af hECT-kontraktion. (A) (I) Billeder af elektroderne skåret fra grafitstænger. De magenta pile angiver huller til fastgørelse af rustfrit stål ledninger. Skalabjælke = 1 cm. (II) Skråt billede (venstre) og set ovenfra (højre), der viser placeringen af grafitelektroderne i bioreaktoren. Elektroderne optager mellemrummet mellem den 25 mm brede bioreaktor og skålens væg for at sikre en ensartet afstand mellem elektroderne. Ledningerne er bøjet for at tillade lukning af opvaskelåget. (B) Foto af hECT pacing setup inde i laminar flow clean bench - alt udstyr er placeret på vibrationsisoleringsbordet for at reducere vibrationsstøj fra den rene bænk. Bioreaktoren (magenta pilespids) sidder på den kappede opvarmede scene, oplyst af en LED-lyskilde ovenfra. Dissekeringsmikroskopet peger vandret mod et retvinklet spejl (orange stjerne) for at se bioreaktoren nedefra og er udstyret med et CCD-kamera (venstre). Det turkise beslag angiver et vandbad til kontinuerlig temperaturovervågning for at give feedback til den lukkede kredsløb opvarmede sceneregulator. Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelser: hECT = humant manipuleret hjertevæv; LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Funktionelle målinger af hECT

1. Opsætning af arbejdsområdet Pacing
   1. Tænd for det opvarmede trin til 39,5 °C, og placer pacingudstyret på et vibrationsisoleringsbord inde i en laminar flow clean bænk i henhold til figur 6B. Monter dissekeringsmikroskopet på et bomstativ, og peg det mod et retvinklet spejl (figur 6B, orange stjerne) placeret på en laboratoriestik under glasbordet for at se bioreaktoren nedenfra. Fastgør et højhastigheds CCD-kamera til mikroskopet, og tilslut til computeren. Bestråle opsætningen med UV-lys i 15 minutter for at sterilisere arbejdsområdet.
   2. Placer bioreaktoren (figur 6B, magenta pilespids) på det kappede opvarmede scene, oplyst af en dobbelthoved svanehals LED-lyskilde ovenfra (halsen på LED-lamper kan fastgøres mere sikkert til hovedenheden sammenlignet med de fiberoptiske lamper). Minimer yderligere støj ved at sikre, at tempoudstyret på vibrationsbordet (og selve bordet) ikke rører nogen del af laminar flow clean bænken.
   3. Tilsæt endnu en 60 mm skål fyldt med forvarmet vand inde i en 100 mm skål på det opvarmede bord (figur 6B, turkisbeslag), og udstyr med en temperatursonde til kontinuerlig temperaturovervågning. Temperaturindstillingen for det opvarmede trin justeres efter behov for at holde referenceskålens temperatur på 36-37 °C.
   4. Indstil mikroskopforstørrelsen til 1,5x (eller en anden ønsket forstørrelse, hvormed en hECT kan visualiseres i sin helhed med tilstrækkelig opløsning).
2. Justering af kameraindstillingerne
   1. Åbn kamerasoftwaren. Tilpas størrelsen på videofeedet for at beskære synsfeltet så meget som muligt, mens du stadig visualiserer en hel hECT. Dette maksimerer kameraets hastighed.
   2. Indstil optagelseshastigheden til 90 billeder pr. Sekund. Juster eksponeringstiden og lyskildens position for at optimere ensartetheden af lysforholdene i hele synsfeltet og maksimere kontrasten i SPoT'erne.
3. Opsætning af anskaffelsessoftware
   1. Tænd for firkantpulsstimulatoren, og tilslut den til computeren. Juster indstillingerne for at levere bifasiske impulser med en amplitude på 12 V og en varighed på 5 ms.
   2. Åbn dataindsamlingssoftwaren, og åbn derefter filen "AutomatedPostTracking3.vi" (supplerende fil 4). Når det er indlæst, skal du klikke på den hvide pil i venstre side af værktøjslinjen for at initialisere programmet (figur 7A).
   3. Kalibrer softwaren ved hjælp af et glashemocytometer på det opvarmede stadium. Klik på stregværktøjet på værktøjslinjen (figur 7B) for at tegne en linje hen over 1 mm af hæmocytometermarkeringerne (vises ikke). I feltet Afstandskalibrering (pixels/mm) (figur 7C) skal du indstille referencelængden (mm) til 1 og derefter klikke på knappen Beregn.
   4. Mål hECT-tværsnitsarealet ved hjælp af linjeværktøjet til at tegne en linje over vævets bredde. Klik på 1 i feltet Tværsnitsareal (mm^2) (figur 7D) for at beregne arealet (under forudsætning af en cylindrisk geometri af de lineære vævsstrimler, som fastlagt i litteraturen ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,} 12,15,16,18,19,20^,
      21,22,23,24,25,26,37,38). Gentag langs forskellige dele af hECT, og registrer værdierne under de to andre knapper i boksen. Outputdatatabelfilen rapporterer gennemsnittet af disse tre værdier for at beregne vævets diameter.
4. hECT funktionel karakterisering
   1. Sørg for, at indlægstipene er i fokus. Tænd tærskelkontakten (figur 7E), og juster skyderen (figur 7F), indtil SPoT'erne (figur 7G) er pænt afgrænset og ikke ændrer form, når hECT trækker sig sammen.
   2. Brug rektangelværktøjet til at tegne et rektangel rundt om en af SpoT'erne (figur 7, grønt rektangel), og klik på knappen Indstil 1 inde i feltet Indlægsgrænser (figur 7H) for at indstille rektangelpositionen omkring SPoT, hvilket sikrer, at SPoT altid forbliver inden for rektanglets grænse. Gentag for det andet indlæg, og optag det under Set 2.
   3. Juster indstillingerne for objektstørrelse (Figur 7I) for at forhindre, at programmet sporer mindre objekter. Sørg for, at antallet af objekter, der spores i hvert rektangel, forbliver konstant. Grænsefladen (figur 7J) viser den målte afstand mellem de sporede objekter i realtid. Brug denne graf til at overvåge støjen.
   4. Vælg en mappe for at gemme filerne (figur 7K). Gem data fra forskellige dage i separate mapper. Vælg det aktuelle vævsnummer, og skriv eventuelle ønskede kommentarer i feltet Kommentarer .
   5. Under overskriften Pacing Frequency (Hz) (figur 7L) skal du angive det ønskede frekvensområde (Min og Max) og det ønskede interval for trin fra Min til Max. Hvis hECT'erne pacer over hele deres optagelsesområde, skal du teste forskellige tempofrekvenser for at finde den laveste frekvens , hvor der opnås et 1:1 stimulus:peak-forhold , og fortsæt med at øge frekvensen, indtil dette forhold går tabt. Mål den spontane funktion ved at vælge et vilkårligt frekvensområde (f.eks. 0,01 Hz til 0,01 Hz) og holde kvadratpulsstimulatorudgangen slukket.
   6. I boksene til højre skal du vælge de( n) ønskede indstillingstid(er) (et tidsinterval efter frekvensen er indstillet, men data registreres ikke) for at tillade hECT at tilpasse sig den nye tempofrekvens. Angiv optagetid(er) og pacingspænding (V). Start programmet ved at klikke på knappen Start program (figur 7M).
      BEMÆRK: Resultaterne gemmes automatisk i den valgte mappe. Efter hver optagelse skal du observere, at scriptet viser Fourier-transformationen af dataene (figur 7N), hvor toppene svarer til den detekterede slagfrekvens.
   7. Hvis det ønskes, skal du køre programmet "Excitation Threshold Finding" for at finde den mindste spænding, der kræves for at stimulere hECT i betragtning (figur 7O). Beregn om ønsket de maksimale og minimale afbøjninger af stolperne (figur 7P).

Figur 7: Dataopsamlingsgrænseflade efter afbøjning. (A) Knap til kørsel af softwaren. (B) Værktøjslinje, der indeholder linje- og rektangelværktøjerne til henholdsvis længdemål og objektvalg. C) Kontrol af afstandskalibrering. D) Værktøjer til måling af hECT-tværsnitsarealet i tre forskellige punkter. (E) Tærskelkontakt og (F) skyder til konvertering af videofeedet til billeder med høj kontrast i realtid. (G) En SPoT, der er synlig i eksempelvinduet. (H) Værktøjer til udvælgelse af SPoT'er. (I) Skyder til filtrering af objekterne efter størrelse. (J) Graf, der viser den målte afstand mellem de sporede objekter i realtid. (K) Indstillinger for valg af mappe til lagring af outputfiler. (L) Indstillinger for indstilling af frekvensområde, frekvensinterval, optagetid og indstillingstid mellem optagelser for postsporingsprogrammet (M). (N) Grafoutput af Fouriertransformationen af afbøjningskurven for den sidst gemte optagelse. (O) Program til at finde den minimumsspænding, der kræves for at stimulere hECT'erne. (P) Program til beregning af de maksimale og minimale udbøjninger af stolperne. Forkortelser: hECT = humant manipuleret hjertevæv; SPoT = stabil post tracker. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. PDMS rack målinger

1. Afstande uden last
   1. Før hECT fabrikation, monter det ønskede par PDMS racks på en ramme. Brug tempoopsætningen og softwaren beskrevet i trin 5.1 til funktionsmålingerne. Vælg de stationære SPoTs i enderne af indlæggene.
   2. Juster om nødvendigt lyskilden og/eller tærskelværdien for at reducere støjen til <2 μm. Optag den gennemsnitlige live y-værdi, der er angivet i grafen, i et regneark.
2. Stolpehøjder og hECT-højder
   1. Fra tempoopsætningen beskrevet i trin 5.2 skal du fjerne det vinklede spejl og det opvarmede trin. Placer bioreaktoren direkte på laboratoriestikket for at se bioreaktoren fra siden.
   2. Åbn kamerasoftwaren. Juster eksponeringstiden og lyskildens position for at optimere ensartetheden af lysforholdene i hele synsfeltet og maksimere stolpernes synlighed.
   3. Åbn dataindsamlingssoftwaren, og åbn derefter filen "PostMeasurement_PB3.vi" (supplerende fil 5). Når den er indlæst, skal du klikke på den hvide pil i venstre side af værktøjslinjen for at initialisere programmet.
   4. Kalibrer softwaren ved hjælp af et glashemocytometer. Klik på linjeværktøjet i den lodrette værktøjslinje til venstre for visningsvinduet, og tegn en linje på tværs af 1 mm af hæmocytometermarkeringerne. I feltet Afstandskalibrering (pixels/mm) nederst til venstre på skærmen skal du indstille referencelængden (mm) til 1 og derefter klikke på knappen Beregn .
   5. Under kalibreringsfelterne skal du indstille det ønskede vævsnummer (til identifikation) i feltet Vævsnummer . Fokuser kameraet på venstre stolpe på hECT, og vælg Venstre i feltet Stolpeside .
   6. Brug linjeværktøjet til at tegne en linje fra bunden af stolpen (øverst) til spidsen af SPoTs (nederst), og optag ved at klikke på Mål post Ht.
   7. Tegn en linje fra bunden af stolpen til den yderste kant af hECT, og optag ved at klikke på Mål vævstop Ht. Tegn en linje fra bunden af stolpen til den nærmeste kant af hECT, og optag ved at klikke på Mål vævsbase Ht.
   8. På dette tidspunkt skal du dreje bioreaktoren rundt for at måle den rigtige stolpehøjde. Vælg den rigtige postindstilling for at registrere de samme målinger. Klik på knappen Tilføj for at udfylde regnearket med de målte værdier og automatisk beregne gennemsnitshøjden på hECT, som vil blive brugt i trin 7.
   9. Når du er færdig med at registrere vævshøjderne, skal du klikke på Gem knappen for at gemme værdierne i en tekstfil.

7. Funktionel databehandling ved hjælp af brugerdefinerede analysescripts

1. I et regnearksredigeringsprogram skal du udfylde oversigtsfilen ved hjælp af skabelonen (Supplerende fil 6). Brug værdierne for postlængde og gennemsnitlig vævshøjde , der er erhvervet i trin 6.2. Sørg for, at alle hECT'er, der har data i mappen, er repræsenteret i oversigtsfilen. Navngiv filen "summary #.csv", hvor # henviser til antallet af dage inde i eksperimentet.
   BEMÆRK: hECT-funktionsdataene skal være i separate mapper i henhold til eksperimentdagen.
2. Sørg for, at mappen, der indeholder AnalyzeLogsGUI-scripts (supplerende fil 7) og mappen med hECT-optagelserne, begge er føjet til stien.
3. Åbn dataanalysesoftwaren. Til venstre for kataloglinjen skal du klikke på knappen Søg efter mappe for at navigere til den overordnede mappe, der indeholder både AnalyzeLogsGUI-mappen og hECT-funktionsdataene. I sidebjælken Aktuelt vindue skal du højreklikke på disse mapper for at føje til sti | Tilføj valgte mapper og undermapper.
4. Åbn filen "AnalyzeLogsGui_SC.m". På fanen Editor skal du trykke på knappen Kør og vente på, at den grafiske brugergrænseflade (GUI) vises i et nyt vindue.
   1. I feltet Logvalg (Figur 8AI) skal du klikke på knappen Vælg mappe og navigere til den mappe, der indeholder hECT-funktionsdataene. Vælg den ønskede hECT, der skal behandles, i rullemenuen Tissue .
   2. I feltet Datainput (figur 8AII) skal du indtaste den ubelastede afstand mellem de stolper, der er registreret fra trin 6.1 i feltet Diastolisk afstand. Indtast 0,25 i feltet Indlægsradius (mm).
   3. I feltet Analysebegrænsninger (figur 8AIII) skal du vælge de frekvenser, der skal udelades fra analysen, eller vælge bestemte frekvenser, der skal medtages (adskilt af kommaer). Starttidspunktet og sluttidspunktet er som standard indstillet til henholdsvis 0 og -1 for at behandle hele længden af optagelserne. Rediger disse værdier for at trimme optagelserne, hvis det er nødvendigt.
   4. Skift filterparametrene (figur 8AIV) for polynomisk rækkefølge og rammestørrelse for at ændre udjævningsniveauet under filtreringsprocessen, og skyderen Tærskelværdi for spidsbelastning for at indstille den mindste topstørrelse , der genkendes af scripts.
      BEMÆRK: Scriptet indeholder indstillingen Spike Removal, som klipper høje toppe forårsaget af artefakter; Dette anbefales dog ikke, da det ændrer formen på trækningerne. Fjern artefakter ved at trimme optagelsen i stedet (figur 8AIII).
   5. Brug yderligere indstillinger (figur 8AV) til yderligere dataanalyseoutput: Analyse efter afbøjning for at køre en ekstra algoritme til topdetektion, Autoskalering af y-akse på zoomplots for automatisk at justere akserne på trækkraftkurven (figur 8B), Gem force-trace-kurver for at gemme hvert rykkrafttal i en . fig-fil og Gem krafttidsdata for at gemme x- og y-koordinaterne for de filtrerede data, der er afbildet i figuren for trækkraftkurven.
   6. Klik på Kør analyse for at generere en .txt fil, der indeholder attributterne for trækkraftkurven (supplerende fil 8) i gennemsnit over en hel optagelse.

Figur 8: Beregninger af trækkraftkurver. (A) Hvis du kører filen "AnalyzeLogsGUI.m" i databehandlingssoftwaren, åbnes GUI-vinduet. (I) Boksen Logvalg giver brugeren mulighed for at vælge mappen til den mappe, der indeholder hECT-funktionsdataene. Feltet Dagnummer udfyldes automatisk ud fra titlen på den oversigtsfil, der er oprettet i protokoltrin 7.1. Den hECT, der skal behandles, vælges ved hjælp af rullemenuen Væv . (II) Boksen Datainput indeholder oplysninger om det par PDMS-stolper, der understøtter hECT, såsom afstanden til ubelastet (opnået i protokoltrin 6.1) og stolperadius (0,25 mm). (III) Boksen Analysebegrænsninger giver brugeren mulighed for at vælge de frekvenser, der skal udelades eller inkluderes, og trimme optagelserne. (IV) Boksen Filterparametre indeholder indstillingerne til at vælge, hvordan kurven for rå trækkraft filtreres. Polynomisk rækkefølge og rammestørrelse ændrer udjævningsniveauet under filtreringsprocessen. Skyderen Peak Detection Threshold bestemmer den mindste topstørrelse, der genkendes af scripts. Indstillingen Fjernelse af spids klipper høje toppe forårsaget af artefakter. (V) Yderligere muligheder omfatter analyse efter afbøjning, som kører en ekstra algoritme til topdetektion, Autoskalering af y-akse på zoomplot, som virker på trækkraftkurven, Gem kraftsporingskurver, som gemmer rykkrafttallene, og Gem krafttidsdata, som gemmer de plottede rykkraftdata. (B) Eksempel på trækkraftkurven for en 30 s optagelse af en hECT paced ved 1 Hz produceret af GUI-skærmbilledet fra panel A. Den røde trækkraftkurve viser den filtrerede kraft, der produceres af parametrene i AIV, overlejret på den rå trækkraftkurve (mørkeblå kurve, vises, når indstillingen Vis ufiltrerede data i AV er valgt). Forkortelser: hECT = humant manipuleret hjertevæv; GUI = grafisk brugergrænseflade; PDMS = polydimethylsiloxan. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Efter ovenstående protokol blev kardiomyocytter genereret fra en sund iPSC-linje, der tidligere blev brugt af vores gruppe ^9,15 og fremstillet til hECT'er efter 8-61 dage i kultur. Figur 9A viser repræsentative billeder af hECT'er set fra bunden, som blev oprettet uden (øverst) og med (nederste) SPoT'er. Funktionelle målinger blev foretaget ved stuetemperatur (23 °C) og ved fysiologisk temperatur (36 °C) mellem 37 dage og 52 dage efter fremstillingen af hECT. I fremstillingen af PDMS-stativerne har vi dokumenteret, at en erfaren bruger kan forvente at have et 80% udbytte i PDMS-stativer med alle seks stolper intakte og et samlet udbytte på 95% på mindst fem stolper (baseret på tre brugere i vores laboratorium) med <3% variation i stolpehøjde.

SPoT'erne leverede en enkelt defineret form, der skulle spores under dataindsamlingen (figur 9B og supplerende video S1) sammenlignet med de fragmenterede former på markørblækket, som ikke binder godt til spidserne af PDMS-stolperne (supplerende video S2)²⁷. I nogle ekstreme tilfælde kan sporingsobjektet endda være skjult (figur 9C, øverste række). Disse uregelmæssigheder introducerer meget støj, der skjuler trækkraftkurven og dermed forhindrer nøjagtig måling af de udviklede kræfter under 10 μN. For at korrigere for dette og sikre ensartet sporing af disse former kræves der typisk mange justeringer af belysningsvinklen og placeringen for at optimere kontrasten og klarheden. SPoT-formernes mørke og regelmæssighed strømliner denne proces, hvilket reducerer anskaffelsestiden med ca. 50 % (fra ~12-30 min til 5-10 min pr. hECT for et typisk optagelsesområde på 1 Hz til 4 Hz). Derudover gav SPoT'erne i dette arbejde en mere pålidelig form til optisk sporing, og reduktionen i støj muliggjorde måling af svage væv med en udviklet kraft så lav som 1 μN, hvilket repræsenterer en postafbøjning på mindre end 5 μm (figur 9D), samt reducerer variabiliteten mellem målingerne af den samme hECT²⁷.

Det er vores erfaring, at prøvetab i longitudinelle eksperimenter typisk opstår, fordi hECTS glider ud af enderne af de inverterede PDMS-stillinger. Denne glidning af hECT'erne sker normalt ved fjernelse af hECT'erne fra bundpladen (figur 4BV, 1-4 dage efter hECT-fremstilling) eller endnu senere i eksperimentet (1-3 uger efter hECT-fremstilling), da hECT'erne er kompakte og modne. Denne modning af hECT'erne udøver undertiden tilstrækkelig passiv og aktiv spænding på de fleksible stolper til at få hECT'erne til at trække sig ud af enden af en stolpe, hvilket resulterer i en ubrugelig klump væv komprimeret omkring den modsatte stolpe (figur 9E). SPoT'erne giver en hættegeometri, der forhindrer hECT-tab (figur 9F), som kvantificeret i figur 9G. For de 103 bioreaktorer, der blev oprettet i løbet af 2 år (hver med tre til seks hECT'er i starten), bevarede PDMS-racks uden SPoT'er i gennemsnit 95% af hECT'erne på tværs af 66 bioreaktorer. Mens de fleste bioreaktorer ikke havde noget vævstab, mistede nogle bioreaktorer imidlertid 30% -100% af hECT'erne (ofte når en enkelt bioreaktor repræsenterer en hel eksperimentel gruppe), hvilket resulterede i betydelig ineffektivitet. I dette arbejde eliminerede SPoT'erne effektivt hECT-tab og forbedrede dermed retentionshastigheden betydeligt til 100% på tværs af 37 bioreaktorer (p = 0,038)²⁷.

Figur 9: Forbedring af datakvaliteten efter afbøjning og stigning i hECT-retention med tilføjelse af SPoTs til PDMS-stolperne. (A) Set fra bunden af hECT'er uden (øverst) eller med (nederste) SPoT'er. (B,C) Nærbilleder af den ene ende af en hECT på en stolpe set nedefra bioreaktoren, med tærskelindstillingerne i højre kolonne de samme som under dataindsamling. De røde felter angiver objekter, der kan spores af postsporingssoftwaren. (B) Sammenligning af de sporbare fiduciale markører på en stolpe med markørblæk versus SPoT. (C) Afslappede og kontraherede hECT'er på stolper med markeringsblæk (to øverste rækker) eller med SPoTs (nederste to rækker). D) Eksempel på trækkraftsporing af en hECT med elektrisk tempo ved 1 Hz slag med en udviklet kraft på 1 μN, svarende til en indbøjning på mindre end 5 μm (blågrøn farve: ufiltreret sporing; magenta: filtreret sporing). (E) Skråt billede af en bioreaktor uden SPoT'er, hvor hECT'er gled af en af deres stolper, hvilket resulterede i en klump væv, der dannede sig omkring den modsatte stolpe (turkise pilespidser). (F) Foto af en bioreaktor med SPoT'er, der viser 100% hECT-retention. G) Prikplot, der viser vævsretention pr. bioreaktor for PDMS-racks (hver med tre til seks hECT'er) uden SPoT'er (n = 322 hECT'er, 66 bioreaktorer) og PDMS-racks med SPoT'er (n = 134 hECT'er, 37 bioreaktorer), herunder data fra bioreaktorer med vævssvigt under fjernelse af baseplate (dag 1-4) og senere i dyrkningsprocessen (dag 4-15). *p = 0,038; Diamant angiver middelværdien. Vægtstænger = 1 mm (A,C), 1 cm (E). Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelser: hECT = humant manipuleret hjertevæv; SPoT = stabil post tracker; GUI = grafisk brugergrænseflade; PDMS = polydimethylsiloxan. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som et eksempel på anvendelse af ovenstående metoder demonstrerer vi også vigtigheden af at måle hECT-funktionen ved fysiologisk temperatur (36 °C) snarere end ved stuetemperatur (23 °C). hECT-funktionen viste sig at være stabil over længere dyrkningstid i den aktuelle tempoopsætning med det opvarmede trin (figur 10A)²⁷. Sammenlignet med målinger ved fysiologisk temperatur viste hECT'er ændret sammentrækningsdynamik ved stuetemperatur med langsommere sammentræknings- og afslapningshastigheder (angivet med hældningerne af toppene i figur 10B).

I dette arbejde viste 1 hECT ud af 10 hypotermisk inotropi (hvor den udviklede kraft var højere ved 23 °C end ved 36 °C), men kun ved lave frekvenser. Når hECT blev pacet ved 1,5 Hz, havde den en stærkere udviklet kraft ved 36 °C (ingen hypotermisk inotropi) og fuldstændig afslapning mellem trækninger (flade interpeakområder af trækkraftkurven, højre panel), men ufuldstændig afslapning mellem sammentrækninger ved 23 °C (øget passiv kraft mellem toppe, venstre panel) (figur 10BI). Når hECT blev pacet ved 0,75 Hz, var hypotermisk inotropi til stede (figur 10BII), og hECT blev observeret at slappe helt af mellem sammentrækninger, selv ved 23 °C (venstre panel). Imidlertid var endelige frekvensmatchede sammenligninger af hECT-funktion udfordrende, fordi optagelsesområdet for de fleste hECT'er viste minimal overlapning på tværs af temperaturer (figur 10C). Dette skyldtes hovedsagelig den lave maksimale optagelsesfrekvens ved 23 °C (for det meste ≤1,5 Hz) og den høje minimumsoptagelsesfrekvens for hECT'er ved 36 °C (hovedsagelig ≥ 1,5 Hz) (figur 10D); Disse begrænsninger ses ikke i naturligt myokardium (testet ved 28 °C og 37 °C), da naturligt ventrikulært myokardium ikke slår spontant⁴⁶. Kun én af de hECT'er, der havde frekvensoverlapning, viste frekvensmatchet hypotermisk inotropi (figur 10D). Som det fremgår af trækkraftkurverne i figur 10B, viste hECT'er med et tempo på 36 °C højere størrelser på +dF/dt og −dF/dt (figur 10E, ubrudte linjer) end ved 23 °C (stiplede linjer). I hECT, der viste hypotermisk inotropi (rød linje), var sammentrækningen og afslapningen meget hurtigere ved 36 °C på trods af den lavere kraft. Når de blev pacet ved 36 °C, havde hECT'er også en højere spontan slaghastighed (figur 10F) (n = 10, p = 0,000016 for en parret t-test) og et mere ekspansivt område af optagelsesfrekvenser (figur 10G) (n = 9, p = 0,0000061 for en parret t-test), hvorved der opnås 1:1-optagelse ved suprafysiologiske frekvenser⁴⁸ på 4,5 Hz til 6,75 Hz (figur 10C).

Figur 10: hECT-kontraktil dynamik, der viser temperaturafhængighed. (A) Twitch-kraftsporing af en hECT paced ved 1 Hz i 30 min (øverst) for at vise stabilitet i funktionen over tid, med indsatser (nederst), der viser et forstørret billede af toppen med 5 minutters mellemrum. (B) Twitch-kraftsporing af en hECT paced ved henholdsvis (I) 1,5 Hz og (II) 0,75 Hz uden og med hypotermisk inotropi. De venstre paneltraceringer blev opnået ved 23 °C, og de højre paneltraceringer blev opnået ved 36 °C. (C) Kraftfrekvensforhold mellem hECT (n = 6 hECT på dag 37 efter fremstilling på tværs af to bioreaktorer, n = 4 på dag 52 efter fremstilling på tværs af to bioreaktorer) ved 23 °C (stiplede linjer) og ved 36 °C (faste linjer). Hver farve repræsenterer en hECT. (D) Kraftfrekvensforhold mellem tre hECT'er fra panel C , der viser frekvensoverlapning ved begge temperaturer, hvoraf den ene viser frekvensmatchet hypotermisk inotropi (sort pilespids). E) +dF/dt og −dF/dt af de samme hECT'er i panel D afbildet på tværs af frekvenser ved 23 °C (stiplede linjer) og 36 °C (ubrudte linjer). (F) Spontan slaghastighed for hECT ved de to temperaturforhold (n = 10, p = 0,000016). (G) Frekvensområde med 1:1-stimulering:maksimal optagelse (frekvensområde i denne graf defineret som maksimal optagelsesfrekvens - mindste optagelsesfrekvens) ved hver temperatur (n = 9, p = 0,000006,1). p-værdier fra parret elevs t-test. Fejlbjælker angiver standardafvigelsen. Denne figur blev ændret fra van Neste²⁷. Forkortelse: hECT = humant manipuleret hjertevæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: CAD-filer til de bearbejdede bioreaktordele. Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: CAD-filer til det 3D-printede SPoT-støbeapparat. Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: CAD-filer til den isolerende akrylkappe til den opvarmede scene. Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: AutomatedPostTracking3.vi fil til sporing af hECT-afbøjninger (protokoltrin 5.3). Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: PostMeasurement_PB3.vi-fil til måling af stolpelængder og vævshøjder (protokoltrin 6.2). Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: Skabelon til "resumé #.csv" (protokoltrin 7.1), som bruges til behandling af data efter afbøjning. Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 7: AnalyzeLogsGUI-mappe, der indeholder MatLab-scripts til behandling af data efter afbøjning (protokoltrin 7). Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 8: Beskrivelser af variablerne i MatLab-scriptoutputtet "_datatable.txt". Linjerne 10-24 er parameteriseringer af trækkraftkurven i gennemsnit over alle toppe i løbet af optagelsens varighed (angivet i linje 25). Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video S1: Video af spontant at slå hECT'er på indlæg med SPoTs. Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video S2: Video af spontant at slå hECT'er på indlæg uden SPoTs. Denne fil blev tilpasset fra van Neste²⁷. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Der er talrige lineære manipulerede hjertevævsmodeller offentliggjort i litteraturen, hvoraf nogle er beskrevet i tabel 1. Nogle modeller involverer direkte måling af vævskraften, men disse kræver typisk, at konstruktionen overføres til et separat muskelbad³⁸. De fleste modeller er designet med vævene permanent forankret i begge ender, oftest til PDMS-indlæg 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ^,17,18,19,20,21,
22,25,26 (eller ledninger ³⁹), hvilket fjerner behovet for vævsmanipulation, og den kraft, der genereres af vævene, kan beregnes nøjagtigt gennem den optiske sporing af endeankerfunktionerne. PDMS-indlæggene udviklet af vores gruppe 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27 var designet til at understøtte mellemstore væv, og disse stillinger balancerer gennemstrømning, præcise funktionelle målinger og opretholder nøgleaspekter af den oprindelige hjerteniche. Stolperne var for små til at tillade en delt støbningsmetode 10,13,14,18,19,20,21,24, og integrerede hætter ville få stolperne til at snappe under det kritiske protokoltrin 1.3.2. Uden hætter kunne hECT'erne glide af stolperne. I tilfælde, hvor vævsretention ikke var 100%, mistede disse bioreaktorer ofte en stor del af hECT'erne, hvilket skabte et alt-eller-ingen-problem²⁷. Dette skete oftest under det kritiske protokoltrin 3.3.2, når hECT'erne blev fjernet fra deres bundpladebrønd. hECT'erne kunne undertiden manipuleres fysisk tilbage på stolperne med hver ende af stolpen omhyggeligt gevind gennem hullet i hECT; Dette var ikke kun teknisk udfordrende, men også en betydelig kilde til skade, der kunne påvirke den efterfølgende kontraktile funktion negativt.

SPoT'er tilføjet til PDMS-postdesignet giver mulighed for hECT-kultur med et bredere spændingsområde. Således kan hECT'er med en fænotype med lav komprimering / passiv spænding (f.eks. Lavt ikke-myocytindhold eller modeller af dilateret kardiomyopati⁴), som ellers ville glide af stolperne, dyrkes og evalueres med SPoT'erne. Omvendt sikrer hættegeometrien, at hECT'er med høj passiv spænding (f.eks. højt ikke-myocytindhold eller sygdomsmodeller med nedsat diastolisk afslapning⁴⁹), der har tendens til at trække glatte PDMS-stolper af, holdes på plads²⁷. Derudover er SPoT'erne relativt unikke, idet de føjes til PDMS-stolperne i et andet fabrikationstrin, som kun er set i en anden model med betydeligt mindre væv¹⁷. Mens SPoT'erne kræver dette separate fabrikationstrin, giver de mulighed for samtidig tilføjelse af en hættegeometri med mulighed for at inkorporere forskellige materialer i hætten, såsom en uigennemsigtig sort farve, magneter eller fluorescerende perler; Disse er blevet undersøgt af nogle andre grupper, men kræver også yderligere fabrikationstrin 23,25,26.

Et andet fokus i dette papir var at undersøge temperaturens virkninger på hECT-funktionen. Mens hjertemanipuleret væv er blevet brugt til at modellere mange aspekter af in vivo hjertefunktion (fx sygdomsmodellering 4,8,50,51 og lægemiddelrespons 15,21,52), er temperaturafhængige virkninger efter vores viden ikke systematisk undersøgt i disse modeller. Frekvensmatchet hypotermisk inotropi er både udtalt - undertiden med en femdobling i udviklet kraft - og allestedsnærværende⁴⁵, som de ses hos adskillige pattedyrarter (rotter 46,53,54, fritter⁵⁴, kaniner⁵⁵ og katte⁵⁴) såvel som sundt og svigtende humant myokardium i forskellige aldre⁴⁴. Vi fandt ud af, at hECT spontan beathastighed og rækkevidde af optagelsesfrekvenser blev flyttet til meget lavere frekvenser ved lavere temperaturer, men frekvensmatchet hypotermisk inotropi var ikke altid til stede²⁷. I søgen efter at forbedre manipuleret hjertevæv gennem fremskridt inden for modning^13,18 og biokompleksitet⁵⁶ tilbyder hypotermisk inotropi en anden funktionel fænotype af indfødt hjertemuskel, der kan bruges som et benchmark for hjertebiofidelitet.

I lyset af temperaturafhængigheden af native myokardium og i et forsøg på at rekapitulere det indfødte hjertenichemiljø karakteriseres konstrueret vævsfunktion ofte ved fysiologisk temperatur. Dette er imidlertid ikke altid muligt, fordi nogle systemer til erhvervelse af vævsfunktionelle data, samtidig med at steriliteten opretholdes, ikke bidrager til opvarmning. Det er derfor ikke sikkert, at det er hensigtsmæssigt at sammenligne funktionen mellem væv (eller vævsmodeller) målt ved forskellige temperaturer. Faktisk anses standardisering af testbetingelser for in vitro vævstekniske assays for nødvendig både inden for regenerativ medicin⁵⁷ og af regulerende agenturer som Food and Drug Administration^58,59. De metoder, der er beskrevet i dette dokument, kan bidrage til at opnå en sådan standardisering ud over at muliggøre yderligere undersøgelser af temperaturens virkninger på hECT-funktionen²⁷.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 - 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp