Summary
Hier wordt een methode gepresenteerd om enkele kernen geïsoleerd uit de gyrus van de muis te sequencen die de meeste neuronen uitsluit door fluorescentie-geactiveerde kernen (FAN) -sortering. Deze aanpak genereert hoogwaardige expressieprofielen en vergemakkelijkt de studie van de meeste andere celtypen die in de niche zijn vertegenwoordigd, inclusief schaarse populaties zoals neurale stamcellen.
Abstract
Volwassen Hippocampale Neurogenese (AHN), die bestaat uit een levenslang onderhoud van proliferatieve en rustige neurale stamcellen (NSC's) binnen de subgranulaire zone (SGZ) van de gyrus dentaat (DG) en hun differentiatie van nieuw geboren neuronen in korrelcellen in de korrelcellaag, is goed gevalideerd in tal van studies. Het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren, met name knaagdieren, is een waardevol hulpmiddel om signaalroutes te onderzoeken die AHN reguleren en om de rol te bestuderen van elk celtype waaruit de hippocampale neurogene niche bestaat. Om dit laatste aan te pakken, hebben methoden die isolatie van enkele kernen combineren met sequencing van de volgende generatie een aanzienlijke impact gehad op het gebied van AHN om genhandtekeningen voor elke celpopulatie te identificeren. Verdere verfijning van deze technieken is echter nodig om zeldzamere celpopulaties binnen het DG fenotypisch te profileren. Hier presenteren we een methode die fluorescentie geactiveerde kernensortering (FANS) gebruikt om de meeste neuronale populaties uit te sluiten van een enkele kernsuspensie geïsoleerd uit vers ontleed DG, door niet-gekleurde kernen te selecteren voor het NeuN-antigeen, om single nuclei RNA-sequencing (snRNA-seq) uit te voeren. Deze methode is een mogelijke springplank om de intercellulaire regulatie van de AHN verder te onderzoeken en nieuwe cellulaire markers en mechanismen tussen soorten te ontdekken.
Introduction
De continue generatie van hippocampale neuronen op volwassen leeftijd, ook bekend als Adult Hippocampal Neurogenesis (AHN), wordt geassocieerd met cognitieve functies zoals leren, geheugenverwerving / -klaring en patroonscheiding en lijkt een belangrijk mechanisme van veerkracht te zijn bij veroudering en neurodegeneratieve ziekten om cognitieve tekorten te voorkomen 1,2,3 . Knaagdieren zijn het model bij uitstek geweest om AHN te bestuderen met behulp van verschillende methoden, waaronder immunocytochemie en next-generation sequencing (NGS) -methoden. De vertaling van deze resultaten naar andere soorten blijft controversieel. Inderdaad, AHN is waargenomen bij de meeste soorten, maar de mate waarin het gedurende het hele leven aanhoudt, met name bij mensen 4,5,6,7,8, wordt regelmatig besproken.
Tot op heden is bevestigd dat verschillende intrinsieke en extrinsieke signaalroutes AHN1 moduleren. De impact van intercellulaire communicatie op AHN is echter nog maar net in opkomst9. Dit kan in de eerste plaats worden toegeschreven aan onvoldoende specificiteit van de momenteel bekende celmarkers om in vivo analyse uit te voeren met genetisch gemodificeerde dieren. Inderdaad, veel studies hebben vertrouwd op markers zoals doublecortine of glial fibrillary acidic protein (GFAP) die tot expressie komen in meerdere celtypen1. Ten tweede brengt de complexiteit en de hoge mate van celdiversiteit in de volwassen hippocampus niche10 technische uitdagingen met zich mee om elk celtype te profileren. Dit is met name het geval voor bioinformatische analyse met overlappende cellulaire markers die worden gebruikt in analytische pijplijnen voor verschillende populaties, zoals NSC's of gliacellen, wat resulteert in controversiële conclusies bij het beoordelen van AHN 7,11. Ten derde ondermijnt het enorme aantal neuronen het onderzoek naar minder overvloedige celpopulaties, zoals astrocyten, oligodendrocyten of ependymale cellen, hoewel hun rol in de fijnafstemmingsregulatie van AHN prominent wordt9. Samen hebben deze beperkingen invloed op het vermogen om resultaten van knaagdieren naar andere soorten te vertalen. Dit wordt met name versterkt door de moeilijkheid om in vitro een complex weefsel, zoals de hippocampale neurogene niche, te recapituleren, en door de vele hindernissen om toegang te krijgen tot weefsel van hoge kwaliteit samen met een gebrek aan gestandaardiseerde protocollen voor weefselverwerking in studies met menselijke weefsels12,13. Het is daarom van cruciaal belang om nieuwe benaderingen te ontwikkelen om celpopulaties te profileren en nieuwe cellulaire markers binnen de dentate gyrus (DG) te identificeren die uiteindelijk zullen leiden tot een beter begrip van de verschillende bijdragen van elk celtype aan AHN-regulatie.
Om dit te bereiken, is single cell (sc) en single nuclei (sn) isolatie in combinatie met RNA-sequencing instrumenteel geworden om complexe weefsels zoals de DG14 te onderzoeken. Als zodanig zijn strategieën van cellulaire verrijking om enkele cellen te isoleren van de volwassen hippocampusniche van de muis meestal uitgevoerd om NSC's15,16 te onderzoeken. Een interessante strategie om niet-neuronale cellen van de DG te verrijken werd toegepast door GluR1/Cd24 dubbelnegatieve enkele cellen te sequencen die resulteerden in 1.408 cellen die werden gesequenced zonder verschillende clusters tussen astrocyten en NSC's na bioinformatische analyse17. Dit kan te wijten zijn aan de harde enzymatische spijsvertering die nodig is voor eencellige bereiding die de celintegriteit en RNA beschadigt. Om dit technische probleem te omzeilen, zijn verschillende methoden ontwikkeld met behulp van isolatie van enkele kernen en zijn ze bijzonder geschikt voor ingewikkelde weefsels11,18. Het overwicht van neuronen binnen de DG of meer in het algemeen binnen het hippocampus-entorhinale systeem genereert echter een steekproefbias om het geheel van de celpopulaties in deze hersengebieden te bestuderen. Bovendien accentueert het beperkte aantal cellen dat moet worden geladen voor de bereiding van eencellige bibliotheken de aanwezigheid van de belangrijkste celpopulatie in analytische pijplijnen van gesequencede enkele kernen. Inderdaad, grote neuronale clusters worden vaak geannoteerd en geanalyseerd, terwijl andere celpopulaties ondervertegenwoordigd zijn of gemist 5,11.
In een poging om deze vooroordelen te overwinnen en andere celtypen dan neuronen die aanwezig zijn in de muis DG te kunnen profileren, werd in deze studie een methode bedacht met behulp van het principe van Fluorescentie Geactiveerd Kernen Sorteren (FANS)18 dat de meeste neuronale populaties uitsluit door negatieve selectie van gekleurde enkele kernen met neuronaal nucleair antigeen (NeuN, ook bekend als Rbfox3). Deze keuze van antigeen werd geleid door de literatuur die NeuN beschrijft als een betrouwbare neuronale marker19 en door de noodzaak om een nucleair eiwit te gebruiken voor deze benadering. NeuN-negatieve FACS-gesorteerde cellen werden vervolgens voorbereid voor RNA-sequencing op een 10x Genomics-platform. De resultaten tonen aan dat uitsluiting van NeuN-tot expressie brengende cellen een celtypespecifieke, hoogwaardige transcriptomische profilering van glia- en zeldzame celpopulaties mogelijk maakt.
Protocol
Dierverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Francis Crick Institute, evenals de richtlijnen en wetten van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken.
Figuur 1: Voorbereiding van een enkele kernensuspensie van de ontleedde DG van volwassen muizen voor snRNA-seq van niet-neuronale populaties. Stroomdiagram dat de belangrijkste stappen van het protocol beschrijft, waaronder dissectie van muis-DG, voorbereiding van een suspensie van enkele kernen, NeuN-immunostaining en negatieve NeuN-FANS-sortering voordat wordt doorgegaan met snRNA-seq. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Dissectie van de DG (Timing: 15 min)
- Bereid kernisolatiemedia 1 en 2 (NIM1 en NIM2), homogenisatiebuffer (HB) en Wasmedia (WM) voor (aanvullende tabel 1). Plaats alle buffers, media, reagentia en gereedschappen op ijs totdat ze nodig zijn. Zet de Dounce homogenisator (zie Materiaaltabel) tijdens de bereiding op ijs (minimaal 1 uur voor de homogenisatiestap).
OPMERKING: NIM1 kan worden bereid en bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden. NIM2, HB en WM moeten vers worden bereid.
LET OP: Manipuleer DTT, de proteaseremmer en Triton X-100 met zorg. Deze verbindingen zijn huid- en oogirritant, acuut giftig en gevaarlijk voor het aquatisch milieu. Draag tijdens het gebruik van deze chemicaliën beschermende handschoenen, kleding, oog- en gezichtsbescherming, was de handen grondig na het hanteren en vermijd afgifte aan het milieu. - Euthanaseer een 22 maanden oude mannelijke C57Bl/6J-muis door cervicale dislocatie volgens de Home Office Schedule 1-procedure20.
OPMERKING: Zie de discussie voor een reden voor het gebruik van een 22 maanden oude muis in deze studie. Dit protocol kan echter op elke leeftijd gedurende de levensduur worden uitgevoerd. - Ontleed de hersenen uit een geëuthanaseerde muis en breng deze over in een petrischaaltje van 10 cm gevuld met ijskoude 1x PBS (figuur 1). Leg de petrischaal op ijs. Verwijder het cerebellum met behulp van een scalpel en snijd de hersenen doormidden tussen beide hemisferen (langs de sagittale as).
- Vul een nieuw petrischaaltje van 10 cm in met ijskoude PBS en leg deze op ijs. Breng de ene helft van de hersenen over naar de nieuwe petrischaal. Ontleed met behulp van een verrekijker de DG en herhaal deze stap om de tweede DG uit de tweede helft van de hersenen te verkrijgen.
OPMERKING: Deze stappen (stappen 1.2-1.4) zijn aangepast van een eerder beschreven procedure21. Het is belangrijk om in dit stadium zo snel mogelijk te handelen om de integriteit van de cellen te behouden. - Breng de twee DG's over in de voorgekoelde Dounce homogenisator en voeg 1 ml koud HB toe.
2. Weefseldissociatie, isolatie van enkele kernen en anti-NeuN immunostaining (Timing: 2 h)
- Homogeniseer het weefsel met 10 slagen van de losse "A" -stamper, gevolgd door 15 slagen van de strakke "B" -stamper.
OPMERKING: Dounce homogenisatie moet worden uitgevoerd met de mortel op ijs met zachte slagen om warmte veroorzaakt door wrijving en schuimvorming te verminderen. Alle buffers en apparatuur moeten tijdens de procedure worden voorgekoeld en op ijs worden bewaard. - Breng het homogenaat over in een vooraf gegraveerde buis van 15 ml; spoel de Dounce homogenisator met 1 ml koud HB en combineer met dezelfde buis. Voeg 3 ml HB toe aan de buis van 15 ml en incubeer 5 minuten op ijs. Meng 2x door de tube voorzichtig om te keren.
- Maak een zeefdop van 70 μm met 0,5 ml HB vooraf nat over een reageerbuis van 50 ml. Zeef de kernenuspensie vanaf stap 2.2 door de buis van 15 ml voorzichtig in de celzeef te kantelen. Was de celzeef met 0,5 ml HB.
- Verwijder de celzeef en centrifugeer de reageerbuis bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een zwenkbakcentrifuge. Gooi het supernatant weg.
OPMERKING: Het persen van het homogenaat zal helpen het puin te verminderen, wat van cruciaal belang is voor de flowcytometrie en de snRNA-seq downstream-stappen. - Resuspendeer de pellet voorzichtig in 4 ml HB met behulp van een P1000-pipet. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Draai bij 500 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 3 ml WM.
- Maak een zeefdop van 35 μm vooraf nat over een reageerbuis van 15 ml met 0,5 ml WM. Zeef de kernenuspensie vanaf stap 2.5 door de celzeef en pipetteer voorzichtig 0,5 ml per keer met een P1000-pipet.
- Was de zeefdop met 0,5 ml WM en plaats de tube op ijs. Breng het filtraat over in een nieuwe buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten en 4 °C bij 500 x g. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 3 ml WM.
- Draai bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 1 ml WM met de muis anti-NeuN, Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaam (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) en 1 μg / ml DAPI. Incubeer gedurende 45 minuten op ijs in het donker.
OPMERKING: Om de immunostaining van geïsoleerde kernen te optimaliseren, wordt aanbevolen om het antilichaam te titreren om de optimale verdunning voor flowcytometrieanalyse en -sortering te bepalen. Voer vervolgens adequate controles uit om te bevestigen dat de kleuringsomstandigheden optimaal zijn. Bijvoorbeeld, met het geconjugeerde anti-NeuN-AF488-antilichaam, werden een negatieve controle (d.w.z. geen toevoeging van het antilichaam, aanvullende figuur 1A) en een positieve controle (d.w.z. kleuring met het antilichaam, aanvullende figuur 1B) uitgevoerd om de segregatie van niet-gekleurde en gekleurde populaties te beoordelen. Wanneer u begint te werken met een AF488-geconjugeerd antilichaam, wordt het uitvoeren van een AF488-geconjugeerde isotypecontrole aanbevolen om de specificiteit te beoordelen. Als een niet-geconjugeerd antilichaam wordt gebruikt, kan aanvullende controle nodig zijn, zoals het toevoegen van een secundair antilichaam alleen aan een kernpreparaat om de niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam te beoordelen.
3. Fluorescentie geactiveerde kernensortering (FANS) om neuronale populaties uit te sluiten (Timing: 45 min)
- Breng de immuno-gekleurde kernensuspensie over naar een reageerbuis van 5 ml en houd deze op ijs tot het begin van de flowcytometrieprocedure.
OPMERKING: Als u met grotere stukjes weefsel werkt dan twee muis-DG, kan verdere verdunning met WM-buffer nodig zijn om te voorkomen dat de FACS verstopt raakt als de kerndichtheid in de oplossing hoog wordt. - Vortex de monsters gedurende 3 s op lage snelheid voordat de buizen in het FACS-instrument worden geplaatst (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: (FACS setup) Sorteermachines moeten aan het begin van de procedure worden uitgelijnd met kalibratiedeeltjes volgens de aanbevelingen van de fabrikant. De druppelvertraging werd gekalibreerd met kralen of microsferen (zie Tabel van Materialen) volgens het FACS-model. De monsters werden gesorteerd op 4 °C in de zuiverheidsmodus. Om het verzamelvolume te verminderen, werden de kernen gesorteerd door een mondstuk van 70 μm bij de aanbevolen druk voor de flowcytometer. Kernen werden gesorteerd in 1,5 ml laagbindende buizen (zie tabel met materialen) die 50 μL WM bevatten. Alle opvangbuizen werden 's nachts gecoat in PBS + 5% BSA bij 4 °C om het risico te verkleinen dat kernen aan de wanden van de buis kleven. - Om de gegevens van een monster van de gekleurde kernensuspensie te verkrijgen, stelt u de poorten in DAPI-hoogte en het DAPI-gebied in om het celpuin en de geaggregeerde kernen uit te sluiten (figuur 2A). Scheid bovendien enkele kernen van alle resterende DAPI-gekleurde aggregaten of celresten door de poorten in het log Side scatter (SSC)-gebied en het log Forward scatter (FCS)-gebied (Figuur 2B) in te stellen.
- Zet de poorten voor de anti-NeuN-AF488 en het FSC-gebied, om de NeuN-AF488-negatieve populatie te isoleren, zoals weergegeven in figuur 2C.
- Sorteer na analyse, met behulp van de hierboven beschreven gatingstrategie, de NeuN-AF488-negatieve populatie in een verzamelbuis van 1,5 ml gevuld met 50 μL WM.
OPMERKING: Volgens de hierboven beschreven gating-strategie en de dissectieprocedure om de DG te isoleren van de hersenen van een volwassen muis, wordt verwacht dat de NeuN-AF488-negatieve populatie ~ 14% van de enkele kernen vertegenwoordigt.
Figuur 2: Isolatie en transcriptomische profilering van niet-neuronale celpopulaties van de DG. (A-C) Gating strategie om NeuN-AF488 negatieve enkele kernen te isoleren en celresten uit te sluiten. (A) FANS dot plot van een representatieve steekproef van geïsoleerde kernen, met de poortinstelling voor de selectie van DAPI+ kernen en uitsluiting van celresten en aggregaten. (B) Verdere selectie van relevante enkelvoudige kernen met behulp van FSC-gebied en SSC-gebied. (C) De poorten voor NeuN-AF488 om de positieve populatie uit te sluiten en te sorteren op de negatieve enkele kernen. (D) Micrograaf van een goede suspensie van één kern met minimale hoeveelheid puin en een hoger aandeel kernen van goede kwaliteit (ronde vorm, zwarte pijl) in vergelijking met kernen van slechte kwaliteit (witte pijl). Schaalstaven = 50 μm, 10 μm (inzet). (E,F) Analyse van snRNA-seq-gegevens en profilering van de verschillende celpopulaties geïsoleerd van de DG van 22 maanden oude C57BL / 6J mannelijke muizen. Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) plots van single nuclei profielen van de (E) niet-FACS-gesorteerde cellen en (F) NeuN-negatieve FACS-gesorteerde cellen, gekleurd op celtype. (G) Cirkeldiagrammen waarin de frequenties van geïdentificeerde celtypen in beide monsters worden vergeleken. (H) Respectievelijke metrieken voor de gesequencede monsters: aantal kernen, mediaan aantal genen en transcripten per kern. (I) Vioolplots die de verdeling weergeven van het aantal gedetecteerde genen en transcripten voor elk celtype in beide monsters. Astr. = astrocyten, Olig. = oligodendrocyten, Vasc. = vasculaire cellen, CRCs = Cajal-Retzius cellen, Neur. = neuronen, Imm. = immuuncellen, OPC's = oligodendrocyten voorlopercellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Voorbereiding van de suspensie van enkele kernen om single nuclei RNA-sequencing uit te voeren (Timing: 30 min)
- Voeg na het sorteren 1 ml PBS met 1% BSA toe aan de opvangbuis om druppels op de wand van de buis te verzamelen en draai bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en laat 50 μL over.
OPMERKING: Behandel de gecentrifugeerde kernen met zorg, omdat het moeilijk kan zijn om pellets aan de onderkant van de buis waar te nemen. Het gebruik van een zwenkbakcentrifuge helpt het supernatant weg te gooien zonder de pellet te verstoren. - Pipetteer voorzichtig om gecentrifugeerde kernen te resuspenderen. Voeg 5 μL van de kernensuspensie toe aan 5 μL Trypan blauw in een microbuisje van 0,5 ml.
LET OP: Behandel Trypan blue met zorg omdat het gevaarlijk is voor de gezondheid, kanker kan veroorzaken en wordt verdacht van het beschadigen van de vruchtbaarheid of het ongeboren kind. Draag beschermende handschoenen, kleding en oog- en gezichtsbescherming. Niet hanteren totdat alle veiligheidsmaatregelen zijn gelezen en begrepen. - Meet de concentratie en beoordeel de levensvatbaarheid van de eencellige suspensie met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller (zie materiaaltabel). Voer bibliotheekvoorbereiding en volgorde van de kernen uit zoals beschreven in stap 5.
OPMERKING: Monsters die van goede kwaliteit werden geacht voor sequencing vertoonden ronde en regelmatige kernvorm onder de microscoop zonder celresten (figuur 2D). De aanwezigheid van een halo rond het kernmembraan of de aggregatie van meerdere kernen samen zijn tekenen van beschadigde kernen en dergelijke celsuspensies moeten niet worden overwogen voor snRNA-seq (figuur 2D). De gemeten concentratie van kernen lag binnen het bereik van 300-700 kernen/μL.
5. Bibliotheekvoorbereiding en -volgorde
OPMERKING: Beschrijving van de volgende stappen is gebaseerd op het interne sequencingplatform dat in dit onderzoek is gebruikt (zie materiaaltabel). Daarom kunnen sommige instellingen verschillen wanneer u een ander platform gebruikt. Hier worden alleen de belangrijkste stappen beschreven en moet elke parameter worden bepaald volgens richtlijnen en protocollen van de gekozen fabrikant, zij het met optimalisatie vóór het eerste gebruik. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de voorbereiding van bibliotheken zo snel mogelijk wordt uitgevoerd na het concentreren van gesorteerde kernsuspensies om RNA-degradatie te voorkomen en een optimale kwaliteit van de sequencing te garanderen.
- Laad tussen de 7.000 en 10.000 kernen in een microfluïdica Single Cell Chip.
- Partitioneer geladen kernen in nanoliter schaaldruppels met behulp van de meegeleverde controller en de reagentia van de gekozen leverancier. Lysekernen in elke druppel en omgekeerd transcriberen RNA.
OPMERKING: In een druppel deelde alle resulterende cDNA dezelfde celscode. - Bereid bibliotheken voor op snRNA-seq volgens de richtlijnen van de gekozen leverancier en zorg voor compatibiliteit met het sequencingplatform. Controleer de kwaliteit en concentratie van uiteindelijke bibliotheken met behulp van elektroforese, fluorometrie of op qPCR gebaseerde methoden en, indien van toepassing, bundel ze equimolarly voorafgaand aan de sequencing.
- Denature bundelde 3ʹ genexpressiebibliotheken en verdunde volgens de aanbeveling van de fabrikant.
- Voer paired-end, single of dual indexing sequencing uit op een next generation sequencing platform met sequencing diepte van 50.000 leesparen per cel.
Representative Results
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode om een suspensie van niet-neuronale enkele kernen geïsoleerd van de DG voor te bereiden om snRNA-seq uit te voeren. Met of zonder FANS, bioinformatische clustering onthulde goed gescheiden groepen kernen die overeenkomen met bekende celtypen binnen de DG (figuur 2E, F). Binnen het niet-FACS-gesorteerde monster bestond de meerderheid van de hoogwaardige kernen die werden gesequenced uit drie groepen neuronen (84,9% van de totale kernen voor dit monster, figuur 2E, G, H). Dergelijke resultaten worden verwacht, gezien het feit dat de meest vertegenwoordigde celpopulaties in de DG korrelneuronen, andere exciterende neuronen (gelabeld exciterende neuronen) en remmende neuronen zijn10. De geïdentificeerde niet-neuronale clusters waren meestal gemaakt van gliaceltypen (11,1%), waaronder astrocyten, oligodendrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC's), immuuncellen (3,3%) en Cajal-Retzius-cellen (0,6%). Bij het uitvoeren van FANS om NeuN-positieve populaties uit te sluiten (NeuN-negatieve FACS-gesorteerde steekproef; Figuur 2F,G,H), clusters van gliacellen werden overheersend (81,3%). De isolatie van een groter aantal gliale kernen maakt een betere segmentatie mogelijk van verschillende populaties die zonder FANS zouden clusteren. Inderdaad, bij het opnieuw clusteren en analyseren van specifieke genen, hetzij uitgedrukt in NSC's of in astrocyten, scheidden vier subclusters zich af (aanvullende figuur 2A, B). Kijkend naar meer specifieke cellulaire markers en het beoordelen van genexpressieniveaus in de celtypen, werd een klein cluster van NSC's gedetecteerd die afzonderlijk van de belangrijkste astrocytische populaties werden gescheiden met een hogere expressie van Hopx en Notch2 en bijna geen expressie van Aldh1a1 of Aqp4 (aanvullende figuur 2C). Vanwege de overlap in genexpressie tussen astrocyten en NSC's zou verdere analyse echter nodig zijn om specifiek verschillende subtypen cellen te profileren en te identificeren. Bovendien had het NeuN-negatieve FANS-monster extra clusters gelabeld als vasculaire cellen (2,3%) die endotheelcellen, pericyten en vasculaire leptomeningeale cellen omvatten wanneer er kruisverwijzingen naar worden verwezen voor expressie van celspecifieke markers (gegevens niet getoond).
Volgens de richtlijnen voor het gekozen protocol om bibliotheken voor sequencing te genereren, werden expressieprofielen van hoge kwaliteit verkregen met of zonder FANS. Voor monsters gesequenced bij 50.000 reads/nucleus werden gemiddeld 2.510 genen gedetecteerd per kern voor het niet-FACS-gesorteerde monster (5.578 transcripten, figuur 2H) en 1.665,5 genen (3.508 transcripten) voor NeuN-negatieve FANS-monster, na het filteren van lage kwaliteit kernen (figuur 2H, I). Deze statistieken bevestigen dat dit protocol hoogwaardige transcriptomische profilering van afzonderlijke kernen genereert, vergelijkbaar met studies met verschillende benaderingen22,23 en dat het proces van FACS-sortering kernen voor daaropvolgende snRNA-seq niet beschadigt. Met name het verschil in het aantal genen en transcripten per kern tussen de twee monsters is niet te wijten aan een lagere gegevenskwaliteit, maar aan het hoge aandeel neuronen in het niet-FACS-gesorteerde monster (84,9% vergeleken met 1,7% in NeuN-negatieve FANS-steekproef), die een hogere transcriptionele activiteit hebben (2.660 genen / kern en 6.170 transcripten / kern in niet-FACS-gesorteerd monster) dan de gemiddelde transcriptionele activiteit van alle niet-neuronale celtypen (1.090 genen / kern en 1.785 transcripties/kern, figuur 2I).
Samen tonen deze representatieve resultaten aan dat de selectie van NeuN-negatieve kernen met behulp van FANS een krachtig hulpmiddel is om celtypen met lage abundantie te isoleren van vers ontleed hersenweefsel en hoogwaardige transcriptomische profilering van één kernen van deze verschillende celpopulaties uit te voeren via snRNA-seq-methoden.
Aanvullende figuur 1: Validatie van de immunostaining voor FANS. Kernsuspensie werd geïncubeerd (A) zonder het anti-NeuN-AF 488-antilichaam als negatieve controle of (B) met het antilichaam en door de FACS-sorteerder geleid om immunostaining-omstandigheden te valideren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Genexpressieanalyse en herclustering van de astrocytencluster. (A) Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) plot toont de clustering van 4968 kernen op basis van genoombrede expressieprofielen uit figuur 2F. Celtype-aanroepen werden gedaan op basis van celtypemarkers. (B) Astrocytencluster bestaande uit 2579 kernen gekozen uit (A) voor verdere sub-setting om potentiële cellulaire subtypen te onderzoeken. Vier subtypen werden gedetecteerd door Seurat (0-3) clustering, weergegeven door verschillende kleuren. (C) Genexpressieniveaus van specifieke cellulaire markers in de vier celtypen. Alle percelen werden verkregen met behulp van het Seurat R-pakket24. Kortom, RNA-seq tellingen werden genormaliseerd voor elke cel door de totale expressie en vermenigvuldigd met de schaalfactor (10.000). Dit resultaat werd vervolgens gelogd. De getransformeerde waarden werden geschaald (variantie geschaald naar één) en gecentreerd (gemiddelde ingesteld op nul) binnen elke cel voordat UMAP werd toegepast om de insluitingen te berekenen, die werden gebruikt als waarden op x- en y-assen. Grafieken vertegenwoordigen de uitvoer van een dimensionale reductietechniek op een 2D-spreidingsdiagram waarbij elk punt een cel vertegenwoordigt met respectievelijke x- en y-coördinaten op basis van de celinbeddingen bepaald door de reductietechniek. Cellen met vergelijkbare genhandtekeningen worden door de inbeddingen dicht bij elkaar geplaatst. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Genexpressieanalyse van NeuN in de neurogene afstamming. (A) UMAP-plot met de clustering van neurogene afstamming uit openbaar beschikbare dataset15. UMP's werden gegenereerd zoals in aanvullende figuur 2. (B) Genexpressieniveaus van specifieke cellulaire markers in de neurogene afstamming die Astrocyten (Aquaporine 4 = Aqp4), NSC's (Homeodomain-only protein = Hopx), NeuN/Rbfox3 (NSC's en intermediaire voorlopercellen [IPC's]) en fietsende cellen (Cyclin-dependent kinase 6 =Cdk6) laten zien. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Samenstellingen van media en buffers die in het onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Om dit protocol met succes uit te voeren, is de dissectie van het DG de eerste kritieke stap, die enige oefening vereist om het onbeschadigd te houden en besmetting van de omliggende weefsels te beperken. Uit ervaring kon scheiding van de DG van de hippocampus zeer snel worden verkregen door een bekwame onderzoeker die vervolgens kon werken aan het verfijnen van hun techniek om de snelheid van dissectie te verhogen en daarom de versheid van het weefsel te verbeteren om gegevens van hoge kwaliteit te genereren. In dezelfde geest vereist de voorbereiding en resuspensie van enkele kernen consistentie tussen de verschillende omstandigheden die in een enkel experiment worden gebruikt, maar ook het vermijden van overmatig pipetteren dat het nucleaire membraan zou kunnen verstoren door omgevings-RNA's vrij te maken die de sequencingresultaten zullen beïnvloeden. Naast de eerder genoemde aanbevelingen voor het bereiden van kernen van hoge kwaliteit, moet ook de concentratie van de suspensie van enkele kernen worden overwogen voordat wordt overgegaan tot sequencing. Volgens de richtlijnen van de fabrikant moet een preparaat met een concentratie hoger dan 1.200 nuc/μL worden verdund, omdat dit niveau van kernconcentratie een hoger risico heeft op het vormen van multipletten die van invloed zijn op downstream bioinformatische analyses. Het is van belang dat het sequentiëren van monsters met kernconcentraties onder de 500 nuc / μL mogelijk niet de moeite waard is vanwege de kosten die ermee gemoeid zijn. Het wordt ook aanbevolen om het advies van een geavanceerde FACS-gebruiker op te volgen om alle gating in te stellen en consistent te blijven met de instellingen voor monsters en biologische replicaties. Evenzo vereist de voorbereiding van bibliotheken voor RNA-sequencing enige training om resultaten van hoge kwaliteit te bereiken en de meeste leveranciers hebben uitstekende ondersteuning om dit efficiënt te bereiken. Deze methode werd in deze studie alleen getest met vers weefsel; FANS is echter ook uitgevoerd met bevroren weefsel25. Het is daarom redelijk om aan te nemen dat dit protocol kan worden uitgevoerd met bevroren weefsel, zij het met kleine optimalisatie.
Dit protocol is ontwikkeld met een bepaalde downstream-toepassing in gedachten, namelijk het onderzoeken van andere celpopulaties dan neuronen binnen de hippocampale neurogene niche. Inderdaad, toenemende bewijslijnen geven aan dat een verslechtering van AHN bij veroudering kan worden toegeschreven aan de omliggende cellen binnen de niche 1,2,3,9. In het bijzonder komen astrocyten en oligodendrocyten naar voren als belangrijke regulatoren van AHN; hun isolatie van de DG in combinatie met RNA-sequencing heeft echter gemengde resultaten opgeleverd, waardoor deze hypothese moeilijk te beoordelen is met deze techniek 1,17. Deze benadering van FACS-sorterende NeuN-negatieve kernen maakte de isolatie van meer astrocyten en oligodendrocyten mogelijk in vergelijking met monsters die niet FACS-gesorteerd waren, wat een betere bioinformatische analyse mogelijk maakt. Dit protocol is toepasbaar op alle leeftijden gedurende de hele levensduur en de representatieve gegevens die hier worden gepresenteerd met weefsels van oude dieren bieden een bewijs van het concept dat deze methode robuust is om de ouder wordende hippocampale neurogene niche te onderzoeken. Om het gebruik van deze methode uit te breiden en aan te passen aan verschillende biologische vragen, is het belangrijk om te overwegen dat andere neuronale kernmembraanantigenen kunnen worden getest samen met een grondige titratie van de best gevalideerde antilichamen voor deze markers. Bij het bestuderen van het proces van neuronale differentiatie van NSC's in de DG, beginnen sommige celtypen zoals type 2-cellen of neuroblasten neun tot expressie te brengen (aanvullende figuur 3). Daarom zou een ander antigeen nodig zijn om deze celtypen specifiek te onderzoeken. Omgekeerd werden sommige neuronen nog steeds geïdentificeerd in deze studie na NeuN-negatieve FACS-sortering, mogelijk als gevolg van lage of geen expressie van NeuN in deze populaties (bijv. Corticale Cajal-Retzius-neuronen19). Bovendien is gemeld dat NeuN tot expressie komt in subpopulaties van oligodendrocyten26, wat bevooroordeelde resultaten zou kunnen geven als deze subpopulaties van belang waren. Daarom moet de keuze van antigeen bij het gebruik van FANS zorgvuldig worden overwogen om inclusie of uitsluiting van celpopulaties te voorkomen die een nauwkeurig antwoord op een specifieke biologische vraag zouden uitsluiten. In overeenstemming hiermee wordt ook aanbevolen dat elk sequencingresultaat verder wordt gevalideerd door orthogonale assays (bijv. Immunohistochemie of RNA-scope) voordat de geteste hypothese met dit protocol wordt gevalideerd of weerlegd. Ten slotte zou de stap met FANS verder kunnen worden ontwikkeld om meer dan één antilichaam op te nemen met een meer uitgewerkte sorteerstrategie om gewenste celpopulaties uit te sluiten en / of op te nemen.
Uiteindelijk kunnen technologieën die in dit protocol worden beschreven enkele beperkingen hebben wanneer ze worden gebruikt met andere soorten. De niche is bijvoorbeeld zeer goed gedefinieerd bij knaagdieren met de aanwezigheid van proliferatieve en rustige NSC's of pasgeboren neuronen die beperkt zijn binnen specifieke subregio's van de DG, maar het is nog steeds niet duidelijk hoe de hippocampale neurogene niche moet worden afgebakend in andere soorten. Inderdaad, proliferatieve cellen zijn niet uitgelijnd binnen een continue zone van de DG bij niet-menselijke primaten en mensen, maar zijn er eerder omheen verspreid en kunnen ook aanwezig zijn in de amygdala7. Daarom zou het ontleden en isoleren van bredere gebieden dan de DG in andere soorten mogelijk van invloed zijn op het gebruik van dit protocol. Met name de dissociatie- en trituratiestappen voor de voorbereiding van weefsel moeten worden geoptimaliseerd tijdens het werken met grotere stukken weefsel27,28. Wat bioinformatische analyse betreft, terwijl inteelt gehuisveste knaagdieren een zeer homogeen en zeer goed geannoteerd genoom hebben, vereist de genetische variabiliteit van het menselijk genoom in combinatie met onvoldoende aantallen cellulaire markers om duidelijk onderscheid te maken tussen verschillende celpopulaties (bijv. NSC's en astrocyten) veel normalisatie voor analyse die tot verschillende conclusies kan leiden wanneer een klein cluster van cellen wordt geïdentificeerd7, 11. In dergelijke situaties kan celverrijking nog steeds een voorkeursoptie zijn of moet het naast andere strategieën worden gebruikt om het analytisch vermogen te vergroten.
Niettemin kan de huidige aanpak onderzoek mogelijk maken naar de rol van onderbelichte, zij het potentieel belangrijke celpopulaties in de regulatie van AHN. Dit zou met name het geval kunnen zijn voor populaties van astrocyten, die een centrale rol spelen bij het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve ziekten29,30. Deze studie toonde aan dat astrocyten en andere zeldzame celpopulaties kunnen worden geïdentificeerd en geprofileerd door simpelweg de overgrote meerderheid van de neuronen binnen de DG uit te sluiten. Andere studies met verschillende benaderingen zijn niet in staat geweest om een vergelijkbaar herstel van kernen uit hetzelfde bereik van celpopulatieste bereiken 5,11,17. Bovendien tonen de resultaten van deze studie aan dat het mogelijk is om met deze aanpak een NSC-cluster te isoleren zonder specifieke verrijking van deze celpopulatie15.
Kortom, het volgen en verbeteren van deze methode zou een stap voorwaarts zijn om openstaande vragen aan te pakken met betrekking tot de contextuele rol van de hippocampale neurogene niche voor de modulatie van AHN. In het bijzonder zou het nieuwe inzichten kunnen brengen in genexpressieniveaus in verouderde en zieke hersenen in celpopulaties geassocieerd met de regulatie van AHN9, de identificatie van een potentiële heterogeniteit van de NSC's1 ondersteunen of de rol van de vasculatuur in AHN aanpakken. Uiteindelijk kan deze methode worden aangepast voor andere volwassen stamcelniches met vergelijkbare vragen en problemen.
Disclosures
SG, TL en SK zijn werknemers van Merck Sharp &Dohme LLC, een dochteronderneming van Merck &Co., Inc., Rahway, NJ, VS, bekend als MSD buiten de VS en Canada. SG is aandeelhouder van Merck &Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
Acknowledgments
De auteurs willen Lachlan Harris en Piero Rigo bedanken voor technische ondersteuning en Jason M. Uslaner en Ditte Lovatt voor het geven van feedback op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidiesteun van de MRC en een pre-competitieve onderzoekssamenwerking met MSD, het Francis Crick Institute, dat zijn financiering ontvangt van Cancer Research UK (FC0010089), de UK Medical Research Council (FC0010089), de Wellcome Trust (FC0010089) en door een Wellcome Trust Investigator Award aan FG (106187 / Z / 14 / Z). We verontschuldigen ons bij de vele auteurs wier werk we niet konden bespreken en citeren vanwege ruimtegebrek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
| 5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
| Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
| Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
| Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
| Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
| KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
| Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 |
References
- Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
- Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
- Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
- Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
- Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
- Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
- Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
- Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
- Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
- Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
- Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
- Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
- Guidance on the Operation of ASPA. , Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
- Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer's disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
- Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
- Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
- Phatnani, H., Maniatis, T.
